来自两种不同的分相框架的分相rna的作用GhMYB2位点在独联体-棉花基因组中的基因调控

背景

阶段性小干扰RNA (phasiRNA)主要来源于22-nt miRNA靶向位点。GhMYB2是miR828和miR858在phasirna生成过程中的靶基因，在棉纤维细胞命运决定中具有潜在作用。

结果

在本文中，通过对分相评分和分相rna分布模式的评估，我们发现来自GhMYB2分别来自22-nt miR828和21-nt miR858的3 '切割片段。这两个miRNA靶向位点在一个基因座的转录本上启动了两个相位框架。通过RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增(RLM-RACE)，我们进一步证明了来自这两个相框的相RNA在遗传过程中发挥了作用独联体监管的GhMYB2。phasirna来源于GhMYB2均在体细胞组织中表达，尤其是在花药和下胚轴中。我们进一步利用我们之前的小RNA测序数据以及公开数据库中发表的棉纤维胚珠、花药、下胚轴和胚性愈伤组织的降解数据，验证了phasiRNAs的表达、分期模式和功能。

结论

本研究提供了相rna调控细胞凋亡的分子机制GhMYB2位点。

阶段性小干扰rna (phasiRNAs)广泛存在于多种植物基因组中，从藻类和苔藓物种到单子叶植物和双子叶植物[1]。第一个报道的相RNA是来自长非编码RNA位点的反式小干扰RNA (tasiRNA)，即助教基因:TAS1/2, TAS3和TAS4［2]。作为一种特殊类型的相rna, tasirna起源于助教基因转录和功能作用于反式在转录后水平调控mRNA [3.]。启动phasiRNA生成的mirna被称为phasiRNA触发器[4]。TAS1/2是由miR173 [2，5，6]。TAS3是由miR390 [5，7，8，9),TAS4by miR828 [10，11，12，13]。除了由单个miRNA触发外，还有一种替代的phasiRNA生成模式，称为双命中模型[7]和phasiRNA的产生可以由两种不同的小RNA触发，正如在矮牵牛基因组中观察到的那样，phasiRNA的产生可以由两种不同的小RNA靶向触发[14]。

虽然在过去的十年中已经探索了phasiRNAs的生物发生，但我们对phasiRNAs的表达和相位模式的理解仍然有限。phasiRNA分布研究证实了其组织特异性表达模式。例如，phasiRNAs是被子植物花药中发现的主要小RNA类型[15]。此外，对玉米花药小RNA谱的分析表明，在细胞发育过程中，phasiRNA的表达会发生变化[16]。根据小RNA的长度，phasiRNA模式可分为21-nt和24-nt的分相间隔。在细胞命运规范和分化的各个阶段，21-nt phasiRNAs比24-nt phasiRNAs更活跃，而减数分裂与24-nt phasiRNAs的激活有关。最新的DNA修饰分析表明，减数细胞中21-nt和24-nt组的phasiRNAs位点上的CG、CHG和CHH甲基化水平都很高[15]。这些特征表明，phasiRNAs在花药发育和潜在的表观遗传修饰中发挥着重要作用。

近年来对植物相RNA的研究表明，相RNA作为小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)在调控关键农艺性状中起着重要作用。例如，miR2118在水稻穗发育阶段表达[17]及其他种子植物品种[18]。进一步的遗传学和转基因证据表明，miR2118触发Pms1水稻光敏雄性不育(PSMS)产生相rna的位点[j]19]。选择性研究表明，miR828靶点参与非生物胁迫反应拟南芥［13]，苹果[20.]和红薯[21]，以及类黄酮的生物生成[22，23]和棉花表皮纤维细胞的发育[24]。

phasiRNA的功能模式包括按照反向互补方式切割靶基因序列。一些TAS2衍生的sirna可以通过这种方式识别五肽重复(PPR)蛋白编码基因[25]。最近的一项功能研究报道，水稻AGO5同源物MEL1优先结合phasiRNAs [26]。这种现象与mir2118靶向序列和mir2118触发的phasiRNAs高度相关。

棉花基因组中的PhasiRNAs在很大程度上仍然是未知的。在陆地棉中有11个基因被预测为助教基因(27]。此外，在海岛棉中已鉴定出约200个相位基因座[28]。此前，我们在棉花基因组中首次报道了一个功能性相rna衍生基因，GhMYB2，被miR828和miR858靶向[24]。GhMYB2编码MYB转录因子，该因子在植物表皮细胞命运决定中起作用。启动子活性测定和mRNA原位数据表明GhMYB2在细胞分化阶段主要在棉籽纤维细胞中表达[29，30.]。miR858对相rna生物发生的影响GhMYB2仍然是未知的。的功能GhMYB2-产生的phasirna尚不清楚。在这里，我们检查了我们之前研究的棉花叶片和胚珠组织的小RNA测序数据，以及我们从在线发表的数据库中获得的棉花纤维胚珠、花药、下胚轴和胚性愈伤组织(EC)的mRNA降解数据。结合这些来源，我们进一步探索了由两个microrna靶向位点驱动的新的分相模式GhMYB2和独联体-调节作用GhMYB2-衍生的phasiRNAs在棉纤维分化的早期阶段。

棉花GhMYB2分两个阶段产生phasirna

phasirna衍生基因在形成dsRNA后发生相变以产生同相siRNA，这在模式植物中有报道。拟南芥［31]。来检验是否GhMYB2可以推导出siRNA的相位，我们采用相位评分的计算来评价GhMYB2利用陆地棉胚珠组织的小RNA文库(陆地棉，加入Texas Marker-1, TM-1)在0 DPA(花后第一天)收获。如图所示。1的相位曲线模式GhMYB2在miR828切割位点的3′端出现了清晰的峰。这证实了我们之前的报道GhMYB2miR828触发的衍生phasiRNAs [24]。在phasirna衍生的候选基因中，Gh_D07G1901(miR390靶向)预计相当于GhphasiRNA1在棉花基因组中。相位曲线打开GhMYB2不像那些有规律吗GhphasiRNA1。虽然可以清楚地观察到21-nt phasiRNA间隔，但在胚珠和其他组织中也存在不同的峰。只有…的行动GhphasiRNA1在21 nt间隔内，下胚轴产生平滑的相位曲线(图2)。1a).我们通过分析交替峰的间隔来检验它们的模式。在曲线中观察到21-nt的间隔(图2)。1a).进一步检测phasiRNA的丰度和位置表明GhMYB2从miRNA858靶点的3 '切割位点得到相位曲线(图2)。1b、补充表1)。此外，在胚珠和花药组织中也观察到反复出现的小峰。因此，我们确认GhMYB2可以在miR828和miR858的3 '切割片段上相生siRNA。相应的，我们将miR828的3′裂解片段命名为phasing frame 1 (PF1)。miR858的替代相位框架被命名为相位框架2 (PF2)。在PF2相中发现的phasirna多于PF1相，如图所示。1A和b。

与miR390触发的二次命中模型的交替相位相反[7]，表示miR828与miR858之间的距离GhMYB2短至12个基点。这两个miRNA靶向位点之间没有足够的相位空间(一个小RNA在相位中为21 nt)，因为大多数phasiRNA触发器是22 nt的miRNA。根据对两个分相框架的分相rna的观察，分相过程应该分别从独立转录本上的miR858和miR828切割片段开始。由于miR858本身不能触发phasiRNA的发生，因此在内源miR858的切割位点上启动了phasiRNA的分期过程GhMYB2可能受到miR828触发的相变的影响。由两个miRNA 3 '裂解片段触发phasiRNA发生的两个miRNA位点应该位于不同的起始位点。

GhMYB2衍生的phasiRNA可以降解GhMYB2通过顺式效果

的两个相位框架GhMYB2在相位评分曲线上显示为两个主要的相位峰(图2)。2a).这些phasiRNAs可能通过在in的起始位点上形成dsRNA来加速mrna的降解独联体。为了验证这一假设，我们检测了GhMYB2通过phasiRNAs表达mRNA。RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增(RLM-RACE)使用从主动表达相RNA的花药中提取的总RNA进行。结果表明:GhMYB2被miR828和miR858产生的phasirna切割。检测到的裂解位点与phasiRNA预测的裂解位点完全一致。裂解位点a(如图所示)。2b)由pf1衍生的phasiRNA PF1_3 ' D3(−)产生。裂解位点在PF1_3 ' D3(−)的第10 ~ 11个核苷酸之间。这种模式与植物基因组中mirna介导的mRNA切片相似。在由pf2衍生的phasiRNA PF2_3 ' D8(−)产生的裂解位点b上也观察到类似的模式。PF2_3 ' D8(−)在第15和第16个核苷酸之间也产生了另一个裂解位点c。切割位点d位于pf2衍生的phasiRNA PF2_3 ' D10(−)上。虽然由于DNA片段克隆效率的不同，该方法不能用于切割产物的定量测定，但该结果提供了直接证据GhMYB2-衍生的phasiRNAs可以降解GhMYB2记录在独联体。

我们进一步检测了GhMYB2mRNA在花药、下胚轴和胚性愈伤组织(EC)中的表达(补充表2(见方法)。的数量GhMYB2花药降解组的图谱读数明显高于下胚轴和EC降解组(补充图2)。2(典型的是Wilcoxon秩和检验P< 0.01)。MYB109，而GhphasiRNA1则不遵循这种模式(补充图2)。2)。这些数据表明GhMYB2转录本优先降解其自身的副相rna独联体在花药。

phasiRNAs的组织特异性表达GhMYB2位点

为了确定phasiRNA的产生是否与起源基因的表达相关，我们检测了两种miRNA前体和GhMYB2在棉花胚珠、花药、下胚轴和EC组织中进行qRT-PCR。结果表明，GhmiR828和GhmiR858前体在花后0天和3天的胚珠(DPA)、下胚轴中表达水平较高，但在DPA - 3天的早期胚珠、花药和EC组织中表达水平较低(图2)。3.a、补充表6和补充图。3.)。的GhMYB2−3 DPA、花药和EC组织的下胚轴组织表达水平最高，早期胚珠表达水平最低，0和3 DPA的早期胚珠表达水平介于两者之间(图2)。3.a). 0 DPA和3 DPA胚珠中miR828和miR858的丰富积累与先前的发现一致[24]。值得注意的是，与0 DPA胚珠相比，miR828和miR858水平相对较高的3 DPA胚珠表现相对较低GhMYB2mRNA表达的精确调控GhMYB2在棉纤维发育过程中通过miRNA表达基因。

的组织特异性表达的分子基础GhMYB2派生phasiRNAs

棉花基因组经历了多轮全基因组复制。我们推测棉花基因组在phasiRNA生物发生过程中携带冗余蛋白。为了验证这一假设，我们检测了Ago1, sg3, rdr6和DCL4利用mRNA测序数据和qRT-PCR对棉花胚珠、花药、下胚轴和EC组织进行研究。我们发现，负责phasiRNA生物发生的基因在早期胚珠组织中活跃表达，这与受精胚珠中的小RNA活性相对应(图2)。3.)。这些基因在花药组织中的表达较低。AGO1在胚珠和下胚轴组织中表达相似，但RDR6和DCL4下胚轴的表达明显高于其他组织(图2)。3.b).所有这些基因表达模式都与来源于GhMYB2下胚轴(图2)3.a).而EC组织中phasiRNA生物发生的缺失对应于GhphasiRNA1和GhphasiRNA1的未检测水平GhMYB2未分化EC组织中的phasiRNAs。在生殖组织中，AGO1表达非常活跃(图2)。3.B)，类似于在水稻中观察到的模式[32]，我们之前提到过。的表达式DCL基因在下胚轴组织中的表达也高于花药组织(图2)。3.b)我们知道拟南芥,的功能DCL4可以由DCL1。但不像21-nt的最终产品DCL4，DCL1产生更多22-nt siRNA [33]。同样，GhphasiRNA1，和GhMYB2在棉花基因组中，它们不仅产生21 nt的phasiRNAs，而且还可以产生18-29 nt的sirna(补充数据集)1)。为了揭示棉花中相rna -生物发生蛋白的潜在冗余功能，我们在全基因组范围内扩展了相应的同源物。的表达模式以前，rdr6, SGS和DCL通过mRNA-seq分析，对14个棉花组织的同源物进行了广泛的检测。这些基因总体上显示出明显的组织特异性模式，这与qRT-PCR分析显示的模式相似(补充图2)。2、补充表6)。这些结果排除了qRT-PCR内控基因选择带来的潜在误差。因此，AGO1可能主导miRNA/mRNA的切割，而DCL1和DCL4可能主导dsRNA的最终切割。与未分化细胞相比，Argonaute和DCL编码基因在体细胞组织中的主动表达活性可能是phasirna表达丰富的原因。

GhMYB2棉花基因组中的位点在体细胞组织中产生phasirna，而在未分化的细胞中不产生phasirna

GhMYB2是一种在棉花纤维组织中产生相rna的编码基因[24]。phasiRNA触发器miR858和miR828GhMYB2基因表达显示组织特异性模式与GhMYB2在纤维细胞调节中的功能一致。为了检测GhMYB2因此，我们研究了棉花基因组中可能产生相rna的基因。我们之前的研究预测了这一点GhMYB109被miR828靶向产生phasirna。然而，小RNA定位和miRNA切割试验表明GhMYB109并不是棉花中产生相rna的基因。因此，在本研究中GhMYB109作为phasiRNA产生的阴性对照。我们利用miRNA靶向的反向互补规则预测了陆地棉基因组中miR173和miR390的靶位位点(g .,TM-1)，允许三次错配和一次T-G凸起。然后，我们确定了棉花基因组中45个预测的miR173靶点和13个预测的miR390靶点作为潜在的phasirna衍生位点(补充表)3.)。GhphasiRNA1在早期胚珠、花药、下胚轴和EC中显示了特别丰富的小RNA转录本(图2)。4)。因此，选择它们作为phasirna衍生棉花基因的阳性对照。最后是棉花GhUBL1选择编码泛素的基因作为非mirna靶向对照。

小RNA密度图使用来自每个样本的完美映射reads。为了弥补每个组织样本生物复制的不足，我们选择了三个体细胞组织，早期胚珠，花药和下胚轴作为独立的生物样本，与未分化的EC组织进行比较(补充表)2)。

我们观察到GhMYB2来自棉花A和D亚基因组的位点在胚珠、花药和下胚轴中产生高密度的小RNA分布(图2)。4)，类似于GhphasiRNA1。由于A和D等位基因之间的多态性较低，GhMYB2小RNA密度没有明显的等位差异(图2)。4a).如预期，GhMYB109，其模式与…相似GhUBL1在任何组织中都没有产生高水平的小RNA(图2)。4)。此外，我们注意到GhMYB2也不GhphasiRNA1在胚性愈伤组织(EC)中产生了大量siRNA，如图2所示。4b.这些结果表明GhMYB2由于组织特异性的表达模式，在已分化的体细胞中可以表达和产生phasiRNAs，而在未分化的EC细胞中则不能表达和产生。

GhMYB2衍生的phasirna在反式-调节下游指标

进一步研究的潜在功能GhMYB2我们根据反向互补规则预测棉花基因组中的phasiRNA靶标，允许2次错配(补充数据集)2)。为了避免随机小RNA的影响，我们只选择了来自胚珠、花药和下胚轴的重叠相RNA进行靶标预测研究。phasiRNA靶点在棉花胚珠、花药和下胚轴组织中的表达情况如图热图所示。5a. phasiRNA靶基因在花药和下胚轴中的差异表达基因(DEGs)用VENN图表示，如图所示。5b.只有41.3%(38/92)和63.3%(38/60)的靶基因是下胚轴和花药中常见的上调基因。然而，97.2%(65/67)下调的下胚轴靶基因与花药靶基因重叠。花药中下调的靶基因在下胚轴中显著富集(Fisher’s exact test;P< 6.54 e⁻¹⁵)。在花药和下胚轴中常见的、下调的基因比例很高，这表明这些组织中的phasirna在相似的功能途径中靶向相似的基因。氧化石墨烯富集分析表明，在高富集因子条件下，这些phasiRNA靶点参与了质膜上的细胞骨架锚定(补充图2)。4)。细胞骨架的排列与细胞的形状结构有关。我们发现这一类下调基因的富集反映了其独特的功能GhMYB2在特定的细胞形态中，特别是在纤维细胞中，作为phasirna衍生基因(补充表4)。

花药富含21-和24-nt相rna [16]。为了研究抑制花药和下胚轴中phasiRNAs靶表达是否由于GhMYB2我们将65个phasiRNA靶点的降解片段与总基因组进行了比较。为了避免随机降解片段的影响，在phasiRNAs靶向位点的5 '端上绘制的reads被过滤掉。在花药和下胚轴中，65个phasiRNA靶点降解的中位数水平是整个基因组的两倍(图2)。5c) (Wilcoxon秩和检验，花药vs ECP= 0.0276;下胚轴与ECP= 0.05101)。在花药、下胚轴和EC组织中，phasiRNA目标降解片段显著高于总编码基因背景(通常为Wilcoxon秩和检验)P< 2.2 e -¹⁶)。因此，65个phasiRNA靶基因的表达差异可能是由phasiRNA引起的反式——监管。这表明由GhMBY2可通过增加靶基因mRNA的降解来下调靶基因的表达。

GhMYB2棉花基因组中有两个相rna合成的分相框架

PhasiRNAs是一种独特的小RNA。它可以由长度为21 nt或22 nt的触发mirna衍生[34]。在过去的十年中，已经在苔藓中发现了几种phasiRNA触发器[35]，橄榄[36]、杉木[37]，苹果[20.]，大米[38]，棉花[27，39]、高粱[40]，龙眼树［41]和大豆[42]。phasiRNA触发的一种模型由“一次命中”系统组成，通常涉及22个nt的microRNA触发。MiR173是植物基因组中保守的相rna触发器。phasiRNA生物发生的另一种模式由“双击”系统组成，每个mrna转录物使用两个21-nt microrna [34]。代表助教“双击”模式基因携带两个miR390靶向位点，在苔藓和拟南芥［7]。这些mrna在200-300 nt区域携带两个miR390反向互补位点。研究发现，PhasiRNAs在5′期至miR390切割位点的两个miRNA靶向位点之间的区域具有活性。另据报导，该地区的分期方案也有[7]。对于这种交替阶段的原因有两种假设:独联体-激活其中一个phasirna，或激活5 ' miR390切割位点。

据报道，苹果和棉花基因组中的一些miR828靶向位点被两个miRNAs靶向;miR828和miR858 [20.，24]。两面夹攻GhMYB2可以在3 ' miR828切割位点产生phasirna [20.，24]。在我们目前的研究中，我们观察到GhMYB2位点在3 ' miR858切割位点的交替相框中主动生成相rnaGhMYB2可以在多种组织中产生PF1和PF2上的phasirna。

由于存在双相位框架的轨迹，相位分数曲线为GhMYB2在每个相位显示双峰。这不是一个典型的相位曲线。在phasiRNAs分析中从未考虑过其他分期小rna。因此，传统的phasiRNA预测评估遵循一个位点上一个相框的原则，可能低估了基因组中phasiRNA的数量。这一发现可能反过来影响phasirna功能的分析。

棉花中phasiRNA表达的组织特异性

起始位点的phasirna丰度因组织而异。GhphasiRNA1在生殖组织中产生phasiRNAs(图2)。4),GhMYB2在营养组织中比在胚珠中产生更多的phasirna。4)。因此，phasiRNAs的生物发生效率很可能在不同的组织中有所不同。

phasiRNAs的生物发生需要一组独特的蛋白质，但集体数据揭示了所涉及的Argonaute和DCL蛋白家族的功能冗余。在拟南芥，一种Argonaute蛋白被认为是22-nt mirna靶向mRNA切片所必需的[43]。在最近的报道中，这些衍生的21-nt phasiRNA在一个细胞中被检测到ago1零突变体[43]。AGO2和AGO7在phasiRNA生物发生中的同化作用[j]6，8，44]在Argonaute蛋白家族中是多余的。类似地，dicer样蛋白DCL1-4将dsRNA消化成小RNA [4]，而几种不同的DCL蛋白执行与miRNA、siRNA和phasiRNAs相关的功能。DCL4特异性识别rdr6生成的双链RNA并将其切割成21 nt RNA [2]。但在没有DCL4的情况下，DCL1采用了这一功能，其产物为长度为22 nt的阶段性小rna [33]。

我们观察了phasiRNA生物发生相关基因在棉花组织中的表达模式。这些结果表明，phasiRNAs位点的相变主要依赖于Argonaute和dicer样蛋白的活性，而这种活性在不同组织中是不同的。的活动Dcl1, dcl2, dcl3和DCL4在早期胚珠和纤维组织中持续高表达(图2)。3.b)。RDR6和DCL4下胚轴mRNA表达模式相同。DCL1, DCL2和DCL3均在下胚轴中活跃表达(图2)。3.b).下胚轴中AGO1、AGO4和AGO7 mRNA的表达也很高(图2)。3.b).因此，冗余的Argnaute和dcl很可能将长dsRNA切割成不同长度和相的小rna。

的独联体- phasiRNAs的功能

PhasiRNAs在植物基因组中很常见，但对这些小rna的生物学功能知之甚少。2014年，对不同发育阶段的玉米花药进行了小RNA测序，发现phasiRNA的表达与减数分裂过程有关[15，16]。在花药发育过程中，21-nt phasiRNAs的表达先于24-nt phasiRNAs的表达，说明21-nt phasiRNAs和24-nt phasiRNAs在减数分裂中起着不同的作用。对玉米小RNA的分析也表明，phasiRNAs是花药组织中的优势小RNA群体[16]。这些发现开始阐明21-nt phasiRNAs的具体功能。然而，这些phasirna的确切功能仍然未知。

作为回应，我们试图通过RNA降解数据分析来证明phasiRNA可能在mRNA降解中发挥作用独联体监管(无花果。6)。phasiRNA的原始位置可能是phasiRNA的主要靶点，特别是在花药中。降解的碎片GhMYB2在phasiRNA生成水平高的组织中，mRNA富集。这一现象似乎表明，phasiRNA以与miRNA相似的方式靶向原始mRNA，以指导mRNA的切割。然而，我们也发现降解片段在下胚轴组织中不富集，尽管有phasiRNAs表达。因此，mRNA降解是组织特异性的。这最终表明mRNA的降解必须受到基因组中除小RNA之外的其他未知元素的控制。

的反式- phasiRNAs在基因沉默中的作用

小RNA在纤维发育中起着独特的作用，其过程可以反映在phasiRNA的功能上。叶片和胚珠的小RNA谱在纤维发育的早期阶段以及受精期间和受精后明显不同[45]。绒毛纤维的分化是由N₁的基因,GhMYB25-like / GhMML3［46];绒毛的抑制是由小rna引起的GhMML3轨迹。小RNAGhMML3在N₁是由?的正义和反义转录本形成的dsRNA产生的GhMML3。

虽然生物发生途径不同，但phasiRNAs可以以类似于天然反义转录物(Natural anti - sense transcripts, NATs)中的小RNA的方式影响基因组[47]。集体数据表明，nat衍生的小rna参与从头DNA甲基化和组蛋白修饰[46]。这些小rna可以遵循反向互补碱基对规则，以较高的精度找到演绎的靶标位置。在此，我们预测了棉花基因组中的phasiRNA靶点，这些靶点似乎在下胚轴中受到抑制。发现下胚轴组织中产生的phasiRNA最高GhMYB2在所有被检查的组织中。下胚轴组织中这些基因的抑制表明phasiRNAs与其潜在靶标之间存在相关性，这意味着phasiRNAs可能在反式-基因调控(图2)6)。

在本研究中，我们广泛地分析了GhMYB2派生phasiRNAs。我们整合了小RNA序列、mRNA序列和mRNA降解数据，研究了phasiRNA在棉花基因组中的行为和功能。使用棉GhMYB2，TAS1/2，TAS3作为研究的例子，我们发现GhMYB2可以在两个相位框架上生成相位rna;一个位于miR828的3 '切割端，另一个位于miR858靶位点。已知的两个miR390位点对TAS的两次触发仅呈现一个相位帧。这种phasiRNA生物发生的单相框架原理激发了大量的全基因组phasiRNA检测拟南芥水稻、玉米和许多其他物种。我们在一个基因座上发现了一个可选择的相位框架，这一新发现可能会改变相rna预测和评估的公式。PhasiRNAs可以独联体——调节GhMYB2通过降解mRNA。在我们的研究中，我们提供了phasiRNA在植物基因组中内源性功能的直接证据。

棉料生长条件及棉组织采集

陆地棉(陆地棉)标准加入Texas Marker-1 (TM-1)从美国农业部农业研究所作物研究部获得。TM-1在28°C, 16/8 h(光/暗)光循环的温室中生长。在开花当天(0days - po花期，DPA)采集表皮上的胚珠纤维和花药，进行小RNA测序取样。从4周龄的棉花幼苗中采集下胚轴组织。下胚轴组织培养的愈伤组织在胚性培养基中培养8周，获得胚性愈伤组织。每个组织至少进行了三次生物复制。收集胚珠、下胚轴、花药和胚性愈伤组织进行RNA提取和qRT-PCR验证。

小RNA测序，降解和棉花mRNA测序数据源

棉花胚珠小RNA测序数据陆地棉, acc。TM-1之前在我们的实验室生产，并发表在国家生物技术信息中心，基因表达综合(NCBI GEO)，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，加入号PRJNA293171, TM-1小RNA加入号SRX1174194。将−1、0、1、3和5 DPA胚珠组织的RNA混合，制备早期胚珠小RNA文库。小RNA测序数据g .分子囊，下胚轴和胚性愈伤组织下载自NCBI GEO，登录号为GSE43531(花药、小RNA和降解体)和GSE41132(下胚轴和胚性愈伤组织、小RNA和降解体)[48]。参考基因组为陆地棉TM-1基因组[49]。

RNA提取和实时定量反转录PCR (qRT-PCR)

采用Plant RNA Express extraction kit (RK2002, Zoonbio Biotechnology)提取RNA，并用Nanodrop检测RNA质量。采用首链cDNA合成试剂盒(pc24 - 50t, Zoonbio Biotechnology)进行反转录，在ABI 7500上进行qRT-PCR。将相关基因表达归一化到棉花上组蛋白3基因(46]使用ΔΔCt方法[50]。qRT-PCR引物设计如下[51]。所有基因加入号和qRT-PCR引物信息在补充表中列出5。在补充表中列出了MiRNA前体6。

小RNA定位和降解组定位的生物信息学分析

从NCBI GEO公开的数据库中获得小RNA的原始reads和降解组测序文库，分别代表胚珠、花药和下胚轴三种体细胞组织，以及胚性愈伤组织一种未分化组织。由于每个样本缺乏足够的生物重复，因此采用三种不同的体细胞组织作为独立的生物样本进行比较。适配器剪切后，使用Bowtie将每个文库中的clean reads定位到候选基因上。52(settings -a -v 0)，不允许不匹配并保留所有对齐。保留的sRNA读数分别为:早胚珠14956687，花药16347976，下胚轴24948581,EC 25984975(补充表)2)。组织样本之间的小RNA比较采用同一相RNA衍生位点上的百万计数(CPM)值归一化。小RNA总定位率为90-93%(补充表)2)。各文库的唯一映射率和多次映射率均在40%以上(补充表)2)，为进一步研究提供了一个精细的小RNA图谱。小RNA密度以每百万计数(CPM)值归一化。

用Ylab: RPKM检测降解性。每个箱形图的中心线表示中位数。盒的顶部和底部边缘表示第25和75个百分位数，胡须延伸到盒边缘以外的四分位数范围的1.5倍。采用Wilcoxon秩和检验评估显著性。

的映射MYB2分相rna的mRNA内部切割位点

用于绘制内部裂解位点MYB2使用FirstChoice®RLM-RACE试剂盒(Invitrogen)进行mRNA、RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增(RLM-RACE)。从结果中显示的组织中分离总RNA，包括花药、下胚轴、胚珠和EC。总RNA (4 μg)不经小牛肠碱性磷酸酶(CIP)和烟草酸性焦磷酸酶(TAP)处理，直接连接到GeneRacer RNA Oligo适配器上。外5 ' RLM-RACE PCR采用5 ' RACE外引物(5 ' -GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3 ')和5 ' RACE基因特异性外引物(5 ' -TACCATTGCTAATGGATCCTGTTGAT-3 ')引物进行逆转录反应合成首链cDNA。然后使用5 ' race内引物(5 ' -CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3 ')和5 ' race基因特异性内引物(5 ' - catcaagttcaaggaacttattccc -3 ')进行内5 ' RLM-RACE PCR。PCR产物经凝胶纯化后克隆至pGEM-T Easy载体(Promega, Madison, WI)进行测序。

相变评定

相变数据由优化后的方程[31]：

其中，n为在8周期窗口内至少一个小RNA被读取占据的相周期位置的数目，k为在8周期窗口内给定相中所有具有整合序列的小RNA的读取总数。分相的截止点被任意设置为5分。

PhasiRNA靶标预测

基于来自GhMYB2A和GhMYB2D在所有胚珠、花药、下胚轴和胚性愈伤组织中作为保守的phasiRNA查询，预测了陆地棉TM-1基因组中的phasiRNA靶点[qh]49]。phasiRNA靶标预测方法采用TargetFinder (https://github.com/carringtonlab/TargetFinder)在线工具。参数设置为TargetFinder评分≥140，小RNA::mRNA相互作用二级结构最大自由能(MFE)≤- 20 kcal/mol。

在目前的研究中使用和分析的数据集可以在国家生物技术信息中心，基因表达综合(NCBI GEO)，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，编号为PRJNA293171、GSE43531(花药、小RNA和降解体)和GSE41132(下胚轴和胚性愈伤组织、小RNA和降解体)。如有合理要求，可向通讯作者索取植物资料。

phasiRNA:

相控小干扰RNA

RLM-RACE:

RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增

phasiRNA:

反式作用的小干扰RNA

电子商务:

胚胎发生的愈伤组织

PF:

定相架

分区:

花后天数

度:

差异表达基因

不适用

国家重点研发计划项目(2016YFD0101006)、国家自然科学基金项目(NSFC, 31971985, 31900395)、中国博士后科学基金项目(2018m632477, 2019 M652094)、中央高校基本科研业务费专项资金、jic - mcp项目、浙江大学大北农学科发展与人才培养基金资助。所有这些资助都支持研究的设计、数据的收集、分析和解释以及撰写手稿。

作者指出

1. 赵婷和陶晓源对这项工作的贡献相同。

从属关系

1. 浙江大学农业与生物技术学院，浙江杭州

   赵婷，陶晓远，陈杰丹，方磊，张天珍，关雪英

2. 南京农业大学农学院，作物遗传与种质改良教育部重点实验室，棉花杂交种研发工程中心，江苏南京

   李梦琳，高梦涛，周娜，梅高富，丁林云，周宝亮，张天珍，关雪英

贡献

x.g.构思研究方案，设计实验并协调项目。曾国光、曾志、曾田和曾政分析了所有的数据并撰写了手稿。小田、m.g.、m.l.、n.z.、j.c.、g.m.、j.l.、k.w.、l.d.进行了实验室实验，并参与了数据分析。L.F, j.c.b.z和t.z.提供了mRNA-seq数据。所有作者讨论了结果并对稿件进行了评论。作者阅读并批准了最后的手稿。

相应的作者

对应到Xueying关。

伦理批准并同意参与

本研究中进行的植物实验研究符合机构、国家和国际准则。

发表同意书

不适用

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

b施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构的管辖权要求保持中立。

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