全基因组鉴定和棉花的功能表征（gydF4y2Ba棉花gydF4y2Ba）Mapkkk基因家庭回应干旱压力gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKKs)是MAPK信号通路的重要组成部分，在植物抗旱调控中发挥着重要作用。探索gydF4y2BaMAPKKKgydF4y2Ba基因家族在棉响应和对干旱胁迫下的抵抗力，我们进行了系统分析gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在这项研究中，157名非冗余gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba（包括87.gydF4y2BaRAFsgydF4y2Ba, 46岁gydF4y2BaMEKKsgydF4y2Ba和24gydF4y2BaZiks.gydF4y2Ba)在棉花中鉴定出(gydF4y2Ba棉花gydF4y2Ba）.这些gydF4y2BaGhMAPKKKgydF4y2Ba基因在26个染色体上分布不均匀，并且节段重复是Mapkkk家族扩大的主要途径。此外，同一亚家族内的构件共享类似的基因结构和基序组合物。与植物生长和对应力反应相关的许多联合元素分布在启动子区域gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba.此外，这些gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba在棉花组织中显示差异表达模式。在热处理、冷处理和PEG处理下，大多数基因的转录水平发生了显著变化，而一些基因的表达则发生了显著变化gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba是在干旱胁迫下诱导的。在这些干旱诱导基因中，我们选择了gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba和gydF4y2BaGHMEKK12gydF4y2Ba通过病毒诱导基因沉默(VIGS)方法进行进一步的功能鉴定。结果表明，基因沉默的棉花对干旱胁迫的耐受性降低。干旱胁迫下，基因沉默的棉花丙二醛(MDA)含量较高，但脯氨酸积累量、叶片相对含水量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性均低于对照。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

本研究对陆地棉MAPKKKs基因结构、染色体定位、基序组成及进化关系进行了系统研究。gydF4y2Ba棉花gydF4y2Ba以下的表达和功能研究表明，它们在棉花抗旱性中起着重要的作用，为进一步研究棉花的抗旱作用提供了基础。gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba棉花对干旱胁迫的反应和抗性。gydF4y2Ba

棉花是一种重要的作物，它生产优良的天然纤维，广泛用于世界各地的纺织工业[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．因此，棉花在世界范围内被大规模种植。陆地棉(gydF4y2Ba棉花gydF4y2Ba）是同种异体一种倍增物种（Ad1，2n = 4x = 52），并有助于世界上棉纤维的90％产率[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．根据报告，全球57%的棉花种植在缺水地区(世界资源研究所，gydF4y2Bahttp://www.wri.org/gydF4y2Ba）.干旱胁迫严重影响棉花生产和品质[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．因此，利用基因工程技术提高棉花水分利用效率，培育抗旱品种具有重要意义。gydF4y2Ba

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号级联在真核生物中高度保守，广泛参与植物生长和抵御非生物胁迫[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．植物感知环境刺激，通过典型机制将胞外信号传递到胞内，并引起一系列反应[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]．MAPK信号级联用作综合信号转导模块，以激活植物反应环境刺激。首先，上游信号通过磷酸化激活丝裂原激活的蛋白激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶激酶（Ser）在Ser和Thr残基下磷酸盐活化的蛋白激酶激酶激酶（Mapkk）。最后，活化的MAPKK进一步磷酸化MAPK在THR残余物中。因此，信号逐渐放大并转发到下游部件。磷酸化的MAPK可以通过磷酸化相关酶，转录因子和其他信号组分来调节下游基因。在植物中，MAPK信号级联在非生物应激反应中具有重要功能，例如干旱，高盐度和反应性氧物质[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．到目前为止，在植物中已经发现了许多MAPK信号级联。拟南芥MEKK1-MKK4/5-MPK3/6信号通路是植物中首次发现的MAPK级联反应，与植物先天免疫有关[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]．此外，NPK1-MEK1-NTF6级联参与植物响应烟草马赛克病毒感染[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．在干旱压力下，棉花gydF4y2BaGhMAP3K15gydF4y2Ba磷酸化gydF4y2BaGHMKK4gydF4y2Ba，然后磷酸化gydF4y2BaGHMKK4gydF4y2Ba进一步的磷酸化gydF4y2BaGhMPK6gydF4y2Ba，最后的磷酸化gydF4y2BaGhMPK6gydF4y2Ba磷酸化gydF4y2BaGhWRKY59gydF4y2Ba．然后，磷酸化gydF4y2BaGhWRKY59gydF4y2Ba与启动子的W字箱CIS元素相互作用gydF4y2BaGhDREB2gydF4y2Ba激活其表达式。上述基因/蛋白质构成了一种调节模块，参与棉花干旱反应[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

MAPKKK是MAPK信号通路的重要组成部分[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．据报道，一个水稻Raf MAPKKK基因(gydF4y2BaDSM1gydF4y2Ba)参与增加植物的耐旱能力[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]．过度的烟草gydF4y2BaNPK1gydF4y2Ba在玉米加强抗旱性[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]．在拟南芥中，过表达gydF4y2BaMAPKKK18gydF4y2Ba增强转基因植物的耐旱性[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]．这些结果表明MAPKKKs在植物对干旱胁迫的响应和防御中发挥着重要作用。gydF4y2Ba

MAPKKKsgydF4y2Ba在植物中组成一个大的基因家族。据报道有80个推测gydF4y2BaMAPKKKsgydF4y2Ba在拟南芥中，水稻78份，小麦155份，玉米74份，黄瓜59份，番茄89份[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]．然而，到目前为止，陆地棉MAPKKK家族的信息还不清楚。与此同时，最近发布的完整的陆地棉花基因组序列和最新版本的注释为我们更准确地鉴定和表征异源四倍体棉花基因组中的MAPKKK基因家族提供了机会[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba].在这项研究中，我们确定了157个假定的gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba通过对陆地棉进行全基因组扫描，分析了它们的进化关系、染色体分布、基因结构和基序组成，检测了这些基因在正常条件下和不同非生物胁迫下的转录水平，并进一步研究了所选MAPKKs在棉花防御中的作用利用病毒诱导基因沉默（VIGS）技术对抗干旱胁迫。gydF4y2Ba

棉花MAPKKKs的鉴定gydF4y2Ba

识别gydF4y2BaMAPKKKsgydF4y2Ba在棉花中，使用80个拟南芥MAPKKK蛋白序列作为查询，对棉花进行blast搜索(gydF4y2Ba棉花gydF4y2Ba)基因组数据库(gydF4y2Bahttps://www.cottongen.orggydF4y2Ba）.将推定的GhMAPKKKs蛋白序列用SMART和Pfam工具检测激酶结构域的存在。鉴定的157个GhMAPKKK中的每一个都包含一个保守的激酶结构域，GhMAPKKK蛋白的长度从294到1433个氨基酸不等。GhMAPKKKs的分子量为33.51 ~ 157.75 KDa，等电点(pI)为4.4 ~ 9.68。生物信息学分析预测，GhMAPKKK蛋白可能位于叶绿体25个，细胞质35个，线粒体12个，细胞核82个，质体2个，液泡1个。所有特征和染色体位置的鉴定gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba显示在附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S1。gydF4y2Ba

我们分析了的进化关系gydF4y2BaGhMAPKKKgydF4y2Ba根据157条GhMAPKKK蛋白序列和80条拟南芥MAPKKK蛋白序列的多序列比对，构建系统发育树。通过系统发育分析，我们发现棉花MAPKKK家族可以分为RAF、MEKK和ZIK类群，与拟南芥的MAPKKKs类群相似(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).皇家空军集团有87名成员，MEKK集团有46名成员，ZIK集团有24名棉花成员（附加文件）gydF4y2Ba1gydF4y2Ba图S1)。他们被指定为gydF4y2Baghraf1.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaGhRAF87gydF4y2Ba，gydF4y2BaGhMEKK1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaGhMEKK45gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaGhZIK1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaGhZIK23gydF4y2Ba根据他们在棉花上的确切位置(gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba)染色体1-26(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S1)。此外，亚细胞定位的预测分析显示，大多数棉花RAFs位于细胞核和细胞质中，ZIKs和MEKKs通常分布在细胞核中(Additional file)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S1)。此外,gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba在大多数分支中显示散布的排列，表示gydF4y2BaGhMAPKKKgydF4y2Ba基因家族在谱系分化之前就扩大了。我们还观察到许多拟南芥MAPKKKs在棉花中有两个或更多的副同源基因，这表明gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba在棉花和拟南芥的分化进化后复制。gydF4y2Ba

染色体定位与基因复制gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba

确定…的位置gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba在染色体上，通过BLASTN搜索棉花基因组数据库获得染色体定位信息。如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba, 155年gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba不均匀地分布在不同的染色体上，但其余两个基因未被标记在染色体上。此外，棉花基因组包括a亚基因组和d亚基因组，分别包含80和77gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba分别，复制事件可能会照亮关于扩展的机制gydF4y2BaGhMAPKKKgydF4y2Ba基因家族。因此，我们检测了基因对gydF4y2BaGhMAPKKKgydF4y2Ba家庭。共检测到115对基因对gydF4y2BaGhMAPKKKgydF4y2Ba基因家族和一些基因反复参与基因复制事件（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.在这些基因对中，有112对分布在不同的染色体上，表明节段复制是棉花主要的扩展模式gydF4y2BaMAPKKKgydF4y2Ba基因家族。相反，一些副同源基因位于同一染色体上，表明串联复制也有助于GhMAPKKK家族的扩展。gydF4y2Ba

陆地棉(gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba)是异源四倍体物种，是由二倍体A基因组物种(gydF4y2BaG. Arboreum.gydF4y2Ba)和D基因组物种(gydF4y2BaG. Raimondii.gydF4y2Ba） [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．因此，我们对其同源基因进行了研究gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba在其祖先二倍体A基因组物种(gydF4y2BaG. Arboreum.gydF4y2Ba)和D基因组物种(gydF4y2BaG. Raimondii.gydF4y2Ba)我们分别在陆地棉的At和Dt亚基因组以及祖先A和D二倍体棉种的相应基因组中鉴定了77对和76对同源基因（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S2)。此外，我们发现gydF4y2BaGhRAF37gydF4y2Ba在A亚基因组中没有同源基因gydF4y2Bag .植物园gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaGhRAF65gydF4y2Ba，gydF4y2BaGhRAF80gydF4y2Ba和gydF4y2Baghmekk30gydF4y2Ba在D亚基因组中没有同源基因gydF4y2BaG. Raimondii.gydF4y2Ba，表明这些基因可以在多倍化事件中产生gydF4y2BaGossypiumgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

基因结构和保守蛋白质图案的棉花MapkkksgydF4y2Ba

利用模因程序研究MAPKKK蛋白的保守基序。如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，Ghmapkkk蛋白质拥有10个图案。然后将这些图案进行智能在线服务器进行注释，结果表明，图案1-9属于Pkinase域（PF07714）。此外，大多数Ghmapkkk蛋白质共享类似的主题组合物。另一方面，我们还发现一些Ghmapkkk蛋白质具有不同的主题组合物。例如，Ghraf83缺乏图案8和9，而gydF4y2BaGhRAF4/31/36/50/77gydF4y2BaPkinase域中缺少基序8。仅gydF4y2BaGhZIKgydF4y2Ba其中motif 10属于氧化应激反应激酶1 c端结构域(PF12202)，提示motif 10可能与ZIK组的特异功能有关。gydF4y2Ba

基因的外显子/内含子分布gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba使用GSDS工具进行调查(gydF4y2Bahttp://gsds.cbi.pku.edu.cn/gydF4y2Ba）.我们发现gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba拥有多个外显子和内含子，而gydF4y2BaGhMEKKgydF4y2Ba基因的编码区不包含内含子。来探索基因结构gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba是符合进化关系的，我们对GhMAPKKK蛋白序列进行了系统发育分析。正如预期的那样，我们发现在进化关系密切的基因之间存在着相似的外显子/内含子分布模式(图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

启动子区存在顺式元件gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba

我们分析了gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba更深入地了解他们的角色 从棉花基因组数据库中提取转录起始位点上游的kb序列，并提交给PLACE数据库以研究其顺式元件的分布。在该数据库中观察到许多参与植物发育和环境胁迫反应的顺式元件gydF4y2BaGhMAPKKKgydF4y2Ba发起人(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba桌子。S3）。在157中gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba，97个基因的启动子区含有ABRE（ABA反应元件），22个基因的启动子区含有DREs（脱水反应元件）。这97个基因中的每个基因平均有4个ABRE，而22个基因中的每个基因在启动子区仅含有一个DRE（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba图S2)。以上结果表明gydF4y2BaGhMAPKKKgydF4y2BaS可能在植物反应对干旱胁迫中发挥重大作用。gydF4y2Ba

基因表达模式gydF4y2BaGhMAPKKKgydF4y2Ba棉面巾纸中的SgydF4y2Ba

为了进一步了解gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba，通过分析棉花转录组数据，确定其在棉花组织中的转录模式。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba在各种器官和组织中显示不同的表达模式。此外，一些人gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba在棉花的特定组织中高度表达。例如，抄本gydF4y2BaGHRAF5 / 25/36 / 72/78 / 81gydF4y2Ba这些基因主要在雄蕊中积累，表明这些基因可能是雄蕊生长发育所必需的gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba在某些营养器官中有较高的转录本积累。例如，更高的表达水平gydF4y2BaGhRAF32/78gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhZIK7/18gydF4y2Ba在根中检测到，而gydF4y2BaGhMEKK17/25/44gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhZIK23gydF4y2Ba在叶片中表现出较强的表达。上述结果表明gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba可能参与棉花的生长和发展。gydF4y2Ba

表达概况gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba棉花在不同非生物胁迫下的生长gydF4y2Ba

调查是否gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba是应激反应调节蛋白，我们检测到的表达模式gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba在各种非生物胁迫下的棉花叶片中。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，表达最多gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba是由非生物胁迫诱导的。此外,更多的gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba渗透胁迫(PEG处理)和高盐胁迫比热胁迫和冷胁迫更能显著地诱导叶片衰老。需要注意的是渗透诱导的表达gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba在大多数情况下，棉花叶片在高盐胁迫下也会增加。例如,gydF4y2Baghraf2.gydF4y2Ba，gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba，gydF4y2BaGhRAF48gydF4y2Ba，gydF4y2BaGhRAF50gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhZIK8gydF4y2BaPEG和盐处理12 h对棉花的诱导作用显著。此外,一些gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba棉花在冷热处理下也会产生。例如，的表达gydF4y2Baghraf3.gydF4y2Ba，gydF4y2BaGhRAF49gydF4y2Ba和gydF4y2Baghmekk38gydF4y2Ba在棉花下在冷处理下增加12小时，而转录物gydF4y2Baghraf7.gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhMEKK45gydF4y2Ba在热处理下棉花增加6小时。gydF4y2Ba

据报道，MAPKKKs参与了植物抗旱。例如，过度表达烟草gydF4y2BaNPK1gydF4y2Ba增加了转基因植物抵御干旱胁迫的能力[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]．阐明…的可能功能gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba在棉花抗旱性中，基因的转录模式gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba本研究利用抗旱棉花品种J-13的叶片分别在干旱处理0、2、4、6和8 d后的转录组数据进行分析[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]．表达最gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba通过干旱治疗诱导棉花叶子。但是，转录水平gydF4y2BaGhRAF18gydF4y2Ba，gydF4y2BaGhRAF50gydF4y2Ba，gydF4y2BaGhRAF69gydF4y2Ba和gydF4y2Baghmekk39.gydF4y2Ba在干旱胁迫下，棉花叶片的叶绿素含量降低。此外，表示gydF4y2BaGHMEKK12gydF4y2Ba，gydF4y2Baghmekk31.gydF4y2Ba和gydF4y2Baghmekk36.gydF4y2Ba是在干旱胁迫下持续诱导的，而一些gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba仅在一两个干旱时期就增加了(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.此外，我们还发现了一些gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba包含其启动子区域的DRE元素（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba图S2)，并关注这些基因的表达。然而，只有表达gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba和gydF4y2BaGHMEKK12gydF4y2Ba干旱胁迫对棉花的诱导作用很强（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

为了证实转录组数据的结果，我们进一步检测了gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba通过定量RT-PCR分析干旱处理下棉花幼苗的生长状况。如图所示。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba干旱处理2-8天后，棉花幼苗中检测到的大多数基因都增加了 在干旱胁迫下，许多基因表现出相似的表达模式，例如gydF4y2BaGhMEKK40、GhRAF8 GhRAF21gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhRAF78gydF4y2Ba在2-4天的干旱下，在棉花幼苗中积累，但在随后的6-8天干旱后，它们的表达水平降低。表达式gydF4y2BaGHMEKK10gydF4y2Ba，gydF4y2BaGHMEKK24gydF4y2Ba，gydF4y2Baghmekk36.gydF4y2Ba和gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba在干旱胁迫下在棉花逐渐增加，达到第8天的峰值。上述结果表明gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba可参与棉花反应和对干旱胁迫的抵抗力。gydF4y2Ba

沉默gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhMEKKgydF4y2Ba12降低了棉花对干旱胁迫的抵抗力gydF4y2Ba

基于的转录水平gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba在棉花干旱胁迫下，我们推断一些gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba可以参与棉花反应对干旱的压力。因此，我们雇用了Vigs技术来研究的功能gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba在干旱胁迫下棉花。作为转录水平gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba和gydF4y2BaGHMEKK12gydF4y2Ba在干旱治疗下棉花显着增强（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)，我们选择了这两个基因进行VIGS实验。在感染10天后，具有gydF4y2BaTRV2: GhCLAgydF4y2Ba展示白化性表型（图。gydF4y2Ba8gydF4y2Baa），表明Vigs实验的成功。定量RT-PCR分析显示表达gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhMEKKgydF4y2Ba12明显抑制gydF4y2BaTRV2：GHRAF4.gydF4y2Ba和gydF4y2BaTRV2：GHMEKK12.gydF4y2Ba植物，与对照组相比（图。gydF4y2Ba8gydF4y2Bab） 。四周后，目标基因沉默(gydF4y2BaTRV2：GHRAF4.gydF4y2Ba和gydF4y2BaTRV2：GHMEKK12.gydF4y2Ba)和控制(gydF4y2BaTRV2：00gydF4y2Ba)植物受到干旱胁迫。水分亏缺处理15天后gydF4y2BaTRV2：GHRAF4.gydF4y2Ba和gydF4y2BaTRV2：GHMEKK12.gydF4y2Ba植株表现出比对照更严重的萎蔫（图。gydF4y2Ba8gydF4y2Bac).进一步分析表明，复水后，目标基因沉默植株的存活率与对照植株有显著差异。复水3 d后，对照植株的生长状况逐渐恢复正常，但只有66%的TRV2:gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba和50% TRV2:gydF4y2BaGHMEKK12gydF4y2Ba植物存活了下来（图。gydF4y2Ba8gydF4y2BaC）。此外，我们测量了几种生理指标，包括MDA和脯氨酸含量，并在干旱治疗和正常生长条件下进行的SOD和POD活性。如图所示。gydF4y2Ba8gydF4y2BaD-G，在正常生长条件下，gydF4y2BaTRV2：GHRAF4.gydF4y2Ba和gydF4y2BaTRV2：GHMEKK12.gydF4y2Ba植物没有表现出任何不同gydF4y2BaTRV2：00gydF4y2Ba控制植物。然而，在扣缴水后15天后，MDA含量增加，但在TRV2中降低了脯氨酸含量和SOD和POD活性：gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba和gydF4y2BaTRV2：GHMEKK12.gydF4y2Ba植物，相比之下gydF4y2BaTRV2：00gydF4y2Ba此外，在正常生长条件下，目标基因沉默植物与对照植物的土壤和叶片中的相对含水量没有显著差异。相反，目标基因沉默植物的叶片和土壤中的相对含水量显著低于对照植物er干旱处理（图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba设定h)。在正常生长条件下，目的基因沉默植株的气孔开度与对照植株相似。然而，在干旱处理下，靶基因沉默植株的气孔比对照植株的气孔开得更大。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba总之，上述结果表明TRV2的渗透调节能力和耐旱性：gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba和TRV2：gydF4y2BaGHMEKK12gydF4y2Ba植物可能因干旱而衰弱gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba或gydF4y2BaGHMEKK12gydF4y2Ba基因沉默。gydF4y2Ba

MAPKKKgydF4y2Ba在一些植物物种中，基因家族已被广泛分析[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]．然而，关于棉花的信息gydF4y2BaMAPKKKgydF4y2Ba到目前为止，基因家庭相对稀缺。在这项研究中，我们将发布的rapidopsis mapkkks作为查询来搜索普通棉花（gydF4y2Ba棉花gydF4y2Ba)基因组数据库，鉴定出157gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba在棉花基因组中，系统发育分析表明gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba可分为三组(包括87个RAFs, 46个MEKKs和24个ZIKs)。基因结构和基序组成分析表明，同一类群内大多数GhMAPKKKs具有相似的基因结构和基序分布。然而，一些ZIKs和MEKKs基因也有特定的motif组成，而一些MEKK基因在开放阅读框中不包含内含子。基因复制事件在植物基因组变异中起着重要的作用，它导致了新基因的产生和基因调控途径的产生。基因复制(包括串联基因复制和节段基因复制)是基因家族扩大的主要驱动因素[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]．我们的分析表明，节段复制是促成扩张的主要驱动力gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

为了进一步理解gydF4y2BaGhMAPKKKgydF4y2Ba在不同的环境胁迫下，我们研究了棉花启动子区顺式元件的分布gydF4y2BaGhMAPKKKgydF4y2BaS，并观察到大量与植物非生物胁迫反应相关的顺式元件，表明gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba可以参与对非生物胁迫的棉花的调节。gydF4y2Ba

为了更好地理解gydF4y2BaGhMAPKKKgydF4y2Ba在棉花生长和非生物胁迫耐受性中，我们研究了表达gydF4y2BaGhMAPKKKgydF4y2Ba在正常条件和多种非生物胁迫下，棉花组织中S的变化。的表达式概况gydF4y2BaGhMAPKKKgydF4y2Ba在干旱胁迫下的叶片中的基因是从我们实验室的转录组数据获得的，我们也检测到转录水平gydF4y2BaGhMAPKKKgydF4y2Ba通过定量RT-PCR来验证之前的转录组数据。转录组数据和定量RT-PCR分析表明，表达量最多gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba表明这些基因可能与棉花对干旱的反应和抗旱性有关。gydF4y2Ba

调查的角色gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba在棉花耐湿度下，两个沉默gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba，gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhMEKKgydF4y2Ba12、被执行。结果表明，沉默gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhMEKKgydF4y2Ba12降低了棉花对干旱胁迫的抵抗力。此外，测定了干旱胁迫下叶片MDA和脯氨酸含量、SOD和POD活性以及叶片和土壤相对水分含量等生理指标。结果表明，在干旱胁迫下，vigs沉默植株的SOD和POD活性低于对照。干旱胁迫下，沉默植株中脯氨酸含量较低，MDA含量高于对照。在干旱胁迫下，沉默植株叶片和土壤的相对含水量均低于对照。干旱胁迫可导致活性氧(ROS)的过量产生，导致膜脂过氧化、生理过程紊乱和程序性细胞死亡[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．因此，去除过剩的ROS是植物抵御干旱胁迫的关键过程[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．SOD和POD是ROS-清除系统中的必需酶，在干旱胁迫下植物中的活动增加了它们的活性[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]．在vigs沉默的棉花中，MDA含量升高，SOD和POD活性降低，表明其清除ROS的能力可能受到了损害。类似地，以前的研究也报告说gydF4y2BaMAPKKKsgydF4y2Ba通过调节ROS的积累与植物抗旱性有关[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]．脯氨酸是一种无毒的渗透剂，参与植物细胞的渗透调节。为了维持原生质体胶体的稳定性，在干旱胁迫下，植物细胞通过积累脯氨酸来增加渗透压[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]在本研究中，干旱胁迫诱导棉花中脯氨酸的积累，从而增强了植物的渗透调节能力。VIGS沉默棉花中脯氨酸的较低积累表明这些植物的渗透调节能力因沉默MAPKKK基因而减弱。在干旱胁迫下，植物通常会降低开放度限制细胞失水的气孔结构[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]．在本研究中，我们的数据显示，在干旱胁迫下，vigs沉默的棉花植株的气孔比对照更宽，表明沉默gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba和gydF4y2BaGHMEKK12gydF4y2Ba影响气孔关闭，从而增加植物水分流失。gydF4y2Ba

在本研究中，我们全面确定了其进化关系、基因结构、基序分布、顺式元件分散和表达gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba棉花在正常条件和各种非生物胁迫下的生长。数据表明，该序列特征gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba都是保守和多样化的。此外，两个角色gydF4y2BaGhMAPKKKgydF4y2Ba基因（gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba和gydF4y2BaGHMEKK12gydF4y2Ba)，利用VIGS技术研究了干旱胁迫下棉花中显著诱导的表达。沉默gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba和gydF4y2BaGHMEKK12gydF4y2Ba棉花对干旱胁迫的敏感性增加。因此，我们在这里提供的数据可能为进一步研究的作用建立一个良好的基础gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba对棉花对干旱胁迫的反应进行了详细研究。gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

棉(gydF4y2Ba棉花gydF4y2Ba简历。Coker312)本实验室提供的种子用10%双氧水表面消毒1.5 h，然后用无菌水冲洗3次。无菌种子在无菌水中浸泡10-12 h，然后盆栽，在控制条件(25°C, 16 h光照/8 h黑暗)下生长。棉花幼苗生长约10天后，将子叶完全展开的棉花幼苗进行病毒诱导基因沉默(VIGS)试验。gydF4y2Ba

序列检索gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba

在棉花(gydF4y2Bag .分子gydF4y2BaL.，品种TM-1 (AD1)基因组数据库(gydF4y2Bahttps://www.cottongen.orggydF4y2Ba）.识别gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba，拟南芥MAPKKK蛋白作为查询，搜索棉花(gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba)数据库。然后，为了证明blast结果的准确性，对所有预测的蛋白序列进行InterproScan程序和Pfam工具(gydF4y2Bahttp://www.sanger.ac.uk/software/pfam.gydF4y2Ba)来验证激酶结构域的存在[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]．随后，我们利用ProtParam工具估算了棉花MAPKKK蛋白的基本性质(gydF4y2Bahttp://www.expasy.org/tools/protparam.html.gydF4y2Ba)，并利用TARGETP1.1预测棉花MAPKKs的亚细胞定位(gydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/targetp/gydF4y2Ba)和WoLF PSORT (gydF4y2Bahttp://wolfpsort.seq.cbrc.jpgydF4y2Ba)项目gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

系统发育分析gydF4y2Ba

利用拟南芥和棉花的MAPKKK蛋白序列，利用Cluster X软件进行多序列比对。然后利用mega6.0软件根据多序列比对结果构建无根系统发生树，将系统发生树提交到ITOL (gydF4y2Bahttp://itol.embl.de/gydF4y2Ba）形成互动树。gydF4y2Ba

基因结构分析和保守的主题识别gydF4y2Ba

棉花MAPKKK基因组序列及其编码区gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba)基因组发送至基因结构显示服务器(gydF4y2Bahttp://gsds.cbi.pku.edu.cn/gydF4y2Ba)研究它们的外显子/内含子分布[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]所有MAPKKK蛋白均接受模体诱导（MEME）在线程序(gydF4y2Bahttp://meme.sdsc.edu/meme/intro.htmlgydF4y2Ba)来预测保守基序。InterProScan (gydF4y2Bahttp://www.ebi.ac.uk/tools/Interpro-scan/gydF4y2Ba)，用以批注已识别的主题[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

染色体定位和基因重复分析gydF4y2Ba

它们的核苷酸序列gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba被担任查询Blastn搜索棉花（gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba)获取染色体位置信息的基因组数据库。接下来，我们检测了gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba基于前人研究的原理:(1)比对覆盖了>长度基因的70%;(2)对齐区域具有恒等> 70% [gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．使用Circos-0.69软件可视化染色体定位和基因复制[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]．使用Blast version 2.2.9鉴定陆地棉花及其祖先A和D二倍体棉花的基因组间的同源基因对[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]．然后，使用McScanx来识别同源地区[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

基因启动子区顺式元件的分布gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba

为了确定顺式元素在启动子中的排列gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba，我们找回了2个 基因转录起始位点的kb上游序列gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba并提交它们来放置数据库（gydF4y2Bahttp://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/gydF4y2Ba)来研究顺式元件的分布。gydF4y2Ba

表达分析gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba在正常条件和不同非生物胁迫下棉花组织中gydF4y2Ba

我们下载了棉花的相应转录组数据（gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba) NCBI的TM-1 (gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA248163gydF4y2Ba）.使用TopHat2将reads定位到棉花参考基因组(v2.1)，并使用Cufflinks (gydF4y2Bahttp://cole-trapnell-lab.github.iocufflinks/gydF4y2Ba） [gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

表达分析gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba干旱胁迫下gydF4y2Ba

在之前的研究中，我们对干旱处理的棉花进行了转录组测序(RNA-seq) [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]．使用TOPHAT 2.1.1映射到参考TM-1基因组（V2.1）的参考TM-1基因组（V2.1），并用袖扣2.2.1进行基因表达的定量（gydF4y2Bahttp://cole-trapnell-lab.github.iocufflinks/gydF4y2Ba)通过使用GTF注释文件[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

用于检测的表达gydF4y2Baghmapkkks.gydF4y2Ba采用定量RT-PCR方法对干旱胁迫下的棉花进行分析。棉(简历。幼苗在土壤中生长，经过干旱处理。然后分别在干旱胁迫后0、2、4、6、8 d采集幼苗叶片进行RNA提取。采用基因特异性引物进行定量RT-PCR分析(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S4）。用2.5%的数据计算候选基因的相对表达值 − ∆Ct方法和管家基因gydF4y2BaGhUBI1gydF4y2Ba（EU604080）用作内部控制。实验用三种生物重复进行。gydF4y2Ba

来自转录组数据和定量RT-PCR分析的基因表达的折叠变化是在干旱处理中棉中基因表达值与正常条件下的基因表达值相同（对照）[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]．然后利用Excel软件的CORREL公式计算相关系数R值。gydF4y2Ba

棉花VIGS的载体构建与程序gydF4y2Ba

病毒诱导的基因沉默（Vigs）实验是通过如前所述的方法进行的[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]．片段(400 bp)gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba和gydF4y2BaGHMEKK12gydF4y2Ba插入TRV2载体生成TRV2:gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba和TRV2：gydF4y2BaGHMEKK12gydF4y2Ba分别构造。所有相关引物均在附加文件中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S3。TRV1 TRV2gydF4y2Ba: GhRAF4gydF4y2BaTRV2:gydF4y2BaGHMEKK12gydF4y2Ba和TRV2gydF4y2Ba: CLA1gydF4y2Ba（Cloroplastos Alterados 1）将构建体转移到gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2Ba应变GV3101。然后,gydF4y2Ba农gydF4y2Ba用trv1和gydF4y2Ba农gydF4y2Ba包含TRV2：00，TRV2：gydF4y2Baghraf4.gydF4y2BaTRV2:gydF4y2BaGHMEKK12gydF4y2Ba或TRV2:CLA1以等量混合并在28℃孵育 3摄氏度 h、 将混合农杆菌溶液渗透到10天龄棉花幼苗的子叶中，生成对照（TRV:00）和对照gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba(和:gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba),gydF4y2BaGHMEKK12gydF4y2Ba(和:gydF4y2BaGHMEKK12gydF4y2Ba)沉默的棉花植物。和:gydF4y2BaCLA1gydF4y2Ba作为阳性对照。和富时:gydF4y2BaCLA1gydF4y2Ba植物出现白生表型，表明基因已被沉默。随后，表达gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba和gydF4y2BaGHMEKK12gydF4y2Ba和:gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba和:gydF4y2BaGHMEKK12gydF4y2Ba通过定量RT-PCR分析检测沉默植株和野生型对照，然后对四周龄的沉默棉花植株和野生型对照进行水分亏缺处理，实验采用三个独立的生物复制。gydF4y2Ba

表达分析gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhMEKKgydF4y2Ba12在VIGS和控制工厂gydF4y2Ba

研究TRV2中的基因表达:gydF4y2Baghraf4.gydF4y2Ba和TRV2：gydF4y2BaGhMEKKgydF4y2Ba用12株棉花幼苗的第三片真叶提取总RNA。然后用RNA逆转录试剂盒(AMV, version 3.0, TaKaRa, Shuzo, Otsu, Japan)将RNA逆转录为cDNA。采用基因特异性引物进行定量PCR(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S4)。管家基因gydF4y2BaGhUBI1gydF4y2Ba（EU604080）用作内部控制。实验用三种生物重复进行。gydF4y2Ba

干旱胁迫相关生理参数的测定gydF4y2Ba

采用丙二醛定量检测试剂盒(南京建城生物工程研究所，南京，中国)测定0.1 g棉花叶片组织丙二醛(MDA)含量。对于脯氨酸含量的定量，制备0.1 g棉花叶片样品，按照脯氨酸定量试剂盒生产厂家(南京建城生物工程研究所，中国南京)所述程序进行。叶片相对含水量的测定方法为Barrs和Weatherley [gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]．用过氧化物酶(POD)检测试剂盒和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒的生产厂家(南京建城生物工程研究所，中国南京)对受胁迫植物和对照进行过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)检测。利用显微镜观察了正常条件下和干旱处理下棉花叶片的气孔大小，测定了气孔长宽比(gydF4y2BangydF4y2Ba>每个样品50个气孔)。gydF4y2Ba

当前研究中使用的所有数据都包含在这篇发表的文章中，或者在合理的要求下可以从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

MAPKKK：gydF4y2Ba

丝裂原活化蛋白激酶gydF4y2Ba

挂钩:gydF4y2Ba

聚乙二醇gydF4y2Ba

中收取:gydF4y2Ba

病毒诱导的基因沉默gydF4y2Ba

ABRE:gydF4y2Ba

脱落酸 - 响应元件gydF4y2Ba

Dre：gydF4y2Ba

脱水反应元素gydF4y2Ba

RT-PCR：gydF4y2Ba

逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba

MDA：gydF4y2Ba

丙二醛gydF4y2Ba

草地：gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶gydF4y2Ba

圆荚体:gydF4y2Ba

过氧化物酶gydF4y2Ba

活性氧：gydF4y2Ba

活性氧物种gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

农业部转基因工程资助项目(No. 2016ZX08009-003);国家重点研发计划项目(No. 2016YFD0100505)。关键词:土力学，抗剪强度，抗剪强度作者声明，资助机构在研究设计、数据收集和分析以及手稿准备中没有任何作用。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 华中师范大学生命科学学院遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室，武汉，430079gydF4y2Ba

   张景波、王心鹏、王亚超、陈一豪、罗景文、邓迪、李雪宝gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

XBL和JBZ构思和设计了研究;JBZ，XPW，YCW，YHC，JWL和DDL进行了实验;JBZ和XBL分析了数据并写了论文;所有作者均阅读并批准了手稿。gydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

通信gydF4y2BaXue-Bao李gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

道德认可和参与同意gydF4y2Ba

棉是一个广泛种植的常见作物。gydF4y2Ba本研究不包含任何需要伦理同意或批准的研究。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

竞争利益gydF4y2Ba

提交人声明，所有提交人均无任何利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意事项gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中，除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中，并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途，你将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条中提供的数据，除非数据信用额度中另有规定。gydF4y2Ba

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