燕麦胚乳皱纹1转录诱导油脂积累对小麦胚乳代谢的转变

背景

谷物，包括小麦(小麦L.)，是食物和饲料的主要来源，在温带地区以小麦为主。这些最终用途利用了谷物淀粉胚乳中的储存储量，而淀粉是大多数谷物品种的主要储存成分。然而，燕麦(燕麦属漂白亚麻纤维卷L.)的不同之处在于淀粉胚乳储存了大量的油脂。因此，了解淀粉和油等储存化合物组之间碳分配的控制，对于了解谷物的组成及其最终使用质量非常重要。皱纹1是一种已知诱导三酰甘油(TAG;油)在几种植物贮藏组织中积累。

结果

燕麦的胚乳同源物WRI1(AsWRI1)表达自胚乳特异性HMW1Dx5启动子导致小麦籽粒碳分配发生剧烈变化，籽粒重降低，种子表型起皱。水稻成熟籽粒胚乳淀粉含量AsWRI1与对照相比，小麦减少了(干重(dw)从62%减少到22%)，TAG增加了9倍(油分(dw)从0.7增加到6.4%)，蔗糖从1.5增加到10%。的表达AsWRI1在小麦籽粒中还可形成多层细长的外周糊粉层细胞。rna测序，脂质分析，以及脉冲追踪实验¹⁴c -蔗糖表明脂肪酸的无效循环可能是油脂积累的限制因素。

结论

我们的数据表明，燕麦胚乳的表达WRI1在小麦胚乳中导致代谢的变化，这可能是生物技术应用于控制籽粒成分的基础。特别是，在小麦胚乳中对淀粉合成的显著影响表明，WRI1的一个重要的间接作用是在积累油脂的植物储存组织中转移淀粉生物合成中的碳分配。

谷物是世界上最重要的食物和饲料植物来源，在小麦种植区，小麦提供了人类消耗的总热量的20%至50% [1］．小麦的主要部分是胚乳，约占小麦的90% (小麦)籽粒干重(dw)，包括一层外层糊粉细胞(约占籽粒重的6.5%)，围绕淀粉胚乳(约占籽粒重的83%)，胚乳是主要的贮粮组织[2］．少量油(三酰甘油;TAG)储存在胚胎和糊粉细胞中，再加上少量的淀粉胚乳，总脂含量约为籽粒重重的3% [3.］．

相比之下，燕麦(燕麦属漂白亚麻纤维卷)是谷物中唯一能储存大量油脂的品种(按每粒重计可达18%)，其中大部分油脂沉积在淀粉胚乳中[4，5，6，7］．由于全球对植物油生产的需求不断增加，提高谷物的含油量是值得关注的，而且还可以改善营养质量，从而扩大其用途[8，9］．高油玉米的发展(玉米L.)品种的增加主要是由于胚比例和胚油含量的增加[10］．然而，小麦胚并没有被广泛食用，当谷物被碾磨成白面粉时，它就会消失在麸皮中(在大多数国家，如英国，白面粉仍然是小麦的主要食用形式，占面包面粉的90% [11])。因此，探索改变碳分配以增加淀粉胚乳含油量的策略具有重要意义。

转录因子可以调节代谢开关中的整个遗传程序，是植物碳代谢重编程的重要工具。wr1是一种转录因子，对种子油脂积累起关键作用。它最初是在拟南芥中发现的[12，13]并且在其他植物的贮藏组织中也发现了同源物[14，15，16，17，18，19]，包括燕麦淀粉胚乳[20.，21，22］．植物中的TAG生物合成途径涉及多个亚细胞细胞器，其中脂肪酸在质体中重新产生，并运输到内质网，在那里它们被酯化成甘油主干，形成TAG [23，24］．已知WRI1的基因靶点参与糖酵解和脂肪酸合成，并增加了TAG合成碳前体的可用性[13，25，26］．过度的WRI1在一些双子叶植物的种子中，已经积累了大量的油脂，导致其油脂含量增加了10-40% [12，14，19，27，28］．此外，马铃薯的油脂积累(茄属植物tuberosumL.)通过拟南芥的结节特异性表达诱导块茎实质WRI1［29］．相比之下，试图通过延长玉米胚的表达来增加玉米的含油量WRI1玉米胚乳ZEIN启动子中的淀粉胚乳同源物不会导致组织中油脂的积累[30.］．

在这里，我们确定了分子，生化和形态的变化，在发育的小麦籽粒中，油的积累是由燕麦胚乳同源物过表达诱导的WRI1来自淀粉胚乳特异性启动子。本研究不仅证明了生产高含油量白面小麦新品种的可行性，而且有助于我们理解谷物胚乳碳分配的调控机制。

种子表型皱褶，种子重量减少，糊粉层细胞多层

成熟粒由纯合子形成AsWRI1不同基因插入数(1、2或12)的小麦系，表S1)与相应的奇偶(null)分离子相比，显示出褶皱种子表型(图S1)，如图中有12个插入的行所示。1a - b。开花后26天的颖果外观肿胀(图2)。1C-d)，当用手术刀切开颖果时，一种清澈的水状液体渗出。在光学显微镜下，颖果的淀粉胚乳体积大大减少，在显微镜下，有一个空腔(图2)。1E-f)，但其中含有所述的透明液体。然而，胚乳在籽粒周围似乎是完整的。

成熟籽粒的重量AsWRI1在有12个插片的品系中，-小麦减少了29%，但在其他纯合子品系中，与零品系相比，-小麦没有受到影响。2a).颗粒直径无明显变化AsWRI1-小麦系(图;2b).晶粒硬度指数大大降低，多次插入线最多降低67%AsWRI1与对照组相比(图;2c).多插线成熟晶粒也易碎易裂。测量的其他晶粒参数为面积、长度和宽度，其中只有后者均有显著增加AsWRI1与空行相比(图。2d-f)。种子发芽率与零株无差异(图S2)。

在26 dpa光镜下观察颖果切片，发现外围糊粉层细胞细长，部分位置呈多层状，蛋白质含量高，被浅绿色染成绿色AsWRI1与对照组相比，只有单层长方体外周糊粉层细胞存在(图2)。3.模拟)。谷物糊粉细胞通常是油稠的，苏丹黑(一种脂质特异性染色)证实了它们的高脂含量(图。3.情况)。在发育后期的冷冻断裂晶粒的扫描电子显微镜证实了表型AsWRI1-小麦显示细长的外周糊粉层细胞(图;3.I和j)。

燕麦胚乳WRI1诱导小麦胚乳油脂积累

为了排除胚油的贡献(胚油约占全麦籽粒的3%，但在所有谷物中通常是油密集的)，从小麦籽粒中切除胚，留下以后称为胚乳的剩余部分(即含有大部分淀粉胚乳，以及糊粉层、种皮和果皮的相关部分)。16个纯合子中有12个成熟粒胚乳总脂肪酸含量显著增加AsWRI1-小麦线与相应的空分离线(图S3.)。对总脂肪酸含量最高的4个品系的分析表明，脂肪酸含量的增加主要是由于TAG含量的增加(图2)。4a).插入12个基因拷贝的品系TAG含量明显高于插入1、2个基因拷贝的品系。纯合子株系中，极性脂类和其他脂类(即主要是单酰甘油和二酰甘油)含量分别在2个和3个株系中增加。4b和c)，尽管可以注意到这些脂质的绝对水平比TAG低得多。

对两个纯合子品系(分别有1个和12个插入基因拷贝，以下分别称为单插入品系和多插入品系)在籽粒发育过程中的分析表明，与零品系相比，TAG含量在10 dpa时就已经较高，后期差异更大(图2)。5a).籽粒成熟时，多插系TAG含量比零线高9倍以上(dw为6.4%，0.7%)。在整个籽粒发育过程中，多插系的极性脂质含量较高，随成熟度增加2倍(图2)。5b).游离脂肪酸和其他酰基脂的含量高达7倍AsWRI1-小麦线与零线的比较(图。5c - d)。脂肪酸分布变化最大的是AsWRI1极性脂质和游离脂肪酸中油酸比例增加(18:1)，亚油酸比例减少(18:2)(图S .小麦系)4)。对TAG也观察到类似的脂肪酸谱变化，但幅度要小得多。

每粒(不包括胚)的含油量增加了5倍以上，从对照组的约0.3毫克TAG增加到多插组的1.6毫克AsWRI1-成熟小麦(根据种子重量和TAG含量计算)。这表明，籽粒含油量以百分比表示的增加并不是由于种子重量的减少。然而，存在多层高度拉长的糊粉细胞AsWRI1 -小麦提出了一个问题，即谷物中TAG含量的增加是否是糊粉细胞增加的结果，而不是淀粉胚乳细胞的增加，这是由于小麦的组织特异性所预期的HMW1Dx5用来驱动的启动器AsWRI1［31］．因此，在26 dpa时，将多插入系和无插入系的籽粒解剖成胚、淀粉胚乳和外层(包括糊粉层)后，确定TAG在籽粒中的分布。

总TAG含量的最大变化出现在淀粉胚乳中，从空白的0.4% dw增加到多插入系的2.1%(图2)。6)。淀粉胚乳是小麦籽粒的主要储存组织，胚乳中含油量增加了4倍以上，这是一种剧烈的代谢变化。TAG含量在胚中最高(dw为14%)，株系间差异不大。由于胚对小麦籽粒总量的贡献很小[2这种油对粮食总含油量的贡献不大。通过解剖制备的谷物的“外层细胞层”包括果皮、种皮和糊粉层，但也包括一些淀粉胚乳组织(即外层细胞层被淀粉胚乳污染)，特别是对AsWRI1-难以解剖的小麦颗粒。该组织的TAG含量在空白组(1.8% / dw)和多插入组(4.5% / dw)之间增加了2.5倍。糊粉细胞通常只占小麦籽粒的一小部分[2］．然而，除了淀粉胚乳中油的含量增加外，糊粉细胞中存在的油也促进了籽粒油含量的增加AsWRI1考虑到糊粉层数增加，淀粉胚乳体积大大减少。可以注意到，在种子发育过程中观察到的透明液体AsWRI1通过薄层色谱分离的总脂质提取物目测，小麦不含任何脂质。

减少淀粉，增加糖

纯合子籽粒胚乳淀粉含量AsWRI1与空白系相比，-小麦系显著减少(图2)。7a).这在18 dpa的多重插入系中已经很明显，但在发育后期更为明显，纯合子系在成熟时淀粉含量比零系减少了50-63%。

籽粒胚乳的蔗糖含量反而大大增加AsWRI1与对照组相比(图;7b).从18 dpa开始，这是明显的，到成熟时，纯合子系的蔗糖含量高达8-10% (dw)，而对照只有1.5%。籽粒的葡萄糖含量变化不大，但在26 dpa的纯合子系中，与对照相比，葡萄糖含量有所增加。7c).果粒中果糖含量较高AsWRI1-表示籽粒，成熟时约为4% / dw，而零线为1% / dw(图2)。7d)。

目的:探讨不同处理对小麦胚乳碳平衡的影响AsWRI1表达，我们计算总碳量作为淀粉等量物在胚乳AsWRI1-小麦和控制。每个胚乳的淀粉量从对照的22毫克下降到多嵌体的5毫克AsWRI1——成熟的小麦。如果淀粉损失的所有碳(17毫克)在胚乳中重新分配到油的合成中，则应增加6.8毫克油(考虑到按重量计算，油的能量含量大约是淀粉的2.5倍)。然而，石油的增加AsWRI1-小麦胚乳与对照组相比仅为每粒1.3 mg。在多重插入中，每个胚乳增加2.5毫克糖(蔗糖、果糖和葡萄糖)AsWRI1小麦解释了淀粉中剩余的部分碳损失，但每个胚乳仍有6.9毫克的差异。蛋白质含量在不同系间无显著差异(图S5)。

脉冲追踪¹⁴蔗糖的碳分配发生了剧烈变化

为了更好地了解碳分配是如何受到表达的影响AsWRI1，¹⁴使用与以前用于研究燕麦和小麦类似的离体系统，对分离穗上发育的种子进行C脉冲追踪标记[32，33，34］．累计净额¹⁴多插系与对照组胚乳中蔗糖的C含量大致相同，约为50000 dpm/粒(图S6)，表明比较的比例分布是有效的¹⁴发育过程中不同颗粒组分间的C。既然净额没有减少¹⁴C标签在追逐期间被观察到，不太可能占显著比例¹⁴在研究的时间间隔内，C标记因呼吸而丢失。

净积累的比例要高得多¹⁴在籽粒胚乳的脂质部分中回收了CAsWRI1-小麦，从脉冲后0小时的8%增加到192小时的20%，而对照组仅为5%(图2)。8a).相比之下，的比例要低得多¹⁴选C。AsWRI1-小麦被分配到淀粉/纤维素部分，与零线相比;在脉冲后0小时，分别为23%和69%，然后在192小时分别增加到42%和86%(图2)。8b).的比例最高(69%)¹⁴C在水/甲醇可溶性部分中被回收AsWRI1相比之下，对照组只有27%(图2)。8c).虽然随着时间的推移，水/甲醇溶解部分逐渐减少，但仍占总量的38%¹⁴选C。AsWRI1-表达线在192小时，相比之下，对照组只有8%。

分析¹⁴C在不同脂类中差异最大的是TAG，其在胚乳中的积累量是前者的6倍AsWRI1-小麦籽粒与0小时时的对照(图S7a).而净积累¹⁴TAG中的C增加AsWRI1-wheat在整个8天的脉冲追逐周期中，它只在零线的两个第一个时间点之间增加。的净积累也出现了类似的模式¹⁴C在游离脂肪酸中，但绝对水平要低得多(图S7c).在其他类型的脂类中没有观察到大的差异(图S7B, d, e)。

转录组学显示脂肪酸合成增加，淀粉合成减少

作为形态学、分析和生化研究的补充，我们使用高通量测序方法测定了多插入体发育籽粒胚乳mRNA的转录水平AsWRI1-wheat行和null行。将Reads定位到TGACv1小麦cDNA组合上，拟南芥蛋白序列(AraPort v11)用于代谢图谱的注释。AsWRI1在分析的最初阶段(10 dpa)高表达，每千碱基百万转录本(TPM)值约为5000，在26 dpa逐渐下降至约100。与零线相比，在多重插入线中，当折叠变化≥2时，基因被定义为上调，当折叠变化≤- 2时，基因被定义为下调。基于基因本体论，与中心碳和脂肪酸代谢相关的差异表达转录本(表S2)用热图绘制(图;9)。

质体中几个参与胞质糖酵解途径和脂肪酸合成的基因显示了转录体丰度的增加AsWRI1与对照(如细胞质的特性,6-BISPHOSPHATASE(AT1G43670.1)，质体定位丙酮酸脱氢酶e1 beta(AT1G30120.1))。与此相关的是转录丰度的增加磷酸烯醇丙酮酸磷酸/ TRANSLOCATOR1(AT5G33320.1)，它参与磷酸烯醇丙酮酸(脂肪酸合成的主要底物)穿过叶绿体内膜的运输。在质体内，参与葡萄糖6-磷酸转化为adp -葡萄糖的几个基因的转录水平下调，这是淀粉的关键前体，如adp -葡萄糖焦磷酸化酶大亚基4(AT2G21590.1)和ISOAMYLASE1(AT2G39930)。两个参与淀粉降解的基因表达上调。

只有少数参与标记生物合成的基因显示了转录水平的增加，最显著的是三酰甘油生物合成缺陷(AT2G19450.1)。与此同时AsWRI1-小麦籽粒中几种表达增加OLEOSINS参与形成贮存TAG所需的油体，例如OLEOSIN 1(AT4G25140.1)。编码标记降解蛋白的转录本(SUGAR-DEPENDENT1, AT5G04040.1)以及几乎所有编码脂肪酸过氧化物酶体β-氧化和相关乙醛酸循环功能的基因都被上调。大多数编码磷酸戊糖途径功能的基因显示了转录体丰度的增加AsWRI1线与控制线的比较。GLUCOSE-6-PHOSPHATE脱氢酶(AT5G40760.1)。

小麦胚乳中碳从淀粉向油的再分配

本研究表明，虽然小麦胚乳中通过表达转录因子皱纹1可以启动并大大增加油脂的积累，但这并不是简单的固定碳向油脂的再分配。分析、生化、显微镜和转录组数据显示，燕麦胚乳对贮藏代谢有显著影响WRI1(AsWRI1)当使用淀粉胚乳特异性启动子过表达时HMW1Dx5在麦粒中。AsWRI1已显示在燕麦淀粉胚乳组织中高度表达[20.]在谷物中，它是独一无二的，能积聚大量的油脂。AsWRI1也已表明，诱导油积累时，瞬时表现为烟草benthamiana(多明)叶子[21］．成熟时，植物的胚乳AsWRI1小麦的TAG含量增加了9倍(从dw的0.7到6.4%)，同时淀粉中的碳积累大大减少(从dw的62%到22%)，蔗糖中的碳比例增加(从dw的1.5到10%)。这些变化可能是观察到的褶皱种子表型的原因，就像在经典的褶皱豌豆中，淀粉合成发生了突变[35］．胚的大小和含油量在两组间无差异AsWRI1与高油玉米品种对照的对照品系[10，36］．

利用基因表达法提高玉米种子油含量的方法WRI1淀粉胚乳中来自玉米胚胎的同源物没有导致该组织中碳分配到油中的任何变化[30.］．相比之下,AsWRI1小麦淀粉胚乳中TAG的表达显著增加了碳在油中的分配，其TAG含量(6% / dw)与燕麦籽粒中常见的TAG含量(3-18% / dw)相似。虽然在多次插插的株系中种子重显著降低AsWRI1主要由于胚乳淀粉含量的减少，成熟时每粒油的总量增加了5倍，表明油的合成能力总体上提高了。虽然在种子中没有特异性表达，但从玉米泛素启动子aWRI1同族体从Brachypodium distachyon在同一品种中，籽粒胚乳组织含油量增加[37]，但与这里报道的小麦相比，这一水平要低得多。对贮藏代谢的影响要大得多AsWRI1小麦籽粒胚乳可能是利用了强淀粉胚乳特异性HMW1Dx5启动子(31]与组成型表达的玉米泛素启动子相比[38］．

虽然AsWRI1每粒胚乳含油量增加了5倍，成熟时种子重量减少了29%。将碳分配到油中而不是淀粉中，可以预期至少会导致种子重量减少，因为以重量为基础的油的能量密度大约是淀粉的2.5倍。然而，成熟籽粒胚乳中油脂含量增加AsWRI1与对照相比，小麦与淀粉中的碳损失不相对应，观察到的糖的增加并不能解释剩余的差异。事实上，与对照相比，多插系成熟籽粒的胚乳每粒总碳(估计为存在于油、淀粉和糖中的碳水化合物当量)减少了45%。另一方面，在体外脉冲追踪分析使用¹⁴不同处理间胚乳净碳积累量无显著差异AsWRI1小麦和籽粒发育中期的控制。这可能暗示了碳汇强度的颗粒表达AsWRI1籽粒发育中期后严重减少。籽粒中蔗糖含量的增加降低了源库间的糖梯度，这可能会对光合产物向籽粒的转运产生负面影响。

光镜下观察发育后期籽粒的淀粉胚乳细胞在表达的籽粒周围是完整的AsWRI1但是，该组织的内部缺乏细胞结构，而是含有一种含水液体，与对照植物中整个颗粒的细胞结构的连续性形成鲜明对比。此外,¹⁴c -蔗糖标记实验表明，碳明显被困在水/甲醇可溶性部分AsWRI1核磁共振(NMR)分析表明，与对照相比，胚乳中蔗糖等可溶性糖的含量大大增加。因此，很可能是碳从糖分配到淀粉严重减少，或淀粉降解增加，在AsWRI1线，导致糖的积累增加，除了增加合成脂类。可以推测，胚乳发育的早期阶段[39]可能在小麦表达中正常发挥作用AsWRI1，但随着时间的推移，大量减少的淀粉合成分配对谷物生理的影响变得更加严重，这可能导致蔗糖的累积。在籽粒发育过程中观察到的这种对代谢增加的影响与用于表达的启动子的时间一致AsWRI1，表达量约为8-10 dpa [31，40］．

对糊粉细胞的影响

小麦中营养物质的积累呈现出一个梯度，不同的谷物组织具有不同的营养成分，这对碾磨和加工有影响[41，42］．谷物胚乳细胞的外层形成糊粉层，与淀粉胚乳细胞不同的是，胚乳细胞壁厚，非面筋蛋白、脂类、维生素和矿物质含量高。在燕麦粒中，储存脂质积聚在淀粉胚乳中，但在外胚乳中含量较多[4，5］．虽然最高的折叠变化在TAG含量AsWRI1籽粒胚乳部分淀粉含量明显高于对照组，外细胞层(包括糊粉层、种皮和果皮)TAG含量的折叠式变化也有助于籽粒整体含油量的增加。显微检查AsWRI1小麦籽粒外周糊粉层细胞形态发生变化，部分部位呈拉长、多层分布。这种影响是惊人的，因为在大多数谷物品种中，包括小麦和燕麦，外围糊粉层只包括一层典型的长方体形状的细胞。在栽培谷物中，只有大麦(大麦芽L.)有多层糊粉层细胞(最多可达四层)[43，44，45]但胚乳细胞发育成糊粉细胞的命运似乎在其他谷物中也表现出可塑性，正如对玉米和水稻突变体的研究所显示的那样[46，47］．观察到的变化AsWRI1-小麦糊粉细胞的表达令人惊讶AsWRI1由高分子量谷蛋白启动子驱动，该启动子已知在小麦籽粒淀粉胚乳中活跃，但在糊粉细胞中不活跃[31］．然而，糖浓度除了作为碳和能量来源外，还一般影响碳汇强度，并在控制植物代谢、生长和发育的信号传递中发挥作用[48，49］．由此可以推测，其胚乳中蔗糖含量较高AsWRI1-小麦籽粒(10% dw)对淀粉胚乳细胞周围糊粉细胞的发育和储存积累有间接影响AsWRI1是表达。

转录组转变和代谢意义

转录组分析显示，在水稻中，参与淀粉生物合成的基因表达下调，而参与淀粉降解的基因表达上调AsWRI1表达小麦胚乳的模式与小麦胚乳诱导油的模式相似AsWRI1和其他WRI1烟叶同源物[21］．淀粉合成基因也被下调WRI1-马铃薯块茎[29］．这表明WRI1的一个重要的间接功能可能是通过转录降低淀粉合成势和淀粉降解来转移淀粉中的碳。因此，大部分蔗糖通过折痕运输到发育中的胚乳[50]可能会积累而不是转化为淀粉，这可能部分解释了在AsWRI1小麦胚乳。更详细的研究AsWRI1与对照相比，单插入或双插入的品系没有表现出种子重量的减少，淀粉含量的减少也较小，这可以进一步了解转录本丰度与储备分配效应之间的关系，以最大限度地减少不必要的表型效应。

我们的转录组分析结果证实了WRI1对编码细胞质糖酵解、从头质体脂肪酸合成以及三磷酸酯跨质体膜运输功能的几个基因的转录调节的影响，这些功能此前已被报道用于双子叶种子、叶组织和马铃薯块茎[21，25，29］．尽管有少数基因编码TAG组装途径的功能在基因中被发现上调AsWRI1我们的结果与之前观察到的wr1对脂肪酸合成的转录调节作用一致，而不是对TAG生物合成的转录调节作用[15，16，51，52］．油苷(油体蛋白)在油体中起结构作用，编码油苷的基因在油体中表达上调AsWRI1-小麦籽粒胚乳。在WRI1-马铃薯块茎[29但不在WRI1-表示叶[21］．

已知高度疏水的游离脂肪酸在微藻和植物中积聚具有细胞毒作用[53，54，55，56］．脂肪酸通常与蛋白质结合，无论是在质体中的从头合成过程中，还是在酰基链的细胞分布过程中(例如进入脂质组装)，从而降低了它们的细胞毒性[23，57］．但在脂肪酸过量的情况下，这种蛋白质可能会限制脂肪酸的降解，从而导致脂肪酸的降解。而与异位堆积的TAGWRI1单子叶和双子叶植物叶片中的表达均被翻转[21，37，58时累积的TAGWRI1在马铃薯块茎中表达29］．转录组分析表明，在不同处理条件下，TAG降解，尤其是脂肪酸过氧化物酶体降解上调AsWRI1小麦胚乳。游离脂肪酸也显示化学和¹⁴c标签分析增加AsWRI1转录组分析表明，这可能是由于TAG降解和高度诱导的从头合成脂肪酸造成的。脂肪酸合成与降解同时增加表明脂肪酸在体内是无效循环的AsWRI1小麦。总而言之，这可能意味着不仅TAG的周转和脂肪酸合成的降解，而且不充分的TAG组装(不能通过增加从头脂肪酸合成来处理构建块的增加可用性)可能是进一步增加的限制因素AsWRI1小麦胚乳。此外，由于谷物内部碳分子的循环增加，脂肪酸的无效循环可能会潜在地减少谷物中的碳输入。

小麦胚乳油脂积累进一步增加

综上所述，我们的数据表明，在不影响种子重量、表达的情况下，将小麦胚乳中的油含量提高到与开发有关的水平AsWRI1还不够。事实上，表达一种已知的将碳分配到油中的转录因子的效果可能因代谢环境而异，特别是植物组织是否具有源或汇特征。在TAG产生过程中编码不同功能的基因的共表达(即WRI1，二酰基甘油ACYLTRANSFERASE1和OLEOSIN)采用推-拉-保护的方法引起烟叶碳代谢的巨大变化，导致含油量以dw计达15% [59］．我们的结果表明，即使我们认为TAG组装途径不会限制TAG在某些植物储存组织中的积累[15，16，51，52]，建议在油菜中限制使用[60它还可能限制谷物淀粉胚乳中的油脂积累。因此，TAG组装可能是一个靶标(即酰基转移酶)，以增加碳分配到油和减少徒劳的循环碳在AsWRI1小麦胚乳。尽管编码油酸蛋白的基因在AsWRI1在小麦胚乳中，进一步增加该组织中的油苷可以保护新形成的TAG不被降解，因为TAG的周转被表明是油含量增加的限制。抑制脂肪酶增加拟南芥和烟草叶片TAG含量[58，61]，抑制脂氧合酶会增加小麦籽粒中的脂肪酸含量[62]，表明这些酶也可以靶向减少TAG的周转，从而提高谷物胚乳的含油量。

我们的数据首次显示了燕麦胚乳表达时代谢模式的变化WRI1小麦胚乳是世界上最重要的食物和饲料来源之一。未来对燕麦和小麦的研究可能会阐明调节谷物胚乳细胞中油脂和淀粉积累所需的发育和代谢途径的机制，而不会将高份额的碳转化为可溶性糖，从而导致不期望的表型效应。

过度表达构造和转换

胚乳的过表达结构WRI1燕麦属漂白亚麻纤维卷(1338bp) [21]在淀粉胚乳特异性的控制下HMW1Dx5启动子(31),高分子量和35S终结者创建使用Sal1/Xba1 .克隆策略。该片段由聚合酶链反应(PhusionTaq聚合酶，Fisher Scientific，莱斯特郡，英国)，使用PCR引物WRI1OEF: CATGTCGACATGAAGAGATCCCCGCC和WRI1 oer: CATTCTAGATCAATTACACACAGTGA。

使用BigDye Terminator 3.1版本循环测序试剂盒(Applied Biosystems, Life Technologies Ltd.， Paisley, UK)，使用结构物特异性引物Rab1: CACAACACCGAGCACCACAAACT和DX5R2: CATTATTACTGGGCTTTACTC(牛津大学生物化学系，英国牛津)对结构物进行测序。通过粒子轰击(PDS1000;Bio-Rad, Hercules, USA)的未成熟鳞片(10 - 14d.p.a)。华彩粒，与pAHC20质粒共轰击，含有可选择标记基因酒吧由玉米的组成型泛素启动子驱动[38]，如Sparks & Jones所述[63］．转化效率为1.7%。

使用Wizard试剂盒(Promega Ltd.， Hampshire, UK)从叶片中提取基因组DNA。用Rab1和Rab1进行PCR检测，证实转基因基因的存在WRI1OER引物25 μl反应，1.1X ReddyMix™PCR Master Mix (1.5 mM MgCl₂)来自Thermo Scientific (ABgene House, Surrey, UK)，每个引物约200 ng DNA和0.8 mM。循环条件:96°C(5分钟),96°C(32×30年代),58°C(30秒),72°C(1.5分钟),72°C(10分钟)。PCR产物用1.0% (w/v)琼脂糖凝胶分析，用溴化乙锭染色，紫外光观察。T1植物材料的合子性分析如Nemeth等所述[64]以鉴定分离模式与单一插入位点一致的转基因株系，从而鉴定出在分离株中具有相应的奇合子null(对照)的纯合子株系(表S .)1， R，复制数;P，植物号)。可以注意到，如果考虑到小麦的六倍体性质，进一步分析了六个单独的品系，这是很重要的。

植物生长和取样条件

源自同一原始过表达转化子(T1)的纯合子和奇合子(零)分离子(T2)在温室(Rothamsted Research, UK)中生长，环境分别为18°C-20°C(白天)和14°C-16°C(夜间)，光周期为16小时，自然光辅以Son-T 400 W钠灯(Osram, Ltd.， Munich, Germany)，光周期为400 - 1000 μmol m⁻²年代⁻¹光合作用的有效辐射生长室(Biotron SLU-Alnarp, Sweden)在250 μmol m的荧光灯下培养T3种子⁻²年代⁻¹)，光周期16 h, 21°C/18°C(昼夜)，湿度70%(分离的小麦穗也在该箱中培养)。穗被标记为在特定发育阶段收获的花和谷物。胚胎与谷物分离，剩下的部分被称为“胚乳”(包括淀粉胚乳、糊粉细胞、种皮和果皮)。一个生物复制指的是一株植物。样品被快速冷冻成N₂(l)保存在−80°C。植物组织在钢容器中研磨，在N₂(l)使用混合磨机(Retsch, Haan, Germany)， 30hz (15 s, 12 mm钢珠)，保存在−80°C并在代谢产物分析之前冷冻干燥。

纹理分析

颗粒测量(面积、长度和宽度)使用Marvin数字种子分析仪确定，使用来自三个生物重复的100个颗粒(CGTA Sensorik GmbH, Neubrandenburg, Germany)。硬度和单个种子重量使用Perten模型单核表征系统4100 (Perten仪器，Calibre Control国际有限公司，沃灵顿，英国)确定。用3个生物重复的20粒种子进行发芽试验。种子在70%乙醇中洗涤(10分钟)，然后在20%次氯酸盐溶液中洗涤(60分钟)。对于多插系，20%次氯酸盐过于苛刻(种子脆弱)，减少到10%。种子在无菌蒸馏水中清洗，放入90mm的培养皿中，用Whatman 1号湿滤纸，用parafm密封，放置在4°C(2天)以同步发芽。在室温下(20-21°C)培养，5天后，胚根和下胚轴存在，萌发得分(图S2)。

显微镜分析

将颗粒在26 dpa下分离，放入固定液(2% (w/v)多聚甲醛，2.5% (v/v)戊二醛，0.1 M Sørensen磷酸盐缓冲液，pH 7.2)中，搅拌o/n孵育。样品用缓冲液洗涤3 × 15 min，然后用一系列乙醇(每次3 h)脱水。样品使用一系列乙醇:二甲苯(每个12小时)清除，并在模具中铸造前用Histowax Special (histab Products AB, Göteborg，瑞典)在55°C孵育(3 × 24小时)浸润。使用显微刀从块上切割12 μm截面，并安装在玻片上(SuperFrost Plus, Menzel, Fisher Scientific, Waltham, USA)。在室温下，通过二甲苯和乙醇连续洗涤(各5分钟)去除石蜡。将载玻片在室温下用1)浅绿色、卢戈尔溶液和2)苏丹黑染色[65并使用Pertex安装液进行安装。染色切片使用光学显微镜(徕卡，DFC 450C相机)进行分析。对于扫描电子显微镜，使用剃须刀片对小麦颗粒进行标记，以帮助压裂，并将其安装在铝存根上，通过钻一个孔来固定颗粒，使用50:50的OCT化合物(Sakura FineTek)和胶体石墨(TAAB)的混合物进行修改。谷物在N₂(l)并在真空下转移到保持在−180°C的GATAN ALTO 2500冷冻室。样品冷冻断裂，在- 95°C下蚀刻2分钟，并涂上一层薄薄的Au-Pd。样品转移到JEOL 6700F扫描电子显微镜的冷级，保持在−130°C，并在5 kV下成像。

脂质分析

采用改良的Bligh - Dyer法从植物组织中提取脂质[66用0.15 M醋酸代替水。总脂质浸提物在N₂(g)然后甲基化产生脂肪酸甲酯(FAMEs)，或者先用薄层色谱法分离成不同的脂类，然后甲基化。脂质甲基化在2% H中进行₂所以₄在甲醇。采用气相色谱法进行FAME鉴别和定量。有关脂质分析的详细信息，请参见Grimberg等人。67］．值得注意的是，与其他提取方法相比，Bligh和Dyer的提取方法在小麦粉中总非淀粉脂类(如三酰甘油，这是我们研究的主要目标脂类)的提取率最高[68，69］．重复样品á每批T2颗粒中使用3个颗粒(图S3.和无花果。4)， TLC上从3个生物重复中分离出相应的10 mg dw的脂质提取物(图。5)。

淀粉，糖和蛋白质分析

使用总淀粉测定试剂盒(Megazyme, Wicklow, Ireland)在冷冻干燥的胚乳面粉(50 mg)上测定淀粉，首先用80%的乙醇水溶液去除可溶性糖。

糖被定量使用¹上文所述的H-NMR波谱[70］．简而言之，用80:20 D提取冻干面粉样品(15 mg)₂O: CD_3.OD含0.01% w/v d₄-三甲基硅基丙酸作为内标。¹使用Avance光谱仪(Bruker, Coventry, UK)在600.0528 MHz工作，使用选择性反向探针在300 K下获得H-NMR谱。使用水抑制脉冲序列收集光谱，脉冲为90°，弛豫延迟为5秒(128次扫描64,000个数据点，宽度为7309.99 Hz)。光谱进行傅里叶变换¹H化学位移参考δ 0.00处的TSP-d4。¹使用AMIX (Bruker BioSpin)将H NMR谱简化为包含等宽集成区域(0.001 ppm)的ASCII文件。光谱强度被缩放到TSP-d4区域(从δ 0.05到−0.05)。碳水化合物的定量相对于已知浓度的内部标准使用特征峰从一个真实的标准库。

从谷物胚乳中取出4±0.2 mg冷冻干燥种子粉，称入锡胶囊(梅特勒-托莱多XP6)，折叠后用元素分析仪进行分析(Flash 2000, Thermo Scientific)。没有产生_x减为N₂(g)在还原柱中，与CO分离₂在分子筛填充气相色谱柱上，用热导检测器进行分析。使用Eager experience软件(version 1.2, Thermo Scientific)分析数据，确定总氮含量。总蛋白含量估计为Nx6.25。

¹⁴C脉冲追逐实验

小麦穗在开花时被标记，并在14 dpa下与植株分离。茎在70%乙醇(1分钟)，1.0%氯(10分钟)中表面消毒，并在无菌水中冲洗。通过在水下使用手术刀消除空化，茎长缩短至7厘米。将刺钉转移到含有10 mL 1.47 g·L无菌营养培养基的塑料瓶中⁻¹Murashige & Skoog介质，0.5 g·L⁻¹2[N-morpholino]乙烷磺酸，0.5 g·L⁻¹谷氨酰胺，40 g·L⁻¹蔗糖(Duchefa, Harlem，荷兰)。(U - D -¹⁴C]-蔗糖(PerkinElmer, Massachusetts, USA)加入浓度为5700 dpm·nmol的培养基中⁻¹在前48小时内。这¹⁴C脉冲在介质中以尖峰的形式出现¹⁴C-labelled衬底。每隔2天更换营养培养基，新鲜切茎。在给定脉冲(0 h)和192 h后直接从穗的中部取样6个颗粒。谷物在N₂(l)在切断胚胎之前，将胚乳收获到塑料管中，进一步在N中快速冷冻₂(l)保存在−80°C。的决心¹⁴不同胚乳组分的c标记如前所述[33]除了在分离脂类时使用了庚烷:二乙醚:乙酸(70:30:1体积)。

RNA-sequencing

从N研磨的籽粒胚乳中提取总RNA₂(l)使用PureLink植物RNA试剂(Ambion, Foster City, USA)在−80°C保存。总RNA经DNase处理(TurboDNase, Ambion)，使用Experion RNA StdSens分析试剂盒(BioRad, Hercules, USA)测定完整性和浓度，稀释至60-340 ng·μL。样本暴露于Illumina HiSeq2500配对端测序与v4化学(SNP&SEQ技术平台，国家基因组学基础设施，瑞典)。文库用TrueSeq链mRNA文库试剂盒，polyA选择(Illumina)制备。RNA序列数据使用CLC Genomics Workbench v9.5.2进行处理。根据标准设置修剪序列，并将其映射到小麦参考转录组TGACv1(集合基因组[71])，按标准设置。使用CLC Genomics Workbench v9.5.2 (blastx, E-values cut-off≥0.01)对拟南芥蛋白质数据库(AraPort v11)注释小麦参考转录组。基因表达水平以TPM(每千碱基百万转录本)表示。基因的差异表达计算为TPM之间的折叠变化在一个生物复制AsWRI1-小麦和TPM的平均值。基因表达数据采用PathVisio 3.3.0进行可视化[72，73］．

统计分析

使用单因素方差分析(ANOVA)分析代谢物数据，然后进行Fisher检验(p< 0.05, LSD)比较各治疗组均值(Minitab 16)。之所以使用Fisher检验，是因为在数据集中(针对每个发育阶段或组织，转基因品系和对照之间)只有预先定义好的成对比较才有意义。当需要稳定方差并获得统计推断所需的残差的近似正态分布时，在统计检验之前使用自然对数对数据进行转换。

对颗粒参数数据(重量、直径、硬度、面积、宽度和长度)进行方差分析(两条零线与四条纯合子线进行比较，线按类型嵌套进行方差分析)。不需要数据转换，分析后的残差评估显示了对分析假设的广泛确认。使用差异的标准误差(SED)比较合适的均值，从而调用5%水平的最不显著差异(LSD)。利用LSD对转基因R3P8.10和转基因R3P8.12以及转基因R7P2.6和转基因R7P2.11进行了比较。一个假定二项分布的广义线性模型用于具有嵌套类型的行的发芽数据，但注意到一些过度分散(方差高于和超出二项的预期)是由f检验而不是默认的卡方来解释的。使用了Genstat(第18版，VSN国际有限公司，Hemel Hempstead，英国)统计包。

支持本文结论的植物材料和数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

分区:

花后天数

dw:

干重

名声:

脂肪酸甲酯

标签:

Triacylglcyerol

TPM:

每千碱基转录数百万

WRI1:

WRINKLED1

作者要感谢生命科学实验室、国家基因组学基础设施、NGI和Uppmax在大规模并行测序和计算基础设施方面提供的支持。我们也要感谢Delia Corol博士进行代谢物提取，Salla Marttila博士在光学显微镜分析方面的建议，统计学家Jan-Eric Englund博士和Stephen Powers博士在统计分析方面的支持，以及Helén Lindgren, Mirela Beganovic和Niklas Ohlsson对植物的护理。

道德规范，批准和同意参与

不适用。

这项研究由瑞典战略研究基金会(RBP14-0037)、英国生物技术和生物科学研究委员会(BBSRC)、设计未来小麦战略计划(BB/P016855/1)、Crafoord基金会和Einar和Inga Nilsson基金会资助。由瑞典农业科学大学提供的开放获取资金

从属关系

1. 瑞典农业科学大学植物育种系，瑞典阿尔纳普SE-23053

   Åsa格里姆伯格，Per Snell, Anders S. Carlsson & Per Hofvander

2. 洛桑研究所植物科学部，哈潘登，AL5 2JQ，英国

   Mark Wilkinson, Irene González-Thuillier & Peter Shewry

3. 现地址:MariboHilleshög Research AB, Box 302, 261 23, Landskrona, Sweden

   每一个斯奈尔

4. 洛桑研究所计算与分析科学系，哈潘登，AL5 2JQ，英国

   丽贝卡·p·德沃斯，艾哈迈德·陶菲克和简·l·沃德

贡献

实验由Å.G设计。, P.Sn。，M.W., P. Sh, A.S.C. and P. H and were performed by M.W. (gene construct and transgenic plants, seed characteristics), P.Sn., Å.G., and I.G.T. (lipid analyses), P.Sn. and Å.G. (¹⁴C实验，淀粉分析，转录组和光学显微镜)，R.P.V.(电子显微镜)，J.L.W.和A.T.(糖分析)。数据是由进行实验的同一个人分析的。用P.Sn对RNA-seq进行处理和分析。A.G.和P.Sn。写了文章的初稿。A.G.协调写作。所有作者都对写作做出了贡献。P. Sh和P. h .编辑了文章的草稿。 P.H. supervised the study. The author(s) read and approved the final manuscript.

相应的作者

对应到Asa Grimberg．

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有利益冲突。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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