高油烟(烟草通过crispr - cas9介导的敲除NtFAD2-2

背景

烟草籽油可作为生产生物柴油的合适原料。然而，烟草籽油的高亚油酸含量使其容易氧化。通过提高油酸含量来改变脂肪酸谱，可以改善烟草籽油生物柴油的性能。

结果

四个FAD2的基因,NtFAD2-1a，NtFAD2-1b，NtFAD2-2a,NtFAD2-2b，在烟草异源四倍体基因组中鉴定。蛋白质序列的系统发育分析表明NtFAD2-1a和NtFAD2-2a起源于n tomentosiformis,而NtFAD2-1b和NtFAD2-2b从n的抗旱性。表达分析显示NtFAD2-2a和NtFAD2-2b在发育中的种子中转录本比在其他组织中更丰富NtFAD2-1a和NtFAD2-1b在发育中的种子中转录物水平较低。系统发育分析表明NtFAD2-2a和NtFAD2-2b是seed-typeFAD2基因。在酵母细胞中的异源表达表明，NtFAD2-2a和NtFAD2-2b蛋白都可以在Δ上引入双键¹²脂肪酸链的位置。烟草脂肪酸谱分析fad2-2由CRISPR-Cas9编辑的植物衍生的突变种子显示油酸含量从11%急剧增加到79%以上，而亚油酸从72%下降到7%。此外，叶片脂肪酸组成不受影响fad2-2突变体植物。

结论

我们的数据显示，敲除种子型FAD2烟草种子油中油酸含量显著增加。本研究提示CRISPR-Cas9系统为烟草种子脂质工程提供了一种快速高效的方法。

烟草(烟草作为一种传统上用于制造香烟的工业作物，世界各地都在种植。最近，烟草籽油已被证明是生产生物柴油的合适原料[1，2，3.，4]。烟草是一种油籽植物，含油量为种子干重的36%至41% [5，6]。烟草籽油的脂肪酸组成主要为棕榈酸(8.83 ~ 12.3%)、硬脂酸(2.1 ~ 3.3%)、油酸(9.97 ~ 11.69%)和亚油酸(64.38 ~ 75.9%)[1，7，8]。原料供应是制约生物柴油生产的主要因素之一。一种高种子产量的烟草品种(索拉里斯)被培育出来用于生产种子油[9]。生命周期分析表明，生产Solaris烟草生物柴油所产生的影响与生产其他作物生物柴油所产生的影响相似[10]。此外，生物柴油的燃料特性，包括冷温流动特性、氧化稳定性和NOx排放，也是限制生物柴油广泛应用的其他因素。生物柴油的燃料性能主要取决于植物种子油的脂肪酸组成[11]。因此，改变脂肪酸谱可以改善生物柴油的燃料性能。

烟草籽油的高亚油酸含量使其生产的生物柴油更容易氧化，这将限制其在传统发动机中的使用。微粒体Δ¹²油酸去饱和酶(1-酰基-2-油基- cn -甘油-3-磷酸胆碱Δ¹²去饱和酶(FAD2)将内质网中的油酸去饱和转化为亚油酸。在过去的几十年中，FAD2许多植物物种的基因已被克隆和鉴定[12，13，14，15，16，17，18]。先前的研究报道了烟草的抑制NtFAD2经RNAi (RNA干扰)处理可显著提高油酸含量。同样的策略也被用于增加其他油籽作物的油酸含量，如大豆[19]，芸苔属植物拉伯［20.]，棉花[21]和花生[22]。此外，人工microrna [23]， TALENs(转录激活因子样效应核酸酶)[24]和标准诱变[25，26，27，28方法也被用于FAD2基因的抑制。

尽管RNAi和人工microRNA是基因功能鉴定的有用工具，但对T-DNA结构的持续遗传需求限制了这些技术在植物遗传育种中的应用[29]。最近，CRISPR(聚集规律间隔短回文重复序列)-Cas9系统已成为各种生物体中基因组编辑的强大且通用的工具[30.，31，32]。与RNAi和人工microRNA技术(通过抑制目标基因的转录物产生敲除)截然不同的是，CRISPR-Cas9系统可以通过改变基因组DNA序列来产生定义的基因敲除[33，34]。最近，CRISPR-Cas9系统被成功应用于基因敲除生产高含油籽油FAD2多种作物的基因，包括亚麻荠漂白亚麻纤维卷［35]，花生[36]，芸苔属植物显著［29]和大豆[37]。在本文中，我们确定了四个FAD2烟草基因组中的基因。CRISPR-Cas9载体被设计用于特异性敲除种子型NtFAD2-2a和NtFAD2-2b基因。烟草突变体种子脂肪酸谱表现为高油酸和低亚油酸表型。本研究获得的高油酸突变系可作为种子脂质工程研究的重要材料。

四个FAD2对烟草基因组进行了基因鉴定

使用拟南芥FAD2蛋白(NP_187819)作为查询序列，在烟草基因组中鉴定出4个FAD2蛋白。根据序列相似性，将这4个FAD2蛋白编码基因命名为NtFAD2-1a(XM_016657141),NtFAD2-1b(XM_016639420),NtFAD2-2a(NM_001326113),NtFAD2-2b(XM_016659639)。先前的研究表明，FAD2蛋白在3个H盒中含有6个跨膜结构域和8个保守的组氨酸残基，这是其内质网定位和去饱和酶活性所必需的[12，38]。利用TMpred软件预测了所有烟草FAD2蛋白的6个跨膜结构域(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html) [39]。此外，蛋白质序列比对表明，烟草FAD2蛋白的推定跨膜结构域和H盒与其他FAD2蛋白中报道的区域相同(图2)。1）.FAD2蛋白是一种内质网膜结合的脂肪酸去饱和酶，内质网定位需要在c端有内质网检索基元[40，41]。序列分析表明，烟草FAD2蛋白在c端含有保守的内质网定位信号(YKNKL)。1）.烟草FAD2蛋白的编码区除了具有较高的氨基酸序列相似性外，还具有较高的序列一致性(~ 85%)1:图。S1)，这将使通过RNAi方法进行功能分析成为一个挑战。

烟草是一种天然的异源四倍体植物n的抗旱性和n tomentosiformis。为了追溯这四个的起源FAD2基因、系统发育分析。我们的结果表明NtFAD2-1a和NtFAD2-2a起源于n tomentosiformis,而NtFAD2-1b和NtFAD2-2b起源于n的抗旱性(附加文件1:图。S2)。

NtFAD2-2a和NtFAD2-2b为FAD2种子型基因

描述烟草的功能FAD2采用实时荧光定量pcr技术检测NtFAD2不同器官中的基因。我们的结果表明NtFAD2-1a和NtFAD2-1b有相似的表达模式，NtFAD2-2a和NtFAD2-2b具有相似的表达谱，可能是由于启动子区域的序列一致性高(附加文件1:图。S3)。NtFAD2-1a和NtFAD2-1b基因在营养组织和花中高表达，而在发育中的种子中转录丰度相对较低。NtFAD2-2a和NtFAD2-2b在所有器官中均检测到基因，其中发育中的种子转录水平最高(图2)。2）.这些结果表明NtFAD2-2基因可能主要参与了种子储存脂质和脂肪的去饱和NtFAD2-1基因可能在营养器官和花卉细胞膜脂质去饱和中发挥更重要的作用。

先前的研究表明，FAD2根据系统发育分析，基因可分为管家型和种子型。实时qRT-PCR结果显示NtFAD2-2基因属于种子型FAD2基因。为了进一步证实这一结果，基于蛋白质序列构建了系统发育树。系统发育分析表明NtFAD2-1基因被划分为管家型。的NtFAD2-2基因被划分为与先前报道的种子型相同的分支FAD2来自其他油料作物的基因，包括向日葵、大豆和棉花(图2)。3.）.综上所述，这些结果表明烟草NtFAD2-2基因为种子型FAD2基因。

NtFAD2-2蛋白为Δ¹²酵母细胞中的去饱和酶活性

酵母(酿酒酵母)细胞已成功用于功能表征FAD2来自多种植物物种的基因[16，17，42，43，44，45]。由于缺乏FAD2像基因一样，酵母细胞不能将油酸转化为亚油酸。为了确认烟草种子型NtFAD2-2蛋白的去饱和活性，我们利用NtFAD2-2a和NtFAD2-2b将基因克隆到酵母表达载体pDR195中，在PMA1启动子调控下在酵母细胞中表达。用空载体pDR195转化的酵母细胞只含有典型的酵母脂肪酸，包括C16:0、C16:1^Δ9、C18:0和C18:1^Δ9(无花果。4a)两者的表达NtFAD2-2a和NtFAD2-2b基因在气相色谱上产生两个额外的峰，对应于C16:2^Δ9日12和C18:2^Δ9日12(无花果。4b,无花果。4c).此外，C16:1的峰面积^Δ9和C18:1^Δ9在NtFAD2-2酵母细胞中过表达的基因明显小于空载体转化细胞中相应的峰值，这可能表明16:1的转化^Δ9和C18:1^Δ9到C16:2^Δ9日12和C18:2^Δ9日12，分别为(附加文件2:表1)。综上所述，这些结果表明种子型NtFAD2-2a和NtFAD2-2b蛋白具有Δ¹²酵母细胞中的去饱和酶活性。

一代的NtFAD2-2利用crispr - cas9介导的基因组编辑技术敲除突变体

进一步调查的作用NtFAD2-2基因对烟草种子脂肪酸进行去饱和，构建高油酸烟草种子油料，我们生成NtFAD2-2使用基于crispr - cas9的基因组编辑方法敲除细胞系。的高序列同一性NtFAD2-2a和NtFAD2-2b利用CRISPR-P 2.0设计了一个靶向这两个基因编码序列的gRNA(图2)。5a).通过农杆菌介导的转化将CRISPR/Cas9构建体导入烟草。通过卡那霉素选择获得18个T0转基因品系和两个独立的纯合突变植株NtFAD2-2a和NtFAD2-2b基因(fad2-2 # 06和fad2-2 # 14)通过Sanger测序鉴定。fad2-2 # 06突变体有1bp的缺失fad2-2 # 14在原间隔器相邻基序(PAM)序列上游3bp处有5bp的缺失(图2)。5b,无花果。5C)，这些都导致过早终止密码子。采用PCR方法，分别从两株突变株自花授粉产生的20株T1分离植株中筛选出T-DNA无构建植株(附加文件1:图。S4)。从每个突变系中选择3株无T-DNA纯合突变T1植株进行表型分析。

油酸含量增加fad2-2突变体种子

成熟种子脂肪酸谱fad2-2用GC-MS分析突变植株。与WT植株相比，两个突变系的种子均表现出预期的高油酸和低亚油酸表型(图2)。6）.油酸含量从WT种子的约12%急剧增加到两个突变系的79%以上(图2)。7a).相反，亚油酸含量从WT植物种子的71.9%显著降低到两个突变系的7.1-8.8%(图2)。7a).然而，在两个突变系中仍然检测到亚油酸，剩余的亚油酸可能是由低表达水平提供的脂肪酸去饱和酶活性产生的NtFAD2-1和plastidialFAD6种子发育中的基因。令人惊讶的是，棕榈酸含量显著降低fad2-2突变种子(图2)7a).也观察到棕榈酸水平降低FAD2抑制花生，大豆和棉花[21，37，46]，而棕榈酸还原的潜在机制尚不清楚。

以往的研究表明，高油酸表型是由RNAi介导的FAD2低温降低了沉默烟草的不稳定性，作者认为高油酸表型的不稳定性部分是由于塑性去饱和酶的活性[47]。因此，我们研究了低温处理的WT和fad2-2我们的研究结果表明，低温下WT种子的亚油酸含量水平升高，而高油酸表型的亚油酸含量升高fad2-2突变体种子不受低温影响(表2)1）.

脂质含量不受影响fad2-2突变体种子

种子脂质主要以三酰甘油(TAG)的形式储存在油籽中。由于工程脂肪酸谱的低效利用，以往的研究表明，在多个转基因植物种子中，TAG的总产量通常会减少[48，49，50]。因此我们检测了总脂质含量fad2-2突变体种子。出乎意料的是，两者的脂质含量都没有受到影响fad2-2突变系(图2)7b)，这表明增加的油酸可以有效地融入TAG中。

油料植物的种子大小和种子重与种子脂质含量普遍呈正相关[51，52，53]。我们进一步研究了野生野生和野生野生的种子大小和重量fad2-2突变体线。结果表明:种子的大小和种子的重量不受NtFAD2-2基因突变(附加文件1:图5)。这些结果与种子脂质含量一致。

叶片脂肪酸谱无明显变化fad2-2突变体

的辅助NtFAD2-1a和NtFAD2-1b基因序列与种子型高度相似NtFAD2-2a和NtFAD2-2b基因(附加文件)1:图。S1)。可能由于非特异性，RNAi介导FAD2基因沉默导致烟草叶片脂肪酸谱中油酸含量增加[j]。54]，这可能会影响转基因植物的抗逆性。在本文中，我们确定了NtFAD2-2a和NtFAD2-2b作为seed-typeFAD2基因和创造fad2-2通过高特异性CRISPR-Cas9系统突变。我们认为是种子型突变NtFAD2-2基因不会影响烟叶脂肪酸的去饱和，因为基因的功能冗余NtFAD2-1营养组织中的基因。为了证实这种可能性，我们研究了野生野生植物和野生野生植物的叶片脂肪酸谱fad2-2突变体线。气相色谱-质谱分析结果表明fad2-2突变系与WT植株相当(表2)2）.我们的结果表明，编辑种子类型FAD2在不影响营养组织的情况下，利用CRISPR-Cas9系统对烟草籽油进行基因改造是一种可行的方法。

烟草seed-typeFAD2基因可以作为种子脂肪酸谱工程的靶点

由于烟草种子含油量高，因此被认为是一种很有前途的生物柴油原料[2，4，9]。然而，从氧化稳定性的角度来看，烟草籽油的高亚油酸含量存在问题，这对工业应用很重要[1，3.]。低亚油酸和高油酸含量是几乎所有油料作物育种的首选，通过选择或工程降低FAD2活性产生了高油酸品种[j]。55]。在本文中，有四个方面FAD2首次从烟草基因组中鉴定出基因(图2)。1）.基因表达分析和系统发育分析表明NtFAD2-2a和NtFAD2-2b是seed-typeFAD2基因(图。2,无花果。3.）.基因敲除的NtFAD2-2基因通过CRISPR-Cas9系统导致烟草籽油高油酸和低亚油酸表型(图2)。6,无花果。7a).此外，NtFAD2-2基因编辑的植物不受影响(表2)2）.我们的结果表明，种子型NtFAD2-2基因是高油酸烟草种子油育种的理想靶点。

CRISPR-Cas9系统是烟草育种的有效工具

温度对多种油籽作物储脂中多不饱和脂肪酸含量的影响[j]。56，57]被认为是不可取的，因为它会导致产品质量的变化[58]。温度通过调节脂肪酸的表达来影响脂肪酸的去饱和FAD2基因(59，60，61，62]或影响FAD2蛋白周转率[63，64，65，66]。先前的研究表明，高油酸表型FAD2-沉默烟草在较低温度下减少[47]。我们的研究结果表明，基因敲除烟草种子型NtFAD2-2基因利用CRISPR-Cas9系统可以得到稳定的高油酸烟草籽油(表2)2）.

FAD2催化的脂肪酸去饱和是生物合成包括亚麻酸在内的多不饱和脂肪酸的关键步骤，对维持细胞功能至关重要。之前的研究已经证明了这一点FAD2基因在应对各种非生物胁迫(如低温)中起着至关重要的作用[60，67，68，69]和盐[70]。最近,FAD2基因被证明是番茄生物胁迫的原因[55]。的辅助NtFAD2-1基因序列与种子型高度相似NtFAD2-2基因。可能由于rnai介导的基因沉默方法特异性较低，转基因烟叶的脂肪酸组成也发生了改变，这可能会影响转基因株系的抗逆性[47，54]。CRISPR-Cas9系统介导的基因敲除更具特异性，我们的研究结果显示突变系叶片的脂肪酸谱不受影响(表2)2）.因此，CRISPR-Cas9系统生成的高油酸烟草突变系无副作用，可作为进一步脂质工程的基础材料。

烟草fad2-2突变系可以进一步设计来积累不寻常的脂肪酸

FAD2蛋白在Δ上添加了一个双键¹²油酸的位置。积累不寻常脂肪酸的植物具有不同形式的Δ¹²-去饱和酶(FAD2)能够在Δ催化替代修饰¹²油酸的位置，如形成碳碳三键或共轭双键排列，或插入环氧桥或羟基。由于独特的物理和化学性质，不寻常的脂肪酸可以用作添加剂或许多工业产品的原料，如润滑剂、塑料和油墨。71]。然而，不寻常的脂肪酸主要产生于未被驯化为作物的植物中，如蓖麻豆和桐树。为了满足日益增长的需求，最近的研究工作集中在利用生物技术在现有油籽中设计所需的不寻常脂肪酸[71，72，73]。sn-2- 18:1-PC被用作FAD2和不同形式的FAD2蛋白的底物。为了最大限度地产生不寻常的脂肪酸，内源性FAD2活性必须被消除。本文利用CRISPR-Cas9系统生成了高油酸烟草籽油突变体，这些突变系可用于特殊脂肪酸工程。

综上所述，有四个FAD2首次在烟草基因组中鉴定出基因NtFAD2-2a和NtFAD2-2b基因被确认为种子型FAD2基因。与RNAi技术相比，采用crispr - cas9介导的基因敲除方法获得了两个稳定的高油酸烟草种子油系。此外，通过CRISPR-Cas9系统构建的突变体叶片脂肪酸谱不受影响。本研究产生的突变体可用于高级工程生产特殊脂肪酸。

植物材料和生长条件

野生型(WT)烟草(烟草l .简历。K326)由云南省烟草农业科学研究院(http://ynycnky.yn-tobacco.com/）.云南省烟草农业科学院烟草生物技术育种重点实验室黄长军博士对样品进行了正式鉴定，并提供了样品存放的详细信息。利用WT烟草进行遗传转化。WT和转基因或突变型烟草植株在温室中25°C，光照16 h，黑暗8 h生长。低温处理时，采集授粉后20 d发育的种子，在添加2%蔗糖的1/2 MS培养基上，18°C黑暗培养24 h。对照处理温度为25℃。

分离及序列分析FAD2烟草中的基因

识别假定的FAD2烟草中的基因，拟南芥以FAD2蛋白(登录号:NP_187819)作为查询序列，对烟草基因组数据库(https://solgenomics.net/organism/Nicotiana_tabacum/genome)。选取同源性评分大于70%的同源蛋白序列进行进一步分析。靶序列通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST程序进一步确认。用DNAMAN软件进行序列比对。采用MEGA5.0 [74]。采用1000个重复的Bootstrap分析来检验节点的显著性。

RNA分离及定量RT-PCR (qRT-PCR)

植物组织取样后立即在液态氮中研磨₂使用Plant total RNA Isolation Kit (Foregene, China)提取总RNA，并使用PrimeScript™RT reagent Kit (Takara, Dalian)反转录成cDNA。qRT-PCR程序采用SYBR Premix Ex Taq™II (Tli RNaseH Plus) (Takara，大连)在CFX96实时PCR系统(Bio-Rad，美国)上进行。qRT-PCR开始循环，95°C 1个循环2 min，然后在95°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 30 s下进行40个循环。看家基因，NtGAPDH(XM_016643257)，作为内部控制。进行了3次生物重复和3次技术重复。所有用于qRT-PCR的引物在附加文件中列出2表S2。

的表达NtFAD2-2基因在酿酒酵母

的编码区NtFAD2-2a和NtFAD2-2b扩增基因并插入pDR195载体。重组载体分别命名为pDR195: NtFAD2-2a和pDR195: NtFAD2-2b。的BY4741菌株酿酒酵母用醋酸锂法转化这些载体，并选择在缺乏尿嘧啶的最小琼脂板上[75]。将分离的菌落接种于含2%葡萄糖的10ml完全最小滴出-尿嘧啶培养基中。当培养达到固定阶段时，在4℃下，1500 g离心5分钟，收获酵母细胞，用蒸馏水洗涤一次。用于构建载体的引物在附加文件中列出2表S2。

向量构造

对于CRISPR-Cas9载体的构建，靶向编码区的引导RNA (gRNA)NtFAD2-2使用CRISPR-P 2.0 (http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/) [76]。采用金门组装法将gRNA插入pKSE401载体，如前所述[77]。重构的向量(命名为pKSE401-NtFAD2-2)经Sanger测序确认，并导入根癌土壤杆菌应变GV3101。用于构建载体的引物在附加文件中列出2表S2。

烟草遗传转化与选择

如先前报道的，转基因烟草是通过农杆菌介导的转化产生的[78]。在卡那霉素50mg /L的培养基上选育0个代系。按照之前报道的方法进行突变选择，但做了一些修改[79]。简单地说，使用Plant DNA Isolation Kit (Foregene, China)从抗卡那霉素T0转基因植株的叶片中提取基因组DNA。为了选择突变的转基因植株，利用gRNA靶位点两侧的引物对进行PCR扩增NtFAD2-2(在起始密码子下游39 bp处进行正向引物退火，在起始密码子下游441 bp处进行反向引物退火)，并使用Sanger法直接对生成的PCR产物进行测序。通过扩增子序列与WT模板的比较选择突变植株。对20株T0突变植株自花授粉后产生的T1分离植株进行了T-DNA存在/缺失的筛选Cas9基因序列。选择3株无T-DNA纯合突变T1植株进行表型分析。这些步骤中使用的PCR引物在附加文件中列出2表S2。

脂质分析

为了分析酵母细胞、烟叶和烟草种子中的脂质，脂肪酸甲酯(FAMEs)的制备方法如前所述[80]，然后采用气相色谱质谱(GC-MS)进行定量分析(GC-2010, DAOJING)。气相色谱条件为:分式进样(1:20)，进样器温度220℃，烘箱温度程序150℃1 min，然后增加10℃min⁻¹至200°C，在200°C下保持1分钟，然后增加5°C分钟⁻¹至210°C，保持1分钟。

种子重量和大小测量

在相同条件下，从野生型和突变型烟草植株中收获成熟种子。每组50粒种子在分析天平上仔细称重，每粒种子重量除以种子数计算。数值以mean±SD表示。成熟种子用立体显微镜(德国徕卡)拍摄，用Image J软件测量种子大小。数值以mean±SD表示。

本研究过程中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章(及其补充信息文件)中。在当前研究中使用和/或分析的数据集可根据通讯作者的合理要求提供。

CRISPR:

有规则间隔的短回文重复

DAF):

开花后几天

呃:

内质网

时尚:

脂肪酸去饱和酶

饥饿:

脂肪酸甲酯

气相:

气相色谱-质谱法

NCBI:

国家生物技术信息中心

PC:

磷脂酰胆碱

RNAi:

RNA干扰

SD:

标准偏差

标签:

三酰甘油

本文分别:

转移dna

不适用。

本研究得到农业部转基因新技术与方法专项项目[No. 5]的部分支持。2016 zx08010001 - 010]。资助者在研究的设计、数据的收集、分析和解释以及撰写手稿方面没有任何作用。

作者指出

1. 田银帅和陈凯对这项工作也有同样的贡献。

从属关系

1. 河北工程大学景观与生态工程学院，河北邯郸056038经济技术开发区太极路19号

   田银帅，陈凯

2. 四川大学新能源与低碳技术研究院，四川省成都市双流区川达路610207

   田银帅，陈芳

3. 四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川省成都市武侯区望江路29号，610065

   小李和陈方

4. 河北工程大学水利水电学院，河北邯郸056038经济技术开发区太极路19号

   Yunpu郑

贡献

Y-ST、Y-PZ、FC设计实验，Y-ST、KC、XL执行实验。所有作者都对结果进行了回顾、讨论和解释。Y-ST, Y-PZ和FC撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到方陈。

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

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