陆地棉自交系和杂交系的比较转录组分析揭示了陆地棉产量杂种优势的分子特征

背景

杂种优势的利用极大地提高了世界上许多作物的产量。了解陆地棉杂交产生高产的潜在分子机制对高效育种至关重要。

结果

本研究在不同年份、不同地点的田间试验基础上，筛选了产量杂种优势水平不同的高、中、低杂交种。表型上，优良杂交种比优良亲本平均多出14%的籽棉产量。利用方正期不同组织对这些杂交种及其4个近交亲本进行了全基因组RNA测序。每个杂交亲本三联组的转录组比较差异显示每个组织中差异表达基因(DEGs)的比例较高。表达水平显性分析表明，大多数杂种的DEGs偏向亲本表达。一系列参与ATP和蛋白质结合、膜、细胞壁、线粒体和蛋白质磷酸化的deg在杂交中具有更多的功能注释。糖代谢途径和植物激素信号转导途径在各杂种中最为丰富。此外，这两种途径在已知籽棉产量qtl上的表达位点最多。整合转录组、qtl和基因共表达网络分析发现基因Gh_A03G1024，Gh_D08G1440、Gh_A08G2210、Gh_A12G2183、Gh_D07G1312、Gh_D08G1467、Gh_A03G0889、Gh_A08G2199、而且Gh_D05G0202显示了许多相互连接的基因的复杂调控网络。为确保RNA-Seq数据的准确性，对这些DEGs进行qRT-PCR检测。

结论

通过全基因组比较转录组分析，确定了9个与陆地棉产量杂种优势生物学过程相关的关键基因和途径。我们的研究结果和数据资源为棉花产量杂种优势的分子机制剖析提供了新的见解。

Cotton(棉花)一词来源于阿拉伯语quotn [1]，属于属Gossypium，拥有近50个二倍体(2n = 26)和四倍体(2n = 52)水平的物种[2］．其中，陆地棉(分子)是异体四倍体，称为新世界棉，占世界棉花产量的90%以上[3.］．它有一个特殊的产量，早熟，和中等良好的纤维质量。棉花在世界热带和温带地区的商业种植面积为3200万至3400万公顷，用于农业和工业，年产量为2565万公吨[4］．根据过去3年的平均水平，棉花是全球产量或多或少与全球棉花消费量相当的少数主要大宗商品之一。近期基因型的交错产量潜力和气候变化是主要制约因素。育种者应通过培育不仅产量和纤维质量优越，而且能抵抗主要害虫、疾病和非生物胁迫的品种或杂交来缓解这些问题。杂交棉花在中国的商业化始于1980年左右，随后几年随着杂交棉花的发展，种植面积不断增加英国电信棉(5，6］．

熟练利用杂种优势，提高了作物的数量和质量。杂种优势是指后代产生的性状比父母更优越的现象[7，8］．在上个世纪，EM East [9在同一属的不同异体四倍体之间杂交烟草形成了特殊的杂种优势。达尔文(C Darwin) [10而是乔治。H Shull第一次在植物育种中使用杂种优势一词[11］．引入杂交种后，许多作物的产量都得到了有效提高。虽然棉花是异源多倍体，但它有两组以上的基本染色体。尽管如此，在许多田间试验中，不同性状的杂种优势仍有意义[12，13，14，15］．棉花杂交种的主要影响包括自给自足、稳定生产、提高纤维质量、创造就业、创汇和发展种业[5］．利用杂种优势培育棉花杂交种的方法有两种:一是传统方法，即阉割和人工授粉。二是雄性不育系统，这是一种降低人工阉割成本，保证种子纯度的有效方法[16，17］．

杂种优势的遗传基础受到了干扰，人们用各种方法进行了近一个世纪的研究，例如遗传学[18，19]、分子生物学[20.组学[21]、生理生物化学[22］．许多研究者试图用所谓的显性基因作用假说来解释作物杂种优势。23，24，25]， overdominance [9，26，27]，以及上位[28，29］．然而，在棉花中，亲本间的遗传多样性和杂种优势水平并不是简单直接的[30.］．QTL作图在1990年取得了进展，为了解单个QTL以及它们之间的相互作用提供了机会。杂种优势的遗传基础复杂，涉及动态优势效应、上位效应和环境相互作用的QTL [31］．随着分子研究的进展，许多研究者认为显性、超显性和上位性基本是概念性的，并没有阐明杂种优势的分子机制和原理[19，32］．同时，遗传模型同样重要，因为杂种优势现象是多个杂合基因组合的非线性效应。此外，产量性状是数量性状，多种遗传特征共同作用产生杂种优势产量，单一的遗传机制无法解释植物杂种优势的遗传基础[33］．

考虑到F的重要性₁杂种优势育种中，利用模式生物技术工具对水稻和玉米等农艺作物杂种优势的遗传和分子机制进行了广泛的研究。例如，在玉米中观察到有害等位基因的不完全显性导致表型性状变异和杂种优势[34］．杂交种中两个亲本等位基因的特异性表达或不平衡表达有助于水稻杂种优势的形成[35］．然而，高通量测序的先进研究尚未在棉花上进行。这背后的一个原因是研究人员获得陆地棉全基因组序列的时间较晚[36，37］．此外，与其他作物相比，异源多倍体棉花基因组的分子多态性水平较低[38]且在多倍体化前后发生了许多基因组重复事件，导致棉花基因自然沉默、器官特异性和同源偏倚基因表达[39］．更好地了解产量杂种优势的遗传机制可以提高未来棉花育种的效率。考虑到杂种优势的重要性和实现陆地棉分子研究的差距，我们设计了一个综合研究，包括田间试验和全基因组转录组分析₁杂种和它们各自的近亲亲本。本研究的主要目的是:选择在不同环境下产量性状表现一致的杂交种。检测DEGs、基因表达模式和生物学途径对产量杂种优势至关重要。利用共表达网络分析鉴定候选基因及其调控机制。

具有不同杂种优势水平的棉花杂交种的鉴定

我们前期对6种环境下的11个自交系和30个种内杂交种的研究发现，与自交系相比，棉花杂交种在产量性状上表现更好、更稳定[40］．在本研究中，杂种优势分析表明，大多数杂种在铃重、籽棉产量、皮棉产量和衣分方面具有正的中亲本杂种优势(MPH)和较好的亲本杂种优势(BPH)(附加文件)14:表S1)。随后，将3个具有不同产量杂种优势水平的杂交种划分为高(H)、中(M)和低(L)，其中H型杂交种(SJ48 × Z98)在SCY的MPH产量为19.9%，BPH产量为14.1%。1)．m -杂种(SJ48 × 851)对SCY的平均时速为13.3%，BPH为2%，而l -杂种(SJ48 × DT)对SCY的平均时速仅为8.8%。这3个杂种的母系近交亲本相同，但父系近交亲本各不相同。h -杂种是亲本SJ48 (A)与父本Z98 (B)的杂交，m -杂种是与父本851 (C)的杂交，l -杂种是同一母系与父本DT (D)的杂交。产量杂种优势水平的差异表明，这3个杂种及其近交亲本适合用于棉花产量杂种优势的比较转录组分析和调控机制的研究。

63个棉花杂交种及其近交亲本平整期RNA文库的转录组谱

为了了解棉花产量杂种优势的全球转录组谱，利用3个对比杂交种及其4个近交亲本在平方期进行了RNA测序。每种基因型分别采用叶片(以下简称RL)、花蕾(F)和开花后1 d胚珠组织(1 DPA)进行3次生物复制。共构建了63个文库(7 × 3 × 3)用于Illumina深度测序。每个库总共生成了约4300万到5000万次读取(附加文件15:表S2)。有效读取的平均百分比≥98.5%。Q30%值在95%以上。大约94.9%的clean reads被映射到参考文献g .分子基因组(36］．在每个样本和基因型中，近90.5%的reads被映射到外显子区域。其中内含子和基因间区域映射≤5%(附加文件1:图S1)。每个库的总映射、唯一映射、多映射、非拼接和拼接读取的简要细节可以在附加文件中看到15:表S2。主成分分析证实了本实验中组织和基因型之间的变异(附加文件)2:图S2)。双标图中两个生物重复集中在同一簇中。所有复制和暴露RL组织的Pearson相关检验彼此之间相关性强(≥75)，与F和1 DPA相关性弱(≤50)(附加文件)3.:图S3)。F与1个DPA样品间相关性较强(~ 55 ~ 60)。

棉花杂交种及其近交亲本的整体转录组变化

总表达基因的数量提供了所有数据集转录组景观的概述。如果一个基因在一个样本的所有三个生物重复中表达均高于零，则认为该基因已表达。每个数据集中共表达约60000个基因(附加文件4:图S4)。花芽中表达的基因总数远高于叶片和1 DPA胚珠。以外显子模型每百万reads mapping (FPKM)中每千碱基片段数计算mRNA的不同表达水平，分析杂种与亲本之间转录组的动态变化。在每个组织的至少一个样本中，表达水平高于0.5 FPKM的基因被用于进一步分析。样本间差异表达基因(DEGs)的选择条件为:log2 (fold change) > 1或< - 1，差异有统计学意义(p值< 0.05)．对每个杂交亲本三联体和组织进行转录组比较。h -杂种亲本三位一体中Up + down的deg总数及分布如图所示。2．H与母本(A)的比较分析显示，花芽中总DEGs数量最高(F)，而与父本(B)相比，分别在1 DPA中鉴定出最高的DEGs(图2)。2a).亲本a和亲本B组合相比h -杂种有更高的deg数量(在所有组织中约为2100个)。DEGs分布的结果显示，在每个组织中，大部分基因是共同的，而少数是独特的(图2)。2b, c, d)。例如，A与H的组合在RL中只有367个唯一的deg。

结果显示，与父本(C)相比，带有母本(A)的M具有更低的deg比例(图2)。3.a).此外，在每个组织中发现了更多常见而不那么独特的deg(图。3.b, c, d). l -杂交亲本三位一体的deg对比分析如图所示。4．结果显示，L与母本(A)在RL中有1112个deg，在F中有935个，在1个DPA中有3528个deg(图2)。4a). L与亲本(D)比较，RL、F、1 DPA的deg总数分别为1524、790和4118个。与亲本A相比，亲本D在1个DPA中有较多的deg。此外，DEGs在各组织中的分布结果与高、中杂交相似(图2)。4b, c, d).各杂交亲本在方正期的比较转录组分析表明，杂种间遗传差异表达的百分比与亲本间相似。

杂交种表达水平显性性分析

表达水平显性是指后代遵循两个二倍体亲本中的一个表达模式的现象。为了确定种间F的表达量和方向性₁按照Yoo等人的方法和材料，将deg分为12个可能的组。，［41(图。5a).结果表明，杂种中大多数基因的表达量与亲本中的一个相似(图1)。5)．例如，h -杂种的叶片和1 DPA胚珠中大部分基因分别表现出较高的母本显性表达和较低的母本显性表达(图2)。5b;额外的文件5:图S5a, c)。低父本显性表达在花蕾中所占比例最高(图S5a, c)。5b;额外的文件5:图S5b)。m -杂种叶片和1 DPA胚珠的非加性表达基因大多表现出较高的母系显性表达。5c;额外的文件6:图S6a, c)。其中，花蕾中低母本显性表达比例最高(图S6a, c)。5c;额外的文件6:图S6b)。在l -杂种中，大多数叶片基因表现出较高的母本显性表达(图2)。5d;额外的文件7:图S7a)，而低父本显性表达在花蕾中所占比例最高(图S7a)。5d;额外的文件7:图S7b)。在该杂种中，1个DPA胚珠中的大部分基因表现出较高的母系显性表达(图2)。5 d；额外的文件7:图S7c)。通过表达水平显性性分析，大多数杂种在squared期在不同组织中表现出亲本表达水平显性(P-ELD)，这可能对棉花产量杂种优势起作用。

P-ELD对DEGs的功能注释及通路富集分析

为了识别P-ELD中DEGs的功能，我们将4个基因集(3-6组)汇集在一起，对每个杂种和组织进行GO和KEGG富集分析(附加文件)16:表S3和附加文件17:表S4)。h -杂种的GO富集分析显示，每个组织中的大多数基因都具有与膜、ATP和蛋白质结合相关的功能注释(附加文件)8:图S8a)。与叶绿体、细胞外区和ATP结合相关的基因在m -杂种叶片中所占比例最高8:图S8b)。在花蕾中，大部分基因与生物过程、分子功能和膜的组成成分有关。1 DPA胚珠中功能基因最多的是生物过程、叶绿体和线粒体(附加文件)8:图S8b)。l -杂交种叶片中最富集的GO项是ATP结合和丝氨酸/苏氨酸激酶活性(附加文件)8:图S8c)。在l -杂种的1个DPA胚珠中，与生物过程、膜整体成分和叶绿体相关的功能注释最多，而与质膜、转录调控和线粒体相关的基因最多(附加文件)8:图S8c)。

P-ELD基因KEGG富集分析表明，h -杂种叶片中淀粉和蔗糖代谢、内吞作用和色氨酸代谢更显著(图2)。6a).花蕾中大部分基因富集于淀粉和蔗糖代谢、吞噬体、戊糖和葡萄糖醛酸盐相互转化。而在1个DPA胚珠中，植物-病原菌相互作用和植物激素信号转导是更有代表性的途径。6a). m -杂种叶片中淀粉和蔗糖、抗坏血酸和桤木酸、色氨酸等代谢途径的富集程度更高(图2)。6b).在花蕾中，淀粉、蔗糖代谢和植物激素信号转导基因富集较多(图;6b).淀粉和蔗糖代谢及磷脂酰肌醇信号系统在1 DPA显著富集(图。6b).途径分类表明，l -杂种在叶片中具有淀粉、蔗糖代谢和核糖体意义(图。6c)，而淀粉和蔗糖代谢、植物激素信号转导和核糖体是花蕾中更有代表性的途径(图。6c).在1个DPA胚珠中，植物激素信号转导、植物-病原菌相互作用以及淀粉和蔗糖代谢的基因富集程度较高(图2)。6c)。

P-ELD基因在杂交种中的共同功能是膜、生物过程、线粒体和ATP结合的组成部分(附加文件)9:图S9a)。参与糖代谢、植物激素信号转导和蜡生物合成等常见途径的基因在杂种繁殖阶段的生长中具有重要意义(附加文件)9:图S9b)。在植物的生殖生长过程中，养分的吸收和分布是至关重要的。从理论上讲，激素和糖代谢产物生物过程中所涉及的基因表达的差异可能是棉花产量杂种优势的原因。

已知籽棉产量qtl的关键通路DEGs图谱

QTL提供了基因组学和表型组学之间的联系，使用QTL可以是了解产量杂种优势遗传复杂性的有效方法[42，43］．在此，我们研究了关键通路DEGs、籽棉产量qtl和产量杂种优势之间的关系。利用涉及关键途径的杂交deg对已知的57种棉种产量(SCY) _qtl进行了图谱分析18:表S5)。结果显示，在43个qtl上共映射了74个杂交deg(图2)。7)．有趣的是，大多数基因被定位在qtl区域，这些区域被报道了不止一次(图2)。7)．在这些基因中，有6个基因在所有杂种中与亲本存在表达差异，而13个基因在两个杂种中是相同的。13个deg是中等杂种所特有的。然而，17和25个deg分别针对高杂交和低杂交(附加文件10:图S10)。

高、低杂交的共表达网络分析

加权基因共表达网络分析(Weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)是推断共表达基因之间潜在关系的重要工具，构建共表达网络有助于理解基因群之间的功能联系，而不是单个基因，并为生物过程的系统级理解提供了新的视角[44，45］．在这里，我们使用RNA-seq数据分析中识别的deg(从叶子、花蕾和1 DPA中提取的)在高杂交和低杂交中进行了共表达网络分析。高度相连的基因聚集成不同的模块。聚类树状图显示，在高杂交和低杂交中，各模块的互通性和大小有较大差异(附加文件)11图S11a, b)。有趣的是，在高杂交中鉴定出8862个基因分布在21个模块中，模块大小在34 - 1972个基因;在低杂交中鉴定出7863个基因分布在33个模块中，模块大小在42 - 2880个基因(补充文件)19:表S6)。高杂化模块和低杂化模块之间的相关性分析非常强(附加文件11:图S11c)。在高杂交中，许多模块基因的平均连通性高于低杂交(附加文件)11:图S11d)。虽然绿松石和蓝色模块在两个杂交组合中具有最高的相关基因，但蓝色模块中不同基因之间的相关系数要高得多。

籽棉产量杂种优势基因调控共表达网络

为了构建产量杂种优势的显著调控网络，首先在两个杂种中选择蓝色基因模块。其次，筛选在scy - qtl上定位的deg及其互作基因的权重≥0.40(附加文件20.:表S7)。随后，我们构建的基因共表达网络显示，9个SCY-QTLs基因具有许多相互连接的基因，参与碳水化合物代谢过程、催化活性和蛋白质结合或转运等生物和分子功能(图2)。8)．我们认为这9个基因可能是产量杂种优势的候选基因。这些基因在RNA-seq分析中显示了杂交特异性表达谱(附加文件)12:图S12)。九个基因中，只有两个Gh_A03G1024（BZR1:油菜素唑耐药1)和Gh_D08G1440（ASK8参与植物激素信号转导途径的毛毛相关蛋白激酶(Shaggy-related protein kinase theta)在高杂交种花芽中有差异表达。另外3种淀粉和蔗糖代谢途径在高杂交种花蕾中也有差异表达。这些基因Gh_A08G2210(16)内切葡聚糖酶,Gh_A12G2183（GBSS1:颗粒结合淀粉合成酶1，叶绿体/淀粉体)，和Gh_D07G1312（APL2:葡萄糖-1-磷酸腺苷基转移酶大亚基2，叶绿体)。其余4种基因在低杂交的1个DPA胚珠中有特异性差异表达。其中三个表示为Gh_D08G1467（MPK4:丝裂原活化蛋白激酶Gh_A03G0889（PHO1:磷酸盐转运体PHO1同源物3)，和Gh_A08G2199（JAZ10: jasmonate - zimm -domain蛋白10)在植物激素信号通路中富集。剩下的一个基因Gh_D05G0202（CRR21:含五肽重复蛋白)属于淀粉和蔗糖代谢途径。总的来说，杂交种基因共表达网络分析不仅有助于筛选关键基因，而且为棉花产量杂种优势的调控机制提供了新的思路。

实时定量PCR (qRT-PCR)

我们选择了9个候选的deg进行qRT- PCR分析。这些基因在RNA-seq中表现出杂交和组织特异性表达，映射在scy - qtl上，并且在共表达网络中具有最高的互通性基因。引物采用基因特异性方法设计，以确保表达的准确性(附加文件21:表S8)。分析结果显示Gh_A03G1024,Gh_D08G1440，Gh_A12G2183, Gh_A03G0889, Gh_D05G0202, Gh_A08G2199, Gh_D08G1467而且Gh_D07G1312显示了每个杂交后代与他们的一个亲本或双亲相比的显著变化(附加文件13:图S13)。然而,基因Gh_A08G2210杂种间差异无统计学意义。更有趣的是，这些基因在RNA-seq结果中明显表现出与他们的母系或父系父母相似的表达。

棉花杂交的有用性及转录组序列概述

利用杂种优势一直是棉花育种家的主要目标之一。种内和种间棉花杂交组合在产量和产量相关性状上均表现出显著的杂种优势[12，15，46，47，48］．然而，陆地棉种内杂交需要更多的努力才能获得显著的正杂种优势。我们在6种不同环境下的田间试验表明，70%以上的陆地棉种内杂交种在每种环境下的产量性状具有正的MPH。后代杂种优势水平可能下降。然而，之前的一项研究发现F₁和F₂棉花杂交品种的产量分别比亲本高出20-40%和6-10% [49］．其他报告的MPH为20%₁10%是F₂对于皮棉产量[50］．一些研究人员发现，旱地品种在皮棉产量上比现代品种表现出更高的MPH [51］．任何期望性状的杂种优势水平取决于杂交亲本和育种设计。在美国，选择遗传优良和生理有效的亲本已使玉米产量提高了15% [32]和中国10-20%的大米[52］．

为了更好地理解产量杂种优势背后的遗传学，在繁殖阶段开始时对三个不同产量的杂种及其四个近交系亲本进行了转录组测序。对所有数据集的差异基因进行比较分析，发现杂种的差异基因总数与亲本之间的差异基因总数相似。此外，在基因表达水平上，杂种与亲本之间几乎没有独特的基因组差异。这些结果说明杂交后的转录重编程，即使基因表达的数量或质量差异很小，也可能导致杂种的表型变异。此外，杂种中的一些基因可能表达不同，在某些组织或条件下表现更好，而另一些基因可能在其他组织或条件下表现更好。这几个基因的累积效应可以形成杂种优势。对许多农艺作物的研究已证实杂交对基因表达有显著影响[53，54，55，56］．在此之前，杂交种与亲本之间的比较分析仅报告了0.8-2.3%的DEGs显著［56]和超级杂交稻LYP9的10.6% [57］．另一项关于水稻的研究发现，杂交水稻中只有2.8%的DEGs [58］．这些研究使我们了解到，只有少数的遗传差异才能在杂交中产生优越的性能。

棉花杂交种在方正期表现出亲本表达水平优势

已发现异源多倍体具有表达水平优势(ELD)，即子代的基因表达在统计学上与亲本的基因表达相似[59］．我们的分析结果发现，大多数杂交DEGs在方正期具有非加性基因表达，特别是高/低母本或父本样表达组的比例最高。加性表达或中亲本表达的表达量较低。可以假设两个亲本不同基因组的交叉可能导致理想亲本的基因组优势，这些变化可能是杂种表现更好的原因之一。有趣的是，这些杂交种在苗期的非加性显性基因表达量较高[60］．在此之前，人工合成和天然的棉花异体多倍体被发现模仿两个二倍体亲本之一的表达模式[59］．一项超级杂交水稻的转录组分析发现，在发育早期，30-50%的非加性基因表达[57］．许多玉米科学家注意到较高的非加性基因表达[61，62，63]，而另一些人则检测到杂种中有更高的加性基因表达[64，65］．由于在很多情况下，亲本系间的deg数量多于亲本系与F之间的deg数量，因此考虑了杂种优势中涉及加性基因的预测₁混合动力车。近年来已有大量研究采用ELD分类方法来检测杂种的基因表达模式。例如，70-80%的非加性基因显著F₁杂种在开花前期表现出较高的亲本表达水平优势[56］．小麦杂种DEGs大多遵循母本在幼苗组织中的表达和父本在穗组织中的表达[66］．在某些作物杂交种中，也报道了杂种优势相对于非杂种优势的显性表达[67，68］．根据许多研究的结果，目前还不清楚哪个表达类别是重要的，但似乎加性和非加性基因表达都可能产生植物的杂种优势。

信号和糖代谢途径基因在产量杂种优势中的可能作用

我们的研究发现P-ELD杂交种的DEGs富集了许多不同的途径。植物激素信号通路和糖代谢通路是最重要的信号通路。本研究发现生长素反应因子(ARF)、富亮氨酸重复序列蛋白(Leucine-rich repeat protein)、Jasmonate-zim (JAZ)结构域蛋白、MAP激酶、油菜素内酯信号调节蛋白(brassinosteroids signaling regulator, BZR)相关信号基因表达发生变化。植物激素是一组结构独特的关键分子，调节植物生长和控制与生物和非生物胁迫相关的反馈。油菜素内酯和赤霉素相关的植物激素信号通路基因在杂交玉米株高调控中起关键作用[69］．进一步，在转录组比较显著表明IAA和SA反应基因在F中存在差异表达₁杂交，最终激发了杂交活力[56］．生长素通过IAA蛋白和ARFs控制转录。IAA蛋白与ARF结合并在称为topless的辅抑制因子的帮助下抑制转录[70］．转录被抑制或激活取决于与DNA结合的ARF的类型[71］．植物激素信号和反应通常在转录中发生重大变化。然而，这些并不像植物中的转录反应那样被很好地分类[72］．在出现异常条件或压力时，植物通过转录物、蛋白质和代谢物水平的变化，产生不同的糖和激素信号，以维持代谢过程的平衡[73］．早期转录本分析显示糖和生长素信号在高温胁迫下调控棉花花药发育[74］．

尤其值得注意的是，许多与纤维素合成酶(CESAs)、果胶裂解酶样(PEL)、蔗糖合成酶(Sus)、淀粉合成酶、α - β -淀粉酶、五肽重复(PPR)和四肽重复(TPR)蛋白相关的糖代谢基因在杂交种中均有差异表达。纤维素和果胶是植物细胞壁的重要组成部分，在棉纤维细胞发育过程中起着重要作用。纤维素合成控制纤维二次壁增厚[75］．减少图像的基本单位基因转录本导致其酶活性降低，最终降低了棉花的纤维伸长率[76］．纤维素合酶6突变体(CESA6)显示出强烈的纤维素缺陷，因此在下胚轴短表型在拟南芥中出现[77］．一项全基因组关联研究显著确定CESA6可作为茎部抗倒伏的候选基因[45］．光合产物在植物体内以蔗糖的形式运输，通过积极参与韧皮部卸载过程，受到Sus酶的调控。Sus活性相关基因在棉纤维发育中起着关键作用，为生长纤维提供蔗糖和纤维素[78，79］．此外，Sus活性与植株贮藏淀粉器官的最终收获指数密切相关。淀粉是一种碳储存聚合物，通过平衡净碳利用率作为植物生长的主要调节因子。植物所固定的碳以淀粉的形式储存在阳光下，在夜间完全用于呼吸和生长[80］．因此，任何导致暂时碳短缺状态的变化，都会通过平衡净碳来降低植物的生长速度[81，82]通过提高淀粉的合成速度和降低淀粉的分解速度[83，84］．杂交水稻的基因表达研究表明，与昼夜节律、碳固定、淀粉和蔗糖代谢相关的几个基因位于产量qtl区域，预计这些可能是产量杂种优势的候选基因[85］．除了光合作用外，其他代谢途径如蔗糖和淀粉也可能是小麦杂种优势的关键因素[86］．玉米种子和马铃薯块茎以干重计含有大量的淀粉，因此产量主要取决于淀粉和蔗糖的代谢[87，88］．由于碳和淀粉的不平衡，无淀粉突变体不能在明暗循环中生长，最终导致夜间碳短缺，导致第二天相当几个小时的生长阻抗[81］．

qtl和共表达网络在产量杂种优势候选基因挖掘中的作用

数量性状位点(qtl)提供了复杂性状的基因组学和表型学之间的联系。在过去的十年中，一些研究人员进行了qtl分析以了解杂种优势[42］．然而，由于所鉴定的qtl区域较大，大多数情况下难以确定目标基因。为了减少这一挑战，一种有前途的方法是将deg映射到已知的qtl上，然后构建它们的共表达调控网络。此外，产量杂种优势反映的是许多相互关联的基因的影响，而不是单个基因的影响，因此了解基因之间的相互关系有助于开发可能与生物系统相关的候选基因。类似的方法已经在水稻和显著［45，58］．所选杂交种籽棉产量均优于或劣于亲本，并在43个重叠的籽棉产量qtl上定位了74个关键途径的遗传位点。

我们利用green模块对高、低杂交种进行了综合共表达网络分析，揭示了9个棉籽棉产量qtl定位基因，这些qtl与许多富含碳水化合物代谢过程、催化活性和蛋白质结合或转运等生物和分子功能的基因相互连接。我们确定的候选基因是Gh_A03G1024，Gh_D08G1440、Gh_A08G2210、Gh_A12G2183、Gh_D07G1312、Gh_D08G1467、Gh_A03G0889、Gh_A08G2199、而且Gh_D05G0202。更有趣的是，这些基因在杂种的生殖组织花芽和1个DPA胚珠中均表现出组织特异性差异表达。基因BZR1与油菜素类固醇介导的信号通路相关，调节细胞伸长和分裂。BES1陆地棉转基因植株对油菜素唑的下胚轴敏感性降低，叶片卷曲，叶柄弯曲，BR组成基因表达改变[89］．OsBRI1基因在水稻的各种生长发育过程中发挥作用，导致水稻矮化和叶片弯曲[90］．ASK8是一种shaggy相关基因，使细胞外信号能够调节分化细胞的转录，应激反应[91]，也参与与BR反应相关的生物学功能。的基因Gh_A08G2210属于内切葡聚糖酶基因家族，参与细胞壁组织和纤维素分解代谢。预测其可能在拟南芥花粉和花粉管生长中起作用[92］．

其他与淀粉生物合成相关的候选基因，如GBSS1而且APL2在高杂交种花蕾中表现出差异表达。CRISPR/Cas9介导的突变GBSSI对水稻生殖生长的影响[93］．此外，有希望的候选信号基因与JAZ10而且MPK4蛋白在低杂交种的1个DPA胚珠中有差异表达。MPK4改变响应生物和非生物胁迫的基因表达，并在病原体防御中发挥重要作用[94］．不仅如此，它还参与细胞因子的调节[95]、水杨酸和茉莉酸介导的防御基因表达。JAZ10基因作为茉莉酸盐反应的抑制因子，茉莉酰异亮氨酸特异性促进COI1-TIFY10A / JAZ1在拟南芥中观察到的相互作用[96］．基因PHO1被认为与无机磷酸盐的运输有关[97]，本研究结果显示低杂交的1 DPA胚珠表达下调。叶绿体CRR21基因在叶绿体RNA编辑和修饰中起主要作用[98］．有趣的是，该基因仅在低杂交种纤维胚珠中表达下调。总之，转录组、qtl和共表达网络的整合为籽棉产量杂种优势的基因组学研究提供了有益的认识。

值得注意的是,F₁旱地杂交种在籽棉产量上表现出显著的中优杂种优势。对竞争杂交种及其近交系亲本进行转录组比较研究，发现许多具有亲本样基因表达的deg。此外，许多生长素、油菜素类固醇、茉莉酸激素信号通路和纤维素、蔗糖和淀粉合酶代谢的deg被定位在已知的棉种产量qtl上。共表达网络分析鉴定出9个有潜力的候选基因，并发现其复杂的生物网络与相互关联的基因可能介导籽棉产量杂种优势。综上所述，我们在棉花田间试验中量化杂交对提高产量是有帮助的。全面的全基因组转录组分析为了解产量杂种优势的初步遗传学提供了新的思路。然而，陆地棉产量杂种优势的扰动生物学系统还有待进一步的基因功能研究。

产量参数的表型杂种优势计算

2015年，我们课题组共生产了30个种内F₁陆地棉11个亲本杂交研究。关于所有植物材料和在三个地点进行的两年实地实验的简要细节可以在我们之前的研究中看到[99］．利用各大田试验的表型数据，确定产量性状的杂种优势程度，其中中亲本杂种优势(MPH)的计算公式为MPH = 100 × (F₁- MP)/MP，较优亲本杂种优势(BPH)的杂种优势为:BPH = 100 × (F₁- BP)/BP，其中F₁是F的每个性状的表现值₁MP是父母该性状的平均值，BP是更好的父母该性状的值。

RNA提取，Illumina测序，数据分析

根据产量性状的表型杂种优势水平，选择高(记为H)、中(记为M)、低(记为L)杂交种及其4个自交系亲本在棉花抽穗期(一般为棉花繁殖阶段的开始)进行转录组分析。本研究使用的自交系经过多代自交以保持纯度，包括一个名为SJ48的母系(记为A)和三个父系，即Z98-15 (B)、851-2 (C)和DT-8 (D)。关于田间试验的细节见我们已发表的研究[60］．对于RNA样本，收集了来自2018年田间试验的所有7种材料的叶片、花芽和开花后1天(1 DPA)胚珠。本研究使用的所有植物材料和田间地点均为中国农业科学院棉花研究所所有。叶片和花蕾的样品均采于开方阶段。同时，从随机植株上标记完全开放的花，取1个DPA胚珠。从不同植物中选取约2毫克的嫩叶作为复合样品。同样，2毫米、3毫米和4毫米大小的花蕾也被汇集起来。总共有63个样本被用于分离总RNA。在初始质量测量和准备之后，LC生物科学中国按照供应商推荐的方案对Illumina Hiseq 4000进行了配对端测序(300±50 bp)。Cutadapt 1.10 [One hundred.]和Perl脚本在内部用于质量控制。Hisat 2.0 [101]用于陆地棉基因组的整齐清洁reads [36］．StringTie 1.3 [102用来组装映射的读。最终转录组生成后，StringTie 1.3与Ballgown [103]用于估计表达水平。用StringTie 1.3检测FPKM形式mrna的表达谱。条件log2(折叠变化)> 1或<−1和p值< 0.05用于识别两个样本之间差异表达的mrna。表达水平优势度的分析采用R软件包中的密度估计器进行，方法如前所述[59］．通过这种分析，两个亲本及其衍生杂种的表达统计数据被分配到以下12个可能的组。杂交种的基因表达表现为加性表达(1组和2组)、父本表达水平显性(3组和4组)、母本表达水平显性(5组和6组)、越界表达低于或高于亲本任何一方(7 ~ 12组)。使用Goatools软件对deg的GO功能标注进行测试[104］．KOBAS软件[105]进行KEGG通路富集分析。阈值准则p值≤0.05采用富因子进行富集分析。

在籽棉产量qtl上绘制关键的DEGs

从棉花QTL数据库中获得具有遗传位置和连锁分子标记的棉花产量QTL (LOD > 2)。www.cottonqtldb.org)．从陆地棉基因组中获得qtl的物理位置、基因位点和坐标[36］．取决于基因位点和QTL的物理位置。然后将来自高富集和关键通路的deg映射到qtl上。使用Mapchart软件2.0显示基因和qtl在相关染色体上的物理位置。

加权基因共表达网络分析

在高杂交种和低杂交种中分别进行WGCNA，使用平方阶段的deg。通过对这些杂交种及其亲本和叶片、花蕾和1个DPA胚珠组织的RNA-seq数据进行比较分析，将每个生物复制作为一个单独的数据集。生物学上合适的网络是按照前面描述的方法逐步构建的[106］．在WGCNA中，采用动态树切法绘制模块树状图。而模块的识别则基于merge CutHeight方法。不同的基因根据其校正权重和表达谱被聚类到不同的模块中。最后，我们从每个hybrid中选择连通性最高的模块来构建网络。共表达网络仅使用假定的候选基因(籽棉产量qtl和关键途径均富集的基因)及其相互连接的基因，其权重为> 0.40。Cytoscape_v 3.7.1软件[107]表示最终的共表达网络。

存在分析

对于qRT-PCR，使用PrimerScript™RT Reagent Kit For Perfect Real Time (RR037A, TaKaRa, Japan)为每个样品制备相同的RNA测序总RNA合成第一个标准cDNA片段。采用Oligo7软件设计基因特异性引物，采用TransSart Top Green qPCR SuperMix (AQ131,TransGen Biotech, China)制备qRT-PCR反应混合物。肌动蛋白基因用于归一化。对目标基因和肌动蛋白基因分别进行3个生物重复和3个技术重复。qRT-PCR的方案和数据分析技术与我们之前的研究相同[17］．

本研究中生成或分析的所有测序数据集均免费提供，登录号为GSE150052https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE150052．

度:

差异表达基因

迈:

中亲本杂种优势

P-ELD:

亲本表达水平显性

经济价值:

数量性状位点

WGCNA:

加权基因共表达网络分析

作者感谢Muhammad Yasir, Zhiden Zuo, Ting Li和Yongfeng Zhang (ICR-CAAS, China)在这项工作中的帮助。感谢Muhammad Sarmad Ifikhar(澳大利亚昆士兰大学)的英文编辑。作者也感谢同行审稿人的建设性意见，大大改善了这篇手稿。

国家重点研发计划项目(2016YFD0101400)资助。资助机构在设计、分析、解释数据和撰写手稿方面没有任何作用。

从属关系

1. 棉花生物学国家重点实验室，中国农业科学院棉花研究所，农业部棉花遗传改良重点实验室，黄河大道38号，河南安阳455000

   卡西夫·沙赫扎德，张雪娴，郭丽萍，齐廷祥，张孟，张冰冰，王海林，唐慧妮，乔秀琴，冯娟娟，吴建勇，邢朝珠

2. 金华市经济特种技术推广处，浙江金华321017

   保立升

贡献

CZX和JYW设计了实验。LPG、TXQ、HT、XQQ、LSB和HLW构建了杂种群体并进行了田间评价。KS, XXZ MZ, JJF, BBZ进行数据分析。KS、JYW和CZX参与了手稿的准备工作。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Jianyong吴或Chaozhu兴．

伦理批准并同意参与

所有使用和分析的棉花品系都是公共的，可用于非商业用途。这篇文章不包含任何作者对人类参与者或动物进行的研究。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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