定位于内质网的丝氨酸羟甲基转移酶在清除H₂O₂以提高水稻耐冷性

背景

水稻是一种对寒冷敏感的作物，会受到低温的严重损害。过度表达LSI1.基因(LSI1.-本研究表明，一种主要定位于内质网（ER）的丝氨酸羟甲基转移酶（OsSHMT）参与提高水稻的耐冷性。

结果

更高的转录水平OsSHMT在中检测到LSI1.-与野生型相比，牛稻更具优势。组蛋白H1和核酸结合蛋白被发现与基因启动子区结合OsSHMT并调节其表达，这些蛋白的转录水平也上调LSI1.-ox米。此外，OSSHMT与ATP合酶亚基α，热休克蛋白HSP70，线粒体底物载体家族蛋白，抗坏血酸过氧化物酶1和ATP合酶亚单位β相互作用。LSI1.-编码的蛋白OsNIP2;1也与ATP合酶β亚基相互作用，这些蛋白的协调作用似乎在还原活性氧物种，如H₂O₂转基因的内容OsSHMT拟南芥在低温处理下，低于非转基因品系。

结论

我们的结果表明er定位的OsSHMT在清除H₂O₂以提高耐冷性LSI1.ATP合酶β亚基是OsNIP2;1和OsSHMT之间的中间连接。

植物的正常生长和发育需要一个特定的温度范围，温度的突然变化会导致生长抑制甚至死亡[1]．晚春天的冷咒是在短时间内突然下降的例子，并且可能对大米的生长产生不利影响。一些品种的大米，主要是那些籼稻亚种，对低温特别敏感[2,3.]．作物植物的持续低温已被证明会导致活性氧(ROS)和细胞膜的过氧化，并影响叶绿体基因的表达，抑制光合作用[4]．这些RO包括o²⁻， H₂O₂哦⁻［5]．

方等人[6研究表明，低温处理抑制了对温度敏感的双生稻叶绿素合成基因的表达，促进了蛋白酶体基因的表达(栽培稻ssp。籼稻），导致叶绿体损伤，叶绿素降解，绿色丧失和叶中RNA的部分降解。Cui等人。［7]发现Dular叶片的低温胁迫下的美白用该基因编码pentatricopeptide（LOC_Os09g29825.1）的序列的缺失有关，这是一种RNA结合蛋白，与基因编码序列错过相对于从日本晴8个碱基大米，导致蛋白功能的编码序列和去激活的移码突变。突变基因被命名为DUA1．在低温胁迫下，DUA1蛋白失活导致水稻RNA编辑能力的丧失，导致水稻幼苗表现出叶绿体发育缺陷和叶片褪绿。当硅吸收基因(LSI1.)在杜鹃水稻中过表达，转基因株系的耐冷性显著提高，叶片在低温处理下保持鲜绿色。在低温胁迫下，转基因水稻光合途径的基因表达增强，蛋白酶体相关基因表达下调。此外，编码丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase, SHMT)基因的转录水平，LOC_Os03g52840）在转基因水稻中上调，但在野生型中下调，并且其相应的miRNA的表达以相反的方式改变，表明OSSHMT可能参与调节DORAL的冷冻耐寒性[6]．

SHMT广泛分布于植物中[8]．该酶催化丝氨酸和甘氨酸之间的可逆交换(甘氨酸CH₂-四氢呋喃₂O↔丝氨酸四氢呋喃)[9,10，这两种氨基酸是叶绿素、色氨酸和乙醇胺的前体[11]．因此，SHMT在植物的光呼吸过程中起着重要的作用[12]．研究发现水稻线粒体丝氨酸羟甲基转移酶基因突变(osshm1)导致光呼吸通路的阻塞，从而影响卡尔文循环和光能的效率；叶绿体中过多的光会导致活性氧的积累，导致叶绿体发育中断，叶绿体越来越小，基粒越来越少[13]．

此外，SHMT在调节植物的抗逆性方面也起着积极的作用。在拟南芥，低温抑制了NADH脱氢酶的表达，导致ROS的持续积累，抑制了冷应答基因的转录和对低温的超敏反应[14]．SHMT活性有助于减少在叶绿体ROS积累并因此降低氧化性损伤[15];作为第二信使，ROS的减少也会阻止冷信号的传递，减少ROS造成的损伤。隐性突变Shmt1-1.在拟南芥导致细胞死亡的异常调节，导致各种环境条件下的褪蓝和坏死疾病，以及携带的突变体Shmt1-1.等位基因表现出更多的H₂O₂在盐胁迫下比野生型植物积累更多的叶绿素，导致更大的叶绿素损失[16]．据我们所知，OsSHMT在水稻抗寒性调控中的具体作用尚未见报道。

在本研究中，一个OsSHMT基因(LOC_Os03g52840)的基因扩增，研究了OsSHMT的亚细胞定位，以及与启动子区结合的蛋白OsSHMT被获得。通过对与OsSHMT互作蛋白的研究，揭示了水稻在低温胁迫下OsSHMT的调控网络，揭示了OsSHMT可能在清除H中的作用₂O₂提高水稻的抗寒性。

Dular的耐冷性和LSI1.-牛米

杜拉尔河LSI1.-OX转基因株系对4个品种的低温处理表现出不同的耐受性 摄氏36度 h、 杜拉尔水稻的大部分叶子变得更白，而LSI1.-OX系保持了对冷却的耐受性(图。1一种）。进一步的研究表明，LSI1.过表达载体由泛素启动子驱动，翻译OsNIP2；1定位于细胞质中（图。1B)，它与细胞膜上最初的定位有显著的不同[17]这一结果表明OsNIP2；1可能比其初始功能具有更多的作用，它属于水通道蛋白家族，控制水稻中的硅积累[17].叶片的扫描电子显微镜（SEM）图像显示，叶片中含有二氧化硅体LSI1.-ox米叶比多木米饭大（图。1c)。

OsSHMT的亚细胞定位

过表达LSI1.在双生稻中导致数千个基因表达的变化[6]，包括OsSHMT基因。表达式OsSHMT在过去的十年中，这一点得到了提高LSI1.-OX稻与双粒稻的比较(图。2a).在水稻原生质体中，OsSHMT (LOC_Os03g52840)的亚细胞定位显示，黄色荧光集中在细胞核周围，未观察到明显的核内荧光，而在eYFP载体转化的水稻原生质体中，整个细胞核中均可见明显的黄色荧光(图S)1）.这表明OSSHMT在内质网上定位在细胞核周围的内质网上。与麦克里的内质网状标记蛋白的进一步共定位表明，OSSHMT广泛分布在内质网中，因为来自与EYFP的OSSHMT的标记蛋白和黄色荧光的MCHERRY荧光完全重叠（图。2b). OsSHMT参与植物的光呼吸过程，已有研究表明该蛋白定位于线粒体、叶绿体和细胞质。这项研究的结果补充了这些发现。

启动子区域OsSHMT以及结合蛋白

The promoter region 2597 bp upstream of the CDS of theOsSHMT本研究扩增了杜ular rice基因，并在该DNA片段的5 '侧翼区域进行了生物素标记(表S1）.根据DNA的拉下结果，与对照组相比，在室温下，低温处理LSI1.-OX诱导多种蛋白以结合的启动子区OsSHMT．相比之下，低温处理对与启动子结合的蛋白质没有显著影响(图2)。3.a） 对蛋白质的鉴定表明，从这两种蛋白质中都鉴定出了逆转录转座子蛋白（Ty3-gypsy亚类）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和AT-hook基序蛋白LSI1.-OX和籼稻在低温或室温条件下;而部分蛋白如组蛋白H1、核酸结合蛋白(核酸结合蛋白)、微管蛋白/FtsZ结构域蛋白(loc_os03g5160.01)仅在冷冻处理后被鉴定LSI1.牛集团;另一个微管蛋白/FtsZ结构域蛋白(LOC_Os05g34170.2)在冷冻处理后被鉴定LSI1-OX和杜勒斯组，从杜勒斯组在室温。在室温Dular组中鉴定到3a型atp酶家族蛋白，而在低温Dular组中未鉴定到3a型atp酶家族蛋白，该蛋白在低温Dular组中被诱导LSI1.-OX组在室温下与对照组比较(表1)1）.选择含有微管蛋白/FtsZ结构域的蛋白(loc_os03g5160.0.1, LOC_Os05g34170.2, LOC_Os07g38730.1)、组蛋白H1和NABP在两种水稻上的基因表达量进行分析。杜乐和杜乐基因转录水平的比较LSI1.-OX水稻经低温处理12、24和36 h后，与0 h相比，表现出相反的趋势，基因表达水平上调LSI1.同处理条件下，-OX稻与单株稻比较(图2)。3.b).结果表明，这些基因联合作用，在调控中发挥积极作用OsSHMT表情。

与OsSHMT相互作用的蛋白质

通过GFP-TRAP方法获得与OsSHMT相互作用的蛋白，发现有几种蛋白与OsSHMT共沉淀，与gfp载体对照的蛋白相比较(图)。4；表的年代2)其中一些蛋白质，包括ATP合酶α亚单位、ATP合酶β亚单位、热休克蛋白70、携带线粒体底物的家族蛋白E、抗坏血酸过氧化物酶1，是与OsSHMT蛋白相互作用的防御蛋白质（表1）2）.进一步测定OsSHMT与ATP合成酶α亚基、ATP合成酶β亚基、Hsp70、MSCP和APX的相互作用，发现OsSHMT在侵染烟草叶片中均表现出黄色荧光。对照组未检测到荧光，表明OsSHMT与上述蛋白呈正相互作用(图。5）.结果表明，OSSHMT与水稻中的防御相关蛋白质相互作用，包括APX，MSCP，HSP70和ATP合酶，共同调节冷却抗性。

H₂O₂内容OsSHMT转基因答:芥和野生型

进一步表明奥斯赫姆在清除h中的功能₂O₂,野生型答:芥和阳性转基因t_3.答:芥seedlings were exposed to a temperature of 4 °C for 12, 24 and 36 h. The leaves of the wild type showed more reddish-brown spots after Diaminobenzidine (DAB) staining. The transgenic line also showed reddish-brown spots, but the spots were small in size and number (Fig.6一种）。叶子H的测定₂O₂转基因株系和野生型的含量答:芥表明H₂O₂在转基因物种中答:芥经过冷冻处理后，显著低于经过相同处理的野生型（图。6b）。

OsNIP2;1与来自水稻的ATP合酶亚基β相互作用

LSI1.编码水通道蛋白OsNIP2；1，这是一种结节蛋白26样内在蛋白（NIP），定位于细胞膜LSI1.在杜拉尔水稻中，使用泛素启动子导致该蛋白在细胞质中定位，使OsNIP2；1发挥多种作用。还研究了OsNIP2；1与OsSHMT之间的相互作用。结果表明OsNIR2；1与OsSHMT之间没有直接相互作用。然而，OsNIP2；1与同样相互作用的蛋白质ATP synβ相互作用结果表明，ATP合成β作为OsNIP2；1和OsSHMT之间的中间连接（图。7）.

植物在低温条件下经常会产生ROS的积累，从而导致细胞膜脂质过氧化。我们的研究表明OsSHMT在清除H₂O₂在工厂。OsSHMT已被宣布在线粒体，叶绿体，细胞质，细胞核，细胞质膜和细胞溶质[本地化13,18,19]，并参与光呼吸途径。此外，我们目前的研究表明，OsSHMT也定位于内质网，内质网是蛋白质和脂质合成、膜生物发生、外源性解毒和细胞钙储存的主要细胞器[20]．OsSHMT清除H₂O₂被认为是突出的，当大米经历低温胁迫。

清除H₂O₂，发现OSSHMT与几种蛋白质相互作用。在这些相互作用的蛋白质中，APX是具有ROS-扫描活性的蛋白质。在拟南芥蒂利亚纳，胞质溶血物过氧化物酶1（APX1）是H的中心部件₂O₂-scavenging系统，不存在在敲除线APX1的导致叶绿体H的崩溃₂O₂通关系统，从而增加h的水平₂O₂和氧化蛋白[21]．热休克蛋白HSP70也与OSSHMT相互作用。Hsp70是分子伴侣蛋白，在压力耐受中发挥关键作用[22];在水稻中，叶绿体定位的Hsp70对高温条件下的叶绿体发育至关重要，而水稻中线粒体Hsp70的过表达抑制了程序性细胞死亡[23,24]因此，Hsp70的多种功能有助于提高水稻的耐冷性。由于ATP是清除活性氧的催化反应所必需的，OsSHMT还与ATP合成酶的α亚单位和β亚单位相互作用。这些亚单位广泛分布于线粒体和叶绿体中，并且与亚单位在ADP产生的ATP中起作用，在膜上存在质子梯度，这是由呼吸链的电子传递复合物产生的[25]，线粒体底物载体家族蛋白催化ADP/ATP等亲水性化合物通过线粒体内膜[26]．这些蛋白质的协调出现了OsSHMT在清除H激活ATP提供₂O_2.

OsSHMT在清除H₂O₂，增加表达水平OsSHMT有助于提高其能力。基因表达OsSHMT是更高的LSI1.-OX水稻比野生型Dular [6]．表达水平的不同OsSHMT来自这两个水稻品系主要归因于转录调节器将所述表达OsSHMTNABP和组蛋白H1是两种转录调节因子，它们与基因启动子结合OsSHMT．NABP具有在转录和转录后水平的基因表达的调节双重作用[27,28]．真核生物中的组蛋白是一种结构蛋白，它与DNA结合形成染色质核小体。组蛋白H1通常被认为是一种转录抑制因子，因为它阻止转录因子和染色质重塑复合物进入DNA [29]．其他一些蛋白，包括aaa - atp酶家族蛋白和含微管蛋白/FtsZ结构域蛋白，在这些dna结合蛋白中同时出现。微管蛋白是植物微管的主要成分，在调控抗逆性中起重要作用，从而对各种胞内和外界刺激作出反应[30,31,32]．更高的转录水平LSI1.表明这些因子在调控-OX水稻的表达方面具有积极的作用OsSHMT基因。无论这些蛋白质是精确的还是间接的与OsSHMT基因启动子还有待进一步研究。

过表达LSI1.导致内质网的定位LSI1.-encoded Nod26-like intrinsic protein (OsNIP2;1)。由于OsSHMT也定位于内质网，ATP合酶β亚基分别与操作系统NIP2 1和OsSHMT，表明OsNIP2 1可以间接地通过ATP合酶β亚单位的OsSHMT合作，并OsSHMT与防御和抗氧化有关的蛋白相互作用调节水稻的抗冷性，并确保其正常生长发育。在OsSHMT表达的增加和清除^ h发挥建设性作用₂O₂提供部分援助，以挽救由于蛋白质失活导致的杜拉米抗冷性丧失DUA1．

过表达LSI1.在寒冷敏感Dular大米导致质膜本地化OsNIP2; 1来执行多个角色; 1种蛋白在细胞质中，这将使OsNIP2表达。表达操作系统SHMT在LSI1.-OX线与双线比较。差异基因表达水平OsSHMT可能受NABP和组蛋白H1的转录调控。此外，OsSHMT与APX、Hsp70、ATP-synα、ATP-synβ和MSCP相互作用，清除H₂O_2.和ATP-synβ相互作用与OsNIP2; 1。甚至OsSHMT不直接相互作用与OsNIP2; 1，ATP合酶亚基β是OsNIP2之间的中间结; 1和OsSHMT（图8）.

植物材料及处理

在本研究中，双季稻(水稻亚种．籼稻)及其转基因系LSI1.超表达(LSI1.牛)使用;糙米被保存在福建农林大学(福州，中国)LSI1.-OX转duular转基因系在我们前期研究中萌发[33]．拟南芥蒂利亚纳与依赖RNA的RNA聚合酶6基因突变(rdr6) [34),尼古利亚娜·宾夕法尼亚州［35[本研究也用于本研究。

杜拉尔河LSI1.-OX水稻种子用25%次氯酸钠溶液(W/V)消毒30分钟，用无菌水洗涤，以清除任何残留。无菌种子在30°C的培养箱中浸泡过夜。种子发芽后，在黑色的花盆里播种，花盆里装满了悬浮在聚乙烯网中的水培营养液。在人工气候室中放置10天，在26°C下保持14 h，在22°C下保持10 h黑暗。室内相对湿度保持在85%左右。营养液每周更换一次，整个实验过程pH保持在5.5 ~ 6.0之间。

当稻子长到三叶期时LSI1.-OX和野生型杜鹃为处理组，处理温度为12°C/10°C(昼/夜)，对照组为置于另一室内，日/夜温度为26°C/22°C的2个水稻品系。每个品系处理和对照组均设4个重复，在同一生长室内重复3次。

蛋白质亚定位

编码的DNA序列OsSHMT（LOC_Os03g52840)被放大并融合eYFP在pCambia2300中构建重组35S:OsSHMT-eYFP矢量水稻原生质体转化。的亚细胞定位操作系统使用共聚焦激光扫描显微镜检测SHMT。将细胞器特异性蛋白质标记物（MCHERRY）与OSSHMT共定，以验证上述结果。同时，仅包含黄色荧光蛋白基因的空白载体分别转移到水稻原生质盒中以作为参考。将水稻原生质体在28℃下培养48小时。通过激光共聚焦显微镜观察原生质体中黄色荧光的分布，以确定OSSHMT蛋白的亚细胞定位。

DNA下拉鱼转录调控子与启动子的结合OsSHMT

4个重复的第2顶叶片分别在冷冻处理后48 h取样。这些水稻叶子很快就被冷冻在液氮中。杜仲和杜仲的天然叶片蛋白质LSI1.-OX用Pi-IP缓冲液(50 mM Tris·Cl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1× EDTA-free蛋白酶抑制剂鸡尾酒，罗氏，默克)提取(方法S1)。启动子区(cd2上游2549 bp)OsSHMT)从杜拉尔的基因组DNA中克隆，启动子上的相互作用蛋白按照我们之前的研究方案获得[36]．

定量PCR检测基因表达水平

杜拉尔和杜拉尔的总RNALSI1.-牛米exposed to a temperature of 15 °C for 12, 24 and 36 h was extracted using Trizol and reverse-transcribed into cDNA using TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix. The control groups were grown at 26 °C for 12, 24 and 36 h. Specific primers for tubulin/FtsZ domain containing protein (LOC_Os03g51600, LOC_Os05g34170, LOC_Os07g38730), histone H1 and nucleic acid binding protein (NABP) are listed in Table S3.以β-肌动蛋白基因为参照物，利用TransStart Tip Green qPCR SuperMix和Eppendorf realplex制备了qPCR反应体系⁴反应过程如下：在94℃预变性 摄氏30度 s、 94℃变性 摄氏度5 s、 55℃退火 摄氏15度 s、 72分机 摄氏10度 s、 42 扩增完成后，进行熔融曲线分析，并根据熔融曲线确定产物的特异性。每个候选mRNA设为四个独立的重复。通过2^-△△Ct方法，计算对照组和测试样本中每个候选mRNA的阈值周期值(Ct) [37]．

拟南芥蒂利亚纳转换

的CDOsSHMT被扩增并插入修饰的pcambia3301（用35升启动子）以构建重组载体拟南芥蒂利亚纳使用Clough和Bent描述的花浸协议进行转换[38]．天然叶蛋白从叶甲中提取_3.一代的结合体OsSHMT转基因答:芥并与GFP-Trap琼脂糖(Chromotek)孵育，以收集推定的相互作用蛋白。

双分子荧光互补（BiFC）验证了水稻与蛋白质的相互作用

BiFC用于验证OsSHMT与从Co IP结果中鉴定的蛋白质之间可能存在的相互作用。编码这些蛋白质的基因是从杜拉尔水稻中克隆的，我们先前的研究中提供了每个基因的重组载体的构建和BiFC的后续方案[36]．

DAB染色与H的测定₂O₂内容

检测H₂O₂在叶中使用二氨基联苯胺（DAB）染色进行;OsSHMT转基因答:芥和野生型分别在4℃处理12、24和36 h。在同一生长室内重复三次。取这两个品系的叶片，抽真空浸泡在50 mg/L的DAB溶液中1 h，室温孵育过夜。用95%乙醇在80℃水浴中脱色，利用集成显微镜(尼康，SMZ18)观察转基因叶片和野生型叶片的红褐色斑点。H₂O₂转基因株系和野生型叶片在12 H处理后的含量用H₂O₂检测试剂盒(Solarbio Life Sciences)。

引物序列

引物清单见表S3.．

本研究产生的所有数据均包含在本发表的文章及其补充信息文件中，本研究中使用或分析的原始数据可在合理要求下由通讯作者提供。

APX型:

抗坏血酸盐过氧化物酶

BiFC:

双分子荧光互补

轻拍：

Diaminobenzidine

呃：

内质网

LSI1.：

低硅基因1

牛:

过度表达

SHMT:

丝氨酸hydroxymethyltransferase

夹:

Nodulin 26样的内在蛋白质

ROS：

反应性氧气

NABP:

核酸结合蛋白

HSP70：

热休克蛋白70

我们感谢福建农林大学基础林业和蛋白质组学研究中心提供的种子拟南芥和本生烟草，以及植物生长的温室。

国家自然科学基金（批准号31871556）资助中国福建农林大学杰出青年科学基金（批准号：XJQ201805），福建农林大学作物科学学院作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室开放项目（批准号GBMUC-2018-001），闽台作物种质资源与栽培联合创新中心（FJ 2011项目，批准号2015-75）福建农林大学科技创新基金会（批准号：CXZX2017310、CXZX2017145、CXZX2018042）、现代种子工业工程研究所基金会，资助方在研究设计、数据收集与分析、数据解释、稿件撰写等方面没有任何作用。

作者指出

1. 方长勋、张鹏力对这部作品贡献相当。

隶属关系

1. 福建农林大学生命科学学院，福建省农业生态加工与安全监测重点实验室，福州，350002

   张勋方，鹏连张，兰兰李，卢克杨，丹麦，薛艳，钟立和文雄林

2. 福建省大学作物生态学与分子生理学重点实验室（福建农林大学），福州，350002

   张勋方，鹏连张，兰兰李，卢克杨，丹麦，薛艳，钟立和文雄林

3. 福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室，福州，350002

   招待会林

贡献

CF和WL设计了实验。PZ、LL和CF进行了大部分实验，并对数据进行了分析。LY、DM、XY、ZL协助实验并对结果进行讨论。CF和WL撰写了手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

通讯作者

对应到招待会林．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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