水稻产量性状的关联作图芍药属rockii基于比较转录组转录因子内的SSR标记

背景

植物数量性状的等位变异是由极其复杂的调控过程引起的。牡丹原产于中国，是一种特有的观赏、药用、油料木本植物。芍药属rockii牡丹属植物之一，是珍稀新兴木本油料作物。然而，在这种有价值的植物中，与产量性状相关的功能位点的研究很少被发现。为此，为探索24个产量数量性状的遗传结构，首次在420个非相关栽培品种中进行了关联作图p . rockii基于下一代测序(NGS)和单分子长读测序(SMLRS)的个体。

结果

从959个与产量相关的候选转录因子(tf)中筛选出58对多态性表达序列标记-简单序列重复(EST-SSR)标记，对这420个转录因子进行基因分型p . rockii登记入册。我们观察到EST-SSRs之间具有较高的遗传多样性(多态性信息含量，PIC = 0.514)和较低的连锁不平衡(LD)。此外，通过结构分析，在关联群体中发现了4个亚群体。此外，单标记关联分析确定了141个显著关联，涉及17个数量性状和41个EST-SSRs。这些位点主要来自AP2、TCP、MYB、HSF、bHLH、GATA和B3基因家族，表型方差占比较小(3.79 ~ 37.45%)。

结论

我们的结果总结了一个有价值的与水稻产量性状相关的功能位点集合p . rockii，并提供了揭示在数量性状基础上的等位变异的宝贵资源芍药属以及其他木本油料作物。

木本油料作物因其种子和(或)果实含油量高、抗性强、产量稳定而成为全球重要经济作物。现在已成为人类食用油、润滑油、生物柴油、化妆品、油漆等行业的关键来源[1，2］．p . rockii(S. G. Haw et L. A. Lauener)洪天和李俊杰属于芍药属部分牡丹直流。，芍药属ceae, which is originated from northwest China and has become one of the most representative species of tree peonies. The varieties originated from the species have been cultivated widely in China as the second-largest cultivar group of Chinese tree peonies, including about 300 cultivars [3.，4］．除了观赏和药用种植，p . rockii近年来在种子产量和种子中不饱和脂肪酸含量方面也表现出优势的农艺性状[5］．因此,p . rockii已迅速扩展为一种新兴的木本油料植物。然而，如何利用分子育种方法提高育种效率和种子产量已成为当务之急。牡丹育种系统以异交为主，栽培品种为杂交来源[3.］．传统的牡丹种质选育方法主要有杂交选育和选育两种，培育一个稳定的新品种至少需要10年时间。因此，早熟期长，遗传背景复杂，传统育种和逆向遗传方法很难提高产量。水稻产量性状的遗传结构优化策略p . rockii将要求有效缩短养殖周期，提高生产价值。

目前，关联作图已广泛应用于各种物种重要数量性状位点(QTL)的鉴定和遗传检测[6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17］．在农作物产量方面的研究也取得了一些进展。流行的陆地棉(陆地棉利用172个中国品种和331个多态性ssr进行了产量相关性状的关联作图。在多个环境中，共鉴定出7个产量性状的93个显著相关位点[18］．为揭示陆地棉产量和产量组成性状的遗传变异，采用混合线性模型对403份材料和560个全基因组ssr进行了关联作图。根据最佳线性无偏预测，共检测到43个标记位点，在6个环境中的至少3个环境中(−lgP> 1.30,P< 0.05) [19］．在大麦芽，共对379个品种进行全基因组关联作图，鉴定了控制产量相关性状的等位基因，获得了13个调控欧洲栽培大麦籽粒性状的推测基因[20.］．在小麦中，采用混合线性模型进行关联作图，以确定产量相关性状的KASP标记。结果表明，TaSnRK2.9-5A的Hap-5A-1/2具有较高的千粒重，而Hap-5A-4具有较高的穗粒数[21］．这为鉴别与牡丹等木本油料作物产量性状密切相关的分子标记提供了有益的参考。

在几十个标记中，虽然通常使用SNP标记进行作物关联作图，但SNP位点一般为双等位多态性，明显低于SSR标记，开发和检测成本较高。因此，SSR标记具有共显性遗传、广泛的基因组覆盖、染色体特异性定位、相对丰度和高通量基因分型等优点，在关联分析中越来越受欢迎[22］．特别是编码区SSR位点作为表达的tf，具有物种保守性，可直接影响基因的转录或翻译[23，24，25］．目前，EST-SSRs已用于不同物种的遗传多样性和群体结构评价、品种鉴定和图谱构建[26，27，28，29，30.，31，32，33］．EST-SSRs被认为是检测高杂合度木本植物的理想标记类型。在牡丹中，SSRs的开发和应用报道也在广泛增加[34，35，36，37，38，39，40］．然而，分子标记特别是EST-SSRs的覆盖范围仍然有限，这限制了功能标记在遗传多样性、群体结构、LD和关联分析等方面的广泛应用。

转录因子可以调节基因表达，在产量调控中起着至关重要的作用。例如，IPA1(理想植物结构1)可以通过维持水稻生长和免疫之间的平衡来提高产量和抗病性;含CCT结构域的基因家族对抽穗期、区域适应性和籽粒产量有显著影响[41，42］．在小麦、TaNAC2-5A过表达转基因小麦在地上部分表现出较高的产量和氮素积累量;小麦CCAAT包装箱TF可在化肥投入较少的情况下提高小麦产量[43，44］．在Maize中，SBP-box tfunbranched2而且unbranched3通过调节侧原基起始率影响产量性状;核因子Y (NF-Y) B亚基具有耐旱性，可提高缺水英亩的玉米产量[45，46］．在芸苔属植物显著，油菜素内酯生物合成基因过表达DWF4同时提高种子产量和抗逆性[47］．在牡丹中，首次尝试结合与产量相关的tf中的SSR位点进行关联作图p . rockii．

综上所述，对水稻产量性状相关等位变异的研究p . rockii通过结合关联映射和tf内的标记很少被报道。在这里，我们采样了栽培的p . rockii用于关联映射的填充。然后，利用比较转录组对EST-SSRs的遗传多样性和群体结构进行分析。此外，通过LD和单标记关联作图，探讨了等位基因对构建群体复杂产量性状自然变异的影响。本研究结果将为确定水稻产量性状的连锁位点奠定基础p . rockii对木本油料作物产量性状的遗传改良具有重要意义。

关联群体中表型性状的分布与统计

本研究采用多种方法对水稻表型性状进行描述性统计，确定影响水稻产量的性状p . rockii．采用R包进行单因素方差分析，24个数量性状之间均存在较大的表型变异范围。变异系数为12.03 ~ 106.63%，平均38.60%。枝、叶、花、果性状的平均变异系数分别为22.57、37.21和49.75%1:表S1-1)。不同性状间的相关分析显示有202个显著相关(P< 0.05)，其中182例相关性极显著(P< 0.01)(附加文件1:表S1-2)。主成分分析表明，24个数量性状可分为6个主成分，累积方差达73.93%1:表S1-3)。然后，基于6个主成分进行系统聚类分析。结果表明，亲缘群体被划分为8个类别，24个数量性状被划分为5个类别，其平方欧氏距离分别为12和181:表S1-4，附加文件2:图S1)。

综上所述，以单株种子鲜重为产量指标时，我们发现各性状与产量相关。同时，单果数、单果鲜重和单果粒数可被认为是影响产量的主要性状p . rockii．花径、花瓣长、花瓣宽、株高、冠宽、复叶长、复叶宽、最大基枝角、单果长、单果宽、单果果皮厚度、多果鲜重、多果籽数、多果籽鲜重、多果荚果鲜重等15个性状可视为次生性状。其余性状可视为辅助参考因子。

遗传多样性

利用TFs内的58个多态性ssr对420个栽培基因型的遗传多样性进行了评价p . rockii．共检测到483个等位基因。每个位点的等位基因(N_一个)范围从3到16，平均为8。有效等位基因数(N_E)范围为1.02 ~ 7.32，平均为2.83。PIC值为0.021 ~ 0.849(平均0.514)，Shannon信息指数(我)范围为0.07 ~ 2.18(平均1.13)。观察杂合度的平均值(HO)和期望杂合度(H_E)分别为0.529和0.561。自HO高于H_E在26个EST-SSR位点上，莱特近交系数(F_是)的取值范围为−0.828 ~ 0.867，平均值为0.0481)。综上所述，所有EST-SSRs均表现出较高的多态性。

人口结构

结构分析用于确定种群结构。结果表明，LnP（D)达到一种模式K= 4，然后递减，最大的deltaK被检测到时K= 4(图1a, b).讨论了物种的遗传结构，结果到K= 6。在STRUCTURE中实现的贝叶斯方法揭示了每个样本的广泛混合祖先p . rockii．两个主要的分离良好的遗传簇(I-III, IV)在K= 2-6，其中观察到4个分离良好的遗传簇(I、II、III和IV)K= 4-6(图1c).因此，420个类群被划分为4个亚群。

协会人群的LD水平

利用58个多态性EST-SSR标记对该群体的LD进行了评价。在总共1653对标记中(r²区间为0.001 ~ 0.504)，64.13、58.08和47.91%的EST-SSR位点表现出显著的LDP< 0.05,P< 0.01，P分别< 0.001。基于r²估计只有0.67% (r²≥0.05)和0.18% (r²因此，EST-SSR位点之间的LD总体水平较低，且多数处于连锁平衡状态(r²< 0.1;P< 0.001)，如MYB基因家族中的PS10 (PB.32979.2)、PS12 (PB.59960.1)和PS17 (PB.53756.4)。然后，在793个评估位点对中(P< 0.001)， 479例r²水平> 0.005(60.40%)。其中，有几个位点LD值显著，如其中的PS50PSTCP11(PB.61740.1)(图。2)。

水稻产量数量相关性状的关联图谱p . rockii

基于基因型数据问矩阵,K矩阵和产量数量性状数据，采用MLM模型分析标记-性状关联。对于与产量相关的花性状，我们进行了232 (58 EST-SSRs × 4个性状)标记-性状关联试验。其中，EST-SSR位点7个，10个位点(4.31%)显著P< 0.01水平。然而，使用FDR方法对多次测试进行校正后，在显著性阈值为的情况下，数值降至8 (3.45%)问< 0.05，涉及7个EST-SSRs的3个性状。这些位点解释了4.93 ~ 25.32%的表型变异，平均为11.49%。各性状间的关联数为2(花瓣长度)~ 3(花径和花瓣数)。一个EST-SSR (PS31)与至少一个性状相关。8个关联中的3个，基因效应显示显性(|d/一个| > 1.25)。其余5个关联显示添加性(|d/一个| < 0.50, 2)或部分显性至完全显性(0.50 < | . 2)d/一个| < 1.25, 3)(附加文件3.:表S2-1)。

对于与产量相关的分枝和叶片性状，我们进行了464 (58 EST-SSRs × 8个性状)标记-性状关联试验。其中，39个EST-SSR位点在阈值上显著，102个(21.98%)P< 0.01。然而，使用FDR方法对多次测试进行校正后，在显著性阈值为时，数值降至87 (18.75%)问< 0.05，涉及7个性状，36个EST-SSRs。这些位点解释了3.79 ~ 37.45%(平均11.06%)的表型变异。各性状间显著相关数差异为2(冠宽和最大基枝角)至32(顶小叶面积)，如附加文件所示3.．31个EST-SSRs与至少一种性状显著相关。例如，PS25与株高、顶叶面积、顶叶长度和复叶宽度有关。42个关联的基因效应模式为显性，22个为加性，其余46个为部分或完全显性(附加文件)3.:表S2-2)。

对于与产量相关的果实性状，我们进行了696次(58个EST-SSRs × 12个性状)标记-性状关联试验。其中64个(9.20%)关联，包括30个EST-SSRs在阈值时显著P< 0.01。然而，使用FDR方法对多次测试的校正将数量减少到46(6.61%)，显著性阈值为问< 0.05，涉及7个性状，26个EST-SSRs。这些位点解释了表型变异的4.45% ~ 30.29%(平均11.47%)。各性状间显著相关数差异为3(单果果皮厚度、多果种子数)至12(单果数)，见附加文件3.．11个EST-SSRs与至少一种性状有显著相关性。例如，PS43与单果数和多果荚鲜重有关。21个关联的基因效应模式为显性，15个为加性，其余10个为部分或完全显性(附加文件)3.:表S2-3)。

与产量性状相关的性状p . rockii

根据关联作图结果，我们发现花性状与5个基因家族(AP2、NAC、GATA、HSF和GRAS)的SSR位点显著相关，分枝和叶片性状与16个基因家族(AP2、MYB、TCP、bHLH、HSF、GATA、B3、WRKY等)显著相关。果实性状与15个基因家族(AP2、HSF、MYB、WRKY、GATA等)显著相关(附加文件)3.:表S2)。与这3种性状相关的基因家族分别为AP2、GATA、HSF和NAC，其中AP2(29)基因家族的相关频率最高。此外，这3种性状均表现出同一性状与来自多个基因家族的EST-SSRs之间的关联。例如，多重水果鲜重与MADS-box基因家族的PS2和AP2基因家族的PS30显著相关。此外，三种性状均普遍表现为多效性。例如，TCP基因家族中的PS53与多果种子数和多果种子鲜重显著相关。来自MYB基因家族的PS12与多果鲜重、多果籽鲜重和多果荚鲜重显著相关(附加文件)3.:表S2)。

与果实性状相关的SSR位点

由于果实性状与产量显著相关，我们进一步分析了与果实性状相关的EST-SSRs的关联作图结果。剔除单果数、花瓣数、顶小叶面积、顶小叶长度和顶小叶宽度5个贡献率较小的性状。此外，结果显示，49种关联在阈值处显著P< 0.01，问< 0.05，表型方差解释为4.45 ~ 37.45%(平均11.09%)。EST-SSRs之间的显著关联数为1 ~ 7,19个EST-SSRs中有11个与至少一个性状表现出显著关联。21个关联的基因效应模式为显性，15个为加性，其余13个为部分或完全显性(表2)2)。PS66 (HSF)、PS2 (MADS-box)、PS53、PS57 (TCP)、PS7 (RING)、PS145 (WD)、PS122、PS131 (WRKY)、PS94 (YABBY)、PS85 (NAC)和PS43 (bHLH)是仅与果实性状相关的EST-SSRs，可作为MAS育种的重要参考p . rockii．

种群的遗传多样性

群体进化解剖和关联分析的一个重要前提是明确定位群体的遗传多样性和所使用标记的多态性[48］．在此，我们用58个EST-SSRs进行了遗传多样性评价p . rockii．结果表明，平均等位基因数为8个，高于亲本无花果［27]，黄连木王者世界［28]，Cucumis梅洛［29]有教养的p . rockii［39]，但低于野生p . rockii［4］．在这里，我们推测可能是由于本研究的关联群体主要由栽培种质资源组成，且在中存在较高的杂合度p . rockii．同时，EST-SSRs的数量和类型以及测试人群的特征不同。

此外，人口F_是［49，50]的变异范围为−0.828 ~ 0.867，平均为0.048，其中26个EST-SSRs为阴性，说明该映射群体存在显著的杂合冗余。我们推测这与中国栽培种质的杂交起源和自交不亲和有关p . rockii［3.]，这与中报道的结果一致Populus tomentosa［51),p . rockii［39)等。此外，进化过程中突变位点的正向选择和杂种优势也是造成杂合冗余的关键原因p . rockii．因此，我们的结果证明了高度杂合冗余是一种重要的生物学特性p . rockii，进一步支持了栽培资源的观点p . rockii都是复杂的杂交起源[3.］．

与其他异交木本植物相比，我们检测到高水平的遗传多样性p . rockii(pic = 0.514) [52，53]，高于p . tomentosa［51),f . carica［27]，但低于p .王者世界［28),李属鸟结核［54］．这与报道的低多态性水平的遗传ssr的结果不同，这可能是由于栽培的杂交起源p . rockii或者在这项研究中，我们对具有显著基因型差异的资源进行了采样。

人口结构

对作物群体结构的分析，不仅可以反映个体间的基因交换和亲和性，也是关联作图的前提，有利于提高作图效率，避免假阳性的出现[55］．在本研究中，基于STRUCTURE分析，协会种群被分为四个亚种群，这与之前的报道不同p . rockii［39］．我们推测这是由于EST-SSRs和种群大小的差异造成的。在此基础上，分析了栽培种质资源的遗传信息p . rockii主要分为4个亚群，这与本研究栽培种质来源一致，如图所示。3.．我们推测，这四个亚种群可能对应于四个基因库，并类似地反映了它们的地理起源。这也是丰富的遗传多样性的一个重要原因。

木本植物的LD水平

群体LD水平的分析不仅是关联作图的遗传基础，而且为选择合适的关联分析策略提供了参考。一般来说，异花授粉植物的LD水平较低，如p . tomentosa［6，7，56]，桉树［57]，陆地棉［58),p . rockii［39］．牡丹属异交种，因此在关联群体中，EST-SSRs之间的LD水平较低。我们推测，大量的人为干预，如杂交、控制授粉和种质交换也是导致低LD水平的根本原因p . rockii．此外，遗传- ssr位点的LD水平不能代表全基因组或基因间隔区水平，这也可能导致LD水平偏低[59］．此外，缺乏基因组信息和未知的EST-SSR位点的遗传距离p . rockii限制了标记间LD衰减的分析，有待进一步研究。

产量数量性状的关联QTL定位

基于候选基因的SSR标记在调控数量性状相关基因的表达和功能方面具有较高的遗传效应[60］．在该群体中鉴定出41个est - ssr和141个与产量性状相关的关联p . rockii．其中，来自MADS-box、AP2、MYB等基因家族的SSR位点表现出较高的遗传效应。同时，一个性状与多个基因家族的SSRs之间不仅存在显著相关性，而且存在多效性或共定位相关性，这与已有报道的结果一致[6，21，39］．我们推测，这些多效性关联有助于发现重要的基因组区域，并在利用MAS进行性状改良中有价值。

在这项研究中，我们检测到176个与三种不同类型的性状相关的组合。尽管如此，经过多次测试校正后，这个数字减少到141，这进一步提高了关联结果的准确性。此外，研究表明，种群规模和结构的差异会导致关联映射结果的变化。典型的关联种群应该是来自同一地区的多个独立且不相关的个体的组合[61］．因此，为了减少假阳性关联，提供对等位基因变异的高精度估计，我们还需要结合不同地区或分子生物学实验的验证群体来验证关联结果[62，63］．

植物复杂数量性状的关联作图可以检测到许多显著相关的标记，但只能解释一小部分表型变异[64］．本研究EST-SSRs在花(10.81%)、枝叶(10.40%)和果实性状(6.53%)上的平均解释率较低，与报道结果一致[59，61］．此外，分析植物数量性状的遗传调控关系有助于利用显著关联组合进行育种。例如，关联中的加性效应位点可以通过累积遗传效应解释显著的遗传变异，而超显性效应位点表明杂合子可能优于纯合子。在本研究中，单果长与2个EST-SSRs (PS131、PS94)呈显著加性相关，在不考虑标记间效应的情况下，这2个EST-SSRs加在一起可解释14.63%的表型变异。PS66与多果种子鲜重显著相关，且表现出超优势效应(|d/a| = 4.877)，表明在关联群体中具有PS66杂合位点的个体可能产生较重的种子。因此，优势位点的组合可能表现出更强的杂种优势。综上所述，具有相同正负效应的基因型组合可用于目标性状的早期选择。

来自AP2基因家族的转录因子与产量相关

具有APETELA2 (AP2)结构域的转录因子在植物生长发育和胁迫响应中起着重要作用。研究还表明，来自AP2基因家族的tf与作物产量提高有关[65，66，67，68］．在本研究中，来自AP2基因家族的tf不仅与这三种性状显著相关，而且相关频率最高。因此，我们推测来自AP2基因家族的转录因子是调控小麦产量数量相关性状的重要因素p . rockii．此外，具有AP2结构域的tf拟南芥而且栽培稻可控制种子重量和种子产量[65，66］．在本研究中，来自AP2基因家族的PS19 (PB.50898.1)与种子数(多果种子数，|)显著相关d/一个| = 1.517)和种子重量(多果种子鲜重，| . 1)d/一个| = 1.444) inp . rockii，基因效应模式均为显性(| .d/一个| > 1.25)。因此，我们推测PS19可能是调控种子产量的重要标志p . rockii．此外，来自AP2基因家族的tf也与果实大小、果实重量等其他产量性状显著相关，这有待于未来的研究进一步验证。

myb样tf与产量相关

MYB蛋白家族是植物转录因子的一个大家族，参与植物生长发育的调控[69，70，71，72，73，74］．具有MYB结构域的转录因子在作物产量调控中发挥重要作用[75，76，77］．在本研究中，除了AP2基因家族外，来自MYB基因家族的tf在定位人群中也表现出更多的相关性。MYB基因家族中的3个EST-SSRs (PS10、PS12和PS17)与果实性状(4个关联)和枝叶性状(11个关联)显著相关。其中，PS12 (PB.59960.1)与果实重量和种子重量相关性状显著相关，如附加文件所示3.:表S2。我们推测PS12是调控小麦产量的关键SSR位点p . rockii．此外，一项研究表明，新的myb样TFOsMPH1可调节水稻株高，提高水稻产量[76］．MYB基因家族中的PS10 (PB.32979.2)和PS17 (PB.53756.4)主要与分枝和叶片性状相关。其中，在定位群体中，只有PS17与株高显著相关。因此，我们推测PS17是调控水稻株高与产量关系的重要SSR位点p . rockii．

的关联映射p . rockii，我们首先构建了一个由420个个体组成的关联种群。然后选取58个与产量相关的SSR多态性位点进行关联作图。利用多态性位点对该群体的遗传多样性和群体结构进行了评价，结果表明该群体具有较高的多态性水平，并有4个亚群体。基于单标记的关联分析结果表明，17个产量数量性状由16个基因家族的41个EST-SSR位点调控，共鉴定出141个显著关联组合。这些结果为探索与牡丹产量性状相关的有效功能位点提供了实用信息，对油牡丹产量相关性状的选择和高产品种的培育具有重要意义。

植物材料

育苗资源20万余株p . rockii主要由北京果色牡丹科技有限公司在中国西北部甘肃省鉴定采集。所有这些材料都代表了与产量数量性状相关的不同遗传资源，并在中国北京(40°45′n, 115°97′e)的北京鹅塞牡丹园露天田采用一般农艺措施进行栽培(图1)。3.)。然后根据尽可能覆盖现有表型变异的原则，我们从集合中抽取了420个个体。所有被评估的样本都大约有15年的历史，涵盖了三种主要的花类型和八种配色方案。共观察到24个表现稳定的数量性状，表明表型性状的组合是有效的。

表型数据

根据24个候选数量性状(每个基因型至少3个重复)对来自关联群体的420个个体进行评分。总的来说，在盛花期用数字卡尺(YB5001B，中国卡夫十二工业有限公司)或卷尺测量了四种花性状(花直径、花瓣长度、花瓣宽度和花瓣数)。测定了8个枝叶性状(株高、冠宽、顶叶面积、顶叶长、顶叶宽、复叶长、复叶宽、最大基枝角)。其中，株高、冠宽、复叶长、复叶宽用卷尺测量，最大基枝角用量角器Edge测量，其他性状用CI-203激光叶面积仪(CID, USA)测量。同时测定了单果数、单果长、单果宽、单果果皮厚度、单果鲜重、单果籽数、单果籽鲜重、单果荚鲜重、单果数、单果鲜重、单果籽数、单果籽鲜重等12个果实性状。电子天平被用来测量重量。其他性状用数字卡尺和卷尺测量4:表S3)。

DNA提取和EST-SSR标记基因分型

对于关联群体中的每个个体，使用EASYspin Plus复杂植物DNA试剂盒(Aidlab生物技术有限公司)从硅胶干燥的新鲜和幼叶中提取总基因组DNA。北京，中国)根据制造商的说明进行了微小的修改。每组总DNA 5微升采用1%三乙酸- edta (TAE)琼脂糖凝胶电泳，1 μL采用NanoDrop ND2000 [78) (A260 / A280 > 1.8, 28 s / 18岁> 1.0,DNA浓度≥200 ng /μL)。然后调整DNA浓度至50 ng/μL进行聚合酶链反应(PCR)。

我们对花蕾进行了RNA-seq实验p . rockii“Jingshunfen”和p . rockii基于NGS和SMLRS技术的“Fenmiantaosai”[79］．RNA-seq数据已提交到NCBI序列读取档案(SRR9915032，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRR9915032， SRR10872586，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRR10872586)。根据测序数据，从21个与产量相关的基因家族中筛选出959个候选tf。共鉴定出166个含有6个核苷酸重复类型的est -SSR，平均每5.78个ungenes有1个SSR。其中，已有58个EST-SSR多态性标记被鉴定为有效的芍药属(未发表的观察^脚注1)。选择这58个EST-SSRs对420份资料进行基因分型(附加文件)5:表S4)。

每次PCR反应的总反应量为10 μL，其中含有5 μL 2 × Power Taq PCR MasterMix (BioTeke, Beijing, China)，每个引物0.5 μL (10 pmol)， 3.0 μL dd H₂O和1 μL (50 ng)模板DNA。扩增程序为:95℃下5 min, 95℃下30 s，适当退火温度下30 s, 72℃下1 min, 72℃下10 min, 4℃保持。在1%琼脂糖凝胶上进行PCR扩增后，使用ABI3730XL毛细管测序仪和内部尺寸标准(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)进行毛细管电泳分离。多态EST-SSR位点用genemark v1.80软件读取，采用LIZ 600大小标准(SoftGenetics, State College, Pennsylvania, USA)。随后，Micro-Checker v2.2.3 (http://www.microchecker.hull.ac.uk/)用于识别和纠正基因分型错误[80］．

数据分析

采用变异系数(CV/ % =标准差/均值× 100%)、单因素完全随机试验设计(单因素完全随机试验设计)、相关分析、主成分分析(PCA)、聚类分析等24个定量性状进行描述性统计。所有数据均采用IBM SPSS statistics 20.0软件和R语言包进行统计。

利用所开发的58个多态EST-SSRs对关联群体的遗传多样性进行了分析。的统计摘要N_一个，N_E，何，H_E、图片、我而且F_是采用GenAlEx v6.501计算[81]和POPGENE v1.32 [82］．利用所开发的58个多态EST-SSRs对种群结构进行分析和评价。软件包STRUCTURE 2.3.4中的贝叶斯方法(http://pritch.bsd.uchicago.edu/structure.html) [83]，用以推断亚种群的数目(K)。对于每一个值K（K= 1-19)，进行10次独立试验，磨合期为100,000次，随后进行200,000次马尔可夫链蒙特卡罗(MCMC)重复。然后将结果提交给结构收割机(http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/) [84］．结果，现况（D)及ΔK用来检测最优K值(85］．然后使用clupp v1.1.275对复制分析的结果进行分析，以获得最佳的复制集群对齐[86］．群集可视化程序disstruct显示来自clupp的输出[87］．使用结构分析来确定最佳群体结构并纠正关联映射的假阳性。

以等位基因频率的平方相关来衡量LDr²．的r²用10计算EST-SSRs对之间的值(小等位基因频率> 1%)⁵使用TASSEL v2.0.1软件(http://www.maizegenetics.net/)。这些位点对被认为是显着LD时P< 0.001。在关联映射中，采用TASSEL v2.0.1软件包进行标记-性状分析⁴采用混合线性模型(MLM) [88］．的问估计每个接入的隶属度系数的矩阵是从结构运行中导出的。相对亲属关系矩阵(K)采用SPAGeDi软件v1.2确定[89］．假发现率(FDR)分析采用R [90］．

基因效应采用显性比(d)到相加(一个)效应，该效应由每个基因型类的最小二乘均值估计。0.50 < |d/一个| < 1.25， |d/一个|≤0.5，|d/一个| > 1.25分别定义为部分或完全显性、加性效应和过显性或过显性。优势效应和加性效应的算法分别为d = G_Bb- 0.5(克)_BB+ G_bb)和2a = |G_BB- G_bb|，分别为(Gij:第ij基因型对应的表型均值;BB、BB:不同纯合基因型;Bb:杂合型基因型)[91］．

支持本文结论的所有数据集都在论文及其附加文件中。支持本研究结果的RNA-seq数据已存入NCBI序列读取档案(SRR9915032，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRR9915032SRR10872586,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRR10872586)。支持这些发现的材料均不含野生资源，均为栽培种质资源p . rockii。北京桂泽牡丹科技有限公司完全符合机构、国家或国际准则，并已获得相应的许可和营业执照。

1. 1.

   刘娜，程飞，郭霞，钟艳。牡丹转录因子微卫星标记的开发与应用(芍药属rockii)基于下一代单分子长读RNA-seq。综合农业杂志，2020。

p . rockii:

芍药属rockii

门店:

新一代测序

SMLRS:

单分子长读测序

EST-SSR:

表达序列标记-简单序列重复

TF:

转录因子

图片:

多态信息含量

LD:

连锁不平衡

MAS:

分子标记辅助选择

QTL:

数量性状位点

GWAS:

全基因组关联研究

p . tomentosa:

Populus tomentosa

f . carica:

无花果

p .王者世界:

黄连木王者世界

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

我们非常感谢程新云(北京果色牡丹科技有限公司)在收集和维护植物活材料方面所做的努力P．rockii为了这项研究。我们也感谢何超英(中国科学院植物研究所)对这项研究提出的建议。

国家自然科学基金项目(31972446)、北京林业大学世界一流学科建设专项项目(2019XKIS0324)资助。资助机构在研究设计、数据收集、分析和解释以及撰写手稿方面没有任何作用。

从属关系

1. 牡丹国际研究所，北京树木分子设计育种先进创新中心，观赏植物种质创新与分子育种北京市重点实验室，花卉培育国家工程技术研究中心，北京市城乡生态环境实验室，林木与观赏植物遗传育种教育部重点实验室，北京林业大学园林学院，北京，100083

   刘娜，程芳云

贡献

CF参与了植物材料的鉴定和收集p . rockii用于本研究。CF和LN设计了研究。LN收集样本和数据，进行实验，进行计算分析并撰写手稿。所有作者对最终稿进行了修改和认可。

相应的作者

对应到Fangyun程．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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