MYB44gydF4y2Ba竞争性抑制的形成gydF4y2BaMYB340gydF4y2Ba-gydF4y2BabHLH2gydF4y2Ba-gydF4y2BaNAC56gydF4y2Ba调节紫肉甘薯花色苷生物合成的复合物gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

花青素具有重要的生物学功能，对人体健康有益，是红薯块根色素沉着的重要原因。已经确定了花青素生物合成的个别调节因子;然而，紫肉甘薯花色苷生物合成的调控网络尚不清楚。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们从功能上确定了这一点gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Bacotransformed与gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba在烟草和草莓花青素的花青素积累诱导和添加gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba导致色素沉着增加。此外，我们通过酵母双杂交和萤火虫荧光素酶互补实验证实了IbMYB340与IbbHLH2和IbNAC56a或IbNAC56b的相互作用;这些蛋白可形成MYB340-bHLH2-NAC56a或MYB340-bHLH2-NAC56b转录复合物，通过与花青素的结合来调控花青素的生物合成gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba启动子而不是gydF4y2BaIbUFGTgydF4y2Ba启动子。此外，通过烟草叶片的瞬时表达系统发现gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba可以减少花青素的积累。此外，还验证了IbMYB44与IbMYB340、IbNAC56a或IbNAC56b的相互作用。这个结果表明gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba甘薯中花青素的抑制因子。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

的抑制因子gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba通过竞争性抑制花青素的合成来影响花青素的生物合成gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba-gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba-gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba-gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba-gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba调控复合体的形成。总的来说，本研究提出了一个新的调控网络，其中几个重要的tf在调节花青素的生物合成中发挥关键作用，并为紫色甘薯块根花青素生物合成的潜在机制提供了强有力的见解。gydF4y2Ba

红薯(gydF4y2Ba番薯甘薯gydF4y2Ba)以其丰富的营养价值而闻名，是中国第四重要的作物品种[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。其储藏根的颜色主要有白色、黄色、橙色和紫色。在不同颜色的红薯品种中，紫瓤红薯因其贮藏根中花青素含量高而广受欢迎。花青素是目前公认的植物中最重要的次生代谢产物，具有重要的生物学功能，包括抗病、防紫外线、防御食草动物和病原体[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。此外，在人类食谱中添加花青素对预防癌症和糖尿病以及心血管和神经疾病有有益的作用[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

花青素生物合成途径在不同植物物种中已被广泛报道，包括几个关键的结构基因，如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、黄酮3-羟化酶(F3H)、二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)、花青素合成酶(ANS)、udp -葡萄糖类黄酮3- o -葡萄糖基转移酶(UFGT)和谷胱甘肽s -转移酶(GST) [qh]gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。转录因子，特别是MBW复合物，已被证实参与协同调节花青素合成[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。其中，R2R3-MYBs对花青素的生物合成尤其有重要贡献[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。例如,gydF4y2BaAtMYB75gydF4y2Ba，gydF4y2BaAtMYB113gydF4y2Ba和gydF4y2BaAtMYB114gydF4y2Ba在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba11gydF4y2Ba];gydF4y2BaMdMYB10gydF4y2Ba和gydF4y2BaMdMYB110agydF4y2Ba在apple [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba];gydF4y2BaPyMYB10gydF4y2Ba和gydF4y2BaPyMYB114gydF4y2Ba在梨[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba];gydF4y2BaLcMYB5gydF4y2Ba在荔枝中[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba];gydF4y2BaPaMYB10gydF4y2Ba在杏[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba];和gydF4y2BaFaMYB10gydF4y2Ba在草莓里[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]作为活化剂参与了花青素的生物合成。除MYB激活剂外，还有R3-MYB和一些R2R3-MYB抑制剂，包括菊花gydF4y2BaCmMYB # 7gydF4y2Ba(一个R3-MYB)，草莓gydF4y2BaFaMYB1gydF4y2Ba和gydF4y2BaFaMYB44.1gydF4y2Ba、桃子gydF4y2BaPpMYB18gydF4y2Ba和土豆gydF4y2BaStMYB44gydF4y2Ba(R2R3-MYBs)，也被鉴定为参与类黄酮生物合成途径[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

除了MYB TFs外，其他TFs也参与花青素的生物合成。NAC (NAM、ATAF1/2和CUC2) TFs也被广泛报道参与多种生物过程，如植物发育、抗病和非生物胁迫响应[qh]gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。对于次级代谢，许多NAC TFs已被证实参与苯丙素途径，从而调节木质素的生物合成[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba];据报道gydF4y2BaANAC032gydF4y2Ba作为花青素积累的抑制gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在应力条件下[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。此外,gydF4y2BaANAC078gydF4y2Ba和gydF4y2BaPpBLgydF4y2Ba在一定条件下被认为是花青素生物合成的活化剂[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在紫肉甘薯中，花青素生物合成的个体调节因子已经确定[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。gydF4y2BaIbMYB1gydF4y2Ba能特异性促进紫肉甘薯花青素相关基因的表达[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。另一个因素,gydF4y2BaIbWD40gydF4y2Ba，与不同甘薯品种花青素含量呈正相关，说明gydF4y2BaIbWD40gydF4y2Ba在紫肉甘薯花青素生物合成中起关键作用[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]。然而，由于甘薯基因组的复杂性带来的缓慢过程(六倍体(2n = 6x = 90)和高度多态性)，无法提供额外的证据[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]。因此，其他NAC TFs和抑制因子MYBs是否以及如何参与花青素的生物合成尚不清楚，紫肉根茎花青素生物合成的分子调控网络也鲜有报道。gydF4y2Ba

在这项研究中，四个候选tf，gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbMYB44, IbNAC56agydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56b,gydF4y2Ba通过生物信息学和RT-qPCR技术在不同颜色的红薯中筛选到该基因，并通过烟草和草莓花托中的瞬时表达实验鉴定了该基因的功能。进一步的分析表明gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba极大地促进了花青素的积累，也可以与辅助因子形成调节复合体gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba通过与花青素结合来调节花青素的生物合成gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba而不是发起人gydF4y2BaIbUFGTgydF4y2Ba子,而gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba作为一个负调节者，可以与gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或与gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba酵母双杂交和萤火虫荧光素酶互补实验对红薯花青素合成的调控作用。本研究揭示了紫肉甘薯花色苷生物合成的潜在机制，为我们了解不同颜色甘薯根系的调控网络提供了可能的依据。gydF4y2Ba

描述的gydF4y2BaIbMYBgydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNACgydF4y2Ba甘薯花青素相关基因gydF4y2Ba

在以前的报告中，TFsgydF4y2BaAtMYB75gydF4y2Ba（gydF4y2BaAtPAP1gydF4y2Ba)gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba和gydF4y2BaMdMYB10gydF4y2Ba(DQ267897)和gydF4y2BaPyMYB114gydF4y2Ba(ASY06612.1)在非模式物种中被发现是r2r3型MYBs，它可能与其他tf一起调节花青素的生物合成[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。在这里，我们发现Itf12g05820。T1基因高度同源gydF4y2BaAtPAP1gydF4y2Ba(AT1G56650)通过BLAST比对甘薯基因组数据库。它被命名为gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba经多次序列比对，发现其与其他物种的典型R2R3-MYB TFs具有相似性。此外,gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba是从gydF4y2BaFaMYB44.1gydF4y2Ba同源序列比对;gydF4y2BaFaMYB44gydF4y2Ba是否有一种转录抑制因子通过相互作用负向调节草莓花托中的蔗糖积累gydF4y2BaFaMYB10gydF4y2Ba［gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。系统发育分析表明gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba与其他已知的具有R2R3结构域的MYB转录因子一起属于激活子分支(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).相比之下，TFgydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba，其中包含转录抑制结构域LxLxL(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaD，在系统发育上与…相关gydF4y2BaFaMYB44.1gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA)，在草莓中起转录抑制作用[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。因此，我们推测这两种MYB TFs可能调节甘薯花青素的生物合成。gydF4y2Ba

我们从甘薯基因组数据库中检索到含有n端NAC结构域的98个NAC TFs的序列信息。甘薯和桃子NACs的氨基酸序列gydF4y2BaPpBLgydF4y2Ba(ALK27819.1)，能促进gydF4y2BaPpMYB10.1gydF4y2Ba作为异二聚体gydF4y2BaPpNAC1gydF4y2Ba，导致烟叶中花青素的积累[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]，构建系统发育树(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab) 3个NAC基因;gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba，gydF4y2BaIbNAC56b,gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC25gydF4y2Ba，根据系统发育分析结果为候选品种。gydF4y2Ba

然后，我们量化了不同甘薯品种块茎根中候选基因的转录丰度，不同品种甘薯块茎根剖面图如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一。gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba紫肉甘薯‘徐子8号’和‘浙子3号’的表达量显著高于黄肉甘薯‘苏薯8号’和‘广薯87号’，也显著高于白肉甘薯‘栗子香’和‘徐树18号’gydF4y2BaIbNAC25gydF4y2Ba恰恰相反。因此,gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba进行后续实验(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

此外，转录丰度gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba在‘徐子8号’和‘哲子3号’上的表达量显著高于其他品种，而gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba在紫肉甘薯中保持较低水平，而在黄/白肉甘薯中保持较低水平。此外，“栗子香”和“徐蜀18号”的转录水平较高gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba其次是“苏书8号”和“广书87号”。的表达水平gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba除“汉子”外，紫色肉质品种的基因表达量也较高，而黄色/白色肉质品种的基因表达量相对较低。然而，的表达gydF4y2BaIbUFGTgydF4y2Ba和gydF4y2BaIbDFRgydF4y2Ba无明显差异(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

进一步分析了不同甘薯品种花青素生物合成相关基因表达水平的相关性。如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC，的表达式gydF4y2BaIbNAC56a, IbNAC56b, IbbHLH2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba呈显著正相关gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba表达，相关系数为0.77 ~ 0.98。然而，的表达gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba与的表达负相关gydF4y2BaIbMYB340, IbNAC56a, IbNAC56b, IbbHLH2, IbANSgydF4y2Ba和gydF4y2BaIbUFGTgydF4y2Ba这表明可能会有相反的效果gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbMYB44。gydF4y2Ba此外,gydF4y2BaIbNAC25gydF4y2Ba与其他因素负相关(除gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbDFRgydF4y2Ba和gydF4y2BaIbUFGTgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

共转化诱导花青素gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba在烟叶中gydF4y2Ba

的功能分析结果gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba在烟叶中使用瞬时表达试验的结果如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa.转化后烟叶注射区未检测到花青素积累gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba，gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba或gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba单独使用时，出现轻微的色素沉着gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba单独注射。然而，在两者转化后7天，在注射区域可以看到增强的颜色gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56a / IbNAC56bgydF4y2Ba或gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba．当gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba与gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba，可见明显的强烈色素沉着。总花青素含量测定结果表明，3种TFs共转化诱导了花青素的合成，比2种TFs共转化诱导的花青素合成量要大gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba而用空载体转化或用基因载体转化后，烟叶花青素积累不明显gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).接下来我们分析了烟叶的颜色。当色素沉着出现时，L*值明显下降;相比之下，a*/b*比值显著增加(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac - d)。gydF4y2Ba

的异源过表达gydF4y2BaIbMYB340, IbbHLH2gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba诱导草莓花青素的生物合成gydF4y2Ba

进一步确认的作用gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba在花青素生物合成中，我们共同转化gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba在草莓花托中通过农业渗透，二倍体草莓(gydF4y2Ba草莓属vescagydF4y2Ba)用‘Yellow Wonder’5AF7进行瞬态转变实验。在草莓容器中的瞬时表达试验表明gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba与任何其他候选tf共同浸润，在转化后7天出现明显的色素积累，而3个tf共浸润比2个tf或共浸润引起更深的红色色素沉积gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba一个人。空载体浸润后未见色素沉着;gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba分别浸润;或gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Bacoinfiltrated。此外，注射区也可见色素沉着gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).诱导花青素的测量结果如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab.共转化3种TF的总花青素含量显著高于2种TF或单独共转化1种TF的总花青素含量。草莓花托注射区L*和a*/b*值在色素沉着出现时分别急剧下降或急剧上升，并保持在显著的相对较低或较高水平(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac - d)。在本研究中，草莓花托的异源过表达系统表现出与烟草叶片相似的表型变化。我们观察到大量的花青素色素沉着gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba与gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba在一起。gydF4y2Ba

草莓花青素相关基因的表达模式gydF4y2Ba

探索信托基金的监管模式gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba几个关键的花青素相关基因，gydF4y2BaFvPALgydF4y2Ba，gydF4y2BaFvF3HgydF4y2Ba，gydF4y2BaFvANSgydF4y2Ba，gydF4y2BaFvDFRgydF4y2Ba，gydF4y2BaFvUFGTgydF4y2Ba和gydF4y2BaFvRAPgydF4y2Ba采用RT-qPCR技术对诱导色草莓花托中的基因进行分析。gydF4y2BaFvANSgydF4y2Ba表达量大大增加时gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba共变换(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01，图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa).有趣的是gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba单独显示出更高的gydF4y2BaFvANSgydF4y2Ba表达水平高于共变换gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba（gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01或gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。为gydF4y2BaFvDFRgydF4y2Ba， tf的变换，包括gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba或gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba，导致基因表达水平明显高于其他TF组合(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)，而gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba与gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba共转化引起的gydF4y2BaFvDFRgydF4y2Ba表达水平(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01，图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba5gydF4y2BaD-e显示了gydF4y2BaFvRAPgydF4y2Ba和gydF4y2BaFvF3HgydF4y2Ba;这两个基因在与不同tf或tf的共转化中均有高表达gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba独自一人，除了gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba+gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba（gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)。除了…之外gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba+gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba，gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba+gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba也保持了较低的表达水平gydF4y2BaFvRAPgydF4y2Ba和gydF4y2BaFvF3HgydF4y2Ba与其他共变换类型相比，除了空向量pSAK277 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)。从无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2BaC，我们可以看到gydF4y2BaFvUFGTgydF4y2Ba的共转化显著表达gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba+gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba或gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba独自一人(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)，而其他共转化类型似乎没有激活gydF4y2BaFvUFGTgydF4y2Ba．此外，似乎gydF4y2BaFvPALgydF4y2Ba不能被不同的共变换类型激活除了的共变换gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Baf).如上所述，几乎所有参与花青素生物合成途径和液泡运输的基因在上述共转化草莓中都有高表达，特别是当gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbbHLH2,gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Bacotransformed。这一结果表明gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba基因可能通过形成调控复合体来调控或协同调控花青素的合成。gydF4y2Ba

调节复合体gydF4y2BaMYB340-bHLH2-NAC56gydF4y2Ba通过结合促进花青素的生物合成gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba启动子gydF4y2Ba

我们推测产品的gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbbHLH2, IbNAC56agydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba基因可能形成调控复合物来调控花青素的合成。因此，可能的相互作用gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba与gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba通过Y2H试验研究。首先，我们发现共转化酵母细胞中含有pGADT7和gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba在SD−Trp/−Leu/−His/−Ade培养基上生长失败，说明gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba不能单独激活酵母中下游基因的表达。结果表明，共转化的氨基酸序列在SD-Trp-Leu-His-Ade + AbA培养基上生长强劲gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba与gydF4y2BaIbbHLH2, IbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba．然而，Y2H分析显示，两者之间没有相互作用gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).这些结果表明gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba能与酵母相互作用吗gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

此外，我们进一步验证了在酵母中获得的结果，通过萤火虫荧光素酶在烟草中的互补试验。NLuc-的共表达gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和CLuc -gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba载体逆转了强烈的荧光素酶活性。相比之下，我们在任何对照组(包括Nluc-组)均未检测到明显的荧光素酶活性gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba有CLuc和CLuc-gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba/−gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba/−gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba与NLuc(图1)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba罪犯)。综上所述，这些结果表明gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba能与…互动gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba在烟叶中。这些结果与酵母双杂交试验的结果一致。gydF4y2Ba

接下来，我们用gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba通过双荧光素酶报告基因检测启动子(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baf).的共变换gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba显示出更多的交互作用gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba启动器比gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba并发转化与gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba．然而，似乎的共变换gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和任何其他tf或gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba单独没有区别，而变换gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba略微提升了活动(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baf).此外，进行Y1H测定以证明gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba启动子区域直接由gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56b。gydF4y2Ba启动子结构分析揭示了多个顺式调控元件，包括MYB基序(T/CAACCA)和nac结合位点(CACG)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bae).在本实验中，我们转化了pGADT7-gydF4y2BaIbMYB340 / IbNAC56a / IbNAC56bgydF4y2Ba猎物载体进入含有pAbAi-的Y1H Gold细胞gydF4y2BaIbANS1/2/3gydF4y2Ba诱饵载体，在SD/−Ura/−Leu/AbA板上检测。转化子共表达猎物载体pGADT7-gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和pAbAi -gydF4y2BaIbANS1/3gydF4y2Ba在SD/−Ura/−Leu/AbAgydF4y2Ba^400gydF4y2Ba盘子，而pAbAi-gydF4y2BaIbANS1/2/3gydF4y2Ba诱饵载体在SD/−Ura/AbA上不能生长gydF4y2Ba^400gydF4y2Ba盘子，这表明gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba能够与1号(- 956 bp至- 755 bp)和3号(- 310 bp至- 105 bp)结合。gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba启动子片段而不是第二个gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba启动子片段(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba然而，我们发现……之间没有直接的联系gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba的启动子gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba，尽管几个nac结合位点位于不同的单个启动子区域(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bag)。综上所述，这些结果表明不同的调节复合物(gydF4y2BaMYB340-bHLH2-NAC56agydF4y2Ba和gydF4y2BaMYB340-bHLH2-NAC56bgydF4y2Ba)直接激活了的表达gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba通过绑定到MYB motif元素。gydF4y2Ba

IbMYB44gydF4y2Ba通过竞争性抑制调控复合物的形成抑制花青素积累gydF4y2BaIbMYB340-IbbHLH2-IbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba

研究…的作用gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba在花青素生物合成中，我们共同转化gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba以不同的比例注入烟草叶片背面，以测试转录抑制效果gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba．如图所示。gydF4y2Ba7gydF4y2BaA、烟叶色素沉着随着添加比例的增加而逐渐减少gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba．使用双荧光素酶报告试验，我们随后研究了该基因的转激活活性gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba启动子的时候gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba在烟叶中共转化。结果表明，这一比例在稳步下降gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba启动子活动发生时gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba：gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba比例由1:0降至1:4。然而，几个比率之间似乎没有变化gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba：gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba: 1:0.5, 1:0.67, 1:1, 1:1.5(图1)gydF4y2Ba7gydF4y2Bab).总花青素含量和a*/b*值在不同比例下均显著下降，其变化与上述烟叶表型一致，L*值明显升高(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba一部)。因此，当与gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba可以减少花青素的生物合成。gydF4y2Ba

我们进一步验证了gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba与gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba．Y2H分析显示细胞与gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba与gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba可以在SD-Trp-Leu-His-Ade + AbA板上生长(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Baf).此外，被浸润的对照物恢复了标记的荧光素酶活性gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba+gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba+gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba+gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba;相反，是gydF4y2BaIbMYB340 / IbMYB44gydF4y2Ba与CLuc或CLuc-共渗gydF4y2BaIbMYB44 / IbNAC56a / IbNAC56bgydF4y2Ba与Nluc共浸润没有导致足够水平的荧光素酶活性(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba胃肠道)。总的来说,gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba可以相互作用gydF4y2BaIbMYB340, IbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba这表明gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba抑制花青素积累可能是通过竞争性抑制gydF4y2BaIbMYB340, IbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

花青素是一种与植物红色或紫色色素沉着有关的常见类黄酮化合物，近年来受到广泛关注。gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。目前已知植物中参与花青素途径的结构基因受MYB-bHLH-WD40复合物调控，其中R2R3-MYBs对花青素积累的贡献尤为显著;在不同的植物物种中已广泛研究了TFs，包括gydF4y2BaAtMYB114gydF4y2Ba在gydF4y2Ba拟南芥,PpMYB10.1gydF4y2Ba在桃子,gydF4y2BaPyMYB114gydF4y2Ba在梨,gydF4y2BaMdMYB110agydF4y2Ba在苹果，和gydF4y2BaIbMYB1gydF4y2Ba在红薯[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。的共表达gydF4y2BaPpMYB10.1gydF4y2Ba和gydF4y2BaPpbHLH3/33gydF4y2Ba能促进桃花青素的生物合成[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。此外，myb的两种激活剂，gydF4y2BaPyMYB114gydF4y2Ba和gydF4y2BaPyMYB10gydF4y2Ba，可以相互作用促进红梨花青素的生物合成[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。在这项研究中，TFgydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba，高度同源于gydF4y2BaAtPAP1gydF4y2Ba在gydF4y2Ba拟南芥,gydF4y2Ba可以诱导高水平的花青素色素沉着，特别是当与其他TFs共转化时，在烟叶和草莓花托中(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一个,gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).我们进一步论证了gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba与gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba通过形成调节复合物来调节花青素的合成然而，我们没有发现相互作用gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).这些结果表明gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba作为一种转录激活剂，对花青素的积累有很大的贡献。然而，的关系gydF4y2BaIbMYB1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)与gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba等TFs对紫肉甘薯花青素生物合成的调控作用尚不清楚，对颜色形成的协同调控有待进一步研究。gydF4y2Ba

近年来，MYB抑制因子逐渐被证明参与调节类黄酮生物合成途径。阻遏子通常包含位于c端区域的LxLxL负阻遏子基序，这是抑制作用的原因[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。据最近报道，肉特异性的gydF4y2BaStMYB44gydF4y2Ba马铃薯果肉中花青素含量降低的原因[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。gydF4y2BaCmMYB # 7gydF4y2Ba是菊花中R3-MYB负调控因子，可竞争性抑制gydF4y2BaCmMYB6gydF4y2Ba进行互动gydF4y2BaCmbHLH2gydF4y2Ba，导致花青素含量下降[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。在桃子里，gydF4y2BaPpMYB18gydF4y2Ba蛋白质可以通过竞争性地抑制MYB激活剂与bHLHs的相互作用来抑制花青素的积累[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。这里是R2R3-MYBgydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba使烟草在注射区色素沉着逐渐减少(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa).这与先前的研究结果一致，含有LxLxL基序的MYB抑制因子导致花青素生物合成减少。然后，我们获得了相互作用的证据gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和之间的gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba与gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba通过Y2H和萤火虫荧光素酶互补实验(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba外:我)。结果表明gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba-gydF4y2BaIbMYB340, IbMYB44-IbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbMYB44-IbNAC56bgydF4y2Ba配合物可能抑制调节配合物的形成gydF4y2BaMYB340gydF4y2Ba-gydF4y2BabHLH2gydF4y2Ba-gydF4y2BaNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaMYB340gydF4y2Ba-gydF4y2BabHLH2gydF4y2Ba-gydF4y2BaNAC56bgydF4y2Ba．综合来看，结果表明gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba负向调节甘薯花青素的生物合成。gydF4y2Ba

MBW复合物被普遍认为是在转录水平上影响花青素生物合成的调节因子。除MBW复合物外，许多TFs，包括WRKYs、NACs、ERFs、COP1、SPL9、DELLA蛋白等，已被证明在确定花青素生物合成或间接影响MBW复合物活性方面有确证作用[qh]gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。对于NAC TF家族，据报道，NAC TF指定的BLOOD (BL)作为异二聚体与gydF4y2BaPpNAC1gydF4y2Ba促进:促进…的转录活性gydF4y2BaPpMYB10.1gydF4y2Ba，导致花青素积累[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。此外，负面影响gydF4y2BaANAC032gydF4y2Ba对花青素的积累进行了研究gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在应激条件下[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。在这项研究中，三个NAC基因，gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba，gydF4y2BaIbNAC56b,gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC25gydF4y2Ba，是根据98个品种的系统发育分析结果鉴定出来的gydF4y2BaIbgydF4y2Ba北亚和gydF4y2BaPpBLgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa). RT-qPCR分析显示gydF4y2BaIbNAC56a / IbNAC56bgydF4y2Ba在花青素含量丰富的‘徐子8号’和‘浙子3号’中显著表达。gydF4y2Ba2gydF4y2BaA)，表明它们可能是甘薯块根花青素生物合成的积极调节因子。当我们共转化时，更明显地检测到色素沉着gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba与gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba在异源过表达系统中(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一个,gydF4y2Ba4gydF4y2BaA，暗示gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba对功能完备的产品有附加效应吗gydF4y2BaMYB340gydF4y2Ba-gydF4y2BabHLH2gydF4y2Ba伙伴关系。调控模式与在桃子中报道的相似[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。此外，尽管gydF4y2BaIbNAC25gydF4y2Ba是同源的gydF4y2BaPpBLgydF4y2Ba，表达模式与gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba在紫瓤红薯中，相关分析也表明gydF4y2BaIbNAC25gydF4y2Ba与其他因素负相关，除了gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbDFRgydF4y2Ba和gydF4y2BaIbUFGTgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab).因此，我们推测gydF4y2BaIbNAC25gydF4y2Ba可能负向调节花青素的生物合成;然而，该基因的功能还有待进一步研究。gydF4y2Ba

据报道，紫肉甘薯品种“山川村”的贮藏根中表达量显著高于其他品种gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba比白肉品种“玉北白”要多gydF4y2BaIbDFRgydF4y2Ba或gydF4y2BaIbUFGTgydF4y2Ba无明显差异[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]。在本研究中，我们发现了类似的结果:黄肉/白肉品种的叶绿素含量较低gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba表达量高于紫色肉质品种，而gydF4y2BaIbUFGTgydF4y2Ba和gydF4y2BaIbDFRgydF4y2Ba在这些品种中无明显相关性(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).在本研究中gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba诱导烟叶和草莓花青素的明显积累(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一个,gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).此外，RT-qPCR分析显示gydF4y2BaFvANSgydF4y2Ba与上述tf的共转化高度上调(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa). Y1H实验表明gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba可以直接绑定到吗gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba发起人，以及gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba启动子活性最强gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba共转化，通过双荧光素酶报告试验反映出来(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2BaB-c)，这表明gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba基因可能在不同甘薯品种花青素合成调控网络中发挥重要作用。gydF4y2Ba

总之，通过Y2H、萤火虫荧光素酶互补和双荧光素酶报告基因检测，我们研究了不同的调控复合物(gydF4y2BaMYB340gydF4y2Ba-gydF4y2BabHLH2gydF4y2Ba-gydF4y2BaNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaMYB340gydF4y2Ba-gydF4y2BabHLH2gydF4y2Ba-gydF4y2BaNAC56bgydF4y2Ba)可以通过与花青素的结合形成促进花青素的生物合成gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba启动子和上调其他花青素相关基因的表达。此外，我们的研究结果表明gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba甘薯中花青素合成的抑制因子gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba基因的功能还是通过间接影响的gydF4y2BaMYB340gydF4y2Ba-gydF4y2BabHLH2gydF4y2Ba-gydF4y2BaNAC56agydF4y2Ba或gydF4y2BaMYB340gydF4y2Ba-gydF4y2BabHLH2gydF4y2Ba-gydF4y2BaNAC56bgydF4y2Ba复杂，可以增强gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba启动子活动。这些结果可以帮助我们对紫肉甘薯中花青素生物合成的可能潜在机制有更深入的了解，尽管还需要进一步的科学研究来全面而深入地解释。gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

2018年10月10日，在国家甘薯改良中心(中国江苏省徐州市)，‘汉子’、‘徐子8号’、‘哲子3号’、‘哲子4号’、‘苏舒8号’、‘广舒87号’、‘栗子香’和‘徐舒18号’红薯出芽120天后的贮藏根被采集。gydF4y2Ba

烟草种子(gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba“NC89”和gydF4y2Ba烟草benthamianagydF4y2Ba)保存在合肥工业大学食品与生物工程学院(合肥，安徽省，中国)，在24°C的温室中人工辐照(日光，16小时)下生长。见面gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba“NC89”叶片用于瞬时转化实验和双荧光素酶报告系统试验，烟草(gydF4y2Ba烟草benthamianagydF4y2Ba)用六片叶子的植物进行萤火虫荧光素酶的互补测定。gydF4y2Ba

“黄色奇迹”5AF7 (YW5AF7)的种子由中国南京农业大学吴军教授提供，是一种二倍体草莓(gydF4y2Baf . vescagydF4y2Ba黄白色果实的栽培品种。在光照12 h的温室中生长，白天温度保持在25℃，夜间温度保持在20℃。花后2周用花托进行瞬时表达测定。gydF4y2Ba

RNA提取及qPCR分析gydF4y2Ba

采用植物总RNA分离试剂盒(Plant total RNA Isolation Kit, Foregene)提取0.8 g甘薯块根和0.5 g草莓样品的总RNA。用Prime Script™RT Master Mix (Takara)从总RNA合成第一链cDNA。qRT-PCR采用SYBR®Premix Ex Taq™II (Takara)，总反应体积为20 μl，其中模板cDNA为150 ng，每个引物为0.2 μM, SYBR®Premix Ex Taq™II为10 μl，扩增程序为:1循环95°C, 10 s, 40循环95°C, 5 s, 60°C, 34 s。草莓基因，gydF4y2BaFvTubulingydF4y2Ba(基因11892)和甘薯基因，gydF4y2BaIbTubulingydF4y2Ba（gydF4y2BaItfgydF4y2Ba04g29110)，作为内部控制。用于RT-qPCR的引物在附加文件中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S1。gydF4y2Ba

烟草和草莓的瞬态测定gydF4y2Ba

为了进行瞬时表达分析，使用Phanta®Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme)进行PCR扩增，并获得gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba（gydF4y2BaItfgydF4y2Ba12 g05820.t1),gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba（gydF4y2BaItfgydF4y2Ba14 g18730.t2),gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba（gydF4y2BaItfgydF4y2Ba02 g15460.t1)和gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba（gydF4y2BaItfgydF4y2Ba在35S启动子的控制下，将01g19290.t1)插入pSAK277载体中gydF4y2BaEcoRgydF4y2Ba我和gydF4y2BaXbagydF4y2Ba1 .用于表达载体构建的引物序列在附加文件中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S2。将重组载体分别转化为菌株GV3101gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2Ba用化学方法。将携带重组pSAK277载体的农杆菌细胞重悬于注射液中gydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 1.0)，注射前4-5小时，在25℃60 rpm下孵育。gydF4y2Ba

的功能分析gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56gydF4y2Ba含有上述tf的农杆菌培养物均匀混合。此外，农杆菌细胞窝藏gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba以不同的比例混合，以测试gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba．将混合的农杆菌细胞注射到幼仔体内gydF4y2Ban .烟草gydF4y2Ba根据Zhou等人描述的方法提取草莓叶片和草莓花托。[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。将植株在黑暗中孵育24 h，然后移入人工辐照(16 h日长)的温室。注射后7 d拍照，收集花青素进行定量，必要时收集总RNA进行提取。gydF4y2Ba

烟草和草莓中花青素的提取及含量测定gydF4y2Ba

花青素按照Yao等的方法提取并定量。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。简而言之，我们将0.2 g烟叶组织或0.2 g草莓托组织浸泡在注射区周围，在液氮中完全研磨，在1 ml含0.1% HCl的冷甲醇中，在4℃下浸泡24 h。在12000 g下离心15分钟后收集上清。根据式(A = (A))估算甲醇提取物中花青素的含量gydF4y2Ba_530gydF4y2Ba——一个gydF4y2Ba_620gydF4y2Ba) - 0.1 (agydF4y2Ba_650gydF4y2Ba——一个gydF4y2Ba_620gydF4y2Ba)，并使用Multiskan光谱设备(Thermo Scientific Multiskan GO 1510，芬兰)测量吸光度。gydF4y2Ba

酵母单杂交试验gydF4y2Ba

使用Matchmaker®金酵母单杂交系统进行酵母单杂交(Y1H)测定。简单地说，有三种放大gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba将启动子片段(- 956 bp ~ - 755 bp， - 396 bp ~ - 224 bp， - 310 bp ~ - 105 bp)克隆到一个pAbAi载体上gydF4y2Ba后gydF4y2Ba三世和gydF4y2BaXhogydF4y2Ba的完整序列gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba克隆到pGADT7载体上gydF4y2BaEcoRgydF4y2Ba我和gydF4y2BaXhogydF4y2Ba然后，我们将猎物载体转化为含有pabai诱饵的Y1H Gold细胞，并在SD/−Ura/−Leu/AbA板上进行检测。用于载体构建的引物序列在附加文件中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S2。gydF4y2Ba

烟草叶片双荧光素酶报告基因测定gydF4y2Ba

为了构建双荧光素酶报告载体，将基因的1.9 kb上游启动子区域gydF4y2Ba伊班人gydF4y2Ba（gydF4y2BaItfgydF4y2Ba从甘薯栽培品种‘徐子8号’块根的基因组DNA中扩增出13g04110.t1(来自ATG起始密码子)，并插入pGreen II 0800-LUC二元载体中。此外，农杆菌转化和注射制备与烟叶和草莓瞬时转化试验的方法相同。gydF4y2Ba

农杆菌细胞携带pGreen II 0800-LUC重组载体，pSAK277载体，gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbbHLH2,gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbNAC56gydF4y2Ba按1:3:3:3的比例混合。将混合的农杆菌细胞注射到幼体中gydF4y2Ban .烟草gydF4y2Ba两周的叶子。在浸润后48-72 h，用E1910双荧光素酶报告基因检测系统(Promega)检测LUC和Ren活性。gydF4y2Ba

酵母双杂交试验gydF4y2Ba

使用Matchmaker®金酵母双杂交系统进行酵母双杂交(Y2H)测定。的全长编码序列gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba扩增并克隆到pGBKT7载体中gydF4y2Ba濒死经历gydF4y2Ba我和gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2Ba我;的完备序列gydF4y2BaIbbHLH2gydF4y2Ba，gydF4y2BaIbNAC56agydF4y2Ba，gydF4y2BaIbNAC56bgydF4y2Ba和gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba克隆到pGADT7中gydF4y2BaEcoRgydF4y2Ba我和gydF4y2BaXhogydF4y2Ba1 .然后，我们根据制造商的说明，用LiCl-PEG法将整合载体共转化到Y2H Gold细胞中，并在SD/−Leu/−Trp/−His/−Ade + AbA板上检测蛋白-蛋白相互作用。gydF4y2Ba

萤火虫荧光素酶互补试验gydF4y2Ba

萤火虫荧光素酶互补实验参照Chen等人报道的方法进行。[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。的全长编码序列gydF4y2BaIbMYB340gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba将无停止密码子的pCambia1300-NLuc二值载体克隆到pCambia1300-NLuc二值载体上，得到了pCambia1300-NLuc的完整序列gydF4y2BaIbNAC56gydF4y2Ba和gydF4y2BaIbMYB44gydF4y2Ba克隆到pCambia1300-CLuc二进制载体中。农杆菌转化和注射制备按照先前描述的瞬时转化试验进行。然后，用Steady-Glo®荧光素酶测定系统(Promega)测定48-72 h萤火虫荧光素酶的活性。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有样本均独立重复至少三次，所有数据均以均数±标准差表示。采用Student 's进行统计分析gydF4y2BatgydF4y2Ba-测试嵌入Excel 2013软件。使用R脚本分析Pearson相关系数(R值)和构建的热图。重要性以* (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)或** (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)或不同的字母。gydF4y2Ba

在当前研究中使用和/或分析的数据集可根据通讯作者的合理要求提供。gydF4y2Ba

TF:gydF4y2Ba

转录因子gydF4y2Ba

朋友:gydF4y2Ba

苯丙氨酸解氨酶gydF4y2Ba

F3H:gydF4y2Ba

黄烷酮3-hydroxylasegydF4y2Ba

DFR:gydF4y2Ba

Dihydroflavonol 4-reductasegydF4y2Ba

答:gydF4y2Ba

花青素合成酶gydF4y2Ba

UFGT:gydF4y2Ba

葡萄糖类黄酮3- o -葡萄糖基转移酶gydF4y2Ba

销售税:gydF4y2Ba

谷胱甘肽S-transferasegydF4y2Ba

Y2H:gydF4y2Ba

酵母2台混合动力gydF4y2Ba

Y1H:gydF4y2Ba

酵母一个杂化gydF4y2Ba

MBW:gydF4y2Ba

MYB-bHLH-WD40gydF4y2Ba

我们感谢Andrew C. Allan博士、Lin-Wang Kui博士和Richard Espley博士在新西兰奥克兰的新西兰植物与食品研究有限公司提供的双载体pGreen II 0800-LUC。gydF4y2Ba

国家重点研发计划项目(2019YFD1001303, 2019YFD1001300)，国家自然科学基金项目(31901993,31970312,31970200,31670278)，安徽省自然科学基金项目(1908085MC72)，安徽省重点研发计划项目(201904a06020031)，中央高校基本科研业务费项目(JZ2018HGTB0241)资助。资助者在实验设计、数据收集和分析或撰写手稿方面没有任何作用。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 魏增正、胡康迪和赵东兰对这项工作也有同样的贡献。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽合肥230009gydF4y2Ba

   魏增正，胡康迪，李艳红，韩卓，胡兰英，姚改芳，张华gydF4y2Ba

2. 江苏省徐淮区徐州市农业科学研究所，江苏徐州221131gydF4y2Ba

   赵东兰，唐军，黄忠勤gydF4y2Ba

3. 安徽省生态环境厅，安徽合肥230061gydF4y2Ba

   彭金gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

Z.Z.W, G.F.Y, K.D.H. d.l.z和H.Z.构思并设计了实验;Z.Z.W, g.f.y负责实验;j.t.、Z.Q.H.、D.L.Z.提供实验材料;Z.H Y.H.L。,j.t., P.J。H.L.Y.分析数据;Z.Z.W, G.F.Y.撰写论文;k.d.h.， G.F.Y, Z.Q.H.和H.Z.解释了数据并修改了手稿。所有作者都阅读并认可了这份手稿的最终版本。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaGai-Fang么gydF4y2Ba或gydF4y2Ba华张gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和来源，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可协议中，除非在材料的署名中另有说明。如果材料未包含在文章的知识共享许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超过允许的用途，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域免责声明(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba