利用双单倍体育种开发小麦温光敏感核不育系

背景

使用热光敏核不育两系杂交小麦系统（TPSGMS）是目前在中国小麦杂种优势利用最有前途的方法。然而，在过去20年中只有少数TPSGMS系杂交小麦育种，已创造杂种优势杂交种的主要限制因素的发展。加倍单倍体（DH）的育种中的应用提供了一个有用的策略，以有效地开发实际可用TPSGMS线。

结果

F₁s和选择F₂和F_3.由两个商品化的TPSGMS株系组成的8个杂交组合的不育植株被用来生产DH株系。筛选出不育性稳定、异交性好、产量潜力大、抗黄锈、抗白粉病、株高50 ~ 60 cm的优质DH不育系24个。这些DH系是在4年内通过至少1年的评估开发出来的。通过2 ~ 3年的多次试验，大多数(20/24)不育系的雄性不育稳定性得到证实。这些株系有望用于杂交小麦育种。杂种后代所产生的DH品系所产生的优良品系百分率依次为F₂> F_3.> F₁．

结论

本研究表明，将DH技术与常规育种技术相结合是加快培育更实用小麦TPSGMS品系的有效策略。从F₂考虑到缩短繁殖时间和整体育种效率的平衡，这一代似乎是更好的选择。

小麦提供了世界大约20%的营养供应[1]．杂种小麦利用是提高产量的潜力和稳定性，这对于提高小麦的生产，以满足世界日益增长的需求[重要性，最有希望的途径之一2，3.，4]．然而，培育高水平杂种优势和低成本生产杂交种仍然是杂交种育种及其商业化应用的挑战[1，4]．

与基于细胞质雄性不育(CMS)的杂交小麦系统不同[5]及光周期敏感的细胞质雄性不育(PCMS) [6]时，使用热相片敏核雄性不育（TPSGMS）的两系杂交小麦系统是中国小麦杂种优势利用的新的方法。所述TPSGMS线的特征是高温下的低温和短日对杂交种子生产，和育在无菌和长日照自我繁殖。因此，该系统不需要无菌“维护者”线和使杂交种子生产的容易[7，8，9]．从2002年到2018年，中国释放了20个杂交小麦品种[10.]，其中14种，使用基于TPSGMS的双线系统开发，产量增加10-15％，特别是在边缘地上[10.，11.，12.]．与此同时，在越南进行了鼓励多地点评价，“云杂”杂交品种在产量、耐旱性和肥料投入方面远远优于当地自交系品种[13.]．尽管如此，基于14个基于TPSGMS的混合品种占2002年至2018年在中国释放的2691种小麦品种的0.5％[14.]．此外，在中国黄淮河小麦区等主要产区中应用了很少有杂种品种，其中近亲品种表现良好，而最多的杂种品种没有足够的收益率优势。这一情况的重要原因是，在过去的20年里，中国只有八种实际可用的TPSGMS线路发展，这极大地限制了创造杂种杂交种的机会和效率，尽管已经进行了一万次恢复液。实际的TPSGMS线通常在不同年份中表征为≥20天的稳定无菌持续时间[15.，16.]，异交率≥70% [17.]，矮生株高50-70厘米[15.]，以及良好的配合力和农艺性状[9]．此外，受控的无菌性隐性基因仅表达在受限制的温度和昼长条件和在分离群体产生不育植物的低比[15.]．这些因素导致传统育种方法在开发实用TPSGMS系方面效率低下。因此，需要改进现有的育种策略，开发更多实用的小麦TPSGMS株系，以产生更多的杂种优势。

加倍的单倍体（DH）技术允许在一代中均化杂合材料。它已广泛用于作物育种，以提高选择的效率和加速育种过程[18.，19.，20.，21.，22.]．在小麦中，DHs可以通过小麦(小麦L.)和玉米(玉米l .)。这种方法已经成为许多商业小麦育种计划的组成部分。与花药和小孢子培养相比，它在产生单倍体方面具有诱导稳定和基因型限制少的优点[23.，24.]．本研究旨在评价基于小麦×玉米的DH技术在小麦不同子代不育材料选育中的应用效果₁F₂和F_3.．

小麦×玉米制DH株系选育成功

2014-2016年夏播期间，小麦DHs由四个F生产₁s和不育植株的选择₁和F₂代由小麦×玉米系统（图1）.从所有八个十字路口获得总共920瓦线（表1）.2016年12月，一场严重的霜冻对正在抽穗期的植物造成了损害，导致部分植株无法获得DH种子。方差分析显示，未成熟胚胎率(P= 0.00)和单倍体成苗率(0.;每100个接种的胚胎中萌发的幼苗P= 0.00)，说明胚率和单倍体苗率对基因型敏感。平均胚率、胚成苗率和幼苗染色体加倍率分别为36.76、62.65和86.42%，表现出我们前期研究中较好的DH生产效率[25.，26.，27.，28.，29.]．

在昆明的温带气候，特别是从5月到10月，允许在天然条件下全年种植春季和春冬小麦材料（图。2和补充数据1)，这有助于小麦与玉米杂交大规模生产小麦DHs，因为从4月底至11月初的多次玉米种植可以获得新鲜花粉[27.，29.]．

DH优秀不育系候选

在2016年至2018年，选自F产生的所有920个DH品系₁F₂和F_3.通过一年的不育试验来筛选候选不育系(图2)。3.）.共有295个DH系显示正常结实率，排除在进一步分析之外。这些台词大多来自F₁一代又一代。在第1(10月15日)和第2(11月20日)播种的625个DH株系中，结实率低于5%的分别为210个(33.60%)和66个(10.65%)。41个DH系(6.56%)两次播种结实率均小于5%(表2)2,无花果。4和补充数据2）.When further considering other desired traits of out-crossing potential, disease resistance (to stripe rust and powdery mildew), plant height (50–60 cm), tillering and spike formation ability, 24 lines were selected from 41 lines as our final set of elite DH lines．

当无菌线在10月15日播种（第一次播种）和11月20日（第二播种）时，造成生育变化的关键时期分别从3月下旬和4月初到4月初。因此，在关键时期，第一个播种的无菌线将经过较低的温度和更短的日子，以完全表现出无菌，而第二播种线具有相对较高的温度和更长的日子，可能导致早期标题尖刺无菌和晚期标题分蘖部分肥沃，以产生少量种植繁殖（图。2和补充数据1）.

根据我们的经验，在第2播期表现出100%不育性的TPSGMS系通常不育性稳定，但繁殖困难，不适合实际应用。在中国西南地区，小麦一般在10月中旬至11月上旬播种，因此，一个在两个播期(10月15日至11月20日)结实率均< 5%的TPSGMS株系可以满足优质杂交种子的安全生产需求。

F₁优质不育系不育性稳定

为了测试在不同年份不育的稳定性，十˚F₁在2016 - 2018年的两个生长季，分别采用2个不同播期和10个不同播期进行评价(图2)。3.）.2016/2017生长季各品系第1播期结实率均为0，第2播期结实率为2.98 ~ 4.87%3.）.在2017/2018年10个播期的进一步试验中，10个优良品系在第1 ~ 3次播种(10月22日- 11月22日)结实率均< 1%。5)，第5播(11月19日)前播< 5%，第10播(12月24日)≥50%，说明11月5日- 19日之前播最适宜杂交种生产，12月24日之后播最适宜杂交种繁殖(图2)。5和补充数据3.）.

从用于F十个精英TPSGMS线₁从10月15日至11月5日播种，在3年内显示了近100％的无菌性，尽管平均温度在2月下半年的关键时期在关键时期发生在12°C至15°C时。（无花果。2和补充数据1）.经3年试验，不育性稳定，可用于杂交育种。稳定的不育性是TPSGMS株系商业利用的先决条件[16.]．

的F无菌稳定性₂通过重复试验确定了优质不育系

10 F₂在2017分之2016选择衍生的DH系并在2018分之2017生长期（图再次评估。3.）.各品系第1播结实率均为0，第2播结实率为1.99 ~ 4.04%4）.选择2年不育性稳定的10个株系，在10个播期播种，进一步评价其不育性的稳定性，并确定适宜杂交制种和自繁的播种期。

优秀DH不育系表现出较高的异交能力

在冬季播种2018/2019中，源自F的20个Elite TPSGMS线的过交叉潜力₁和F₂代进行评估。20个株系的异交率为70.46 ~ 93.90%，平均为82.87%。共有13个株系，其中8个源于F₂4个株系的外交率在75 ~ 80%之间，3个株系的外交率在70 ~ 75%之间5）.在DH生产后，经过一轮筛选，20个株系均表现出较高的异交潜力。因此，双单倍体对该性状的固定效率很高，证实了我们之前的研究结果[17.]．更多来自f的线条₂与f的那些相比，代表出现了更好的外交能力（> 80％）₁结果表明，在DH生产前多进行一个选择周期有助于进一步提高目标性状。这里的异交率结果是通过几乎无限的花粉供应授粉获得的，这需要在实际杂交制种中进一步证实。

DH世代繁殖效率比较

Based on the seed setting rates < 5% in both sowing dates, 41 DH sterile lines, including 13, 15, and 13 lines derived from F₁F₂和F_3.代，分别被选择(表2），F的育种效率（所选DH线中所选DH线的百分比）为f为4.14,7.35和12.15％_1，F₂和F_3.,分别。在进一步评价其他性状的基础上，筛选出24个优良品系。F_1，F₂和F_3.分别为3.18、4.90和3.74%。U-test分析表明，两组间存在显著差异(P< 0.01)₁F₂和F_3.代(表2）.单个特征（无菌）的育种效率的趋势是f_3.> F₂> F₁，综合性状为F₂> F_3.> F₁这表明，从F₂世代综合育种效率较好。

雄性不育性的发现和应用是杂交小麦商品化生产的基础。创造优秀杂种的机会与育种计划中可用的不育系和恢复系的数量有关。虽然基于tpsgms的两系杂交小麦体系建立于20世纪90年代[7，30.]，到目前为止，我国南北麦区已开发出可供商业使用的TPSGMS株系不足10个。系谱法是开发TPSGMS系的常用方法[7，15.，30.，31.，然而，一些困难阻碍了育种效率。TPSGMS系的不育性是由两个或三个隐性主基因和几个小基因控制的[7，16.，32.，33.，34.]，在隔离群体中引起非常低的无菌植物比例，特别是在F.₂S来自无菌线和正常肥沃线之间的十字架。当在选择期间将其他所需的特征视为在一起时，育种效率会变得极低。从理论上讲，f的纯合子隐性个体的概率₂人口是1/4ⁿ，概率是1/2ⁿ如果DH线条由F生产₁这表明DH育种在选择隐性基因控制的性状方面更有效，比如这里的不育性。半不育材料与不育系杂交可以进一步提高本研究分离群体中高度不育植株的比例，其效果与不育系回交相似[31.]．

目前用于小麦TPSGMS不育系标记辅助选择的有效分子标记很少[35.]．因此，由于不育性的表达需要严格的温度和光照条件，每年只有一个季节可用，因此开发一个遗传稳定的TPSGMS株系是非常耗时的[15.]．在我们之前的繁殖计划中，仅由1996年至2010年的血统方法开发了两条实际的TPSGMS线（K78S和K456S），而在本研究中，我们通过引入DH技术在4年内开发了24条精英TPSGMS系列，并在4年内通过完全纯合性和其他所需的特性。．

本研究中涉及的另一个问题是确定生产DHS的理想生成。大多数育种者宁愿从f中生产DHS₁但这种方法可能会限制重组的机会[18.]．因此，用F₂单杂交或F₁传代杂交的效果似乎优于F₁单株杂交的世代[36.]．同样，斯内普和辛普森(1981)倾向于从F₂通过比较六种农艺性状的遗传变异的增益，六种农艺性状与衍生自f的六种农艺性状₁F₂F_3.F和易于缠结的₂(S3)代(37.]．相比之下，Iyamabo和Hayes(1995)在F产生的DH系中没有发现更有利的基因型₂比F₁因此，他们更倾向于使用F₁代用于生产的DH [38.]．在本研究中，从子代生产DHs的总体育种效率为F₂> F_3.> F₁，表示f₂在育种效率上，该代更有利于生产DHs。但是，通过比较产DHs与产F的育种效率，还需要进一步研究₁和F₂和F_3.源于同一种杂交。

从F生产DHs₁一代繁殖效率较少，因为只发生了一轮重组并且不施加选择。结果，产生了一条农艺上不希望的线的高频率[37.]，这在本研究中得到了证实，因为大多数可育系都是从F₁一代。然而，正如表明在这项研究中，使用了F₁DH育种的世代在节省时间方面有优势;它可以用于具有更好可预测性的杂交，并应对开发抗病品种的迫切需要，如针对其经常变化的致病小种的黄锈病。

本研究开发了20个实用的小麦TPSGMS株系。经多年重复鉴定，不育性稳定，具有良好的异交潜力和其他优良性状。结果表明，引入DH技术是促进小麦TPSGMS株系发育的有效策略。从F生产DHs₂在兼顾育种效率和缩短育种周期的前提下，世代制是较好的选择。然而，利用同一组合衍生出的不同子代的不同遗传材料，有必要进行进一步的研究。在杂交小麦育种中，更实用的TPSGMS株系将进一步增加杂种优势组合的创造机会。

植物材料

本研究选用2个小麦TPSGMS株系和5个小麦半不育高级株系6）.玉米品种“Baitiannuo”作为在DH生产花粉供体。所有小麦和玉米的材料是由中国食品作物研究所，云南省农业科学院院士，昆明，繁殖。

交叉和DH生产

小麦材料在2014年1月播种了晚期播种。2014年3月在2014年3月在2014年3月与无菌线和K456S交叉的半无菌材料在云南省昆明（25°02'N，102°42'e，高度1960 m). For DH production, maize sowing (in April) began 2 months before wheat sowing (in June) to synchronize their flowering dates. Maize was sown in three dates with an interval of 14 days.

在生产双单倍体之前，采用系谱法从分离群体中筛选出不育植株₁和F₂根据不育性表现、异交潜力(包括颖片开放和柱头外露)的世代[17.]，植物高度（50-60厘米），耐黄色生锈和粉状霉菌，分蘖能力和产量潜力。通过切割所有无菌植物，从再生植物中收获无菌植物的种子，然后在灌溉和施肥中进行密集型管理。交叉口和随后的育种工作和DH生产总结在图1中。1．

生产DHs的方法

在卫生署的生产方面，我们采用了先前报告的改进方案[18.，23.，24.]．小麦穗在去雄后24 ~ 48 h用新鲜玉米花粉授粉。授粉24 h后，切碎授粉后的分蘖，喷洒100ppm 2,4- d，在100 mg L营养液中培养14 d^{- 1}2,4-D，40 g l^{- 1}蔗糖，10mg L^{- 1}硝酸银，3 g L^{- 1}磷酸二氢钾3 g L^{- 1}尿素。营养液每3天更换一次。培养过程中，生长室保持暗14 h /光10 h，光照强度6000 Lux，恒温25±1℃，相对湿度80±5%。无菌分离14天颖果的胚，在半强度MS培养基上培养[39.]在24±1°C的黑暗条件下直到萌发，然后在暗14 h /光10 h (3000 Lux)的条件下移入生长室，保持恒温25±1°C，湿度75±5%。当幼苗发育出2 ~ 3个分蘖时，取出植株，在25℃0.05%秋水仙碱溶液中浸泡8 h，诱导染色体加倍。处理后的秧苗移栽至盆内生长至孕穗期，然后移入温室15天，保持温度> 20℃，以保证DH植株的育性。所有植物开花前都装袋，然后逐一收获。

DH不育系的选择及其不育性稳定性评价

对2015-2017年获得的DH品系分别于10月15日和11月20日两个播期独立进行不育性评价(图2)。3.）.在开花前，每株至少随机套袋10个穗，测定结实率。异交潜力(颖片开放，柱头外露)[17.还记录了其他重要特征，如抗病和产量潜力。在明年的稳定性评估中，不含无菌性的无菌细胞稳定性评估。

在2015/2016和2016/2017生长季选取的品系，在2016/2017和2017/2018生长季反复评估。F₁-derived elite DH lines, we also conducted a ten-sowing assessment in the third year from Oct. 22, 2017 to Dec. 24, 2017 with an interval of 7 days. The TPSGMS line K78S was used as the check in all tests. The seed setting rate (SSR) was calculated following Yang et al. (2006) [16.]：

在哪里gn意味着袋装穗上的粒数，桑颖花数。A TPSGMS line with SSR < 5% was recognized as highly sterile and qualified for hybrid seed production [16.]．

2016-2018年的气温数据来自野外温度计屏幕上的数据记录器“HUATO S100-TH”，以及昆明气象站的日照时间。

优秀不育系异交潜力评价

从用于F二十精英DH不育系₁和F₂2018年10月15日，在约600名修复人员的包围下，在1米× 2.5米的地块上，分别种植10行。开放授粉在3-6级自然风的帮助下进行，这在整个小麦生长季节云南是常见的。每个株系20个穗状花序在开花前随机套袋。随机从每个套袋穗系10行采集20个开放授粉穗，测定不育系的异交率[16.，17.]：

在哪里ugn和bgn分别在每个小穗的两个基部小花的未套袋和套袋粒数，桑每穗的小穗数。bgn，排除自交结实率的可能，因为TPSGMS系并不总是保持100%不育。

抗病性评价

黄锈病和白粉病是昆明地区最重要的两种常见病。将一个高度敏感的品种种植在与已检测的DH不育系相近的地方作为对照和传播者。根据Han et al.(2010)对黄锈病不育系的成株抗性进行田间评分[40和Li等(2015)对白粉病的研究[41.]．

统计分析

采用单因素方差分析(ANOVA)分析胚率、单倍体成苗率和染色体加倍率，然后采用Fisher最小显著差异(LSD)检验。多重百分比比较的u检验[42.]被用于评估在育种选自F制造的DH的效率显著差异进行₁F₂和F_3.几代人。SPSS和Excel办公室用于统计分析。

在合理的请求中，本研究中产生的植物线和数据来自相应作者。

TPSGMS：

热光敏性雄性不育

DH:

加倍单倍体

ns：

授粉穗数

NC:

颖果的数量

不:

数量的胚胎

国民健康保险制度:

由胚萌发的单倍体幼苗数

NDH:

双单倍体数

再保险:

胚胎率

RHS：

单倍体苗率

RCD：

染色体倍增

苏维埃社会主义共和国:

种子设定率

gn:

套袋穗粒数

sn:

小穗数

或者：

异交率

ugn:

在每个小穗两个基底小花未袋装粒数

bgn:

在每个小穗的两个基部小花的套袋粒数

我们非常感谢匿名审稿人对本文提出的宝贵意见和建议。感谢德国Strube Research GmbH & Co. KG的Jacobi A博士和Akel S博士，以及美国Wisconsin-Madison大学的Jiming Jiang教授的英文编辑。

该工作得到了中国国家重点研发计划（2016年FD0101603）的支持;云南农业科学院粮作物学会总监（2013LZS003）;中国科技部人才年轻科学家;云南农业科学院人才培育课程。该资助者在研究和收集，分析，数据的解释和写作稿件中没有作用。

作者指出

1. 宏盛李和李绍祥同等贡献这项工作。

从属关系

1. 云南农业科学院粮作物研究所/云南省云南云南分公司，云南，云南，650205，P. R.中国

   宏盛李，李绍祥，Sedhom Abdelkhalik，Armaghan沙赫扎德，肩骨，中汇洋，丁明良，刘昆，赵和亩均杨红

2. 农业研究中心农田作物研究所，埃及Kafr El-Shaikh 33717

   Sedhom Abdelkhalik.

3. 国立基因组学与现代生物技术，国家农业研究中心，伊斯兰堡45500，巴基斯坦

   Armaghan沙赫扎德

贡献

HL和SL构思和设计了研究;SA，AS，JG，ZY和Hz进行了实验;HL，因为我写了稿件;MD和KL有助于准备稿件;所有作者阅读并认可的终稿。

相应的作者

对应到Mujun杨．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

所有作者都同意发布。

相互竞争的利益

作者声明他们没有利益冲突。

出版商的注意

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