与茄子嫁接降低烟草烟碱含量

背景

尼古丁是一种兴奋剂，强效拟副交感神经生物碱占的生物碱含量96-98％。在尼古丁的量的减少在香烟，以实现非成瘾性级别是必要的。我们调查是否通过接枝可以限制烟碱生物合成和生产烟草叶具有超低尼古丁含量茄子代替烟草根，并通过茄子接枝引起的基因表达的差异。

结果

接枝烟叶的尼古丁水平显着降低。粪便汤，纳卡辛，NNN，NNK，NAT，总TSNA和主流卷烟烟雾的尼古丁的含量降低，氨基酸的含量和生物碱的前体在接枝中增加。茄子嫁接导致440个基因的差异表达。LOC107774053在两个PPI网络中具有更高的程度，该网络由TF目标网络中的LOC107802531和LOC107828746进行调控。

结论

用茄子代替烟草根可以限制尼古丁生物合成，生产出烟碱含量极低或零的烟叶。LOC107774053基因的差异表达可能与茄子嫁接有关。

生物碱是一类天然存在的有机化合物，主要含有碱性氮原子[1].尼古丁是一种刺激性强的拟副交感神经生物碱，存在于茄科植物中，茄科，以及烟草中的兴奋剂[2]此外，尼古丁是烟草烟雾中最重要的神经原成分[3.]．尼古丁作为烟叶中的主要活性成分，可诱导成瘾[4.那5.]．Benowitz等人[6.]首先提出将烟草尼古丁含量降低到成瘾阈值以下，可以有效降低吸烟者对烟草的依赖。食品和药物管理局已考虑强制减少香烟中的尼古丁含量，以达到不上瘾的水平[7.]．世界卫生组织建议，烟草中的尼古丁含量应降低到0.4毫克/克以下[8.)至0.2至0.3毫克/克之间，低于维持上瘾的阈值[6.]．因此，迫切需要与低/超低尼古丁烟草技术有关的研究及其对烟草质量的影响。

目前降低烟草中尼古丁含量的技术包括诱变育种[9.]、化学及农艺规例[10]，以及工业方法[11]．然而，这些方法有一些局限性。例如，减少烟叶中尼古丁含量的化学和农艺调控的范围非常有限[12].抑制或敲除尼古丁合成的关键基因可以有效地将烟叶中尼古丁的合成和含量降至接近零的水平，但由于对质量的影响和对转基因生物的限制，很难将其应用于生产[13那14]．工业方法，如化学提取，可以将烟草叶片的尼古丁含量降低到非常低的水平，但它们也具有不利的影响，例如香气成分的降低[11]．

嫁接可以延缓烟草青枯病的发生，降低发病率和病情指数，提高烟草的产量、产值和平均价格[15]．烟草尼古丁的合成部位位于根部[16]．烟草接穗茄子嫁接苗对青枯病的抗性增强[17]．1942年，道森[16结果表明，烟草接穗在番茄砧木上生长时，烟碱在烟叶和茎上的积累不显著。由于本研究主要研究烟草和番茄互接穗中烟碱在砧木和接穗之间的分布，没有进行化学成分检测和基因表达变化的实验。

因此,在当前的研究中,利用烤烟作为同一家族的后裔和茄子根茎,烟草和茄子的种间嫁接技术探索,和新鲜的农艺性状和化学成分测定和烤烟草植物的生长和发育。阐明了超低烟碱含量对烟叶感官品质的影响以及烟叶和烟气中某些有害成分的影响。此外,茄子嫁接诱导的基因表达差异的探索通过生物信息学分析烟草和烟草烟草/ /茄子团体,包括主成分分析(PCA)、(度)的差异表达基因分析基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析、蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络分析、转录因子(TFs)-靶标网络分析。本研究旨在研究是否通过嫁接来替代烟草根来限制烟碱生物合成，从而生产出烟碱含量极低或零的烟叶。

农艺性状

烟草/烟草和烟草/茄子组在最大叶长和叶宽、株高、茎围和节间上没有显著差异，而烟草/茄子组在未发生hilling的情况下，以及烟草/茄子发生hilling 65和80 嫁接后几天(P.< 0.05)(图1）.

生物碱

烟草和茄子嫁接后，烟叶中的生物碱含量显著降低，anabasine占总生物碱的比例增加。烟草和茄子嫁接后产生的新鲜烟叶中未检测到去甲烟碱和锐钛矿碱含量。嫁接烟叶中的烟碱水平显著降低，其中新鲜烟叶中的尼古丁含量降低至0.08%，烤烟烟叶中的尼古丁含量降低至0.09%（与烟草/烟草对照相比降低了95%），尼古丁占总生物碱的比例降低，新鲜和烤烟烟叶中的去甲烟碱、胡麻碱和大麻素占总生物碱的比例增加（表2）1和2）.

喂养的选择行为

供给选择行为的结果表明（图：S1)，在相同条件下，以超低烟碱烟草/茄子叶片为佳，且烟草/茄子取食面积随时间显著增加。而对照组的饲养面积无显著差异。当低烟碱烟草的叶面积为零时Heliothis assulta开始吃对照的叶子

主要化学成分

嫁接后的新鲜烟草在总氮、总糖、还原糖和烟碱方面存在显著差异(P.< 0.05)。烟草/茄子的总氮含量增加，总糖，还原糖和尼古丁显着降低。在接枝后，在固化的烟草的化学成分中观察到显着差异（P.< 0.05)。烟叶上部和中部的烟碱含量均比对照低95%。不上坡时，上、中叶淀粉含量分别比对照提高79和55%(表2)3.和4.）.

嫁接后，鲜烟叶和烤烟叶中氨基酸含量与对照(P.< 0.05)。在鲜烟叶中，除Tyr含量外，嫁接茄子烟叶的氨基酸含量均显著高于对照。在与茄子嫁接的烤烟叶片中，氨基酸(P.< 0.05)， Glu、Tyr、Phe含量在未起堆的烟草/茄子中最低。从总氨基酸含量来看，未上丘的烟/茄子、上丘的烟/茄子与烟/烟(P.< 0.05)。烤烟/茄子不上坡处理与烤烟/茄子上坡处理之间无显著差异，且烤烟/茄子总氨基酸含量显著高于对照(表S1和S2）.总之，烟草和茄子嫁接有利于氨基酸的积累。

对于4-（甲基亚氨基氨基氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNN），（R，S）-N-亚硝吡磺酰胺（NAT），（R，S）-N-亚硝烷基（NAB），4- （甲基亚氨基氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）和通过接枝产生的烟草的总TSNA含量，与对照相比有显着差异（P. < 0.01)烟草/茄子上部叶片的NNN、NNK和总TSNA含量分别比对照低82.71%、79.46%和68.78%；烟草/茄子中部叶片的NNN、NNK和总TSNA含量分别比对照低79.68%、79.80%和68.63%总TSNA含量的降低主要是由于NNN和NNK含量的降低（表S）3.）.

烟的特征和感官反应的变化

总颗粒物质，烟雾中焦油或烟草/烟草中的一氧化碳排放的总颗粒物，烟草/茄子，烟草和烟草与山丘治疗（P.< 0.05)。有尼古丁释放显著差异比对照（P.< 0.01)。烟草/茄子不上丘和烟草/茄子上丘的烟碱释放量分别比烟草/烟草低94.12和92.66%。结果表明，烟草和茄子嫁接能在很大程度上控制卷烟烟气中尼古丁的释放(图。2一种）。

烟草和茄子嫁接对烟叶感官品质的影响，烤烟上部和中部烟叶相同，与对照相比，有隆起的烟草/茄子和无隆起的烟草/茄子的香气品质、不良口感和后味下降较小，没有差异与茄子嫁接后，香气质量和影响发生了显著变化（图。2b, c)。

上叶对吸烟者反应的影响与中叶相同。与控制相比，烟草/茄子的满足，乐趣和接受烟草和烟草的烟草/茄子没有山丘的烟草/茄子低于控制。烟草/茄子与没有山丘的烟草/茄子之间的烟草/茄子之间的满意度，乐趣和验收的得分是一样的。结果表明，通过烟草和茄子嫁接产生的超低尼古丁烟草对吸烟者的反应产生了影响（图。2d）。

数据预处理

通过测序获得总计49.54g原料数据，筛选后获得48.80g清洁数据。在数据预处理后，获得45,956个基因用于本研究。

样本间的相关分析和主成分分析

样本之间的相关系数P为0.982–1。组内样本的相似性平均值为0.9999，组间样本的相似性平均值为0.983（图S）2a). PCA结果显示，烟草/烟草组与烟草/茄子组明显分离(图S2b）。

度分析

在分析之后，在烟草/烟草组和烟草/茄子组之间获得440℃（212升至和228个下调）。热线图和火山图（图S3.)表明，DEGs可以按照预先分组(烟草/烟草组和烟草/茄子组)完全分离样品，表明这些基因与不同的生物碱合成能力相关。

GO和KEGG通路富集分析

结果显示，78个MF、23个CC、180个BP和12个KEGG通路中富集了440个DEGs。图S列出了前10个GO和所有KEGG通路4.．这些基因在维生素B6代谢、转运体和核黄素代谢途径以及细胞对磷酸盐饥饿、细胞对外界刺激和磷酸盐离子稳态反应的BP中显著富集。

PPI网络建设与网络学位分析

PPI网络烟草的抗旱性(无花果。5.a） 及Nicotiana tomentosiformis.(无花果。5.b） 共有113个蛋白质节点和167个蛋白质对N. Sylvestris.．在蛋白网络中有104个蛋白节点和142对蛋白对n tomentosiformis．经过网络度分析，LOC107758934、LOC107774053、LOC107792960、LOC107820178、LOC107821210、LOC107824707对应的蛋白在两个网络中具有较高的度，可能是hub蛋白。

PPI模块分析

模块在PPI确定了烟草的抗旱性(无花果。6.a).它包括10个蛋白质(9个上调，1个下调)，对应13个基因。GO和KEGG通路分析表明，这13个基因在27 MF、17 CC、58 BP(如核小体组装、染色质组装和蛋白质- dna复合物组装)和两条KEGG通路(染色体、相关蛋白和外泌体)中富集。前10名的结果如图S所示6.湾

tf预测与tf目标网络构建

预测tf, TF-target网络如图S所示7.。TF靶网络包括七个TF（LOC107789709、LOC107827800、LOC107802531、LOC107828746、LOC107777554、LOC107767686和LOC107765920）和58个由这些TF调节的差异表达靶基因。由LOC107802531和LOC107828746调节的LOC107774053在PPI网络中具有更高的程度。

本研究嫁接结果表明，烟草和茄子嫁接组嫁接烟叶的烟碱水平显著降低，而烟叶的植物学和农艺性状没有显著变化。嫁接烟草中降烟碱和烟碱含量降低，氨基酸和生物碱前体含量显著升高。蛋白质、淀粉和全氮含量较高，糖含量较低。主流卷烟中NNN、NNK、NAT、总TSNAs和烟碱含量显著降低。生物信息学分析显示，嫁接烟草叶片中有440个DEGs，在维生素B6代谢、转运体和核黄素代谢途径中显著富集。LOC107774053在两个PPI网络中具有更高的程度，该网络由TF目标网络中的LOC107802531和LOC107828746进行调控。

在本研究中，嫁接烟草的生长形态和特性与对照相似，茄子嫁接烟草对烟叶中化学成分含量有影响，嫁接烟草中氨基酸和蛋白质含量高于对照tent可能与碳和氮的分布和代谢变化有关。嫁接茄子的烟草中的氨基酸可能不会进入生物碱合成途径，可能更多地用于蛋白质合成或其他代谢途径。在没有土壤覆盖的烟草/茄子中仍然检测到低含量的尼古丁这表明它合成尼古丁的能力很弱。但是，关于微量尼古丁是来自茄子还是嫁接的部分，还需要进一步的研究。这一结果与Dawson的研究结果一致[16]．当烟草中断在番茄砧座上繁殖时，烟草叶片或茎中没有明显积累。他还发现，尼古丁保持在茎和下叶中，最初存在于温度中，随后产生的叶片和干组织是无尼古丁的。在我们的研究中，通过培养从SCION的基础引起不定根，与没有土壤的接枝烟草的烟草叶片的尼古丁含量显着增加，表明阴分的不定根可以合成尼古丁;因此，土壤培养影响了不定根的尼古丁合成。此外，嫁接烟草叶中的Anabasine的含量与烟酸的含量同步下降，但其总生物碱含量的比例显着增加，这可能是由于叶子中具有合成能力的组织18]．

对于本研究中，NNN，NNK，NAT，和总的TSNA的含量显著与尼古丁含量的降低与茄子嫁接后下降。此外，总颗粒物质，焦油和一氧化碳在香烟烟雾移植后的那些相似的控制，和烟道气中的尼古丁含量显著低于对照。通过嫁接技术，香气质量和数量，不良味道，影响，刺激性，满意，愉悦和验收降低烟叶中的尼古丁含量后下降。尼古丁和生物碱是亚硝胺的前体，且有烟草生物碱和TSNA类[之间的直接相关性19那20]．在相同硝态氮含量和调节环境条件下，烟草叶片TSNAs含量与生物碱含量呈显著正相关[21]．烟碱、去甲烟碱含量与NNN、TSNA含量呈正相关[22]．烟叶中烟碱和全氮含量是影响烟叶内在品质和感官品质的主要因素[23]．尼古丁是限制烤烟口感的主要化学成分[24].在常规育种和化学提取的基础上，超低尼古丁烟叶的质量和感官质量较差，从而降低了消费者的接受度，难以用于卷烟配方[25]．烤烟中烟碱含量与烟叶香气品质和中性香气物质含量相关[23]．由于尼古丁含量低，不能满足吸烟的生理要求。吸烟者的满意和愉悦没有得到满足，影响了对烟叶的接受。因此，烟碱含量的降低对烟叶TSNA品质、香气品质和感官品质均有影响。

在目前的生物信息学分析中，PPI模块分析表明DEG在核小体组装、染色质组装和蛋白质-DNA复合物组装、染色体途径和相关蛋白质及外显体的BPs中显著富集。DNA复制、DNA修复和基因转录后的核小体组装是关键ical用于维持基因组稳定性和表观遗传信息[26]．染色质组件是一种基本的生物过程，对于真核基因组的复制和维持是必不可少的[27]．如上所述，在烟草根中合成尼古丁[16]，这可能解释了DEG的富集KEGG途径和GO项均与尼古丁生物合成无关的现象。LOC107774053在两个PPI网络中的程度较高，这两个PPI网络由TF靶网络中的LOC107802531和LOC107828746调节。因此，我们推测，在egg后差异表达的LOC107774053植物嫁接可能受LOC107802531和LOC107828746的调控。需要进一步的研究来验证我们的推测。

总之，通过嫁接茄子代替烟草根可以限制尼古丁的生物合成，并产生超低或零尼古丁含量的烟叶。但是，潜在的分子机制有待验证。

研究设计和材料

2017年，利用茄子(Solanum Melongena.作为砧木，以烤烟品种云烟87为接穗。共分为3组:(1)对照烟草/烟草，接穗和砧木均为云烟87;(2)烟草(接穗)/茄子(砧木)组1不堆垛，接穗底部不覆土;(3)烟草(接穗)/茄子(砧木)2组采用垄作，在嫁接界面外覆土诱导烟草不定根。本研究使用的植物材料来自洛阳烟草公司和河南农业大学。

黑穗槐的选择行为

本试验在39 × 54 cm泡沫培养箱中进行，保持一定湿度，防止烟叶萎蔫。采集鲜烟叶(上部嫩叶)，处理烟叶和对照烟叶分别切成10等份(2 × 12 cm)，按ABABAB…(图S8.）.相邻叶片之间的距离相同，间距为2厘米。总计25h . assultaof the same size were placed into the center of the box, which was sealed and observed every 3 h. After 12 h, the remaining leaf area was measured using transparent coordinate paper (Fig. S8.）.

新鲜的烟草样品

接枝65天或80天后，取各组中间叶片(第12片叶片)。当烤炉温度达到105°C时，将烟叶放入烤炉中约15分钟杀死烟叶，然后在50°C烘干。研磨后，用60目筛测定化学成分、生物碱、氨基酸和烟草特异性亚硝胺(tsna)。

烤烟样品

通常收获成熟的烟草叶。为每种处理选择烟叶的中间叶（7-14叶位置）和上叶（15-20叶位置）。在将烟叶制成杆后，加入标记物，使用三级烟道固化过程来固化叶子。将固化的样品除去，在50℃，研磨处烘箱干燥，并通过60目筛过滤。

统计分析

采用Excel 2010和SSP17.0软件进行统计分析。多重比较采用Duncan方法。

rna测序和数据预处理

烟草/烟草组和烟草/茄子2组的烟叶样品烟草（普通烟草）具有不同的生物碱合成能力。本研究包括六个样本（烟草/烟草1、烟草/烟草2、烟草/烟草3、烟草/茄子1、烟草/茄子2和烟草/茄子3）。如前所述，使用Qiagen Plant RNA迷你试剂盒从叶片中分离总RNA[28]．All possible DNA contamination was removed by treating RNA with RNase-free DNase I (TaKaRa, Dalian, China) at 37 °C for 30 min. Gel electrophoresis was applied to check RNA quality. The concentration of RNA was determined by detecting absorbance at 260 nm using Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies, USA) and NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, USA). mRNA was extracted from total RNA by utilizing magnetic oligo (dT) beads Then, based on the random hexamer-primed reverse transcription, the first-strand cDNA was synthetized. Next, using buffer, RNase H, DNA polymerase I, and dNTPs, second-strand cDNA was obtained. Short fragment was purified with a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Frankfurt, Gremany) and resolved for adaptor ligation and end reparation. Approximately 200 bp cDNA fragments were isolated after gel electrophoresis. Finally, following the manufacturer’s instructions, the samples were performed single end read sequencing with 50 cycles (Illumina HiSeq 2000).

测序数据保存于国家生物技术信息中心数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA626466）.

首先对的六个样品的原始数据进行质量控制，并且获得干净的数据。干净的读取被映射到的参考基因组烟草（组装NTAB-TN90）（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/715/135/GCF_000715135.1_Ntab-TN90/GCF_000715135.1_Ntab-TN90_genomic.fna.gz)使用tophat软件[29) (v2.1.0)。该参数设置为default。根据烟草基因组注释信息(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/gcf/000/715/135/gcf_000715135.1_ntab-tn90/gcf_000715135.1_ntab-tn90_genomic.gff.gz.）使用FeatureCounts软件[30) (v1.6.0)。

样本间的相关分析和主成分分析

样本间的表达水平相关性是检验实验可靠性和样本选择是否合理的重要指标。我们使用cor函数(https://stat.ethz.ch/R-manual/R-devel/library/stats/html/cor.html)在R3.4.1中计算Pearson相关系数（P）。P越接近1，样本之间表达模式的相似性越高。

PCA的目标是通过降维将多指标转化为几个综合指标。主成分分析后，选取前两个主成分。根据主分量的得分，可以绘制出样本在二维平面上的分布，并从图中确定样本的分类。在本研究中，使用prcomp函数(https://stat.ethz.ch/R-manual/R-devel/library/stats/html/prcomp.html)执行尺寸缩减，以及ggfortify(版本:0.4.5，https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/CRAN/bin/windows/contrib/3.4/ggfortify_0.4.5.zip)包用来构造主成分分析图。

筛选煤层

原始计数的数据归一化使用edgeR包中的拓扑MM算法[31那32(版本:3.4)。同时将其转化为logCPM值，进行烟草/茄子组相对于烟草/烟草组的DEGs分析。相应的P.- 获得所有基因的价值和折叠变化（Fc），P.-value < 0.05，设置阈值为|logFC| > 1 (|FC| > 2)。

GO和KEGG通路富集分析

所有获得的基因都被映射到SWISS-PROT数据库[33]和GO项，包括分子功能(MF)、细胞成分(CC)和生物过程(BP)。使用在线自动标注网站KAAS进行KEGG路径分析[34]（https://www.genome.jp/tools/kaas/).参数设置如下：搜索程序 = 生物体 = nta和分配方法 = BBH（双向最佳击球）。

然后，使用R软件包GOstats（版本：2.40.0）对DEG进行GO和KEGG途径富集分析[35]．选择具有至少5个基因的term (GO- bp、GO- mf、GO CC和KEGG pathway)作为富集背景。最后,与P.-value < 0.05 were regarded as significantly enriched results.

PPI网络建设与网络学位分析

STRING [36]（版本：10.0，http://www.string-db.org/)数据库用于预测由基因编码的蛋白质之间的相互作用。两者之间没有相互作用烟草，这是由间隙之间的杂交产生的同种异体表单N. Sylvestris.和n tomentosiformis[37]．因此，将DEG映射到蛋白质序列N. Sylvestris.和n tomentosiformis获取DEGs和DEGs之间的对应关系N. Sylvestris.以及n tomentosiformis， 分别。然后，PPI网络烟草是通过搜索N. Sylvestris.和n tomentosiformis在数据库中。PPI分数设定为0.4（中等置信度）。获取PPI对后，使用Cytoscape软件（3.4.0版）构建网络（3.4.0版）。http://chianti.ucsd.edu/cytoscape-3.4.0/) [38]．

使用骨盆插件进行节点的网络度分析[39]（版本2.1.6，http://apps.cytoscape.org/apps/cytonca.)参数设置为无权重。通过对每个节点的度进行排序，获得PPI网络中参与蛋白质相互作用的重要节点（hub蛋白质）。

PPI模块分析

评分为> 5的模块使用MCODE插件进行筛选[40]在Cytoscape软件中，参数设置为默认值（度截止值） = 2、节点评分截止 = 0.2，K芯 = 2和最大深度 = 100). GO和KEGG途径富集分析使用R软件包GOstats进行。选择至少有五个基因的术语（GO-BP、GO-MF、GO-CC和KEGG途径）作为富集背景。最后，与P.-value < 0.05 were regarded as significantly enriched results.

tf预测与tf目标网络构建

PlantRegMap在线数据库[41.那42.]（http://plantregmap.cbi.pku.edu.cn/）用于预测DEG的TFS，差异表达的TFS和相应的差异表达的靶基因。参数设置如下：物种= 烟草那Organ = All, Method = Motif, Mode = Genes (retrieve regulations among them). After obtaining the TF target, the TF target network was constructed using Cytoscape software.

测序数据保存于国家生物技术信息中心数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA626466）.

在本研究中使用和/或分析的数据集可从通讯作者在合理要求。

PCA：

主成分分析

度:

差异表达基因

走：

基因ontolog

KEGG:

京都基因和基因组百科全书

PPI:

蛋白质相互作用

TF：

转录因子

TSNA：

烟草特有亚硝胺

MF:

分子功能

答:

蜂窝组件

英国石油公司:

生物过程

舰队指挥官:

折变

某某:

(4) - methylnitrosamino 1 - (3-pyridyl) 1-butanone

奈特:

（r，s）-n-亚硝酸丁滨

纳布：

(R, S) -N-nitrosoanabasine

亚硝胺:

(4) - methylnitrosamino 1 - (3-pyridyl) 1-butanone

一个也没有。

这项工作得到了降低烟草硝酸盐含量研究的支持（批准号2019110004340244）；茄子嫁接生产超低烟碱烟草的研究（批准号20193100001）。

从属关系

1. 烟草科学学院/烟草栽培重点实验室中国烟草/烟草减少研究中心，河南农业大学，河南省郑州450002的文华路95号

   蒙娟仁，宫殿张，汇娟杨洪志施

贡献

研究的构思与设计:HS;数据采集:MZ、HY;数据分析与解释:MZ, HY;统计分析:MZ、HY;起草手稿:MR;重要知识内容手稿的修订:HS。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到石洪志．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突。

出版商的注意事项

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