选择效应和三个蓝莓品种全基因组倍增（WGD）事件的分子足迹：由转录组数据集检测

背景

无论选择效应和全基因组倍增的植物物种和发展中扮演了非常重要的作用，并破译了相应的分子足迹一直是遗传学家的中心任务。Vaccinium是种属丰富是由约450种，蓝莓是最重要的品种之一Vaccinium属植物，因其高健康价值而广受欢迎。本文旨在破译蓝莓物种进化史上单拷贝基因上的自然选择分子足迹和WGD事件。

结果

从19个兔眼蓝莓品种(T1)、13个南方高丛蓝莓品种(T2)和22个北方高丛蓝莓品种(T3)叶片转录组组装的45,535、42,914和43,630条ungenes中，分别鉴定出30,143、29,922和28,891条推测的蛋白编码序列。共发现17、21和27个单拷贝同源基因分别在T1与T2、T1与T3、T2与T3中发生阳性选择，这些同源基因富集于“萜类骨干生物合成”、“缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成”、“丁酸代谢”等代谢通路中。“c5 -支链二元酸的代谢”“泛酸和辅酶a的生物合成”。我们还检测到发生在三个蓝莓物种进化史上的最近(约9.04 MYA)、中(约43.44 MYA)和古老(约116.39 MYA) WGD事件的显著分子足迹。

结论

蓝莓中一些重要的功能基因表现出正向选择效应。在蓝莓物种的进化史上，至少检测到3轮WGD事件。我们的工作为蓝莓的适应进化和物种辐射的遗传机制提供了深刻的见解Vaccinium在短的地质尺度时间内。

突变-选择过程是进化最基本的机制，突变是自然选择作用的来源，最终自然选择导致等位基因(突变)频率的优化过程[1］．识别受自然选择影响的等位基因或基因使遗传学家着迷了很长一段时间。2,3.］．到目前为止，已经引入了十多种统计方法来检测导致自然选择的分子足迹[4,5］．其中，Ka/Ks比值法(Ka:每个非同义位点的非同义替换数，Ks:每个同义位点的同义核苷酸替换的数量)对估计选择压力和理解密切相关但却存在分歧的物种的蛋白质编码序列的进化动态有很大的影响[6,7,8］．

全基因组复制(WGD)或多倍体事件是另一种进化遗传现象，它在物种形成和进化中具有重要意义，长期以来一直吸引着遗传学家[9,10,11,12］．例如，WGD事件是许多植物谱系物种辐射的重要力量[13,14,15,16,17］．根据年龄和细胞遗传学和染色体核型的结果，WGD事件可分为两类，一类是近期的或新的多倍体事件，这导致了“同源多倍体”，并从非减数分裂，或杂交所产生的配子的融合出现从种间杂交产生的相同物种的个体的正常减数分裂配子，或“异源多倍体” [18］．大约47-70%的被子植物被估计为多倍体，大约25%的维管植物经历了近期的多倍体化[19,20.]，该WGD事件可通过核型分析和流式细胞术检测[21］．另一个是发生在早期地质时代的古代多倍体事件。我们认为所有现存的被子植物都是古多倍体，在它们的进化史上都经历了两次或更多的古代多倍体事件[22,23］．尽管随后发生了二倍体化(大量基因丢失和结构重排)或分裂事件，使多倍体恢复到二倍体状态，但古老的WGD足迹仍会以复制基因块的形式出现在基因组序列中[24,25］．

下一代测序技术产生的高通量基因组数据正频繁用于研究进化遗传学的关键问题[26,27,28］．然而，对于一些基因组多倍体、杂合度高或基因组GC含量高的非模式物种，全基因组测序仍不可行。在这种情况下，转录组测序提供了理想的选择，具有测序成本高、信息丰富、编码蛋白、功能预测、无物种或个体限制等优点[29,30.,31］．近年来，转录组测序被广泛用于检测进化研究的分子足迹，包括选择效应和WGD [32,33,34,35,36］．

Vaccinium是杜鹃花科中一个年轻而分布广泛的属，约有450种[37,38］．的种数Vaccinium属远远超过属级植物（约67个属）和杜鹃花科植物（约80个属）的平均物种数(http://www.theplantlist.org/statistics/)．显然,Vaccinium品种经历了近期和辐射演化。在近几十年来，Vaccinium由于许多品种(如蓝莓、蔓越莓、越桔和越橘)的果实中富含抗氧化剂，具有营养和治疗作用，因而越来越受到人们的关注[39］．蓝莓是我国最重要的植物群之一Vaccinium，由约20个品种组成[38］．除6个二倍体种外，所有蓝莓种均为多倍体，有的具有复杂的多倍体基因组，如Vaccinium corymbosum［40］．尽管蓝莓的驯化和栽培只有一个世纪的历史，但蓝莓已被列为北美经济上最重要的五大非柑橘类水果[41,42]蓝莓受欢迎的主要原因是其优良的饮食治疗功能，这是由水果中的高花青素含量产生的[30.,43,44,45]目前商业种植的蓝莓品种主要来自二倍体矮丛蓝莓(诉myrtilloides)、四倍体矮丛蓝莓(诉angustifolium)，北方四倍体高丛蓝莓(诉corymbosum)，六倍体兔眼蓝莓(诉virgatum），南部丛蓝莓（混合自诉corymbosum L×南方本地种)和半高丛蓝莓(杂交诉corymbosum×诉angustifolium)[46,47］．其中，兔眼蓝莓、北方高丛蓝莓和南方高丛蓝莓在商业水平上被广泛种植。

到目前为止，和许多重要作物一样，蓝莓研究也进入了基因组时代。例如，一种北方高丛蓝莓的基因组草图已经发表[48,49］．转录组分析已被用于研究蓝莓在寒冷环境中的基因表达特征[50,51,52]，蓝莓抗氧化物质的代谢相关基因[53]蓝莓感染病毒后基因表达谱的变化炭疽菌acutatum［54]蓝莓果实5个发育阶段的基因表达动态[48]，和检测分子标记的[55］．然而，关于蓝莓的基因组进化的报告是有限的。在本文中，我们分析了组装转录数据，将其从第二代测序平台产生，并且一个主要目的是：（1）重新构造中54个蓝莓品种的亲缘关系，（2）鉴定的基因经历选择效应，（3），并检测在蓝莓的进化史的WGD事件，并在约进化辐射的遗传机制提供深入了解Vaccinium物种。

蛋白编码单基因综述

从45535年rabbiteye组装unigenes蓝莓(T1)、42914年南部高丛蓝莓(T2)和43630年在北高丛蓝莓(T3)物种,我们确定了30143年,29922年和28891年蛋白质编码unigenes根据Nr的注释,Swiss-Prot,去和KEGG数据库,并利用程序三个蓝莓ESTScan物种,分别(表1)．

基因家族的统计数据

我们从三个蓝莓转录组的蛋白编码基因中检测到45171个基因家族。其中，有14882个基因家族，包括52780个ungenes，被所有三个蓝莓转录组共享。兔眼蓝莓与南方高丛蓝莓共有1643个基因家系，其中ungenes 3306个;南方高丛蓝莓与北方高丛蓝莓共有2360个基因家系，其中ungene 4780个;兔眼蓝莓与北方高丛蓝莓共有1585个基因家系，其中ungene 3215个。兔眼蓝莓、南高丛蓝莓和北高丛蓝莓的特异性基因家族分别为9395个、8162个、7144个、7266个。我们还鉴定了所有三种蓝莓共有的12,688个同源单拷贝基因家族和2915个多拷贝基因家族(见表)2无花果1)．

蓝莓品种间的遗传关系

在系统发育树中，所有品种聚为两个主要类群，兔眼品种聚为一个主要类群，南高丛和北高丛品种聚为另一个主要类群，然后又分成两个大类群，同一种蓝莓属于同一类群。在由19个品种组成的兔眼组中，样本V.asch01(品种:蓝铃花)和V.asch08(品种:Summit)与其他品种在遗传距离或系统发育关系上均较远，V.asch09(品种:Delite)、V.asch17(品种:Climax)、V.asch19(品种:Bonita)、V.asch13(品种:Bluebelle)、vasch 18(品种:Beckyblue)的亲缘关系较近，其他品种的亲缘关系较近。在13个品种的南方高丛组中，V.cory01(品种:Sharpblue)、V.cory07(品种:O’neal)和V.cory06(品种:Misty)位于系统发育树的底部，亲缘关系较远。在22个品种的北方高丛组中，V.cory30(品种:早熟禾)位于簇底，V.cory15(品种:Sierra)， V.cory22(品种:大蓝金)，V.cory21(品种:Brigitta)， V.cory23(品种:Collins)， V.cory18(品种:Bluehaven)， V.cory20(品种:Legacy)， V.cory24(品种:与V.cory26(品种:泽西)聚在一起形成一个亲缘关系较近的大分支，而其他所有品种聚在一起形成另一个大分支，具有较近的系统发育关系(图2)。2)．

单拷贝同源单基因的选择效应

在3种蓝莓的12,688个单拷贝同源基因中，经Ks > 0.1和适用Ka和Ks过滤后，T1与T2、T1与T3、T2与T3的同源基因分别为2276、2452、1711个。13例、15例和10例直系亲属存在显著的强阳性选择足迹(Ka/Ks > 1);4、6、7直系亲属Ka/Ks值为0.5 < Ka/Ks < 1，显示弱阳性选择足迹;684、721和512个亲缘Ka/Ks显示了纯化选择足迹(Ka/Ks < 0.1);1575、1710和1180三个类群的Ka/Ks在0.1 ~ 0.5之间呈中性进化(见表1)3.无花果3.；表的年代1)．共鉴定出32个T1的unigenes, 31个T2的unigenes, 37个T3的unigenes进行了阳性选择(表)4；表的年代2)．在这些阳性的选择性单基因中，T1中的9个单基因产生了91个氧化石墨烯项(62个氧化石墨烯项与生物过程有关，18个氧化石墨烯项与细胞成分有关，11个氧化石墨烯项与分子功能有关)。其中4个GO项(GO:0016772、GO:0010506、GO:0031329和GO:0009894)显著富集。T2中10个unigenes共产生185个GO项，其中98个GO项与生物过程有关，39个GO项与细胞成分有关，48个GO项与分子功能有关。其中8个GO项(GO:0010506, GO:0031329, GO:0009894, GO:0010506, GO:0031329, GO:0016485, GO:0051604和GO:0009894)被发现显著富集。T3的14个unigenes产生了234个氧化石墨烯术语(135个氧化石墨烯术语与生物过程相关，38个氧化石墨烯术语与细胞成分相关，61个氧化石墨烯术语与分子功能相关)。其中，6个GO项(GO:0016744、GO:0010506、GO:0031329、GO:0009894、GO:0016485、GO:0051604)显著富集(见表2)4表的年代3.)．KEGG数据库注释了8个阳性选择性unigene0035236和T3-Unigene0033665, T2-Unigene0000660和T3-Unigene0000319, T2-Unigene0021375和T3-Unigene0020145, T2-Unigene0023454和T3-Unigene002102为同源对。其中T2-Unigene0023454和T3-Unigene002102是KEGG数据库中推测的编码“Ste24内肽酶”的基因，其ID为3.4.24.84，而“Ste24内肽酶”是KEGG数据库中涉及“萜类骨干生物合成”代谢途径的关键酶，其ID为ko00900。T1-Unigene0035236和T3-Unigene0033665是KEGG数据库中编码“Acetolactate synthase”的基因，其ID为2.1.1.6,Acetolactate synthase是“缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成(Ko00290)”、“丁酸代谢(Ko00650)”等多途径的关键酶。“c5 -支链二元酸代谢(Ko00660)”“泛酸盐和CoA生物合成(Ko00770)”，这些途径被上述两对同源对攻击，并发现显著富集(Table4；表的年代4)．总共有1119、1047和1083年unigenes在T1、T2和T3进行净化选择至少发现了同源的一组(T1和T2, T1和T3和T2和T3),其中,286年,149年和150年unigenes在T1、T2和T3是重叠之间的T1和T2和T1和T3(图。4a)、T1 vs T2、T2 vs T3(图4)。4b） 和T1对T3和T2对T3（图。4分别c)。

三种蓝莓的全基因组复制事件

在T1、T2、T3三个时间点的Ks年龄分布有三个显著的峰，符合正态分布，拟合曲线基本相似。三种蓝莓的第一个峰均以k≈0.11的模式出现，它代表了三种蓝莓在902万年前的进化史上最近一次共同的WGD事件。3种蓝莓在k≈0.53处的第二个峰代表了3种蓝莓在4344万年前的进化史上发生的中共享WGD事件。三种蓝莓在k≈1.42附近的第3个峰表明，在约1.1639亿年前，三种不同蓝莓的进化史上存在一个古老的共同WGD事件。在三个山峰,Ks近期高点的年龄分布为正态分布的最小变化是薄的,而第三个则为正态分布的最大变化最厚,这种趋势是按照随后的二倍化的演化动力学WGD事件(图。5、表5)．

蓝莓品种间的遗传关系

阐明生物之间的遗传或系统发育关系对育种项目的亲本选择有很大的帮助[56］．近30年来，RAPD、AFLP、SSR、SNP等分子标记在种内和种间个体系统发育关系研究中发挥了重要作用[57,58].在基因组时代，通过使用下一代高通量测序技术以前所未有的速度开发了大规模SNP数据[59,60]，这使得SNP标记成为研究生物系统发育关系最常用和最方便的工具[61,62］．除上述分子标记外，单拷贝同源基因也被认为是研究种内和种间二倍体或多倍体个体系统发育关系的优良标记[63,64］．蓝莓品种来源复杂，系统发育关系的阐明对蓝莓种质资源的鉴定、保护和育种具有重要意义。以往的研究使用不同的分子标记，包括RAPD、SSR和SNP作为工具，构建不同遗传来源的蓝莓种质的系统发育关系[65,66,67,68,69］．尽管蓝莓品种或育种材料来源不同，倍性水平不同，但SSR和SNPs标记似乎是区分和分类蓝莓品种的有效工具[65,67,69］．本研究利用单拷贝核基因数据重建了三种蓝莓品种的系统发育关系，发现不同来源的蓝莓品种之间存在良好的分化和分组。

T1、T2、T3单拷贝基因的选择效应

全基因组复制事件在开花植物的进化过程中非常普遍[70］．然而，一些基因在经历复制事件后会恢复到单拷贝状态，因为在下一次进化过程中，一个拷贝会由于遗传漂变或剂量敏感选择而在基因组中随机丢失[71,72］．近年来，单拷贝的基因已经吸引了众多研究人员，因为在遗传学优秀的应用，例如，单拷贝基因是构建物种进化树[一个很好的分子工具73］．逻辑上，如果没有重复复制，单拷贝的同源基因就可以视为同源基因，而同源基因不干扰进化分析，这使得单拷贝基因成为生物选择效应和物种形成的分子机制的值得研究的对象[27,34,36,55,64,73,74］．在本研究中，我们也仅使用Ka/Ks方法检测单拷贝unigenes来识别选择效应的分子足迹。在进化遗传学中，Ks表示蛋白质编码基因的同义替代率，Ka表示蛋白质编码基因的非同义替代率。一般认为，同义突变不受自然选择的影响，而非同义突变则受自然选择的影响，其原因是编码蛋白中氨基酸组成的变化导致结构和功能的改变[75］．嘉/ Ks的指示改变特定蛋白质的结构和不改变特定蛋白质的突变率，和值给出一个清晰的思路去判断整个密切相关，但分歧的物种同源蛋白质编码序列[进化动力学76,77］．理论上认为Ka/Ks = 1表示中性进化下的蛋白编码基因，Ka/Ks > 1表示在直系进化中出现的非同义替换较多，说明基因是在正向选择下进化的。Ka/Ks < 1表示通过纯化选择(负选择)消除了有害取代。但在实证研究中，大多数Ka/Ks > 0.5基因结合Tajima’检验和Fu & Li’检验进行了适应性进化，因此Ka/Ks > 0.5的阈值一直被认为是正选择[78,79,80,81］．在本研究中，我们按照之前的标准，设置1 > Ka/Ks > 0.5为弱阳性选择，Ka/Ks > 1为强阳性选择。我们还过滤了Ks值为> 0.1的候选直方图，因为它们可能是Zhang等人所描述的拟对数[78和周等人[82］．结果表明，大多数单拷贝基因是通过中性模式进化的。部分单拷贝单基因发生了负选择，其数量远多于正选择(表S)2)．这一结果说明蓝莓基因组中有害突变的发生频率高于有益突变。在发生正向选择效应的unigene0000660和T3-Unigene0000319同源基因中，我们鉴定了编码“抗病蛋白RPS2”的同源基因(T2-Unigene0000660和T3-Unigene0000319)，该同源基因参与“植物-病原体互作(ko04626)”代谢通路(表S4)．推测该同源基因为蓝莓品种的选育和改良及其生态适应提供了有益的候选基因。据我们所知，这是关于三个物种的蓝莓基因组或基因选择效应的首次报道。

蓝莓进化史上的全基因组复制

植物基因组学时代的到来揭示了WGD或多倍体在物种进化史上的重要性和普遍性[83]，因为利用Ks年龄分布分析、基因组内与基因组间共线区域的检测与比较分析、基于高通量基因组数据构建分子系统发育树等方法，可以方便、准确地重建古WGD事件[84］．Ks年龄分布分析具有计算成本相对较低、适用于有限的副组(例如基于EST收集)、不需要副组位置信息等优点，常用于WGD事件的检测[85]因此，在本研究中，我们还使用Ks年龄分布分析来推断T1、T2和T3进化史中的WGD事件。

Ren et al. (2018) [35]利用不同种子植物的105个基因组/转录组数据检测了广泛的WGD事件，包括诉corymbosum，得出WGDs普遍存在于物种丰富的真核生物谱系中。然而，他们没有发现WGD事件诉corymbosum根据转录组数据。诉corymbosum(T2)为多倍体物种，T1和T3为多倍体物种[40]，因此应检测T1、T2和T3进化史中最近或新的WGD事件。Colle等人（2019年）[49推断最近的一次多倍体化事件发生在诉corymbosum根据高丛蓝莓同源体之间的Ks差异和4个单倍型之间的配对LTR差异0.18-0.20%，推测在大约69 - 7.7万年前。然而，这种多倍体化现象是否为其他蓝莓物种所共有还不清楚。在本研究中，尽管三种蓝莓不同转录组的Ks年龄分布直方图并不完全一致，但我们在三种蓝莓中检测到三个显著的正态分布峰。根据正态分布曲线拟合，T1、T2、T3第一个峰的中位Ks值和标准差基本相同，第二和第三个峰的趋势相似。因此，根据T1、T2和T3各副对数数据集构建的Ks年龄分布直方图，我们推断蓝莓物种进化史上至少发生了3轮WGD事件。最近WGD事件发生大约904万年前被发现前三个蓝莓物种分化,甚至可能Cyanococcus分化之前的部分,其中包括大约20个物种和它们中的大多数都是多倍体,因为所有三个WGD事件共享的三个物种,而这次WGD事件可能在蓝球藻物种的形成和进化中发挥了重要作用。Vaccinium是物种丰富的属，由约450个物种组成[38］．多倍体化事件是植物物种多样化的重要动态[11,86］．因此，第二次WGD事件距今约4344万年，可能对属的形成有重要贡献Vaccinium．在本研究中，我们还发现了约1.1639亿年的古WGD事件，这与eudiicots共有的古六倍体化事件(γ)一致[86,87］．三种蓝莓种与其他种的中位Ks值的差异可以解释为不同植物谱系间的替代率不同[86,88,89］．该结果为蓝莓物种历史上发生的三轮WGD事件提供了清晰的分子足迹，有助于理解蓝莓物种甚至杜鹃花科系复杂进化的分子机制。

单拷贝核基因数据集显示了不同来源蓝莓品种的良好分化和分组。蓝莓中一些重要的功能基因发生了正向选择，并表现出适应性进化模式。在蓝莓物种的进化史上，至少检测到3轮WGD事件。我们的工作为蓝莓的适应进化和物种辐射的遗传机制提供了深刻的见解Vaccinium在短的地质尺度时间内。

蓝莓转录组蛋白质编码序列的鉴定

以19个兔眼蓝莓品种、13个南方高丛蓝莓品种和22个北方高丛蓝莓品种(Genbank Accession ID: PRJNA511922)的叶片转录组为基础，分别分析了45,535、42,914和43,630条ungenes。样本信息、库的构建、unigenes的测序和装配等已经发表并描述过[55］．简而言之，54个蓝莓品种(信息列于图。2)采集自贵州省麻江县玄威镇五羊马村蓝莓产业工程技术中心蓝莓种质圃，采用总RNA试剂盒(STRN50-1KT|Sigma)从幼叶中提取总RNA，严格按照公司提供的指导原则提取。RNA测序文库的制备方法如下:首先用DNAse处理总RNA，然后用poly-T-oligo-attached magnetic beads过滤总RNA中含有poly- a的mRNA。其次，从纯化的mRNA序列中获得约300 ~ 500个碱基长度片段，以这些片段为模板生成cDNA的第一单链，然后从cDNA的第一链生成cDNA的第二链。然后，通过15周期pcr反应，最终确定定量纯化的双链测序文库。最后使用Illumina HighSeq 4000平台进行配对端测序。然后使用Trinity将高质量的clean reads(≥Q20)组装成具有默认参数的unigenes [90］．

在本研究中，我们从上述ungenes中鉴定了所有可能的蛋白编码序列，以供进一步分析。首先，我们blastx (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/)，将unigenes序列按Nr (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，瑞士门卫(http://www.expasy.ch/sprot), KEGG [18]及COG/KOG [91] (e值截止水平<1E-5)。Unigene序列按照上述顺序与数据库中的蛋白序列逐步比对。除非在当前数据库中找到重要的匹配，否则迭代过程将继续进行。然后，我们从blast比对结果中选择rank最高的蛋白，确定ungenes的编码区序列，然后根据标准密码子表将编码序列翻译成氨基酸序列，从而获得该基因的核酸序列(序列方向5 ' - > 3 ')和编码区域的氨基酸序列。最后，我们利用ESTScan程序预测了与上述4个数据库进行比对的unigenes的编码区(5 ' - > 3 '方向的核酸序列)及相应的蛋白序列[92］．仅使用Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG/KOG数据库注释的unigenes或ESTScan程序预测的编码区进行进一步分析。

编码序列和基因家族的预测

ESTScan程序注释或预测的单基因编码区与Blastp软件成对对齐[93］．比对后，e值低于1E-7的成对单基因视为种内或种间同源单基因。然后使用OrthoMCL软件v2.0.9，采用默认参数(identity, coverage)将unigenes、homologs(即orthologs和parogs)相互划分为同一基因家族[94］．有三种蓝莓物种的转录不止一个单一基因的基因家族被认为是多拷贝基因家族，否则视为单拷贝基因家族。只有从一个蓝莓品种的个Unigenes基因家族被定义为物种特异性的基因家族。同时，还获得了同源的或独特的基因或基因家族，然后基因家族的数量和三个蓝莓种类对应个Unigenes数由Venny工具计数并进行分析（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)．

用单拷贝ungenes构建系统发育树

通过构建基于同源基因单拷贝的分子进化树，阐明了蓝莓品种间的遗传关系。首先，我们利用ClustalW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)．其次，将所有单拷贝基因家族的多序列比对连接在一起，得到总单拷贝基因序列文件，用于构建进化树。最后，利用MEGA软件(https://www.megasoftware.net/)，在系统发生树中以核苷酸替代率作为分支长度的进化单位。

单拷贝ungenes的Ka/Ks检验

我们利用软件肌肉(http://www.drive5.com/muscle)在MEGA10.1软件中实现(https://www.megasoftware.net/)．比对序列使用RevTrans 1.4转化为相应的核苷酸序列[95］．利用KaKs_Calculator Toolbox利用标准遗传代码表(version 2.0)估算T1、T2、T3的非同义替换率(Ka)、同义替换率(Ks)以及T1与T2、T1与T3、T2与T3的所有同源基因对(orthologo)的Ka/Ks [7］．我们过滤了没有适用的Ka或Ks值或Ks值> 0.1(潜在平行对数的基准)的单拷贝正交[74,78,96］．Ka和Ks值的有效性由Zhou et al.(2016)所描述的Fisher精确检验来证明[82]，根据Yang & Bielawski(2000)的卡方检验结果，当P < 0.05，后验概率为> 0.95时，允许阳性或阴性选择位点[97和Hu等人(2018)[79］．大多数非同义突变的Ka/Ks值较低是有害的，同源基因的单拷贝没有拷贝，使生物体对有害突变的耐受性降低。因此，为了找出发生正选择但可能被大量有害突变位点中和(或覆盖)的ungenes，我们将Ka/Ks > 1的单拷贝同源基因定义为强正选择，Ka/Ks值在0.5 ~ 1之间为弱正选择。根据以前的报告，Ka/Ks < 0.1为负选择(净化选择)[74,79,80,81］．GO和KEGG富集分析采用GOseq [98]及KOBAS [99]的强阳性、弱阳性和负阳性选择的直系亲属集合。的p对于显著富集的假设检验的 - 值公式为如下：

其中，N为所有unigenes中具有pathway(或GO)注释的基因数量;n为n中种特异基因的数量;M为所有unigenes中具有特定通路(或GO)注释的基因数量;m为具有特定通路(或GO)注释的基因数量。计算P-值通过Bonferroni检验进一步校正，KEGG通路(或GO term)与p-value < 0.05定义为物种特异性基因显著富集的GO项(或GO项)。

重复单基因对的Ks年龄分布

我们从编码序列(cds)中鉴定了每个蓝莓作物的重复unigenes对(parogs)，通过不连续all-against-all MegaBLAST测量，序列相似性至少为300 bp，为40% [One hundred.,101］．我们所使用的软件的肌肉（http://www.drive5.com/muscle)比对同源蛋白的蛋白质序列，比对后利用RevTrans 1.4将序列转化为相应的核苷酸序列[61］．我们使用带有标准遗传代码表(2.0版)的KaKs_Calculator Toolbox计算每个蓝莓作物所有拟对数的k [95］．为了避免产生多拷贝基因家族的增殖效应的Ks饱和效应，我们像Shi等人所做的那样，用Ks > 2过滤了parogs [32］．我们构建了Ks密度（年龄）与用于每个情节0.03带宽分布的直方图，并装有由mixtools程序高斯混合模型的正态分布曲线，其构建中的R软件[102］．我们使用公式T来推断重复事件的年龄_多样性=Ks/2r as Zhang et al. (2019b) [103].我们设定了工厂的平均值Ks/year rate = 6.1 × 10⁻⁹根据Lynch&Conery（2000年）的说法，为了估计蓝莓物种中WGDs的年龄，每个峰值的中值Ks值被用来确定WGDs的年龄[104］．

当前研究期间生成和/或分析的数据集可在Genbank（可访问ID:PRJNA51922）[NCBI]存储库中获得，

链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/search/all/?term=PRJNA511922，以及在本研究中使用和/或分析的数据集，可由通讯作者根据合理要求提供。

WGD：

全基因组复制

T1:

兔眼蓝莓

T2:

南方高丛蓝莓

T3:

北高丛蓝莓

米娅:

万年前

作者感谢实验室成员在这项研究中给予的帮助。

贵州省教育厅重点项目[KY(2013)186];贵州省科技厅项目[(2015)6013]和[(2016)5202];国家自然科学基金项目[31560091]。

笔者注意到

1. 宁波韵升王，费聂穆罕默德卡西姆沙希德同等贡献这项工作。

从属关系

1. 凯里学院健康与生命科学学院，贵州凯里556011

   (王

2. 2 .贵州省生物研究所，贵州省贵阳市556000

   范聂

3. 华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广州510642

   穆罕默德·卡西姆舍希德

4. 华南农业大学广东省植物分子育种重点实验室，广州510642

   穆罕默德·卡西姆舍希德

5. 华南农业大学农学院，广东广州510642

   穆罕默德·卡西姆舍希德

6. 场部作物，农业和自然科学，阿邦特伊泽特巴伊萨尔大学，博卢，土耳其学院

   Faheem Shehzad俾路支

贡献

WYS构思并设计了实验。WYS, MQS, FSB和NF撰写了这篇论文。WYS和NF进行了实验。WYS和MQS分析了数据。所有作者阅读并批准了手稿的最终版本。

相应的作者

对应于(王．

伦理批准和同意参与

本研究中使用的植物样本不是从国家公园或自然保护区采集的。根据国家和地方立法，采集这些植物不需要特别许可。我们确认，这符合国家指南，在这种特殊情况下，不需要正式的道德审批。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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