不同化感潜力水稻品种根际土壤代谢物谱分析

背景

从化感水稻根际中提取与化感作用相关的代谢产物，对了解水稻的化感作用机理具有重要意义，进而促进其在农业上的应用。在本研究中，来自5个不同水稻系的根际土壤代谢物，包括化感性水稻加入PI312777 (PI)和非化感性水稻加入Lemont (Le)及其遗传衍生物(如苯丙氨酸解氨酶(朋友) PI和Le基因过表达转基因系，分别为PO和LO，和朋友通过对PI RNA干扰系(PR)的鉴定和比较分析，探索参与水稻化感作用过程的阳性化合物。

结果

结果表明，根际土壤中PI和Le的21种非极性化合物和21种极性化合物含量存在差异，其中包括几种挥发性脂肪酸和长链脂肪酸。脂肪酸的相对含量也有差异朋友过表达或RNA干扰(RNAi)沉默系及其野生型。乙酸含量在不同组间也有差异，即在化感潜能高的水稻中较高。进一步分析表明，来自ADS8树脂萃取相的不同代谢产物比来自ADS21树脂萃取相的代谢产物更丰富，表明化感水稻根系分泌物中的化感物质主要为非极性物质。这些差异代谢物的KEGG注释显示，这些化合物与营养代谢、次生代谢物合成、信号物质合成和毒素降解有关。

结论

ADS8树脂提取相的化感物质比ADS21树脂提取相的化感物质更丰富。化感水稻根系分泌物中的化感物质以非极性物质为主，长链脂肪酸被认为是化感相关代谢产物。

化感作用是一种化学生态现象，供体植物通过分泌、挥发、浸出和残留降解的过程，将其称为化感物质的化学物质释放到环境中，并影响其他受体生物[1)，可以用来控制有害生物，如杂草和害虫。因此，它已成为研究研究的重点[2，3.，4，5，6，7］．水稻化感物质的分类主要有两种观点。酚酸被认为是一组化感物质，其他的是萜类和类黄酮。Rice和Chou等人认为酚酸，如p-香豆酸，阿魏酸p稻秆分解后产生的-羟基苯甲酸和草酸可被土壤团聚体结构物质或腐殖酸固定，储存在根际土壤中，抑制水稻幼苗和杂草的生长[1，8，9］．Rimando和Seal等人从水稻根提取物中分离出化感物质，并鉴定出几种对目标植物具有抑制作用的主要酚类化感物质[10，11］．所有这些证据都有力地支持了酚醛酸是化感物质的观点。然而，Olofsdotter等人对此问题表示怀疑，他们使用4-氨基安替比林分光光度法提出酚酸化合物可能不是抑制目标杂草的化感物质[12］．另一种观点认为，酚酸对目标禾草具有抑制作用，但用于生物测定的剂量远远高于在化感水稻加入的根际土壤中检测到的剂量。因此，莫内酯B等萜类化合物在3 ~ 30 μmol/L的极低剂量下对目标杂草表现出较高的抑制作用，被认为是水稻中很有前途的化感物质[13，14，15，16］．然而，以上所有结果都是在实验室条件下得到的。此外，实验室生物测定中使用的酚酸和萜类物质的有效浓度往往高于田间释放和检测到的化感水稻，因此经常受到一些学者的质疑。

以往的研究表明，植物化感作用主要是由根系分泌的化感物质(次生代谢物)介导的复杂根际生物过程。化感植物在抑制目标杂草方面具有不同的潜力，这主要是由于化感基因在次生代谢产物合成中的功能不同，以及由化感化学物质介导的植物、土壤和根际微生物之间的相互作用结果不同，而这又需要更深入的研究来阐明这一特定根际生物过程背后的化感机制[17，18，19，20.］．

先前的研究已经证明了一些基因，包括共醇二磷酸合酶4 (OsCPS4)、kaurene合成酶样4 (OsKSL4)和苯丙氨酸解氨酶(OsPAL)，在水稻化感作用过程中发挥作用。击昏或沉默OsCPS4，OsKSL4,而且OsPAL结果表明，供体水稻对稗草的化感活性较弱。这种活性的减弱归因于根分泌物中莫内酯或酚酸含量的减少[21，22］．在这些基因中，OsPAL是苯丙类代谢的第一个关键基因，在调节酚酸合成中起作用。大量研究表明，基因表达水平OsPAL来自化感水稻的PI312777高于非化感水稻的Lemont [23，24，25，26]，其中PI312777是Dilday在化感水稻种质鉴定的田间试验中首次报道的[27]，而Lemont水稻则相反，没有化感作用[23，24，25，26］．沉默的OsPALPI312777基因的表达导致杂草抑制能力降低50%，而其过表达使杂草抑制率提高13% [19］．与PI312777小WT相比，这些转基因水稻根际微生物群落多样性也发生了变化，这可能与根系分泌物分泌的变化有关。因此，这些代谢物被认为在杂草抑制过程中起着至关重要的作用。

科学家逐渐认识到化感作用是根际生态系统中一个极其复杂的化学生物学过程中的一种生态遗传特征。然而，最近的研究表明，植物的化感作用包括由化感物质引起的直接化感作用，以及由化感物质通过微生物利用、转化和再合成介导的间接化感作用。因此，有人认为水稻的化感作用可能是由化感化学物质与根际土壤中特定微生物的相互作用引起的[28，29，30.，31］．因此，大量的研究集中在评估化感水稻与根际微生物之间的相互作用[19，22，32]，包括化感物质的分离和鉴定。那么，除了酚酸和萜类物质，还有哪些物质是化感物质呢?这需要代谢组学的应用，这是一种最近出现的生物分析方法。

代谢产物是细胞代谢调节的最终产物，是生物表型的物质基础，可以直接有效地反映生物过程，有助于分析其机制[33］．代谢产物的变化，包括种类和数量的变化，是生物系统对内部或外部刺激的最终反应，如基因突变或环境压力[34］．通过对低分子量代谢物的定性和定量分析，研究代谢途径或代谢网络，比较和分析不同生物个体间宏观表型现象的代谢差异，研究不同诱导和应激下物质的代谢响应机制[33］．代谢组学通常与转录组学、蛋白质组学联合使用，研究DNA→mRNA→蛋白质→代谢物的生理通路变化如何引起对各种环境刺激的反应[33］．由于代谢组学数据具有“高维、海量”的特性，整合差异代谢物的统计分析有助于准确挖掘和代谢途径注释，也有研究阐明了样本差异背后的机制。我们前期的研究表明，在五叶期用极性树脂处理化感水稻的植物提取物或根系分泌物时，对目标杂草的抑制率显著提高，而用非极性树脂处理植物提取物或根系分泌物则相反[35］．研究还发现，化感水稻品种的微生物多样性明显高于同类品种，这是因为化感水稻在根际土壤环境中合成和释放了更多的化感物质(如酚酸)，这说明在根际土壤生态系统中代谢物的组成是影响微生物群落结构的关键因素。在本研究中，化感水稻和非化感水稻品种及其遗传衍生物，即具有主要化感基因的转基因系PAL2-1抑制和PAL2-1-过表达，作为研究材料。采用代谢组学方法，分析不同化感潜力水稻品种在五叶稻苗期用不同树脂从根际土壤中提取的代谢物的差异，以提高对化感水稻根际土壤化学生态特性的认识。

朋友水稻基因和蛋白质的表达

为了验证PI和Le转基因阳性水稻系的有效性，我们对PI和Le转基因阳性水稻系进行了评估朋友PI和Le的基因和蛋白表达量均高于WT，而PI的RNA干扰转基因株系的表达量均低于WT朋友PI基因在水稻中相对于WT的表达。进一步比较这些水稻系的PAL蛋白表达也发现，PAL过表达水稻系的PAL蛋白表达水平高于WT，而PI的PAL RNAi干扰下的PAL蛋白表达水平低于PI的WT(图1)。1)．此外，在朋友在水稻中表达对表型和生育期性状无显著影响。

水稻根际土壤不同极性代谢物的主成分分析

对样本进行主成分分析，以评估组内每个样本的可变性。对于来自PI、PR、PO、Le和LO的根际土壤非极性代谢物，以及来自同一种没有水稻植株的土壤(空白土壤)的代谢物，结果显示，6组样品明显聚类，说明来自不同水稻根际土壤的代谢物有明显差异，而来自同一组的3个重复序列只有轻微差异(附文件)2)．具体来说，来自PI和Le样品的代谢物沉积在第一主成分(t [1])，而PI与Le区分开来，并类似于空白对照CK(附加文件2)．利用主成分II (t [2])。

对从ADS-21值中提取的6个样品进行了PCA分析。结果表明，PO、Le和LO的样品虽然大致相近，但在6组样品之间却有很好的分离，说明来自不同水稻品种的根际土壤样品可以很好地区分，但同一组样品之间也有轻微的差异(附文件)3.)．从PI化感水稻样品中分离出PR和PO转基因系样品和Le非化感水稻样品，从相应的LO中分离出Le, PI与Le的主成分I (t [1])。PO和LO的样品更接近于Le的样品，尤其是PO和Le的样品3.)．

ADS8和ADS21树脂萃取期的代谢物

ADS8和ADS21树脂分别吸附非极性和极性化合物，而根际土壤代谢产物沉积在ADS8树脂和ADS21树脂上，说明ADS8树脂中非极性化合物含量高于ADS21树脂中极性化合物含量。在5个水稻品系中，β等非极性物质的数量和丰度都相对较高。-正丁基醚，9-十八烯酸和十五烷，比极性物质，如2-丁酮，d-甘露醇和丁腈。采用ADS8树脂对PI、Le、PR、PO、LO根际土壤进行乙酸检测。基于ADS21树脂萃取相，在PI、Le、PR、PO和LO根际土壤中检测到d-葡萄糖、丙二酸、戊二酸和极性化合物。结果表明，具有非极性性质的根际土壤代谢产物比具有极性性质的根际土壤代谢产物更丰富。

ADS8树脂提取水稻根际土壤脂肪酸的变化

以往的研究主要集中在不同化感水稻品种中酚酸和萜类两种化感物质的变化和差异。此外，脂肪酸，如长链脂肪酸和挥发性脂肪酸，也被认为在化感作用中发挥潜在作用[1，36，37］．在化感水稻PI和Le根际土壤的ADS8树脂萃取相中，两种样品中检测到8种不同浓度的脂肪酸，PI中乙酸、戊酸和戊酸的相对含量高于Le，而Le根际土壤中环丙羧酸、甲基膦酸、辛酸和富马酸的相对含量较高。沉默朋友PI中己酸、乙酸、庚酸和戊酸的基因表达水平低于WT PI。这也使得己二酸的浓度高于WT PI。当朋友基因在PI中过表达，苯甲酸、丙烯酸、环丙羧酸、壬二酸等5种脂肪酸水平升高，戊酸和硫乙酸水平降低。脂肪酸水平的变化也被检测到朋友过表达线Le。这表明，LO中的丁酸和乙酸水平高于WT Le。此外，还有8种脂肪酸，即9-十八烯酸、庚酸、环己羧酸、3-氨基-2,3-二氢苯甲酸、琥珀酸、2,2-双(4-羟基苯基)-丙酸、辛酸和癸酸，它们在LO中的浓度低于Le(表1)1)．

通过对PI与Le、PI与PR、PO与PI、LO与Le等土壤样品的综合比较，表明乙酸是可能参与化感过程的非极性相化合物之一。

ADS21树脂提取水稻根际土壤脂肪酸的变化

对ADS21树脂萃取相的鉴定表明，一些脂肪酸也沉积在该树脂中。比较根际土壤PI和Le提取树脂中沉积的脂肪酸，发现两种水稻样品中存在7种不同浓度的脂肪酸。在这7种化合物中，七烷二酸、己烷酸和戊二酸在PI中的含量相对高于Le，而8,11,14-二十碳三烯酸、9-十八烷酸、十六烷酸和十二烷酸在PI中的含量相对低于Le。PR稻系根际土壤中，4种脂肪酸在PI和PR中的浓度存在差异，PI中戊二酸和环丙羧酸的浓度高于PR，而PI中十四烷酸和10-十一烯酸的浓度低于PR朋友在PI中过表达时，1,2-苯二羧酸、环己羧酸和己酸在PO中的积累水平高于PI，而环丙羧酸在这两种水稻样品中的浓度表现出相反的趋势。此外，在Le中产生的8种脂肪酸与在其转基因系LO中产生的有差异。LO土壤样品中异丁酸、顺-2-十二烯酸、十六烷酸、癸二酸和环丙烷羧酸的浓度高于Le，而LO土壤样品中9-十八烷酸、2-丁烯酸和十二酸的浓度低于Le(表4)2)．

其中，极性相的己酸和戊二酸在化感潜能高的水稻根际土壤中积累量较高，提示其在水稻化感抑制杂草中的潜在作用。

磷和磷根际土壤代谢物的差异

对PI和Le根际土壤ads8萃取相的充分比较表明，这两个样品中差异表达的化合物主要有21种(图1)。2、表3.)和乙酸、环己醇、戊酸、庚酸、8,11,14-二十碳三烯酸、去精瓜林、2-丁酮、甘氨酸8种化合物，PI的根际土壤中含量高于Le。乙酸的差异最显著(VIP = 1.90713)。相比之下，PI根际土壤中有13种化合物含量低于Le根际土壤，其中包括5-胆甾-3,26-二醇、1,25-二羟基维生素D3、乙醇、雄甾-1,4-二烯-3- 1、17-羟基-17-甲基-、苯胺、缩氨基脲、假菝葜苷、环丙羧酸、甲基膦酸、3-羟基丁酸乙酯、醚和富马酸(图1)。2a和b)。这些化合物参与了不同环境下的微生物代谢(乙酸、甘氨酸、富马酸、苯胺、乙醇、环己醇和环丙羧酸酯)、内分泌(骨化三醇)和其他因子调控的钙重吸收，以及脂肪酸(辛酸)和不饱和脂肪酸的生物合成[(8Z,11Z,14Z)-二十三烯酸参与]。

ads21提取相的鉴定和比较分析也表明，有21种化合物在PI和Le根际土壤中存在差异表达。在21种化合物中，有11种化合物的PI含量高于Le，另有10种化合物的Le含量高于PI。苯酚是差异表达最显著的代谢物(VIP = 2.74924)，其中Le高于PI。这两个水稻系之间差异含量的化合物可能参与代谢途径(四种化合物，即十六烷酸、萘、吡甘酸和(8Z、11Z、14Z)-二十三烯酸，参与代谢途径)，氨基苯甲酸酯降解(涉及苯酚和苯胺)，药物代谢-细胞色素P450(涉及丙烯醛)，赖氨酸降解(涉及戊二酸)和ABC转运体(涉及甘甘醇)(图)。3.a和b，表4)．

21种差异代谢物中每一种代谢途径的分析结果都很复杂，如图所示。3.c和d，说明所有参与异种生物降解和代谢的差异代谢物以及辅助因子和维生素的代谢在PI中的含量都高于Le。相比之下，PI中参与脂质代谢、能量代谢和碳水化合物代谢的差异表达代谢物下调。

PI、PR和PO根际土壤代谢物表达的差异

根据上述方法对PI和PR的根际土壤样品进行分析，结果表明PI和PR的根际土壤样品之间存在26种关键差异代谢物(图1)。4a和b，表5)，其中己酸差异显著。所有这些都可能参与代谢途径:不同环境下的微生物代谢(这一过程涉及六种物质，即醋酸酯、l -天冬氨酸、环己酮、己二酸酯、芴-9-酮和苯甲酰胺)、莨菪烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成(哌啶参与这一途径)、果糖和甘露糖代谢(甘露醇参与这一过程)以及新霉素、卡那霉素和庆大霉素生物合成(帕罗霉素参与)。

分析PI和PR之间26种差异代谢物的相对含量，并建立每种物质可能的代谢途径(图1)。4c和d)。结果表明，PI中己酸、乙酸、庚酸等酸的含量高于PR，这些差异代谢物所涉及的代谢途径主要是不同环境下的微生物代谢。在PI中，参与多种环境微生物代谢和次生代谢物生物合成的物质上调。

在PI和PR样品中ads21萃取相的比较中，PI和PR样品中鉴定出12个关键差异代谢物，其中邻苯二甲酸二辛酯差异最显著(VIP = 5.38322)。在12种差异代谢物中，PI样品中6种上调，6种下调，PR样品中也有相同的趋势(图1)。5a和b，表6)．这些代谢物可能参与赖氨酸降解(戊二酸降解)和氨基苯甲酸酯降解(环丙烷羧酸降解)等过程。

同样，我们分析了PI和PR中各差异代谢物的代谢途径(图1)。5c和d)。PI中戊二酸和环丙羧酸的含量高于PR，除了几个功能未知的差异代谢物外，其余主要参与异种生物降解和代谢。

OPLS-DA分析分别用ADS8和ADS21在PI和PO两个等基因系根际土壤中鉴定出18和17个差异代谢物。ADS8和ADS21中分别以邻苯二甲酸二辛酯和邻苯二甲酸二辛酯的VIP值分别为1.85117和4.48732。两种树脂提取的代谢产物可能参与了不同环境下的微生物代谢。同时，ADS8树脂提取的非极性物质也可能参与类固醇激素的生物合成和抗生素的生物合成，而ADS21提取的极性物质可能参与新霉素、卡那霉素和庆大霉素的生物合成(图5)。6而且7、表7而且8)．

分析PI与PO之间18种差异代谢物的相对含量，以及单物质参与可能的代谢途径(图1)。6c和d)，结果表明，PI中戊酸、帕罗霉素和硫乙酸的含量高于PO。不同环境下参与微生物代谢和异种生物降解代谢的差异代谢物较多，且在PI中表达下调。我们比较了ADS21树脂提取的各种差异代谢物可能参与PI和PO的代谢途径(图1)。7c和d)表明PI中d-葡萄糖含量低于PO。d -葡萄糖主要参与碳水化合物代谢。PI和PO中的其他差异代谢物及其可能的代谢途径也表现出类似的趋势。

对比化感水稻PI及其转基因水稻PR和PO的ADS8提取的代谢物，我们发现PR的独特代谢物是帕罗霉素和苯甲酰胺，而PO的独特代谢物是萘和硫脲。当朋友基因过表达后，12烷、葫芦素b、丁烷等7种物质含量下降，环丙基乙醇、2-异丙基烯- α含量下降。-甲基-、乙酸和十五烷增加。同时，之后朋友基因干扰后，环己酮、帕罗霉素、戊酸、硫乙酸、普南烷-3,20-二酮5种物质含量降低，环氧蛔虫醇和苯乙乙醇含量升高。

从PI、PR和PO样品中提取的ads21相的比较表明，干扰或过表达后，8种极性代谢物的浓度降低朋友基因，例如，甲氧苯，吡咯烷-2,5-二酮和环己烷。而十四烷酸和10-十一烯酸的浓度受干扰而升高朋友基因。然而，当朋友基因过表达，7种代谢物水平升高。

Le和LO根际土壤代谢产物的差异

数字8a和b和Table9结果表明，在差异表达的代谢物中，Le样品中上调表达的代谢物有14种，下调表达的代谢物有10种，其中9-十八烯酸(VIP = 2.48717)和o-乙酰- l-丝氨酸(VIP = 2.03914)差异表达更为显著。分析Le和LO中24种差异代谢物的含量及单个差异代谢物可能参与的代谢途径(图5)。8c和d)表明，Le中9-十八烷酸、庚烷酸和琥珀酸等酸、乙烯酮和辛烷含量高于LO。参与植物次生代谢物生物合成、异种生物降解和代谢以及脂质代谢的差异代谢物在Le中表达上调。

数字9a和b和Table10在代谢组学分析的基础上，在Le和LO样品中鉴定出26种差异代谢物，其中苯酚和9-十八酸化合物差异最显著。这两种代谢物在Le样品中表达上调，而在LO样品中表达下调。基于对Le和LO数据的分析(图。9c和d)，发现Le中参与脂质代谢、能量代谢、其他次生代谢物生物合成、植物激素生物合成和氨基酸代谢的差异代谢物含量高于LO，而参与次生代谢物生物合成和细胞群落原核生物的差异异物含量低于LO。

比较两种树脂提取的代谢物可能的途径，ADS8提取的物质比ADS21更可能参与植物次生代谢物的生物合成、次生代谢物的生物合成、能量代谢和脂质代谢这四种途径，而对不同环境下微生物代谢和异种生物降解代谢这两种途径的参与则减少。

以往的研究表明，植物通过根系分泌物的介导，聚集特定的微生物群落，形成独特的根际微生物群落结构[28，29，30.］．独特的微生态环境由植物、根系分泌物、根系微生物组成，产生化感作用[36，37，38，39，40，41，42］．以往的研究表明，在不同分泌物的介导下，化感水稻和非化感水稻根际土壤中细菌、真菌和放线菌的群落和种群存在显著差异[22，32］．因此，酚酸和萜烯可以特异性聚集某些微生物[43，44］．现有的研究大多集中在水稻中酚酸和萜烯的差异和功能，以及它们与微生物的关系。有关其他潜在化感物质的研究有限，如芳香酸、苯、衍生物、长链烃、脂肪酸等。[45］．

在这些化合物中，有些长链脂肪酸是已知的植物毒素[1］．例如，根据生物测定，壬酸和癸酸对藻类具有植物毒性作用[46]，天竺葵酸(壬酸)因其特殊的植物毒性而被认为是一种天然除草剂[47］．

在本研究中，几种脂肪酸的浓度在有化感作用潜力的水稻品种之间有所不同。五叶期从PI和Le根际土壤中提取的树脂吸附相表明，不同化感潜力水稻材料提取的代谢物存在显著差异。对化感水稻PI和非化感水稻Le的代谢物进行了分析，结果表明ADS-8树脂从水稻根际土壤中提取了21种不同的代谢物，其中乙酸是差异表达最显著的代谢物。化感性水稻PI根际土壤乙酸含量高于非化感性水稻Le。乙酸是一种弱羧酸;在小麦中，麦秸厌氧分解释放乙酸，该化合物具有植物毒性[48］．

高化感水稻中乙酸的相对含量高于低化感水稻，这可能与水稻化感作用有关，该化合物可通过厌氧反应产生，起到抑制杂草生长的作用。它也被认为是生物合成酚酸、萜烯和其他代谢物过程中的前体[49］．

此外，长链脂肪酸也被记录为化感物质，玉米秸秆分解产物表现出对土壤微生物的化感作用促进或抑制作用，从这些分解化合物中鉴定出几种脂肪酸，包括己酸(1.73%)、8-十八烯酸(1.06%)和3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-丙烯酸(1.04%)[50］．PI和Le根际土壤中脂肪酸含量的差异导致了其对杂草化感抑制活性的差异。由于PI和Le具有不同的遗传背景，当它变成同一个水稻系时朋友过表达或沉默后，这些转化的水稻系的脂肪酸也与WT不同，这表明基因表达的变化朋友在水稻中导致根际脂肪酸含量的变化，这表明了一种假定的联系朋友表达和脂肪酸。花生根系分泌物中的十六烷酸会对土壤环境产生影响。落花生hypogaeaL.)与其土壤病害密切相关，高浓度(160 mg/kg土壤和240 mg/kg土壤)的十六烷酸会抑制土壤酶活性，进而降低花生根系活性和叶片叶绿素含量[51］．ADS21树脂提取的PI和LO根际土壤中十六烷酸含量高于Le。Fischer等人也认为长链脂肪酸可能与植物脂类(甾醇等)相互作用形成胶束作为化感物质[52］．因此，推测长链脂肪酸可能直接影响土壤微生物，或与其他代谢物相互作用形成具有化感活性的混合物。

至于其他代谢物，除了脂肪酸，许多也参与微生物或植物的代谢。例如，苯酚是各种微生物的代谢底物，如假单胞菌[53，不动杆菌[54]和红球菌[55］．野生西瓜和Cucurbita最大值可产生葫芦素b，可抑制肿瘤细胞和美罗南属物种的种群密度[56，57］．Glomerella炭疽病可以转化ledol [58］．这些物质的差异可能导致水稻的化感作用潜力不同。但这些物质与水稻化感作用的关系有待进一步研究。

然而，长链脂肪酸和乙酸对根际微生物群落多样性的确切作用及其与杂草抑制的关系还有待深入研究。

我们的研究表明，化感水稻根际土壤中非极性代谢物的积累多于极性代谢物，而脂肪酸被视为重要化合物，这与众所周知的化感化学物质包括酚酸和萜类不同。脂肪酸可能是根际微生物活动不可或缺的物质，有助于构建微环境，维持化感作用活性。

植物生长条件

该实验于2016年在中国福州的福建农林大学进行，实验期间温度在25°C到30°C之间变化，湿度在65%到78%之间变化。场地为室外网络室实验场地。

全球闻名的PI312777是一种较强的化感性水稻(PI，从美国引进)，它的转基因系带有PAL2-1过表达(PO)和与PAL2-1非化感性水稻Lemont (Le，引自美国)及其转基因系的干扰表达(PR)PAL2-1本研究采用过表达(LO)。供试材料均为福建农林大学农业生态研究所提供的多代遗传稳定材料。

按照Li等人所描述的方法移植干育苗。[59］．田间土壤为砂壤土，土壤质量为1.72 g·kg⁻¹总氮，60.67 mg·kg⁻¹碱水解氮，0.67 g·kg⁻¹总磷30.45 mg·kg⁻¹速效磷，1.53 g·kg⁻¹全钾，206.48 mg·kg⁻¹速效钾，21.3 g·kg⁻¹有机质含量较高，pH值为6.13。在水稻苗期随机选取植株进行生长观察，并在五叶期进行土壤采样。

2016年3月25日，采用适当的基肥(基施和追施总氮的70%)移栽N= 225公斤/公顷²n: p: k = 1:0.5:0.8)。每个品种分别种植在3 m × 1 m的不同地块上，播种速率为150 g/m²．此外，在同一区域不种植水稻，CK作为空白对照土。在水稻幼苗出苗后，采用推荐的田间管理方法。

土壤样本收集

在水稻幼苗五叶期进行田间随机取样。样本采集方法之后是略有改进的方法[60］．简单地说，通过摇动根系来清除粘在根系上的土块，收集根际土壤，用镊子去除附着在根系上的剩余土壤，放入50 mL离心管中。然后加入50 mL PBS溶液(pH = 7.0)，超声振荡10min。随后，植物材料在离心后从产生的溶液中除去。最后，从0 ~ 5 cm深度的未开垦土壤中采集对照样品。

不同水稻品种根际土壤代谢物的提取与鉴定

每个处理根际土壤取样6个。每个样品10克加入30ml无菌水，20°C, 200转振荡3小时，然后在12,000×g离心3次，10分钟。最后，将上清液汇集，混合均匀，均匀分成两份。

树脂ADS-8(弱极性树脂)和ADS-21(极性树脂)(购自天津南开和诚有限公司)分别按100g称量。预处理后，将其加入上述水提液中，在20°C的条件下，以200 rpm振荡24 h。随后，除去树脂，加入100 mL甲醇进行洗脱，然后在20°C下，以200 rpm振荡2 h，三次重复，然后甲醇相结合，真空浓缩干燥。然后，加入1ml甲醇溶解树脂，通过0.22 mm混合纤维素膜过滤，然后分析代谢物。

采用岛津gcmms - tq8040气相色谱/三级四段棒质谱仪对上述加工样品进行分析，初始温度设为60℃，反应2 min，然后升温至120℃，反应8℃/min，反应2 min，再升温至210℃，反应10℃/min，反应3 min。最后，温度上升到250°C，以15°C /min，持续5分钟。注射口温度250°C。载气:He，流量:1 mL·min^－1；注入量:1 μL。质谱:离子源的电子轰击。样品在40-650 amu扫描。

本研究期间产生的所有数据都包含在这篇已发表的文章及其补充信息文件中，在当前研究期间使用或分析的原始数据可在通信作者的合理要求下获得。

朋友：

苯丙氨酸解氨酶基因

PAL2-1：

苯丙氨酸解氨酶(朋友)基因2-1

WT:

野生型

PI:

PI312777，化感性较强的水稻

公关:

带主要化感基因的转基因系PAL2-1-抑制PI

博:

转基因系PAL2-1过表达

勒:

非化感性莱蒙水稻

瞧:

转基因系PAL2-1Le过表达

CK:

空白对照土

KEGG:

京都基因和基因组百科全书

PBS的解决方案:

磷酸盐缓冲盐水

主成分分析:

主成分分析

OPLS-DA:

正交偏最小二乘判别分析

贵宾:

OPLS-DA模型的变重要度投影

感谢福建农林大学方昌勋博士对本文修改的方法学指导和建议。感谢李周博士对本文中人物绘制的指导和帮助。

基金资助:国家重点研发计划项目(2016YFD0300508)、国家自然科学基金项目(81573530,31271670)、闽台作物种质资源与栽培联合创新中心(FJ 2011计划，no.;2015-75)，福建农林大学科技创新基金(KF2015043, CXZX2018042, CXZX2017309)。资助方在研究设计、数据收集和分析、数据解释或撰写手稿方面没有任何作用。

从属关系

1. 福建农林大学生命科学学院，福建省农业生态加工与安全监测重点实验室，福建福州350002

   李英哲，徐林林，勒图马普能，林文雄

2. 福建农林大学农学院，作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室，福州，350002

   李英哲，徐林林，勒图马普能，林文雄

3. 莱索托国立大学作物科学系，马塞卢，莱索托100

   Puleng Letuma

4. 福建大学作物生态与分子生理学重点实验室(福建农林大学)，福州，350002

   招待会林

贡献

WXL和YZL构思了该研究;YZL和WXL撰写了手稿。YZL进行了实验;YZL和LNX进行统计分析;PL已经修改了稿件。所有的作者都讨论了结果并对手稿进行了评论，并批准了它的提交。

相应的作者

对应到招待会林．

伦理批准和同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。

开放获取本文遵循创作共用署名4.0国际许可协议(Creative Commons Attribution 4.0 International License)，该协议允许在任何媒体或格式中使用、分享、改编、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的署名，提供创作共用许可协议的链接，并说明是否有更改。本文中的图片或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料不包含在文章的创作共用许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超出了允许的用途，您将需要直接从版权所有者那里获得许可。欲查看此许可证的副本，请访问http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．创作共用公共领域奉献放弃书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。

转载及权限