NaCl通过增加真盐植物胚珠中淀粉的积累来促进繁殖gydF4y2Ba碱蓬莎莎gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

盐生植物在高盐度条件下表现出最佳的繁殖能力。然而，NaCl在真盐植物繁殖中的作用及其可能的机制gydF4y2Ba碱蓬莎莎gydF4y2Ba还有待阐明。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们进行了转录分析gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba测定了0和200 mM NaCl处理下植株胚珠中淀粉积累量、花中糖含量和叶片光合参数。nacl处理的植株胚珠淀粉积累量、花和胚珠糖含量、叶片净光合速率和光化学效率均显著高于对照。在nacl处理植株的花中鉴定出14,348个差异表达基因。据预测，这些基因中有许多与光合作用、碳利用、糖和淀粉代谢有关。这些基因对维持nacl处理植物的光系统结构、调节电子传递和提高光合效率至关重要。此外，果糖激酶和蔗糖磷酸合酶的编码基因在nacl处理植物的花中表达上调。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

胚珠和花中淀粉和糖的含量较高gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba可能是由于参与光合作用和碳水化合物代谢的基因上调，从而提高了光合效率和光合产物的积累。gydF4y2Ba

盐碱地严重降低了世界范围内的作物产量，特别是在灌溉农业用地[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．盐生植物在盐浓度≥200 mM的盐环境中生存和繁殖[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]由于植物生理和生物化学的变化[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]．渗透调节是植物在生理盐水环境中发生的第一个过程。植物通过积累无机离子达到渗透平衡[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和有机溶质(脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱和可溶性糖)[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]．有机生物合成所需的碳和能量都来自可溶性糖，它们在植物的非生物胁迫抗性中起着至关重要的作用[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．因此，碳水化合物代谢可以作为评价盐耐受性的生理指标。在营养生长过程中，真盐植物的存活主要是由于Na的排除gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba和/或它们被隔离到液泡中，并维持离子稳态，以避免幼叶中的离子毒性[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

环境胁迫对植物生产力有负面影响。例如，生殖阶段的冷胁迫可能会扰乱生殖器官的结构和功能，从而导致种子或结果减少或失败[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]．高温会破坏雄性和雌性的组织，并改变生殖发育过程中高度敏感的生理过程，从而显著降低作物产量[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]．生殖期的干旱胁迫可能通过抑制花粉中淀粉的积累以及干扰糖和淀粉的代谢而导致水稻花粉不育[j]。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]．由于光系统II (PSII)功能的抑制，在末端干旱胁迫下，结实率较低[j]。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]和净光合速率的降低[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

虽然作物的生殖发育比营养发育对盐度更敏感[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]，盐度胁迫对植物繁殖影响的分子机制仍有待阐明。盐渍化导致的植物产量下降是由于盐积累、缺钾、水流受限、激素失衡以及光合效率低下导致的碳供应减少等因素造成的[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]．当生长培养基中存在高浓度NaCl时，盐生植物在营养和繁殖阶段表现出最大的生长[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]，甚至达到杀死玉米、小麦和水稻等非盐生植物的水平。NaCl的存在促进了盐生植物的开花，但减少了种子数量gydF4y2BaPlantago植gydF4y2Ba［gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]．然而，盐生植物如何在繁殖阶段对盐环境做出反应，特别是在光合作用和碳水化合物代谢的分子方面，仍有待阐明。gydF4y2Ba

光合作用是植物生长发育的基本过程，受干旱、高温和盐度等非生物胁迫的影响[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]．例如，缺水会降低植物的光合效率gydF4y2Ba麻风树gydF4y2Ba叶子，伴随着含糖量的降低[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]．一般来说，盐度降低光合效率，抑制非盐生植物的生长，包括主要作物。例如，盐度通过降低叶绿素含量和干扰光合过程来降低水稻的生长[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]．然而，耐盐水稻的总可溶性糖含量和净光合作用在盐胁迫下明显高于盐敏感水稻，这是因为碳水化合物提供了能量资源，帮助耐盐水稻适应盐胁迫(13.25 deci siemens (dS) m)gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}) [gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]．相比之下，我们之前证明了净光合速率在真盐植物中显著增加gydF4y2Ba碱蓬莎莎gydF4y2Ba对200 NaCl处理的响应[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

碱蓬莎莎gydF4y2BaL.是中国北方发现的一种可食用的真盐植物，在天然盐碱地环境中生长良好。最适宜的营养生长和生殖生长条件gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba为200 mM NaCl在生长培养基中[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba是揭示真盐植物耐盐机制的一个有希望的模型系统[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]．在营养生长阶段，gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba通过有效地维持离子平衡来适应盐水环境[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]和通过活性氧清除[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]．在生长培养基中添加200 mM NaCl可显著提高花数、种子数和种子产量gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba［gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]．然而，碳水化合物代谢与生殖发育之间的关系gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba在高nacl条件下，特别是在光合作用相关基因的表达方面是未知的。gydF4y2Ba

在这里，我们研究了高盐度如何促进生殖发育gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba200 mM NaCl处理的植株。我们分析了gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba通过高通量Illumina RNA测序(RNA-seq)和测量叶片的光合参数以及碳水化合物指标，对对照和nacl处理植株的花进行了分析。并探讨参与光合作用的基因是否在盐生植物的增强中起重要作用gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba高盐度条件下的生殖过程，特别是叶片的光合作用和花中光同化物的转运、积累和利用。gydF4y2Ba

nacl处理后种子大小增大gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba

我们比较了对照和nacl处理的果实发育情况gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba繁殖期的植物在同一枝上，黑色种子比棕色种子成熟得早。nacl处理植株的黑色和棕色种子均显著大于(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，高于对照植物(另附文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。此外，单株种子数、单株种子重、单株平均种子质量等其他参数也得到了显著提高[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

NaCl能促进淀粉的积累gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba胚珠gydF4y2Ba

我们测定了对照和200 mM nacl处理的胚囊中淀粉积累量gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba植物(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.施肥前(播后108 d)，淀粉含量显著高于(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)， nacl处理植株胚珠内的差异大于对照植株(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa, b).受精后(110 DAS)，积累的淀粉用于胚胎和胚乳发育[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]．因此，施肥后对照或200 mM NaCl处理均未检测到淀粉积累(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac, d)。然而，与对照相比，nacl处理的植株胚珠珠孔积累了更多的淀粉。高水平的淀粉应该为胚胎发育提供了足够的原料，这也许可以解释为什么200 mM NaCl处理的植株的种子比对照植株的大。gydF4y2Ba

在生殖生长早期，NaCl处理增加了叶片、茎和花的总可溶性糖水平gydF4y2Ba

测定了nacl处理和对照的总可溶性糖(TSS)含量gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba植物在生殖生长期开始时(105 DAS)。TSS含量显著高于(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，分别是对照的1.79倍、1.25倍和1.56倍。在200 mM NaCl处理下，植物花器官中TSS含量显著升高，分别是叶片和茎中TSS含量的2.05倍和2.16倍(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

NaCl增加了植株的净光合速率gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba叶子gydF4y2Ba

植物中的淀粉和可溶性糖直接来自光合作用。在生殖生长期初期(103 DAS)，净光合速率(57.4%)显著高于(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba与对照相比，NaCl处理的植株(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).然而，我们发现对照和200 mM nacl处理的植株在蒸腾速率和气孔导度方面没有显著差异(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab, c).相比之下，胞间COgydF4y2Ba_2gydF4y2Banacl处理植株的浓度比对照植株低13.8%(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba

NaCl处理增加了叶绿素含量gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba叶子gydF4y2Ba

光合作用的效率与叶片中叶绿素含量有关。因此，我们测量了对照和nacl处理叶片的叶绿素含量gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba植物在103 DAS。叶绿素含量显著高于(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，其中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量分别比对照增加了26.6%、46.4和31.5%(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.在花中检测到类似的模式叶绿素含量gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2BaNaCl处理植株(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2)。在花发育早期，花瓣是绿色的，含有叶绿体(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S3)，表明gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba花在发育早期可以进行光合作用。gydF4y2Ba

NaCl处理提高了油菜的光合析氧能力gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba花瓣gydF4y2Ba

基于花瓣中叶绿体和叶绿素的存在gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba测定了花前期花瓣光合氧的演化过程。结果表明，紫花苜蓿花瓣的释氧能力较强gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2BaNaCl处理显著高于(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，比对照植物(另附文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S4)，尽管光合能力远低于叶片(图4)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

NaCl处理提高了PSII的光化学效率gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba叶子gydF4y2Ba

两者的潜在光化学效率(gydF4y2BaFgydF4y2Ba_vgydF4y2Ba/gydF4y2BaFgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba)和实际光化学效率(Φ)gydF4y2Ba_{PSIIgydF4y2Ba})的比例显著增加(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.然而，两组在gydF4y2BaFgydF4y2Ba_vgydF4y2Ba/gydF4y2BaFgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba两个处理组之间PSII的最大量子产率指标(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa).相比之下，ΦgydF4y2Ba_{PSIIgydF4y2Ba}，表明在自然光条件下的实际光化学效率显著(9.7%)提高(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，在生殖生长初期，NaCl处理的植株比对照植株(图2)的差异显著。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

序列输出和装配gydF4y2Ba

目的:探讨促进植物花和种子发育的分子机制gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba在NaCl胁迫下生长的植物中，我们收集了对照和NaCl处理(NaCl)植株的花，并对其进行rna测序。在排除低质量序列后，我们使用干净的reads使用Trinity生成一个从头开始的转录组组装[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]，分析了Corset聚类后对照花与NaCl处理花基因表达的差异[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]．本分析中使用的转录本和基因由Guo等人描述。[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

对照与nacl处理花中DEGs的功能注释gydF4y2Ba

我们使用RSEM软件包分析了对照和nacl处理植株花中的差异表达基因(DEGs) [gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]．如前所述，我们基于7个数据库，通过BLAST分析对两组之间的deg进行功能性标注。为了探索deg的生物学功能，我们将deg映射到KEGG通路。总共有3640个deg被映射到124个KEGG通路，如“光合作用”、“淀粉和蔗糖代谢”、“脂肪酸生物合成和延伸”以及“氨基糖和核苷酸糖代谢”[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

与天线蛋白和光合作用有关的deggydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba花gydF4y2Ba

光收集是光合作用的第一步。包含光合色素叶绿素和类胡萝卜素的光收集复合物(lhc)是这一过程中最重要的结构，位于PSI(光系统I)和PSII附近[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]．LHC蛋白是由细胞核中的一个多基因家族编码的[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]．植物含有14种LHC蛋白(Lhca1-Lhca6和Lhcb1-Lhcb8)。lhca型蛋白位于PSI反应中心附近，而lhcb型蛋白位于PSII反应中心附近[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]．在本研究中，确定了6个deggydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba与天线蛋白相对应的花，其中四个被上调，两个被下调。与对照相比，编码Lhcb1的4个deg在NaCl处理的植株花中表达上调，其中3个在NaCl处理下高表达(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.然而，在nacl处理组的花中，编码Lhcb4和Lhcb5的DEGs被下调(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

除了光收集，电子转移也是完成光合作用的先决条件，特别是在不利的环境条件下。盐胁迫显著抑制植物光合效率[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]．植物光合电子传递链由四种蛋白质复合物组成:PSII、细胞色素(Cytb6f)复合物、PSI和ATP合成酶。我们在对照和nacl处理植物的花中发现了与光合作用相关的28个deg，这可能导致了高盐度条件下光合作用功能的变化(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图5)。gydF4y2Ba

PSII由多种类型的叶绿素结合成分组成。在水氧化后的光合作用中，这种复合物负责光收集和电子传递[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]．PSI，一种叶绿素-蛋白质复合物，催化电子从质体青素/细胞色素c6转移到铁氧还蛋白/黄氧还蛋白，这一过程由光驱动[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]．PSI亚基PsaF和PsaN与铁氧还蛋白或质体青素相互作用[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]．在nacl处理过的花中gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba在植物中，编码PsaF的DEGs被下调。相比之下，在与PsaN相关的两个deg中，一个上调，一个下调(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.此外，鉴定出与ATP合酶γ链相关的5个deg，包括1个上调和4个下调(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

与碳利用、蔗糖和淀粉代谢有关的deggydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba花gydF4y2Ba

除了与光收集和电子转移相关的基因外，我们还检测了两组植物花中与碳利用相关的基因的表达gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba植物。我们发现，与对照相比，nacl处理植株花中有35个deg上调，12个deg下调(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图5)。与对照相比，其中16个基因在nacl处理植株的花中特异表达水平较高。详细信息在附加文件中提供gydF4y2Ba6gydF4y2Ba表S1。gydF4y2Ba

羧基化是CO的第一步gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba同化的过程。核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco, EC 4.1.1.39)是这一过程中的关键酶，连接生物圈中的有机物和无机物[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]．编码Rubisco的两个deg (Cluster-10,319.94590和Cluster-10,319.106159)在nacl处理植物的花中表达上调(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.增加的COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba固定效率gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2BaNaCl处理可能是由于Rubisco编码基因的表达增强。同样,在gydF4y2Ba杜氏gydF4y2Ba，在最适NaCl浓度(1.7 M)下，光合作用相关基因表达上调，这与最适生长有关[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]．在核酮糖1,5-二磷酸(RuBP)再生过程中，两个编码异构酶的DEGs (Cluster-10,319.31330和Cluster-10,319.58613)在nacl处理植株花中表达上调。七度(Cluster-10,319.110671, Cluster-10,319.110672, Cluster-10,319.92536, Cluster-10,319)。110,670、Cluster-10,319.110668、Cluster-10,319.92542和Cluster-10,319.9993)在nacl处理植株的花中表达上调(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.这些结果表明，花中较高的糖含量和胚珠中较高的淀粉含量伴随着相关基因的上调表达和较高的光合效率(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

淀粉是植物发育的重要碳源，特别是在生殖生长的花器官中。探讨不同淀粉和糖含量的原因gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba在两个处理组的胚珠和花中，我们检测了参与糖和淀粉代谢的DEGs的表达。我们确定了133个与糖代谢和糖运输有关的基因gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba花(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Baa).这些DEGs可能参与糖结合、糖转运和糖磷酸化，包括77个上调的DEGs和56个下调的DEGs。我们还鉴定出了94个参与淀粉代谢的deggydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba花(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Bab;详细信息在附加文件中提供gydF4y2Ba8gydF4y2Ba表2)。这些基因可能参与淀粉结合、淀粉代谢过程和淀粉磷酸化，包括55个上调的deg和39个下调的deg。最后，参与糖代谢和淀粉代谢的30和27个deg的表达量显著提高(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05);这种上调可能增加了这些植物中的糖和淀粉含量。gydF4y2Ba

蔗糖合成酶(SS, EC: 2.4.1.13)、蔗糖磷酸合成酶(SPS, EC: 2.4.1.14)、果糖激酶(EC: 2.7.1.4)和磷酸葡萄糖葡萄糖化酶(PGM1, EC: 5.4.2.2)是蔗糖和淀粉代谢的关键酶。SS在葡萄糖和果糖转化为蔗糖的过程中起着至关重要的作用，SPS和PGM1也是如此。根据我们的RNA-seq数据，参与这一途径的基因在gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba与对照植株相比，nacl处理植株的花，如编码SPS(两个上调的deg)、SS(八个上调的deg和两个下调的deg)和PGM1(两个上调的deg)的基因。这些发现与nacl处理植株花中含糖量高的现象一致(附加文件)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S6)。gydF4y2Ba

使用qRT-PCR验证RNA-seq数据gydF4y2Ba

为了证实RNA-seq检测到的基因表达变化，我们对随机选择的10个deg进行了定量qRT-PCR。qRT-PCR结果与RNA-seq数据非常吻合，相关系数为gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.90(图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)，从而验证RNA-seq结果的可靠性。gydF4y2Ba

生长培养基中低浓度的盐会严重抑制非盐生植物的繁殖，以及营养生长[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]．这种抑制作用主要是由于钠的积累gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba在生殖器官中[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]．盐度强烈抑制生殖器官的形成gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba65gydF4y2Ba的生育能力会降低gydF4y2Ba高粱二色的gydF4y2Ba［gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]，并减少葡萄花粉管的生长[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]，从而减少种子数量[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]．200 mM NaCl处理12 h后，拟南芥的繁殖能力急剧下降，种子形成率极低(胚珠的5%)[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba]．然而，对于真盐植物gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba，在生长培养基中添加200 mM NaCl促进了繁殖，表现为种子产量和种子大小的显著增加[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]，与非盐生植物在NaCl处理下的效果完全相反[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

总可溶性糖帮助植物调节渗透势，在高盐度条件下增加水分吸收[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]，为植物生长提供原料。在gydF4y2Ba藜藜麦gydF4y2BaNaCl处理降低了胚轴的糖含量[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]．相比之下，在本研究中，不仅叶片和茎中总可溶性糖含量增加，而且花中总可溶性糖含量也增加gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba用200 mM NaCl处理(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.非生物胁迫，如高NaCl，抑制淀粉积累，造成作物产量的巨大损失[j]。gydF4y2Ba72gydF4y2Ba]如大米[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]．然而，在盐生植物中gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba，胚囊内淀粉含量显著增加(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，与对照植株相比，在200 mM NaCl处理下，植株的光合活性显著提高(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa、b);积累的淀粉为发育中的胚胎和胚乳提供营养[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba，gydF4y2Ba75gydF4y2Ba]．高淀粉水平为nacl处理的胚珠和种子发育提供了良好的物质来源gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba植物，这可能归因于高可溶性糖含量的花和叶(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.反过来，可溶性糖的积累受益于叶片光合作用的高效率(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa)和花(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图4)中gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2BaNaCl处理植株。gydF4y2Ba

开花期间，生殖结构成为植物的主要汇器官，需要的光合产物比其他器官多。由于叶绿素含量、叶绿体和光合速率的关系，光合化物主要由叶片提供gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba尽管200 mM NaCl处理显著提高了花和叶的叶绿素含量和光合效率，但花的叶绿素含量都远低于叶的叶绿素含量(图2)gydF4y2BaS2gydF4y2Ba，gydF4y2BaS3gydF4y2Ba，gydF4y2BaS4gydF4y2Ba,无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba76gydF4y2Ba]．但在非盐生植物如绿豆和大白菜中，NaCl处理抑制了植物生长，降低了叶绿素水平和光合效率[j]。gydF4y2Ba77gydF4y2Ba，gydF4y2Ba78gydF4y2Ba]．在本研究中，NaCl处理显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)促进了叶片的光合析氧能力和叶片的光合效率gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba植物(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S4和图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa)与对照植物相比，nacl处理导致光合产物积累更多。这些结果也许可以解释为什么200 mM nacl处理的种子gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba明显大于(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)显著高于对照组(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。gydF4y2Ba

探讨NaCl促进种子发育的分子机制gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba，我们对0和200 mM nacl处理植物的花进行了rna测序。在对照和nacl处理植株之间鉴定出许多deg，包括许多参与光合作用和碳水化合物代谢的deg(附加文件)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba表2)。光收集是光合作用的第一步，而lhc是这些过程中最重要的结构[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]．在本研究中，6个光收获相关基因中有4个在nacl处理的花中上调(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba);这些基因表达的增加提高了植物的捕光能力。电子转移是完成光合作用的另一个先决条件，特别是在不利的环境条件下。盐胁迫显著抑制水稻等作物的光合效率[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]．我们在nacl处理植株和对照植株之间鉴定出28个光合作用相关的deg(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S5)，导致两组的花瓣释放氧效率存在差异gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S4)。gydF4y2Ba

PSI和PSII是植物光合机构的主要成分[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]，包括PSII的近端天线(cp43) [gydF4y2Ba79gydF4y2Ba]及PSI亚单位PsaF及PsaN [gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]．在本研究中，与光合作用相关的DEGs，如编码PsbP和PsbR的基因，在nacl处理下下调gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba花(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.在这些植物中，编码PsaF的DEG被下调，而编码PsaN的一个DEG被上调，另一个被下调(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.与ATP合成酶γ链相关的1个DEG基因上调，其他4个基因下调(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.与此同时,gydF4y2BaPgydF4y2Ba_ngydF4y2Ba与对照叶片相比，nacl处理的叶片(图2)含量更高。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).在NaCl处理下，植株光合参数的增加可能与基因的上调有关。的确，增长的增加gydF4y2Ba杜氏gydF4y2Ba与最适NaCl浓度(1.7 M)下光合相关基因的表达上调有关[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

碳利用是人体新陈代谢的一个重要过程。淀粉是植物生长发育的重要碳源，尤其是在生殖生长过程中的花器官中[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba]．nacl处理植株的高碳利用效率和高淀粉积累水平可能得益于光合作用和碳水化合物代谢的高效率;这些因素都离不开光合作用相关基因的高表达[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]．在碳利用途径的47个基因中，与对照相比，nacl处理植株花中35个基因上调，12个基因下调(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图5)。碳利用效率的提高可能与这些植物花中大量高表达基因有关。在非盐生植物中，淀粉降解为可溶性糖，帮助植物在干旱或盐胁迫等不友好的环境中生存。gydF4y2Ba81gydF4y2Ba]．相比之下，在真盐植物中，植物的渗透势通过大量无机盐离子的积累来适应高盐度环境[gydF4y2Ba82gydF4y2Ba]．因此，在NaCl存在下生长的真盐植物中，淀粉的降解可能会减少。随着碳利用率的提高，淀粉水平也随之提高gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba与控制植物。同样，在甜高粱中，NaCl处理下叶片高糖含量与特定的基因表达模式有关[gydF4y2Ba83gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

淀粉是从光合作用中获得的一种主要物质，它是由叶子中的蔗糖合成的[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba]．淀粉和糖含量显著高于gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba胚珠和花比对照植物(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.与此同时，参与糖和淀粉代谢的基因也有差异表达。我们发现了77个上调和56个下调的基因，这些基因可能参与了nacl处理植物花中的糖结合、糖运输和糖磷酸化。gydF4y2Ba8gydF4y2Baa)。我们还在nacl处理组中发现了55个上调基因和39个下调基因，这些基因可能参与淀粉代谢过程(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Bab).例如，编码蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶、果糖激酶和磷酸葡萄糖糖糖化酶的基因在nacl处理过的植物花中大量表达(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图5)。这些上调的基因可能有利于淀粉的积累gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba并有助于减少淀粉的分解，从而提高淀粉的含量。综上所述，淀粉相关基因在花中表达水平的改变gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2BaNaCl处理可能增加了淀粉积累，减少了淀粉分解，导致花和胚珠中糖和淀粉含量增加，从而导致种子大小增大。gydF4y2Ba

叶子是绿色植物的主要光合器官。除了维持日常代谢所需的基本水平外，大多数光同化物质从叶片出口到其他生长器官。种子灌浆能力受碳水化合物从光合器官(源，如叶片)向储存器官(汇，如种子)转运的影响。在植物中，多糖是主要的储存碳水化合物，主要以淀粉和蔗糖的形式存在[gydF4y2Ba85gydF4y2Ba]．蔗糖是植物中碳水化合物的首选运输形式，因为它可以远距离运输。在长距离运输过程中，蔗糖主动从叶肉细胞转运到伴生细胞。然后，蔗糖被转移到储存器官，如根和发育中的种子。韧皮部的光同化物输出到吸收器官的接收细胞。在发育中的种子中，碳水化合物最常见的储存形式是淀粉;蔗糖通常在发育中的器官中转化为淀粉。gydF4y2Ba

除了叶片，具有绿色组织的花器官(如早期花发育中的绿色花瓣)也可以进行光合作用(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(图S4)并产生光同化物(尽管远低于叶片)，并且光同化物可以转运到发育中的花和种子的附近区域。这与其花器官中的叶绿素含量是一致的gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2)。参与蔗糖合成和分配的基因的差异表达与花中的高糖含量是一致的(附加文件)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S6)和nacl处理植株胚珠中淀粉含量高(图S6)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

美国莎莎gydF4y2BaNaCl处理下植株的种子明显大于对照植株，且种子数量明显增多。为了研究这种差异背后的机制，我们首次测量了这种真盐植物的花和胚珠中的糖和淀粉含量，揭示了这两种产品在植物中含量的增加gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2BaNaCl处理植株。真盐植物生殖生长的改善，特别是种子的生长和发育gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba在盐度处理下需要更多的光合产物形式的原料。为种子发育提供了两种光合产物来源gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba．光合作用的主要供给者是叶片中的光合作用;这些光合产物经过很长的距离被运送到种子那里。此外，少量的光合作用发生在花瓣中gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba花;这些光合产物在很短的距离内被运送到种子中。叶片的净光合速率显著高于gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2BaNaCl处理植株的叶绿素含量高于未处理对照植株，且叶片和花朵的叶绿素含量均有所增加。更高的光合作用效率和更高水平的光合作用gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2BaNaCl处理的植株与光收获、电子传输和光合作用相关基因的表达水平以及糖和淀粉代谢途径中酶的编码基因有关。我们提出了一个可能导致种子大小增加的机制模型gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2BaNaCl处理植株(图2)gydF4y2Ba10gydF4y2Ba）.本研究中产生的RNA-seq数据集为进一步研究花中糖和淀粉含量的增加提供了重要的资源gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba植物在NaCl的存在下对潜在的分子机制的进一步研究将揭示出高碳水化合物含量的确切原因gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba盐处理下的花。gydF4y2Ba

样品gydF4y2Ba

碱蓬莎莎gydF4y2BaL.种子经东营市政府许可从东营市农业科学研究院获得，使用前按Guo等人的方法在冰箱(< 4°C)中保存。[gydF4y2Ba86gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba是一种广泛分布于中国北方天然盐碱地的野生植物资源。该植物的种子采集和实验研究均符合中国国家指南。gydF4y2Ba

在砂盆中播种，进行无盐对照处理(Hoagland营养液不加NaCl)和200 mM NaCl处理(Hoagland营养液中溶解200 mM NaCl)。每种处理12盆植株，每盆保持两株植株。NaCl处理从播种阶段开始进行，直到成熟制种，使用郭等人描述的生长条件。gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]．盐是逐步添加的，以免对植物的生长产生任何渗透胁迫[gydF4y2Ba87gydF4y2Ba]．在生长期间，通过每天两次使用三倍于盆栽持水量的溶液来保持沙子中相对恒定的NaCl浓度。本文中描述的所有实验均在山东师范大学进行，并获得中国东营农业科学研究院的许可。gydF4y2Ba

种子发育分析gydF4y2Ba

在自然栖息地，gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba在同一株植物中产生两种种子，黑色种子和棕色种子;前者比后者发展成熟得早。在繁殖期间，两个处理组(对照和200 mM NaCl处理)在每个小枝上的相同位置收获两种类型的种子(例如，在主茎上形成的第一个分支，分支1与分支1，从植株底部开始计数)，并用千分尺测量果实大小。gydF4y2Ba

胚珠发育的分析gydF4y2Ba

为了测量淀粉在胚珠中的积累，按照Mizzotti等人的描述进行Lugol染色。gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]．受精前后从花中分离雌蕊，立即在FAA溶液(50%乙醇:乙酸:甲醛，体积18:1:1)中固定至少24 h。雌蕊用1.0 M NaOH清洗12 h，用蒸馏水洗涤至少3次，并用Lugol’s溶液染色。在尼康80i Eclipse × 200 DIC显微镜下观察染色雌蕊。gydF4y2Ba

TSS含量的测定gydF4y2Ba

为了量化对照和200 mM nacl处理植株的TSS含量，在105 DAS下收获同一枝上的叶片、相应的茎和花，并将其干燥。用液氮将50毫克烘箱干燥的样品磨成粉末。用80%乙醇提取TSS，用经典蒽酮法定量[gydF4y2Ba88gydF4y2Ba]在紫外可见分光光度计(UV-1700，岛津，日本)。使用葡萄糖构建标准曲线，结果表示为TSS与干重的百分比。gydF4y2Ba

光合作用参数的测定gydF4y2Ba

在生殖生长期(103 DAS)开始时，选取对照和200 mM nacl处理植株的展开叶片，测定净光合速率(gydF4y2BaPgydF4y2Ba_ngydF4y2Ba)、气孔导度(gydF4y2BaggydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba})、蒸腾速率(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)和细胞间COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度(gydF4y2BaCgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba)，使用便携式光合作用测试仪(CIRAS-3, PP, USA)。叶绿素荧光参数使用便携式荧光仪(FMS-2, Hansatech, UK)测定，如Kooten和Snel [gydF4y2Ba89gydF4y2Ba]．为了确定最小和最大荧光，成熟叶片在测试前适应黑暗1小时。最小荧光量(gydF4y2BaFgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba，暗适应叶)和最大荧光量(gydF4y2BaFgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba饱和脉冲8000 μmol m后，叶片适应黑暗gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}为0.8 s)。稳态荧光(gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba})和光适应态荧光(gydF4y2BaFgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba500 μmol m光子照射后测定叶片的参数gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}激活光。PSII的最大光化学效率计算公式为:gydF4y2BaFgydF4y2Ba_vgydF4y2Ba/gydF4y2BaFgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba= (gydF4y2BaFgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaFgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba）/gydF4y2BaFgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba．PSII的量子产率计算公式:ΦgydF4y2Ba_{PSIIgydF4y2Ba}= (gydF4y2BaFgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba”- - -gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba}）/gydF4y2BaFgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba”(gydF4y2Ba90gydF4y2Ba]．对6株对照和nacl处理植株进行了15次重复。gydF4y2Ba

早期的花是从gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba分别在对照和NaCl处理下生长的植株，分离花瓣，使用clark型氧电极(Hansatech, Chlorolab2, UK)测定析氧。gydF4y2Ba

叶绿素含量测定gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba树叶和花朵gydF4y2Ba

在生殖生长期(103 DAS)开始时，收集0和200 mM NaCl处理的植株展开的叶片和花(0.3 g鲜重)，用蒸馏水洗涤，在10 ml提取液(80%丙酮:二甲基亚砜，体积比1:1)中黑暗培养24 h。用80%丙酮调节终体积至25ml。采用Sui等人描述的分光光度计(DU2600, Beckman, Germany)测定645 nm和663 nm处的光吸收值。[gydF4y2Ba83gydF4y2Ba]．如上所述，在花发育早期(108 DAS)测定了花中的叶绿素含量。叶绿体中gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba花瓣在差示干涉对比显微镜下观察(DIC, ECLIPSE 80i, Nikon, Japan)。gydF4y2Ba

总RNA提取，文库构建和测序gydF4y2Ba

在减数分裂(108 DAS)前，采集对照和nacl处理植株的花。按照Guo等的描述进行总RNA的提取和检测。[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]．按照Hu等人的描述生成和处理测序文库。[gydF4y2Ba91gydF4y2Ba]．聚类生成后，文库在Illumina HiSeq 4000平台(Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd, Beijing, China)上测序。RNA-seq采用3个生物重复。gydF4y2Ba

转录组组装与基因功能注释gydF4y2Ba

通过去除低质量序列、包含矢量适配器的序列和poly-N来清理原始读取。使用Trinity进行从头转录组组装gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]，采用Corset [gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]．表达的组装的单一基因gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba按照Guo等人的描述对花进行了注释。[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

DEGs分析gydF4y2Ba

度在gydF4y2Ba美国莎莎gydF4y2Ba使用DESeq R软件包(1.10.1)对nacl处理植株和对照植株的花进行分析。处理和筛选标准如Guo等人所述。[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

实时定量PCRgydF4y2Ba

为了验证RNA-seq鉴定的deg，随机选择10个deg，使用Beacon Designer软件(7.0版)设计的特定引物进行qRT-PCR(定量实时PCR);引物在附加文件中列出gydF4y2Ba9gydF4y2Ba:表S3。程序和计算按照Guo等人的描述进行。[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

每个试验随机选取6株重复植株;统计结果以均数±标准差(SD)表示。采用SPSS (version 17)进行单因素方差分析。图中的不同字母表示在邓肯检验的0.05水平上均值之间有显著差异。gydF4y2Ba

本研究中分析的数据和资料，如有合理要求，可向通讯作者索取。gydF4y2Ba

PSII:gydF4y2Ba

光系统IIgydF4y2Ba

RNA-seq:gydF4y2Ba

RNA-sequencinggydF4y2Ba

TSS:gydF4y2Ba

总可溶性糖gydF4y2Ba

DAS:gydF4y2Ba

播种后的天数gydF4y2Ba

Pn:gydF4y2Ba

光合速率gydF4y2Ba

g:gydF4y2Ba

气孔导度gydF4y2Ba

艾凡:gydF4y2Ba

蒸腾速率gydF4y2Ba

置信区间:gydF4y2Ba

细胞间有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度gydF4y2Ba

F0:gydF4y2Ba

最小荧光量gydF4y2Ba

Fm:gydF4y2Ba

最大荧光量gydF4y2Ba

Fs:gydF4y2Ba

稳态荧光gydF4y2Ba

调频”:gydF4y2Ba

光适应态荧光gydF4y2Ba

迪拜国际资本:gydF4y2Ba

差示干涉对比显微镜gydF4y2Ba

ΦPSII:gydF4y2Ba

PSII的实际光化学效率gydF4y2Ba

度:gydF4y2Ba

差异表达基因gydF4y2Ba

阵线/ Fm:gydF4y2Ba

PSII的最大量子产率gydF4y2Ba

大型强子对撞机:gydF4y2Ba

聚光复合物gydF4y2Ba

PSI:gydF4y2Ba

光系统IgydF4y2Ba

Cytb6f:gydF4y2Ba

细胞色素gydF4y2Ba

二磷酸核酮糖羧化酶:gydF4y2Ba

核酮糖1 5 5-bis-phosphate,羧化酶/加氧酶gydF4y2Ba

RuBP:gydF4y2Ba

核酮糖1,5-diphosphategydF4y2Ba

SS:gydF4y2Ba

蔗糖合成酶gydF4y2Ba

SPS:gydF4y2Ba

蔗糖磷酸合酶gydF4y2Ba

PGM1:gydF4y2Ba

PhosphoglucomutasegydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

国家自然科学基金(批准号:31570251、31770288 ~ BW)、山东省重大专项科技攻关计划(2015ZDJS03002、2017CXGC0313 to BW)、山东省自然科学研究基金(ZR2017MC003 to JG)、山东省高等学校科技计划(J17KA136 to JG)资助。这笔资金用于实验设计、植物材料收集、实验表现、分析和解释撰写手稿的数据。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 山东师范大学生命科学学院山东省植物逆境重点实验室，山东济南250014gydF4y2Ba

   郭建荣，杜明，吕朝霞，王宝山gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

JG写了这个手稿;JG和MD进行实验;JG和CL收集数据并进行所有分析;BW将这个想法概念化并修改了手稿。所有作者已阅读并同意稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba宝山王gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

文中所有实验均在山东省植物胁迫重点实验室进行，符合中国相关法律规定。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和来源，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可协议中，除非在材料的署名中另有说明。如果材料未包含在文章的知识共享许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超过允许的用途，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域免责声明(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

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