转录因子TabhlH49积极调节脱氢gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba基因表达增强小麦抗旱性gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

脱氢酶是一种功能性蛋白质，在许多成熟的种子和逆境条件下的蔬菜组织中都有发现。然而，脱醇蛋白表达的调控机制尚不清楚。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在该研究中，通过使用酵母单杂交系统，从用干旱和冷应力处理的小麦cDNA文库中分离出一种新的干旱胁迫相关的BHLH转录因子突发胁迫相关的BHLH转录因子。TabhlH49蛋白质具有典型的保守的BHLH结构域，是一种Myc型BHLH转录因子。在烟草表皮细胞核中检测到塔布H149，并且C-末端（氨基酸323-362）的氨基酸序列对于其转移活性是必需的。实时PCR分析显示组织特异性表达和干旱胁迫响应性表达gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba在小麦。另外，在Y1H和电泳迁移率变动分析的验证说明的是TabHLH49蛋白能够结合并相互作用与小麦的启动子gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Badehydrin。双荧光素酶检测结果显示，TabHLH49能正向调节WZY2脱氢酶的表达。TabHLH49的瞬时表达和bsmv介导的基因沉默也表明，TabHLH49正调控WZY2脱氢酶的表达，提高了小麦的抗旱性。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这些结果提供了直接证据表明突布49正常调节脱氢酶的表达水平gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba基因改良小麦抗旱性。gydF4y2Ba

小麦作为一种重要的粮食作物，在我国北方大部分地区广泛种植。然而，植物在生长发育过程中通常会遭受干旱、冷害或盐害等不同类型的非生物胁迫，这些胁迫直接影响小麦的整体产量。gydF4y2Ba

作为固着生物，植物已经进化到合成了一系列应激反应蛋白，以避免或抵御不利条件的能力。胚胎发育晚期丰富（LEA）蛋白质在帮助保护细胞免受脱水直接作为功能性蛋白。基于他们的保守序列基序中，LEA蛋白已经被划分成七个独特群体[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．第2类LEA蛋白，又称脱水蛋白，具有高度亲水性。它们被认为是亲水性的，包含3个典型的保守基序:K-(EKKGIMDKIKEKLPG)， Y-([V/T]D [E/Q]YGNP)和S-(丝氨酸轨道)片段。根据这些保守序列(K-、Y-和s -片段)的存在，将脱醇分为不同的亚类:YnKn、YnSKn、KnS、SKn和Kn [gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．小麦脱水gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba调查在目前的研究是一个YSK2型脱水属于YnSKn亚型[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

基本的螺旋 - 环 - 螺旋（bHLH）蛋白质是家族的第二大植物转录因子，可以在激素信号，光形态建成和次生代谢中起重要作用。由于其保守的基本螺旋环 - 螺旋结构域，该系列是众所周知的，其由两个功能区，基本氨基酸区和位于N-末端和C末端的螺旋环 - 螺旋区（HLH）组成分别的BHLH域。碱性氨基酸区含有可以识别和特异性结合靶基因中的DNA基序的基本残基[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]．螺旋环螺旋区域由具有可变长度和氨基酸组成的环路连接的两个两亲性α螺旋组成，其可以促进同杂体或异二聚体以控制基因转录[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

根据前人对bHLH蛋白的研究，这些植物转录因子广泛参与调控植物的生理代谢途径。bHLH在花药发育的调控网络中起着重要的生物学作用gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba［gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．此外，bHLHs还参与了植物对干旱、盐度和低温非生物胁迫的响应。AtbHLH112是由盐、干旱和脱落酸(ABA)诱导的核定位蛋白，编码bHLH蛋白。AtbHLH112作为转录激活剂，通过与基因的GCG或e -box结合调节基因的表达，介导生理反应，包括脯氨酸生物合成和ROS清除途径，以增强耐受性[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．此外，来自的BHLH基因THBHLH1gydF4y2Ba甘蒙柽柳hispidagydF4y2Ba可以通过提高渗透势和减少活性氧积累来提高非生物胁迫耐受性[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

许多以前的研究包括我们的研究，已经表明，小麦在非生物胁迫下合成脱氢。然而，迄今为止脱水的上游调节机制和功能仍然尚不清楚。在这项研究中，我们进一步探索了应力响应机制gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba（UNIPROT ID：B0LXL4）脱氢基于我们克隆的启动子gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba来自小麦“gydF4y2Ba郑寅1＃gydF4y2Ba“在水的压力。gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba（UNIPROT ID：A0A3B6RCI9）被隔离并在通过使用酵母单杂交系统用干旱和冷应力处理的小麦cDNA文库中鉴定。TabhlH49蛋白质编码一个基本的螺旋环 - 螺旋（BHLH）转录因子，其作为正调节器gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Badehydrin基因表达。这是第一次详细报道bHLH参与非生物胁迫下的脱水调节机制，并阐明了其在非生物胁迫下的作用gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Badehydrin信号通路。gydF4y2Ba

TabhlH49和生物信息学分析的表征gydF4y2Ba

在我们以前的研究中，我们分离bHLH49样蛋白与脱水相互作用的cDNA片段gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba由酵母单杂交（Y1H）测定进行的启动子[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]，通过BLAST搜索小麦基因组数据库获得完整的编码序列，将该基因命名为TabHLH49。TabHLH49编码440个氨基酸，预测蛋白分子量为47.54 kDa，等电点为5.61(图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba一种）。该基因含有保守的bHLH域，属于bHLH转录因子家族。TabHLH49的三维结构通过SWISS-MODLE软件（图构成。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac).利用TabHLH49和162 bHLH基因序列构建系统发育树gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba（无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).结果表明，TabHLH49与AtbHLH049高度同源，是myc型bHLH转录因子。gydF4y2Ba

核本地化和TabHLH49的激活能力gydF4y2Ba

根据ProtComp预测算法，核定位信号'VSCPKKRKRPSQ'存在于塔布49的氨基酸序列中（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).因此，TabHLH49可能是一个核定位蛋白。为了验证这一推理，我们通过35S启动子控制下的TabHLH49- gfp共表达来观察TabHLH49的亚细胞定位。重组载体被转化为gydF4y2Ba农杆菌肿瘤术gydF4y2Ba菌株GV3101渗入烟草叶片。用35s转化的GV3101细胞：将GFP载体浸润到烟草叶中作为对照。结果表明，TabhlH49的绿色荧光仅在烟草表皮细胞的核中仅在烟草表皮细胞的核中，而空对照均匀地分布在整个烟草细胞中（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).这表明TabHLH49特异性定位于细胞核。gydF4y2Ba

在Y2H金酵母细胞中测定蛋白蛋白的反式激活活性。当不存在C-末端（氨基酸323-362）时，不能激活报告基因的表达，表明C-末端（氨基酸323-362）的氨基酸序列是用于反式激活活性所必需的禁忌49（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba

表达模式分析gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba和gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba在小麦gydF4y2Ba

Real-time PCR检测表达gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba在小麦的不同组织中（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba结果表明gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba在2周龄幼苗的根，茎和叶子中表达。表达gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba与茎相比，根(1.71倍)和叶(2.89倍)积累较多。gydF4y2Ba

我们之前的研究表明gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba在小麦苗期叶片中含量最高[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]．因此，我们选择小麦幼苗叶片来研究其表达水平gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba和gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba在PEG处理后在不同的时间点（0,1,4,8和12h）（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab). Real-time PCR结果显示gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba在1-12 h明显增加，在12 h达到最高点，约为0 h的31.6倍。有趣的是gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba显示出类似的趋势gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba但落后gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba．这些结果表明，TabhlH49可以积极调节表达式gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

TabHLH49是的上游调节剂gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba

检查TabhlH49之间的交互和gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba启动子(Pwzy2)，酵母单杂交和EMSA分析。酵母单杂交结果表明，含pGADT7-TabHLH49的Y1H Gold酵母细胞不能在SD/−Leu/AbA上生长gydF4y2Ba^{200.gydF4y2Ba}选择性培养基。然而，含有PGADT7-TablH49的Y1H金（PWZY2）诱饵酵母菌株能够在SD / -LEU和SD / -LEU / ABA上生长gydF4y2Ba^{200.gydF4y2Ba}选择性培养基(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa和图SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.EMSA实验表明，与TabHLH49蛋白孵育后，Pwzy2的凝胶流动性发生了变化。gydF4y2Ba4gydF4y2BaB和图.. SgydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.这些结果表明，TabHLH49是gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

TabHLH49正调节的表达gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba提高小麦的抗旱性gydF4y2Ba

描述…的能力gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba激活这一点gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba基因，烟草叶片共渗透gydF4y2BaA. Tumefaciens.gydF4y2Ba包含35s：tabhlh49：gfp矢量与a一起gydF4y2BaRenilla荧光素酶gydF4y2Ba基因由gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba启动子。与GFP表达相比，同时过表达TabHLH49:GFP显著增加了Rluc/Fluc比值(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

探索禁忌49在小麦的功能，gydF4y2BaA. Tumefaciens.gydF4y2Ba将含有35S:TabHLH49:GFP (OE)和35S:GFP (CK)的GV3101注射到小麦叶片中进行瞬时基因表达检测，如前所述[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]．在天然干旱后10天，小麦叶过表达GFP显示出明显的抗潮和卷曲;然而，过表达禁忌49：GFP的小麦显示出更好的生长（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac)。实时PCR结果显示，表达gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba和gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba在干旱胁迫后，过表达TabHLH49:GFP的小麦叶片中TabHLH49:GFP的表达显著高于对照(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2BaD-e）。我们还确定了CK和OE线中丙二醛（MDA），相对含水量和叶绿素含量的含量（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baf-h)。干旱胁迫后，OE株系MDA含量显著低于CK株系，相对含水量和叶绿素含量显著高于CK株系。gydF4y2Ba

我们还探讨了gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba小麦的基因使用大麦条纹马赛克病毒诱导的基因沉默（BSMV-Vigs）技术。BSMV构造BSMV-TabhlH49，携带459个BP片段gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2BacDNA序列，用于沉默gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba小麦种子的基因（表SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.在接种BSMV-PDS后10天，所有感染BSMV-PDS的植株均观察到叶片光漂白，表明内源PDS基因被沉默(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba一种）。在天然干旱后10天，BSMV-TABHLH49线漂白并比BSMV-0和BSMV-PDS线更严重卷曲（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba一种）。实时PCR分析表明，转录水平的gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba和gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba与BSMV:0和BSMV- pds株系相比，BSMV- tabhlh49株系在干旱胁迫后表达量减少(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac)。干旱胁迫后，BSMV-TabHLH49株系的MDA含量明显高于BSMV-0和BSMV-PDS株系，叶绿素含量明显低于BSMV-0和BSMV-PDS株系。gydF4y2Ba6gydF4y2BaD-F）。gydF4y2Ba

此外，我们还测量了失水率，相对含水量和野生型小麦叶片的叶绿素含量，gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Baoe和gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Barnai小麦。gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba-OE小麦的相对水分和叶绿素含量最高，失水率最低gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba-RNAi小麦品系在干旱胁迫下gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba-RNAi系显示最低的相对水和叶绿素含量和最高失水率（图gydF4y2Ba7gydF4y2BaA-C）。这些结果表明，TabhlH49积极调节脱氢gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba小麦抗旱性的基因表达研究。gydF4y2Ba

TabHLH49gydF4y2Ba编码应力响应性的BHLH转录因子，并积极调节小麦干旱耐受性gydF4y2Ba

转录因子在调控植物对干旱的响应中起着重要的作用。在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，许多bHLH转录因子参与了干旱诱导的胁迫反应，如gydF4y2Baatbhlh68gydF4y2Ba［gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，gydF4y2Baatbhlh006.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]，gydF4y2Baatbhlh122gydF4y2Ba［gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]，gydF4y2BaAtbHLH17gydF4y2Ba［gydF4y2Ba17gydF4y2Ba] 和gydF4y2Baatbhlh92.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]．但是，只有少数人在小麦中报道，例如gydF4y2BaTabhlh1.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba19gydF4y2Ba] 和gydF4y2BaTabhlh39.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，以及监管机制等诸多TabHLH蛋白质的生物学功能尚不清楚。在这里，我们得到了一种新的小麦bHLH转录因子，TabHLH49，通过酵母单杂交（Y1H）测定与脱水蛋白启动子WZY2为诱饵。系统发育分析表明，TabHLH49是高度同源AtbHLH049并且是Myc的型bHLH转录因子（图gydF4y2Ba1gydF4y2Bab)。gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba明显受到干旱胁迫的影响(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab)，增强了对干旱胁迫的耐受性(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac).与BSMV-0株系相比，BSMV-TabHLH49株系对干旱胁迫的耐受性降低(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).这些结果表明，TabHLH49编码一种新的bHLH转录因子，正调控小麦的耐旱性。gydF4y2Ba

TabHLH49正调控脱水gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba基因表达gydF4y2Ba

转录因子通过结合调控下游基因的表达gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba式作用启动子的元件。在我们以前的研究，我们发现G-BOX元素的子gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba结合BHLH转录因子[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba]．EMSA和Y1H分析表明，TabHLH49蛋白可以与启动子结合并相互作用gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba（无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.实时PCR结果表明表达式模式gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba类似于gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba但落后gydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba（无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab)。因此，TabhlH49是一个潜在的正稳压器gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba表达。一种双萤光素酶测定也证实了这一结果（图gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).在瞬态表达式分析中gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba与CK相比，在舌苔49-OE小麦线中的干旱胁迫下表达水平显着增加（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bae）。同样，gydF4y2BaWZY2.gydF4y2BaBSMV-TabHLH49细胞系的表达水平显著降低(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac)。另外，当缺失C末端（氨基酸323-362）时，禁忌49蛋白在酵母中没有在酵母中进行转录活性（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac).这些结果表明，TabHLH49正调控脱水gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba基因的表达。gydF4y2Ba

总之，在本研究中提出的结果提供的证据表明，TabHLH49正调节脱水gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba提高小麦抗旱性的基因表达。我们进一步需要开发稳定过表达的TabHLH49，以确定该转录因子是否参与胁迫，这将有助于研究TabHLH49在脱氢酶信号通路中的显性作用。gydF4y2Ba

这项研究表明，转录因子TabHLH49正调控的表达水平gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba基因通过与其启动子结合，从而提高小麦的抗旱性。我们的研究提供了更好地了解监管机制gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba基因响应干旱胁迫，提供进一步作物育种的潜在策略。gydF4y2Ba

酵母单杂交筛选gydF4y2BaT.Aestivum.gydF4y2Ba互补脱氧核糖核酸数据库gydF4y2Ba

619年英国石油公司gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba将启动子(Pwzy2)克隆到pai载体中，将重组质粒转化到Y1H Gold酵母细胞中作为诱饵[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．Two-week-old wheat seedlings exposed to either 12 h high PEG 6000 (20%) or cold (4 °C) treatments were used to construct the cDNA library. The extraction of mRNA was performed with the MiniBEST Plant RNA Extraction kit (Taraka). First-strand cDNA was synthesized by the SMART cDNA Library Construction Kit (Taraka). All fragments were linked to the vector pGADT7-AD and transformed into yeast bait strain Y1H Gold (Pwzy2) following the Yeast Protocols Handbook (Clontech). The transformed stains were cultured on SD/−Leu/AbA^{200.gydF4y2Ba}中等的。酵母提取质粒，并用T7启动和3'AD测序引物扩增。扩增子转化成gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba和测序。gydF4y2Ba

禁忌49的生物信息学分析gydF4y2Ba

在Ensembl服务器的小麦基因组数据库中鉴定了TabhlH49的ORF（gydF4y2Bahttp://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/IndexgydF4y2Ba）.ProtParam工具预测了物理化学特征[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba]．基本的螺旋-环-螺旋保守域和亚细胞定位由NCBI保守域数据库(gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd.gydF4y2Ba)及ProtComp (gydF4y2Bahttp://linux1.softberry.com/gydF4y2Ba),分别。Swiss-Model工具(gydF4y2Bahttps://swissmodel.expasy.org/gydF4y2Ba）用于预测蛋白质的三维结构。系统发育树是由邻接的方法构建的，在Mega 7.0软件中具有1000个引导复制[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba]．所述wbHLH转录因子的氨基酸序列是从先前的报告获得的[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

TabHLH49的亚细胞定位gydF4y2Ba

研究舌蛋白蛋白的亚细胞定位，gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2BaGV3101携带重组质粒pCAMBIA1302：TabHLH49：GFP和pCAMBIA1302空载体（对照）分别注入gydF4y2Ba尼古利亚娜·宾夕法尼亚州gydF4y2Ba树叶。在28℃下在黑暗中培养36小时后，通过荧光显微镜观察烟草表皮细胞中的荧光信号。gydF4y2Ba

TabhlH49转移分析gydF4y2Ba

甲转录激活活性测定法进行如先前报道[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．将TabHLH49全长和截短片段与pGBKT7质粒的GAL4 dna结合域融合，转化酵母Y2H Gold细胞，在SD-Trp/X-α-gal/AbA板上生长，检测其生长情况和α-半乳糖苷酶活性。gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

小麦种子“gydF4y2Ba郑寅1＃gydF4y2Ba“在本研究中使用。小麦植物的生长条件和20％PEG6000治疗与我们以前的研究中描述的相同[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

RNA分离和实时PCR分析gydF4y2Ba

RNA分离和实时PCR的方案是我们之前的研究[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba]．所有real-time PCR反应均重复3次，以确保结果的重现性。gydF4y2Ba

融合TabhlH49蛋白和纯化的表达gydF4y2Ba

将TabHLH49克隆到pET-28a载体中，重组质粒转化感受态BL21 (DE3)细胞。用1 mM异丙基β- d -1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达6 hgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba密度达到了ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba在37℃下含有50μg/ ml卡那霉素的LB液体培养基中的0.6。通过离心收获细胞，并在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中重新悬浮，然后进行超声波细胞破坏30分钟。使用蛋白质™Ni-NTA树脂（转基因）纯化蛋白质纯化，并通过SDS-PAGE检测。gydF4y2Ba

电泳迁移迁移试验gydF4y2Ba

根据制造商的协议，使用LightShift®Chemiluminescent EMSA Kit (Thermo Fisher Scientific)进行EMSA测试。619 bp的区域gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba利用基因特异性引物扩增启动子序列(表SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba）然后纯化和量化。的gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba启动子与纯化的TabHLH49蛋白在室温下反应30 min。然后用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳对配合物进行分离。gydF4y2Ba

双荧光素酶测定gydF4y2Ba

研究TabHLH49对靶点的反式激活作用gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba启动子，双荧光素酶分析根据之前的报道[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]．启动子的gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba被克隆到双荧光素酶报告矢量pc0390-ruc中并转化为gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2BaGV3101然后与PCAMBIA1302：TabHLH49：GFP（效应器）或PCAMBIA1302空向烟叶（控制）一起注射到烟叶。孵育3d后，将叶片研磨在液氮中，然后在室温下与无源裂解缓冲液混合30分钟。离心后，收集上清液并使用双荧光素酶报告系统（Promega）进行荧光素酶活性（Rluc / Fluc）评估。gydF4y2Ba

TabHLH49瞬时表达分析gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba杆菌gydF4y2BaGV3101用PCAMBIA1302转换：TabHLH49：GFP和PCAMBIA1302空向量（控制）注入小麦叶片以进行瞬态基因表达测定，如前所述[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]．新鲜的gydF4y2Ba杆菌gydF4y2Ba在酵母提取物肉汤（YEB）培养基中生长过夜，含有利福平，氨基丙胺和露身霉素。离心后，将细菌颗粒重悬于含10mM MES的渗透缓冲液中，10mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，和400 μM acetosyringone at an optical density of OD_600gydF4y2Ba = 2.0. For wheat infiltration, the fully expanded secondary leaf of wheat seedlings was infiltrated using a 1 mL syringe without a needle. Plant phenotypes were examined between 5 and 14 d after infiltration.

BSMV-mediatedgydF4y2BaTabHLH49gydF4y2Ba基因沉默gydF4y2Ba

如前所述进行病毒RNA和植物接种的体外转录[gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba]．将4株小麦接种BSMV- pds(阳性对照)或BSMV- tabhlh49构建体，每次试验均以BSMV:0(阴性对照)作为对照。这个实验重复了三次，并对数据取平均。gydF4y2Ba

丙二醛(MDA)、失水率、相对含水量、叶绿素含量测定gydF4y2Ba

干旱胁迫后小麦叶片丙二醛(MDA)含量、失水率、相对含水量和叶绿素含量的测定方法如前所述[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

目前的研究过程中产生和分析的数据集在UniProt的数据库的链接获取gydF4y2Bahttps://www.uniprot.org/gydF4y2Ba，分别在加入号B0LXL4和A0A3B6RCI9下。序列gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba启动子可以在我们以前的研究的附加文件中找到gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1080/15592324.2019.1678370gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

bHLH:gydF4y2Ba

碱性螺旋-环-螺旋转录因子gydF4y2Ba

pwzy2：gydF4y2Ba

脱醇促进剂gydF4y2BaWZY2.gydF4y2Ba基因;gydF4y2Ba

阿坝:gydF4y2Ba

脱盐酸gydF4y2Ba

EMSA:gydF4y2Ba

电泳迁移迁移试验gydF4y2Ba

Rluc的：gydF4y2Ba

Renilla荧光素酶gydF4y2Ba

美国人:gydF4y2Ba

萤火虫荧光素酶gydF4y2Ba

阿坝:gydF4y2Ba

Aureobasidin一gydF4y2Ba

Y1H：gydF4y2Ba

酵母一个杂化gydF4y2Ba

IPTG：gydF4y2Ba

异丙基β-D-1-thiogalactopyranosidegydF4y2Ba

MDA:gydF4y2Ba

丙二醛gydF4y2Ba

中收取:gydF4y2Ba

病毒诱导基因沉默gydF4y2Ba

我们承认来自西北A＆F大学的天勇赵博士，为西北A＆F大学提供了双路荧光素酶报告矢量，Zhensheng Kang博士提供了BSMv-Vigs矢量。我们还承认中国国家自然科学基金（第31671608号）。gydF4y2Ba

我们的研究由中国国家自然科学基金（授予31671608）资助。资金代理商在实验设计，数据收集和分析或准备中没有作用。gydF4y2Ba

作者笔记gydF4y2Ba

1. 刘刘，杨和丹丹刘同等为这项工作贡献。gydF4y2Ba

隶属关系gydF4y2Ba

1. 西北A＆F大学干旱地区作物压力生物学学院/州作物应力生物学研究室重点实验室，杨凌712100gydF4y2Ba

   刘浩，杨颖，王小雨，张林生gydF4y2Ba

2. 渭南职业技术学院护理学院，渭南714000gydF4y2Ba

   杨应gydF4y2Ba

3. 云南大学农学院，云南昆明650000gydF4y2Ba

   《刘gydF4y2Ba

4. 中国海洋大学进化与海洋生物多样性研究所，青岛，266000gydF4y2Ba

   小玉王gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

设计实验:HL和LZ。进行实验并分析数据:HL和YY。提供试剂/材料/分析工具:LZ。撰写稿件:HL, YY, XW, DL。所有作者阅读并批准了手稿。gydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2Ba临盛张gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意事项gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放访问gydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中，除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中，并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途，你将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信贷额度中另有说明。gydF4y2Ba

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