MYB转录因子GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba调节柑橘类柠檬苦素的生物合成GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

唇脂剂是由三萜代谢途径产生的主要生物活性化合物。Limonoid生物合成的详细生化过程和其分子调节的机制仍然难以捉摸。调节褐藻性生物合成途径的转录因子的鉴定对于理解潜在的监管机制非常重要。该信息还可以提供用于操纵生物合成基因以调节褐藻素产生的工具。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在本研究中GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba分离出转录因子，鉴定其在类柠檬素生物合成中的作用。多元比对分析和系统发育分析表明GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba是典型的GydF4y2BaR2R3MYB.GydF4y2Ba转录因子与其氨基酸序列高相似性GydF4y2Baatmyb42GydF4y2Ba．柠檬气含量较高GydF4y2Ba柑橘sinensis.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba柑橘祖母GydF4y2Ba和其他物种相比。不同基因型叶片的类柠檬素积累也有不同的趋势。表达GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba与柠檬苦素含量及蛋白表达显著相关GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba在一些柑橘类动物中。过度表达GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba在甜橙中，柠檬素显著积累，而柠檬素下调GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Barna干扰导致矮化表型和nomilin积累减少。此外，酵母单杂交试验和EMSA结果表明GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba专门绑定在启动子中的TTGTTG序列（II型MYB核心）GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba．总之，这些结果表明GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba正向调节类柠檬素的生物合成通过调节表达GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba通过绑定到其启动子的TTGTTG序列（II型MYB核心）。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

cimyb42GydF4y2Ba是一种重要的转录激活因子，参与柠檬苦素的生物合成，调节GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba通过绑定到TTGTTG序列（II型MYB核心）。GydF4y2Ba

柑橘是世界上最重要的水果作物之一。柑橘产生多种次生代谢物，包括柠檬苦素。柠檬苦素类化合物具有广泛的生物和药理活性[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba，例如抗氧化剂[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]昆虫拒食剂[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]以及抗菌[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]、抗癌药[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]， 抗病毒物质 [GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba，抗炎[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba)活动。在不同的柑橘品种、器官和组织以及不同的发育阶段，柠檬碱的产生是不同的[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

唇脂剂是通过甲戊酯（MVA）途径和甲基吡咯醇磷酸（MEP）磷酸（MEP）磷酸（MEP）磷酸（MEP）磷酸（MEP）磷酸（MEP）磷酸（MEP）磷酸（MEP）磷酸（MEP）磷酸（MEP）磷酸（MEP）磷酸（MEP）磷酸（MEP）磷酸（MEP）磷酸（MEP）磷酸（MEP）磷酸（MEP）磷酸（MEP）途径（DMAPP）合成四环素三萜烯化合物。GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba］．IPP和DMAPP的缩合形成C15法呢基二磷酸（FPP），其进一步转化为通过角鲨烯合酶（SQS）在头部到头部缩合反应中催化的线性C30三萜素前体小角鲨烯。随后，Squalene环氧酶（SQE）氧化股氏菌形成2,3-氧基喹啉，其经历由特定氧化喹啉环酶（OSC）介导的环化，形成不同的三萜骨骼[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba］．唇脂生物合成的示意图如图2所示GydF4y2Ba1GydF4y2Ba. 角鲨烯是柠檬苦素、甾醇和油菜素类固醇等三萜类化合物的第一前体。SQS在三萜类化合物生物合成中起着重要的调控作用，因为它位于一个关键的分支点，起着开关的作用[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba］．SQE和OSC是三萜类生物合成中的关键率限制酶，分别催化第一氧合和环化步骤[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21GydF4y2Ba］．通过操纵编码三萜途径酶的基因来改变三萜生产的策略已经被报道[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25GydF4y2Ba］．转录因子（TFS）通过与其启动子区域结合来激活或压制代谢途径中的结构基因来提高次级代谢物的产生巨大潜力GydF4y2Ba26GydF4y2Ba］．因此，它们是控制三萜生产的理想目标。GydF4y2Ba

在柑橘中发现的三萜没有一种被报道调节三萜的生产，但是从其他涉及三萜生物合成的植物中发现的几种三萜已经被鉴定出来。尚等人[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]报告说GydF4y2BablGydF4y2Ba(苦叶)和GydF4y2BaBT.GydF4y2Ba（苦果）BHLH TFS通过与启动子结合调节葫芦酰胺C的生物合成GydF4y2Ba双GydF4y2Ba（一名成员GydF4y2BaOSCGydF4y2Ba)黄瓜(GydF4y2BaCucumis sativusGydF4y2Ba)．GydF4y2BaTSAR1GydF4y2Ba（GydF4y2Ba三萜类皂苷生物合成激活调节器1GydF4y2Ba),GydF4y2BaTSAR2GydF4y2Ba是两个同源的茉莉酸诱导bHLH转录因子，通过与bHLH启动子相互作用直接影响三萜皂苷的生物合成GydF4y2Bahmgr1.GydF4y2Ba（GydF4y2Ba3-羟基-3-甲基 - 甲基戊二醛醛酶A还原酶1GydF4y2Ba),GydF4y2Bamakibishi1.GydF4y2Ba在GydF4y2BaMedicago Truncatula.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba］．甘草(GydF4y2Baglycyrrhiza uralensisGydF4y2Ba)bHLH TF公司GydF4y2BaGubHLH3型GydF4y2Ba正调控三萜皂苷生物合成基因的表达[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba］．最近，GydF4y2BaWsWRKY1公司GydF4y2Ba的GydF4y2Ba有antia somnifera.GydF4y2Ba发现通过在启动子的W字幕序列结合来直接调节三萜途径GydF4y2BaSQS公司GydF4y2Ba和GydF4y2Ba质量工程师GydF4y2Ba[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］．此外，MYB转录因子是参与植物萜类代谢的重要调控因子。葡萄藤的过度表达(GydF4y2Bavitis ViniferaGydF4y2Ba）GydF4y2BaVVMYB5B.GydF4y2Ba在番茄中诱导了有趣的效应，包括苯丙酸代谢和β-胰淀素的下调以及β-胡萝卜素的上调[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba］．GydF4y2BaP. Taeda PTMYB14GydF4y2Ba也与萜类生物合成有关[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba］．这两个GydF4y2BaPtMYB14GydF4y2Ba和GydF4y2BaVVMYB5B.GydF4y2Ba成员的GydF4y2BaR2R3-MYB.GydF4y2BaS，可能调节Terpenoid生物合成。最近，另一个GydF4y2BaR2R3-MYB.GydF4y2Ba成员，GydF4y2BaSmMYB36GydF4y2Ba从GydF4y2Ba丹参GydF4y2Ba据报道，Bunge可促进二萜(丹参酮)的积累[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

R2R3MYB.GydF4y2Ba转录因子是植物TFs中最大的家族之一。该家族成员广泛参与萜类化合物的生物合成，不仅是三萜类化合物的生物合成，而且还参与其他萜类化合物的生物合成。例如，留兰香(GydF4y2Ba薄荷GydF4y2Ba）GydF4y2BaMsMYB公司GydF4y2Ba可以绑定到GydF4y2Bacis-elementsGydF4y2Ba的GydF4y2BaMsGPPS。路易斯安那州立大学GydF4y2Ba并抑制单萜生物合成[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba青蒿AaMYB1GydF4y2Ba在二萜代谢中起激活作用(青蒿素，an) [GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba］．尽管确定了GydF4y2BaR2R3MYB.GydF4y2Ba然而，人们对其在三萜代谢中所起的作用，尤其是在类柠檬素的合成中所起的作用还知之甚少。GydF4y2Ba

在我们以前的研究中，CICEV10021695M是一种MYB系列TF，被RNA-SEQ分析与Limonoids的生物合成相关[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]. 在本研究中GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba被调查阐明了监管机制GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba在柑橘中的唇脂糖的生物合成中。GydF4y2Ba

特点GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba

获得了ciclev10021695m的基因组序列GydF4y2BaC克莱门蒂娜GydF4y2Ba基因组数据库(GydF4y2Bahttps://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!信息？别名=组织GydF4y2Ba). 它编码267个氨基酸，理论等电点和分子量分别为5.14和30.21 分别是kDa。Ciclev10021695m是一个r2r3myb转录因子，因为它包含一个典型的保守的r2r3myb结构域。ciclev10021695m的氨基酸序列与ciclev10021695m有很高的相似性GydF4y2Baatmyb42GydF4y2Ba的GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba（55.86%），因此被指定为GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaA＆B）。GydF4y2Ba

系统发育分析GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba和其他人GydF4y2BaR2R3-MYB.GydF4y2Ba基因GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba表示GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba与之密切相关GydF4y2Baatmyb42GydF4y2Ba和GydF4y2BaAtMYB85GydF4y2Ba已报道参与植物次生代谢[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba］．此外，我们之前的工作证明了表达水平GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba与柚子种子中柠檬苦素含量显著相关[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］．这表明GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba可以作为褐藻性生物合成中的调节因素。GydF4y2Ba

叶片发育过程中的脂质酸盐积聚GydF4y2Ba

九个不同的柑橘品种在三个不同的发育阶段的叶片样本(图SGydF4y2Ba2GydF4y2Ba）用于测定本研究中的柠檬啉（Limonin和Nomilin）含量。表中显示了九个柑橘类涂层的科学名称和缩写GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．不同品种和叶片发育阶段的柠檬碱含量不同。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)范围为0.02 mg/g FW至0.53 9份柑桔种质中FW含量为mg/g。柠檬苦素的最高含量是最低含量的26倍。此外，还观察了不同柑橘品种柠檬苦素含量的变化。GydF4y2Bac . sinensisGydF4y2Ba柠檬碱含量最高(0.25 ~ 0.53 mg/g FW)GydF4y2BaC格兰迪斯GydF4y2Ba(0.15 - -0.22毫克/克FW)。然而，类柠檬碱的含量仍然很低GydF4y2BaC. Reticulata.GydF4y2Ba和GydF4y2Baf . classifoliaGydF4y2Ba，特别是在GydF4y2Baf . classifolia。GydF4y2Ba说明基因型是影响类柠檬碱含量的重要因素之一。此外，在不同的材料中发现了几种不同的类柠檬素积累模式。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．具体而言，在JC和ZSXLMY的叶片生长和成熟期间，柠檬脂含量首先增加，然后在整个叶片生长和成熟期间下降。在Y2期间，NHE的柠檬气含量最明显，并且明显减少。在ST，整个叶片生长期仍处于相当较低的水平，并且变化的趋势与NHE中的变化相似。在WCZPG中，酸橙含量在生长期间不断增加，达到0.04,0.07和0.08mg / g fw。褐藻素含量显示出其他品种的明显变化。GydF4y2Ba

之间的相关性GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba表达和脂溶性含量GydF4y2Ba

相对表达GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba在加入和叶片发育阶段表现出显着差异（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．ZSXLMY在Y2期表达量最高(8.17)，而在GC Y2期表达量最低(0.70)，表达量低12倍。的表达水平GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba在叶片发育过程中表现出与柠檬苦素含量相似的变化趋势。两组间显著正相关GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba在JC，WCZPG和GC中发现了叶片发育过程中的表达和脂质含量（表GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．然而，还观察到一些强烈的负相关性（HPJG，GXSTY和ZSXLMY）。之间的正相关GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba在这些涂布中的所有三叶发育阶段发现表达和脂质含量，特别是在Y3阶段（分别为0.236,0.639和0.66）。在褐藻素内容中观察到类似的相关性GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba表情。但是GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba呈显著相关GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba除GC外，大多数品种在叶片发育过程中都有明显的差异。3个发育阶段的供试材料间的相关性分别为0.971、0.824和0.81。GydF4y2Ba

影响GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba转基因植物中类柠檬素的产生GydF4y2Ba

基因的过度表达和RNA干扰敲除GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba进行了进一步阐明的作用GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba在limonoid生物合成。重组过表达和RNA干涉矢量如图2所示。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一个和无花果。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab.非转基因万金城橙(GydF4y2Bac . sinensisGydF4y2Ba（L.）奥贝克）接枝到用作控制的砧木上。三GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba-overexpressing（GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba-oe）线和三个GydF4y2Bacimyb42GydF4y2BaRNA干扰(GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba(图- r)行。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba图（&F）。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaD)通过GydF4y2Ba农杆菌GydF4y2Ba介导的转换。对照组和gfp阳性细胞在紫外线灯下的图像如图所示。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bae.以R-2转基因植物为例，提供gfp阳性图像。在对照组和过表达系之间没有观察到形态差异，但RNAi株系表现出矮化和节间短的特征(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bad） 是的。随后，进行实时qPCR以评估GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba那GydF4y2BaCisqs.GydF4y2Ba和GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba在转基因株系和对照中(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baf)。GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba过表达株系的表达量显著高于对照，尤其是过表达株系1和3的表达量约为对照的6.6倍。3个RNAi转基因株系(R-1、R-2和R-3)表达水平均下降GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba表达到不同的范围，表现出表达的表现分别降低了39,67和72％。表达GydF4y2BaCisqs.GydF4y2Ba沉默没有抑制GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba在过表达的植物中不上调(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baf).这两个基因的表达呈显著负相关。相比之下，表达GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba与表达一致GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba在转基因植物中。GydF4y2Ba

表情的改变GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba和GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba改变过表达和RNAI线路的褐藻覆积聚。过表达系中的柠檬气含量增加了16.08％，RNAi线下降22.09％（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaG）。值得注意的是，转基因GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba对柠檬酸和Nomilin含量有不同的影响。过表达植物中柠檬啉含量增加了50％，但RNAi线与对照之间没有显着差异。相比之下，Nomilin内容物在RNAi线路上表现出很大的下降，特别是在第2阶段（减少48.76％）。在过度表达线中，Nomilin含量仅显示略有增加（3.31％）。因此，过度表达GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba主要增加柠檬蛋白含量，而GydF4y2Bacimyb42GydF4y2BaRNAi主要降低nomilin的含量。GydF4y2Ba

相关分析表明，柠檬苦素含量与蛋白质表达显著相关GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba和GydF4y2BaCIOC.GydF4y2BaPearson相关系数分别为0.824 (P < 0.05)和0.931 (P < 0.01)。而柠檬碱含量与表达呈负相关GydF4y2BaCisqs.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

cimyb42GydF4y2Ba通过与启动子结合调节类柠檬酸的生物合成GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba

基因表达与GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba那GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaCisqs.GydF4y2Ba暗示了可能的相互作用GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba具有GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba或GydF4y2BaCisqs.GydF4y2Ba. 这些TF结合GydF4y2Ba独联体GydF4y2Ba- 在启动子中鉴定了GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba和GydF4y2BaCisqs.GydF4y2Ba使用PLANTCARE和PLACE在线软件(图SGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．的约2kb启动子GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba和GydF4y2BaCisqs.GydF4y2Ba包含几个MYB核心和AC元素，这是MYB绑定所需的[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba］．在此基础上GydF4y2Ba独联体GydF4y2Ba-Element分析，进行Y1H测定以识别之间的潜在相互作用GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba和启动子GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba和GydF4y2BaCisqs.GydF4y2Ba．检测诱饵载体的最小AbA抑制浓度如图S所示GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba．除了Y1H系统控制之外，还执行空PGADT7和PABAI-SQS / OSC的COTRANSFORATION以降低假阳性率（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaA＆B）。结果表明GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba直接和排他性地与GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba抑制抑制的启动子500ng / ml aba（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bad） 是的。相反，两者之间没有相互作用GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba和GydF4y2BaCisqs.GydF4y2Ba酵母细胞中的启动子（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bac).这表明GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba作为一种激活剂调节GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba．这些结果表明GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba可能是参与柠檬碱生物合成的关键因素之一，通过调节表达GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

cimyb42GydF4y2Ba中介GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba通过与II型MYB核心结合进行transactivationGydF4y2BaCIS-ELEMENT.GydF4y2Ba在里面GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba启动子GydF4y2Ba

许多研究的MyB蛋白通过识别启动子区域中的MyB核心序列（C / TNGTTG / A）和AC元素（ACCA / TAA / CT / C）[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba］．然而，Mybs对这些序列表现出不同的亲和力。Kelemen等人的先驱作者。[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba阐明了……的优先交互作用GydF4y2BaAtMYB85GydF4y2Ba使用AC元素和II型MYB核心，特别是对于II型MYB核心。基于序列相似之处GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba和GydF4y2Baatmyb42GydF4y2Ba和GydF4y2BaAtMYB85,GydF4y2Ba我们推断GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba也可能与AC元件和II型MYB核心相互作用。因此，我们用重组蛋白和三种生物素标记的探针进行电泳迁移率转移分析GydF4y2BaCIS-ELEMENT.GydF4y2Ba序列（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)．CiMYB42蛋白的表达和纯化如图S所示GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba．图S的原图GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba如图S所示GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba．原始的EMSA凝胶图像如图S所示GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba．如图所示。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba，C型末端他标记的CIMYB42蛋白对OSC-2探针具有TTGTTG序列的强烈亲和力，但是。GydF4y2Ba

不能与osc1 (accaac, AC-elementGydF4y2Ba）GydF4y2Ba和osc3 (TAACTA, II型MYB核心)探针。这些结果表明GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba作为一个r2r3型MYB转录激活子，它结合到II型MYB核心(TTGTTG)序列GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba启动子并激活GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba基因在柑橘类。GydF4y2Ba

在本研究中GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba经鉴定，该基因通过调控类柠檬素的表达显著影响类柠檬素的生物合成GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba. 前一份报告指出GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba（ciclev10021695m）是一个GydF4y2BaR2R3MYB.GydF4y2Ba甜橙S00271支架基因(GydF4y2Bac . sinensisGydF4y2BaClementine的S3（GydF4y2BaC. Reticulata.GydF4y2Ba). 冷胁迫和ABA、JA处理均可诱导其表达[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]但它的功能是未知的。一般来说，GydF4y2BaR2R3MYB.GydF4y2Ba转录因子在萜类生物合成中发挥着重要的调控作用，特别是在4、5、15亚群成员中[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba］．GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba在以前的一份报告中列为第12小组别[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]. 我们的研究表明，第12亚组的成员可能也参与了萜类生物合成的调控。GydF4y2Ba

报道了柑桔种子和果实不同种类和不同发育阶段柠檬苦素含量的变化[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba]但是在不同柑橘种类的叶片发育过程中，叶绿素积累的重点较小。在本研究中，在大多数检查的梳理中，发现唇脂酸盐含量在不同的叶片发育阶段具有显着差异。根据遗传背景，叶片发展中的褐藻蓄积趋势提出了几种不同的模式。表达GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba与部分材料在叶片发育过程中的类柠檬素含量不呈正相关(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba). 然而，在这些基因的表达之间也观察到了相似的相关性GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba还有柠檬碱含量，可能是由于GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba通过调节三萜的合成间接参与褐藻性生物合成途径[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba］．此外，类柠檬碱的积累不仅受到类柠檬碱生物合成的影响，还受到类柠檬碱运输和降解等因素的影响。GydF4y2Ba

应用反向遗传学方法来确定GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba在limonoid生物合成。发现了一些有趣的表型GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba-沉默的柑橘植物（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bad） 是的。RNAi击倒GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba导致显然的生长和植物细节短的植物，其具有显着降低的褐藻液。沉默沉默的形态发生抑制现象和降低的褐藻蛋白生产GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba与之前三萜途径基因下调/沉默以及与三萜代谢相关的TFs，如GydF4y2BaNtCAS1公司GydF4y2Ba[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba]，GydF4y2BaATHMGR1.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba),GydF4y2BaWsWRKY1公司GydF4y2Ba[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］．RNAi敲低诱导的Nomilin内容的降低GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba可能是脂蛋白前体耗尽的结果，这是褐藻素生产所需的[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba]. 信号的下调GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba表达也可能导致诺米林的减少。然而，柠檬素产量的微小变化可能是由于尽管诺米林产量急剧下降，但仍有足够的诺米林供应来合成柠檬素。的差别是对这些GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Barna干扰基因敲除诱导表达GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba在柑橘类植物。然而,GydF4y2BaCisqs.GydF4y2Ba有轻微的上调GydF4y2Bacimyb42GydF4y2BaRNAi。最近报道了这种差异调节三萜类生物合成GydF4y2BaW. Somnifera.GydF4y2Ba（涉及GydF4y2BaWsWRKY1公司GydF4y2Ba) [GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba在番茄中(涉及GydF4y2Ba游戏9.GydF4y2Ba) [GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba]和桦木(GydF4y2Ba桦木属platyphyllaGydF4y2Ba苏克。；涉及GydF4y2BaBpbHLH9型GydF4y2Ba) [GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

与…对比GydF4y2Bacimyb42GydF4y2BaRNAi，过度表达GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba在甜橙叶片中增加了表达量GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba和limonoid内容。此外，Y1H的测定结果进一步支持了其重要作用GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba根据发现GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba唯一激活的启动子GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba．这些结果与结论是一致的GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba积极调节韧带生物合成。过度表达GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba诱导了柠檬素的积累而不是诺米林。这表明,GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba可能还有其他目标。除了GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba，唇形途径中的其他下游基因可以诱导GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba．一种靶基因可以由几个TFS调节;相反，一个TF可能涉及多种生物合成过程[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

之前的报告显示，Myb TFS可以绑定到MYB核心序列和AC元素[GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba]. EMSA结果表明GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba可以专门绑定到TTGTTG序列GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba启动子（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba），建议GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba优先绑定到II型MYB核心（TNGTTG / A），类似于GydF4y2BaAtMYB85GydF4y2Ba[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba]GydF4y2Ba．GydF4y2Ba基于两个近同源物的结果GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba那GydF4y2Baatmyb42GydF4y2Ba和GydF4y2BaAtMYB85GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab),建议GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba也可以调节二次细胞壁生物合成。这是第一份阐明转录因素的作用的报告GydF4y2Ba柑橘利森GydF4y2Baoid生物合成。我们的研究成果将为了解R2R3MYB转录因子在三萜生物合成途径中的调控机制提供参考。GydF4y2Ba

在这项研究中，我们确定了一种新的监管因素，GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba，这通过与启动子的II型MyB核心（TNGTTG / A）序列结合来涉及褐藻性生物合成GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba．结果表明GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba是柠檬苦素代谢网络中的转录激活因子。GydF4y2Ba

植物材料及取样GydF4y2Ba

本研究于2017年4月在位于重庆市北碚的中国农业科学院柑橘研究所国家柑桔种质资源库(National citrus种质资源库)中收集了3个不同时期(Y1、Y2、Y3)的健康新鲜柑桔叶片。利用4个品种的9份柑橘种质进行基因表达分析和类柠檬素测定(表1)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)．三个发育阶段的叶片样本如图S所示GydF4y2Ba2GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

柠檬苦素和诺米林的提取及定量研究GydF4y2Ba

根据Sun等人描述的方法，通过HPLC对柠檬苦素和诺米林进行提取和定量[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba[并进行三种生物重复。因为最皂脂组分的标准样品不可用，所以可以仅定量分析仅柠檬啉和Nomilin。因此，Nomilin和Limonin的总和用于表示本研究中的柠檬糖含量。GydF4y2Ba

生物信息分析GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba

的氨基酸序列GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba是从GydF4y2BaC克莱门蒂娜GydF4y2Ba基因组数据库(GydF4y2Bahttps://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!信息？别名=组织GydF4y2Ba)．通过扩展来预测理论pi（等电点）和mw（分子量）（GydF4y2Bahttps://web.expasy.org/compute_pi/GydF4y2Ba)．利用简单模块化结构研究工具(SMART)确定了序列的结构域序列GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba. 对这些蛋白质序列进行BLAST搜索，以识别其它植物物种中的同源序列。DNAMAN v.6.0用于多重比对分析。同源序列GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba用于构建系统发育树。GydF4y2Ba

DNA和RNA提取，cDNA合成和相对表达分析GydF4y2Ba

采用CTAB法提取基因组DNA，按照制造商的说明使用RNAprep纯植物试剂盒提取RNA(天根生物技术，北京，中国)。使用PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒与gDNA橡皮(Perfect Real Time) (Takara Biomedical Technology，北京，中国)将1 μg的RNA逆转录成cDNA。使用1× iTaq™universal SYBR®Green Supermix (Bio-Rad)实时荧光定量pcr检测基因表达。这些程序中使用的引物列于补充表中。S1。利用柑橘进行了三个重复试验GydF4y2Ba肌动蛋白GydF4y2Ba基因进行标准化，并使用2GydF4y2Ba^{-ΔΔctGydF4y2Ba}方法 [GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

转基因甜橙的转化及特性研究GydF4y2Ba

的光盘GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba被放大并连接到GydF4y2Ba囊GydF4y2Ba一世GydF4y2Ba/巴姆GydF4y2BaH i的PBI121CSH网站获得过表达载体。对于RNAi载体的构建，PCR扩增462bp片段并集成到PGBI载体中。这两种表达载体在外源基因转化的可视化方面存在巨大的优点，因为GFP阳性样品易于用紫外线照射（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bae）。重组过表达和RNAi载体被转化为Wanjincheng橙的显微胶质植物（GydF4y2Ba柑橘sinensis.GydF4y2Ba（L.）Osbeck）如前所述[GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba］．在含50mg /ml卡那霉素的MS培养基上筛选转化子。将正枝嫁接到2年生紫阳相城(GydF4y2BaC. Junos.GydF4y2Ba)后进行GFP荧光检测和基因组DNA的PCR扩增。整合与表达GydF4y2Bacimyb42GydF4y2BaRT-PCR分析进一步证实了转化苗中的基因。GydF4y2Ba

酵母单杂交（Y1H）测定GydF4y2Ba

全长GydF4y2Bacimyb42GydF4y2BaORF被扩增并与pGADT7载体融合，以创建用于实验的猎物。的启动子序列(2kb)GydF4y2BaCisqs.GydF4y2Ba(ciclev10028537m)和GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba(ciclev10010416m)由北京基因组研究所合成，插入到pAbAi载体中作为诱饵。用于构建向量的引物列于表中。S1。酵母单杂交(Y1H)检测采用Matchmaker Gold酵母单杂交系统(Clontech, USA)。BbsI酶对pAbAi-SQS和pAbAi-OSC线性化，在SD/−Ura培养基上检测aureobasidin A (AbA)的最低抑制浓度。之间的交互GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba和启动子GydF4y2BaCisqs.GydF4y2Ba和GydF4y2BaCIOC.GydF4y2Ba然后将线性化的诱饵质粒和猎物质粒共转化到SD上的Y1H金酵母感受态细胞/−最佳AbA浓度的leu培养基。GydF4y2Ba

电子机动性转移测定（EMSA）GydF4y2Ba

一个cDNA片段GydF4y2Bacimyb42GydF4y2Ba采用基因特异性引物进行扩增(表SGydF4y2Ba1GydF4y2Ba)并插入pMAL-C2X向量GydF4y2BaBamGydF4y2Ba你好/GydF4y2Ba太平洋标准时间GydF4y2BaI站点与一个6 ×他的标签。将重组质粒pMAL-C2X-MYB42转化到大肠杆菌中GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaRosetta（DE3）菌株。通过固定化的金属亲和层析方法纯化PMAL-C2X-MYB42蛋白，并根据制造商的说明（GE Healthcare，USA）在这一步骤中使用Ni Sepharose高性能。寡核苷酸探针是合成的，由武汉真菌生物工程有限公司标记的生物素蛋白质和探针之间的结合活性在电子迁移率移位测定（EMSA）中。根据化学发光EMSA试剂盒（BeyoTime Biotechnology，China）的说明，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳与未结合的DNA片段分离CIMYB42结合的DNA片段。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

采用SPSSV20.0统计软件包进行统计分析。邓肯测试有显著差异。GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05被认为是显著的。相关分析采用Pearson相关分析。GydF4y2Ba

本研究分析的所有数据均包含在本文及其补充文件中。目前研究中使用和分析的基因序列可从植物僵尸数据库获得(GydF4y2Bahttps://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.htmlGydF4y2Ba)注册号如下：ciclev10021695m，orange1.1g024441m，AT4G12350.1，GRMZM2G104551\u T01，Potri.003g14100.1，Manes.02G034300.1，tc1eg016054t1，Gorai.003G168100.1，mdp000682032，Glyma.011500.1，gsvivt0100417001，mrna32268.1-v1.0-hybrid，Medtr4g102380.1，evm.model.supercontig\u 3.300，ciclev10028537m和ciclev10010416m。根据合理要求，可从通讯作者处获得植物材料。GydF4y2Ba

• 2020年7月06GydF4y2Ba

  对本文的修订已发布，并可通过原始文章访问。GydF4y2Ba

IPP：GydF4y2Ba

异戊烯基二磷酸；GydF4y2Ba

DMAPP:GydF4y2Ba

Dimethylallyl二磷酸;GydF4y2Ba

MVA:GydF4y2Ba

米瓦洛酸盐GydF4y2Ba

MEP：GydF4y2Ba

甲基赤藓糖醇磷酸酯GydF4y2Ba

FPP：GydF4y2Ba

法呢基二磷酸酯GydF4y2Ba

SQS：GydF4y2Ba

角鲨烯合酶GydF4y2Ba

SQE:GydF4y2Ba

角鲨烯环氧酶GydF4y2Ba

营业执照：GydF4y2Ba

Oxidosqualene环化酶GydF4y2Ba

TF:GydF4y2Ba

转录因子GydF4y2Ba

CD：GydF4y2Ba

编码序列GydF4y2Ba

子:GydF4y2Ba

开放阅读框架GydF4y2Ba

JC:GydF4y2Ba

贝贝447橙色GydF4y2Ba

新人道:GydF4y2Ba

Newhall肚脐橙色GydF4y2Ba

Gxsty：GydF4y2Ba

广西Shatian柚子GydF4y2Ba

zsxlmy：GydF4y2Ba

早期的暹罗pummeloGydF4y2Ba

圣:GydF4y2Ba

森塔·乌斯普通话GydF4y2Ba

GC:GydF4y2Ba

Miyagawa瓦斯普通话GydF4y2Ba

WCZPG:GydF4y2Ba

Wangcang Zoupigan普通话GydF4y2Ba

HPJG公司：GydF4y2Ba

Huapi KumquatGydF4y2Ba

拉吉：GydF4y2Ba

Rongan金橘GydF4y2Ba

SD：GydF4y2Ba

合成的辍学生GydF4y2Ba

Ura所言:GydF4y2Ba

尿嘧啶GydF4y2Ba

雷：GydF4y2Ba

亮氨酸GydF4y2Ba

阿坝:GydF4y2Ba

奥雷巴西丁AGydF4y2Ba

EMSA:GydF4y2Ba

电子迁移率转移实验。GydF4y2Ba

作者在西南大学柑橘研究所大大致谢Aihong Peng，为甜橙色转型提供了有用的监督。GydF4y2Ba

本研究得到西南大学“双世界级”发展规划的支持，为实验提供了研究平台。感谢国家重点研发计划(2019YFD1001401-02)、教育部双一流学科建设项目“作物新品种和种质资源育种与应用”，重庆市晚熟柑橘特色经济农业研究体系专项资金和中国农业研究体系专项资金(CARS-26)用于HPLC、Y1H和EMSA分析的资金支持。西南大学人才博士基金(SWU117038)和重庆市基础与前沿研究项目(cstc2018jcyjAX0400)为测序分析和数据分析提供了资金支持。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 西南大学柑橘研究所/中国农业科学院，重庆北贝，400712GydF4y2Ba

   张盼，刘晓峰，于欣，王福生，龙俊红，沈万霞，蒋东，赵晓春GydF4y2Ba

2. 重庆市北城国家柑橘工程研究中心，400712GydF4y2Ba

   张盼，刘晓峰，于欣，王福生，龙俊红，沈万霞，蒋东，赵晓春GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

PZ和X-CZ设计了实验;PZ进行了实验和数据分析，并撰写了稿件的第一个草案;X-CZ和XY编辑了稿件。X-FL提供了关于万新城橙的遗传转化的表达载体和科学指导;XY提供了分析工具并进行了生物信息分析。F-SW帮助样品制备和褐藻素量化。J-HL和DJ对酵母单杂交检测进行了有益的建议。W-XS进行了QPCR分析;DJ进行了样品选择并提供了有价值的讨论。所有作者都已经阅读并赞成最终的手稿。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba赵晓春GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

道德认可和参与同意GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

出版许可GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文根据创意公约归因于4.0国际许可证，这允许在任何中或格式中使用，共享，适应，分发和复制，只要您向原始作者和来源提供适当的信贷，提供了一个链接到Creative Commons许可证，并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明，否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中，除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中，法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用，您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本，请访问GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba．“创作共用公共领域”豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。GydF4y2Ba

再版和权限GydF4y2Ba