miRNA172在番茄中的异位表达(茄属植物lycopersicum)揭示了在水果发育中通过调控an的新功能AP2转录因子

背景

MicroRNAs (miRNAs)是一种短的非编码rna，可以通过多种机制影响基因表达。西红柿是一种因其风味、烹饪特性和高营养品质而被广泛食用的水果。番茄果实是更年期和肉质的，其成熟是由内源和外源信号通过协调的遗传网络调控的。关于番茄果实成熟的机制已经进行了大量的研究，但mirna调控的特定调控基因的抑制/表达的作用尚未得到很好的报道。

结果

在这项研究中，我们证明了miR172特异性靶向四种SlAP2番茄转录因子基因。其中,SlAP2a被过度的表达所压抑SlmiR172表现为花的形态、发育和成熟加速的改变。miR172过表达系被特异性抑制SlAP2a，提高乙烯生物合成，果实颜色和其他成熟特性。大多数先前描述的成熟调控基因，包括RIN-麦斯，NR，TAGL1和LeHB-1不受miR172影响，而中国北车表现出改变的表情。

结论

番茄果实的成熟直接受miR172靶向的影响APETALA2转录因子,SlAP2a，对其他已知的成熟调节基因的影响最小。miR172a-guidedSlAP2a表达提供了对成熟的另一层遗传控制的见解，并为改变番茄和其他可能的肉质水果作物的质量和营养价值提供了目标。

MicroRNAs (miRNAs)是一种短的非编码rna，长度约为18-24个核苷酸。真核mirna来源于内源性加工的RNA转录物，作为长，初级转录物(pri-miRNA)，然后由核糖核酸酶iii样核酸酶和dicer样(DCL)蛋白转录。在四种DCL蛋白中拟南芥， DCL1在其他辅助蛋白的帮助下参与mirna的产生[1，2]。长pri-miRNA采用不完美的单链发夹结构，将miRNA包含在茎的单臂中[3.]。这种折叠对于RNAse III的加工至关重要，RNAse III将它们切割成pre- mirna。mirna大致分为内含子(从宿主转录物的内含子转录)和基因间(由依赖dna的RNA聚合酶II独立转录)[4]。

miRNAs作为基因表达发育调控的抑制因子，通过介导互补mRNA的裂解或抑制翻译发挥作用[5，6，7，8，9，10]。成熟mirna可被纳入rna诱导沉默复合体(RISC)或其他参与靶基因负调控的RISC样复合体中[6，11，12，13，14，15]。在快速变化的发育阶段[16]， miRNA双链的一条链通过解开或切割而被放弃[17]，另一条链保留在RISC中以识别目标mRNA。通过靶向切割的转录沉默已被发现在植物中占主导地位，这有助于使用基于可用基因组序列的计算方法直接预测可能的靶基因[18，19，20.，21]。

在植物中，mirna参与环境相互作用、许多发育过程(例如，控制分生组织身份、细胞增殖、发育时间和模式形成事件)，并作为器官发育的关键调节因子[qh]15，22]。在转录后水平，植物mirna已被证明通过结合来调节代谢过程独联体- - -反式-抑制蛋白质翻译的调控位点[21，23，24，25]。mirna在植物生长发育、信号转导、激素信号传导、先天免疫以及对多种生物和非生物胁迫的反应等方面调控基因表达的作用已被广泛研究拟南芥及其他植物品种[15，26，27，28]。

肉质果实的成熟是许多生化和生理过程的总和，这些过程由发育、激素和环境因素协调，影响色素沉着、质地、香气、风味和营养成分[qh]29]。番茄(茄属植物lycopersicum)是研究最多的肉质果实模型，因为它具有简单的二倍体遗传和较小的基因组大小(900 Mb) [30.]，生命周期短，转化效率高，成熟期表型明显，遗传图谱密集，基因组资源丰富，高质量基因组序列可获得[31，32，33]。

定位克隆特性良好的番茄突变体，如rin（ripening-inhibitor)，Gr（green-ripe)，Nr（never-ripe）,女朋友（绿色的肉),中国北车（无色non-ripening)，提供了对果实成熟过程中分子调控的基本方面的见解，最值得注意的是影响乙烯生物合成和信号传导的成熟调控途径[29，34，35，36，37]。通过转录组分析确定了其他调节因子，并通过抑制、过表达或过度表达证实了它们的作用CRISPR / Cas9基因编辑(母，FUL1，FUL2，MADS1，TAGL1,SlAP2a) [38，39，40，41，42]，或与其他规管机构互动(LeHB-1和TDR4) [42，43，44]。潜在的mirna调控网络和RIN-MADS通过对野生型(WT)番茄中鉴定的mirna进行深度测序和表达谱分析，阐明了基因在番茄果实发育和成熟过程中的作用[45]。mirna还与DNA甲基化和启动子活性相关[46]。

miR172家族参与了一个亚家族的调控APETALA2（AP2)转录因子基因[47，48]。在拟南芥， miR172通过AP2［49]，通过下调TOE1（eat1目标),TOE2（eat2的目标) [50]。在玉米中，已经发现miR172可以阻断基因的结合位点AP2家族基因glossy15（gl15)，并在维持青少年成长方面扮演重要角色[51]。虽然miR156调控了幼虫到成虫的相变拟南芥和延迟开花，从miR156的过表达中可以看出，在miR172过表达系中发现相反的表型[52，53，54]。

基因组序列有助于miRNA的发现。Yin等。[55]在番茄中检测到21个保守的mirna及其对应的靶基因，其中5个是推定的AP2miR172家族靶点，采用计算同源性搜索方法。为了进一步阐明mirna在果实生物学中的作用，我们对mirna的功能作用进行了表征AP2家族基因及其miRNA调控。具体来说，我们分析了miR172在番茄花决定和果实成熟中的作用，并发现miR172过表达模拟SlAP2aRNAi抑制表型。我们进一步证明了miR172的调控作用SlAP2a在肉质果实的发育中，不同于以前在干果中发现的活动拟南芥。

番茄miR172基因的功能分析

采用RNA凝胶印迹法分析番茄中miR172的积累情况。数字1A和附加文件1miR172主要在叶和花中积累，在果实发育过程中减少。miR172转录本在花蕾、心皮和雄蕊发育的早期阶段大量积累(图2)。1B及附加文件1）.

目的:分析miR172在番茄中的功能，横跨miR172的403 bp基因组序列(pre-miR172;番茄细菌人工染色体(BAC)末端序列Mbo我(SL_MboI0036L22_T7_268826)/番茄WGS染色体SL2.40ch11 (solgenomics.net),称为SlmiR172a(NCBI accession 102,464,333)，从指定的BAC克隆中通过PCR扩增。这个序列连接在花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子在载体pBI121中转化为根癌土壤杆菌菌株LBA4404转化WT番茄cv。艾尔莎•克雷格。25卡那霉素（菅直人)抗性独立变换线(T₀)经PCR证实菅直人基因。根据表型和拷贝数选择了3个高表达(OE)株系(2个强表型株系13和16,1个弱单拷贝株系26)₂生成并用于后续研究。与WT对照相比，miR172转录物在3个纯合子转基因系的花和破壳后3天(早熟)果实中都很丰富，花中的丰度高于B3果实(图2)。2和附加文件1）.

miR172过表达影响番茄开花时间和花型

已知miR172通过翻译抑制的方式影响花器官的特性和开花时间AP2家庭成员拟南芥［49，50，56]。在第一个花序之前产生的叶的数量SlmiR172a在16 h光照/8 h暗光照条件下，OE系平均比WT少一片叶片(番茄为日中性;无花果。3.a).开花时间缩短4-5天miR172OE线(图1)3.b).此外，过度表达SlmiR172导致萼片变大，花瓣变窄，以及萼片到花瓣的转变(图2)。4a、b)。

SlmiR172a通过SlAP2a调控果实成熟

镇压SlAP2amiRNA对番茄果实成熟、乙烯产量、成熟时间、类胡萝卜素生物合成及成熟相关基因表达的影响[j]。42，57]。SlAP2a已经被证明含有一种假定的SlmiR172a结合部位[42]。这里，持续发育的时间从1厘米果到破碎机中SlmiR172aOE组比未转化组早4-6天(表2)1)，类似于的效果SlAP2a镇压。在果实发育早期(1厘米后8天)，花萼明显增大(图2)。5a).在成熟果实颜色强度上，两组间无明显差异SlmiR172aOE线和WT(图1)5）.

用于颜料组成的精确表征SlmiR172a用高效液相色谱法测定了成熟果实的类胡萝卜素含量。果皮中番茄红素的积累SlmiR172aOE系m# 16和m# 26与WT相似，但在m# 13系显著减少(图2)。6）.在这三种水果中，β-胡萝卜素的含量增加了大约两倍SlmiR172a我们还测量了类胡萝卜素生物合成基因的表达，包括DXS1（1-脱氧-d -木质素糖5-磷酸合酶)，PSY1（植物烯合成酶)，PDS（八氢番茄红素desaturase),ZDS（ζ-胡萝卜素desaturase)，表现出丰富的mRNA积累，且只有下游基因CYC-B（番茄红素-β环化酶)大幅增加SlmiR172aOE线与WT相比较(图2)。7和附加文件1）.CYC-B催化番茄红素转化为β-胡萝卜素，在成熟的水果中显著升高SlmiR172aOE线与高架一致CYC-B表达式。

miR172在乙烯生产调控中的作用

乙烯是包括番茄在内的更年期水果的重要成熟激素。为了确定miR172在果实乙烯产生中的作用，我们用气相色谱法测量了果实发育5个阶段的乙烯释放。miR172a与WT对照相比，OE果实的乙烯从成熟开始增加了三到四倍，并且在破碎后7天保持不变(图2)。8）.

我们监测了乙烯生物合成基因的mRNA丰度，1-氨基环丙烷1-羧酸合成酶（ACS2)，ACS4,1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶（ACO1)和乙烯反应(E4和E8)基因在果实发育过程中。所有5个基因在miR172a果实成熟的B和B3阶段的OE系与WT相比(图2)。9和附加文件1）.乙烯和相应的基因表达数据表明miR172a通过抑制果实乙烯的生物合成SlAP2a转录因子。miR172aOE拟表型SlAP2a镇压(42]。

mir172引导RNA切割的鉴定及其在miR172a OE细胞系中的作用

为了预测miR172引导的切割产物，我们将miR172和五个假定的靶基因序列进行了比对SlAP2a，SlAP2b，SlAP2c，目标4,目标5(补充数据1）.然后，我们使用RNA连接酶介导的5 ' -快速扩增cDNA末端(5 ' -RACE)对5个预测的靶标miR172a。五个预测靶标中有四个显示了与miRNA互补序列对应的特定切割位点，除了SlAP2b(无花果。10）.所有的裂解事件都发生在靠近互补链的中间，与拟南芥miR172。SlAP2b未显示乳沟(图2)。10）.我们试图检测乳沟SlAP2b使用重复的RACE-PCR与许多额外的3 '基因特异性引物无效，尽管可能是技术问题可能是原因。然而，RACE-PCR用19bp的适配器序列和5bp的裂解序列引物扩增了靶序列miR172aOE线。

我们使用RT-PCR来评估预测靶基因的转录丰度miR172OE线和WT，观察到SlAP2a和SlAP2在B3和AP2b在花中miR172aOE管线(补充图)S1A、B和附加文件1）.同时，乳沟产物目标4和目标5基因在WT和miR172aB3处的OE线。只有SlAP2aB和B3miR172aOE水果(补充图)S2和附加文件1）.其他SlAP2（SlAP2b和SlAP2c)基因未检出，与SlAP2a的已知在果实发育和成熟中起作用。积累SlAP2a转录本在miR172aOE线与WT比较，说明番茄miR172a与下调调控有关吗SlAP2基因(SlAP2a，SlAP2b,SlAP2c)通过miRNA结合位点的切割。

miR172和成熟相关调控基因

观察到的作用miR172a在果实成熟过程中，花器官的同一性促使我们研究两者之间的关系miR172而其他成熟调控基因，具体来说，MADS-RIN（成熟抑制剂)，CNR-SPB（无色NON-RIPENING)，HB1（Hd-zip同源盒蛋白-1),也不（NON-RIPENING）.只有在水果成熟的时候NR表达差异miR172OE线和WT(图1)11和附加文件1）.此外，我们还在这些成熟基因突变的几种基因型组织中对miR172进行了RNA凝胶印迹分析(rin，也不，中国北车,Nr;补充图。S3和附加文件1）.只有Cnr表现出与WT不同的miR172水平，miR172转录物在成熟时更高中国北车与WT相比(补充图:S4）.这个结果表明SlCNR受miR172的影响，尽管这种影响可能是间接的，也可能是由SlAP2a。

miR172是植物中高度保守的mirna。miR156/157、miR170/171和miR165/166也进化为同源基因。这些mirna在植物，特别是花的发育过程中起着重要而保守的作用[15，20.，48，58，59，60]。例如，miR172、miR156和miR159影响植物的开花时间答:芥［50，61，62]。通过对番茄叶片、花蕾和果实的sRNA克隆，鉴定出3种不同的miR172序列[j]。61，62]，其中环状结构前体为miR172a、miR172b和miR172c [58，63]。尽管番茄基因组序列于2012年公布[64]，对番茄中mirna的研究是有限的。在这项研究中，我们注释了pre-miRNA序列(pre-miR172;番茄bac端序列_Mbo我(SL_MboI0036L22_T7_268826)/番茄WGS染色体SL2.40ch11) asSlmiR172a，与Itaya等人报道的预测序列相似[61]，并在35S启动子下过表达。转基因植物不仅影响开花拟南芥但水果的成熟也可能是通过与可能的目标基因的相互作用，SlAP2a［43]。

miR172 OE系的花同源性转化和早花

miR172转录本在番茄花蕾、心皮和雄蕊发育的早期阶段大量存在(图2)。1b)类似于c组花同源基因[50，65，66]。这种miR172的时间表达模式与拟南芥在发芽后不久，积累逐渐增加，直至开花[50，67]。番茄miR172的表达与花和果实发育的功能一致，可能与花器官身份有关拟南芥和金鱼草属植物通过调控ABC花发育模式中的基因[66，68]。在ABC模型中，转录因子基因包括三类花同源基因。这里我们证明了过度表达SlmiR172a在番茄中受影响的花型表现为萼片增大和萼片到花瓣的转化(图2)。4）.其他表型与转录丰度相关SlmiR172a(无花果。1A、b和附加文件1）.有趣的是，番茄萼片到花瓣的转化不同于用拟南芥miR172过表达，其中35S的积累驱动miR172表达导致表型类似于拟南芥ap2突变体包括异常和晚花[49，69]。此外，mir172的过表达具有抗性AP2导致AP2蛋白升高，并出现类似于黄花的缺陷花型ag)（无性生殖的)突变，包括花的确定性丧失，表明miR172下调AP2在花发育期间[49，70]。拟南芥B功能基因的过表达同样观察到萼片到花瓣的转化PISTILLATA（π) [71，72除了…之外绿色的花瓣在矮牵牛[73]。番茄的花发育表型ap2突变体之外SlAP2a在成熟过程中所起的作用至今还没有报道。因此，我们不能结论性地说，花的转移与过表达的SlmiR172a在番茄中是由抑制的结果SlAP2基因。有趣的是,西红柿TAP3和SlGLO1， B功能基因在其各自的突变体中指定花瓣和雄蕊的身份，也具有花瓣转化为萼片状结构和雄蕊转化为心皮状器官的特征[74，75，76]。

先前报道的激活标记显示miR172参与…拟南芥通过两个转录后抑制的花发育和花时控制AP2例如基因,TOE1和TOE2［48，50，77，78]。miR172受GIGANTEA（胃肠道)，但并非如此君士坦斯（有限公司)虽然有限公司是由胃肠道除了…之外光敏色素（体育和中一种（哭年代)。胃肠道介导的miR172通过调控开花地点（英国《金融时报》),TOE1［67，79，80]。过度的SlmiR172a在系统发育上，番茄诱导的开花时间比WT早4-5天，或早大约一片叶子(图2)。3.a, b).在转基因番茄中SFT（单花桁架)基因已被证明比野生植物更早地诱导开花[81，82]，而sft突变体延迟开花时间。考虑到这些数据，我们假设SlmiR172其靶基因控制着由SFT在光周期不敏感的番茄中表达，如光周期拟南芥。之前，我们报道过SlAP2b和SlAP2c带有a的基因SlmiR172-特异性完美互补结合位点(补充数据1)，虽然没有表型变化与抑制SlAP2b和SlAP2c无论是在花型规格还是开花时间上都进行了记录。因此，这些表型是由过表达的SlmiR172a可能反映了目标基因的功能冗余。

SlmiR172a的过表达反映了SlAP2a抑制的成熟效应

我们通过计算预测miRNA172靶向的是AP2基因家族。以前的研究拟南芥证实了miR172与玉米的相互作用AP2家族基因[48，49，50，53，83，84]。我们之前展示过SlAP2a转录本水平在果实成熟初期，而不是在花中，以及在乙烯调节和成熟中的作用[j]。42]。就像AP2家族基因ArabidopsiS和玉米，SlAP2a也含有一个miR172结合位点。

成熟的番茄果实通过基因表达调控代谢通量，积累类胡萝卜素，主要是番茄红素和β-胡萝卜素PSY1，PDS，ZDS,CYC-B基因(85，86]。SlAP2a抑制导致番茄红素减少，β-胡萝卜素升高，表现在橙子果实中PSY1和高CYC-B表达式[42]。水果色素沉着SlmiR172aOE线与SlAP2aRNAi [42，57，62，87β -胡萝卜素的含量显著增加。的确,SlmiR172a原厂13号线有相同的色素沉着SlAP2aRNAi和最强转基因表达系对番茄红素含量的影响最大(图2)。5，6，7）.在研究受miRNA影响的表型性状强度时，miRNA积累已被证明与miRNA过表达相关[88，89]。

我们进一步证明了SlmiR172a过度压抑SlAP2amRNA积累和SlmiR172aOE系在果实成熟过程中产生的乙烯是WT系的3-4倍，这与乙烯生物合成基因的表达增加一致ACS2和ACS4(无花果。8和9）.这种增强的乙烯与在SlAP2aRNAi细胞系[42]。果实成熟时间提前4-5天SlmiR172aOE比WT，同样类似SlAP2aRNAi(表1）.成熟——响应加速SlmiR172aOE与miR172的调控相似GLOSSY15（GL15)，以及拟南芥在那GL15基因在维持幼龄中起主要作用，而miR172诱导抑制GL15促进发育过渡[51，83，90]。

mir172诱导番茄靶mrna切割的鉴定

SlAP2基因家族成员是miR172在番茄中的靶点[55，58，91尽管这些相互作用中很少有功能特征超出了APETALA2/小块土地的基因,SlAP2a［42]。由于大多数植物mirna与其靶基因是互补的，mirna介导的切割可能是基因调控的主要机制[18，20.，92，93]。有趣的是，miR172在拟南芥下调AP2和AP2式(TOE1- - - - - -2)由翻译压抑[48，49，50，69虽然靶基因切割产物的大量积累被注意到。在这种情况下，由于AP2蛋白减少的反馈调节诱导，转录水平没有降低。

番茄miR172有五个预测的靶基因包括SlAP2a。我们对这些基因进行了5 ' -RACE PCR，并成功地鉴定了其中4个基因的裂解位点，包括SlAP2a。所有鉴定的裂解事件都发生在互补区的中间附近，并且与拟南芥miR172裂解位点(图2)10）.miR172至少有三种成熟的番茄同工型。利用改良的RACE PCR技术，我们验证了由SlmiR172a并且观察到SlAP2a转录水平SlmiR172aOE管线(补充图)S1A和附加文件1）.这些结果与引导靶基因切割作为主要机制是一致的SlmiR172作用，支持miR172引导靶基因切割[54]。然而,减少SlAP2mRNA inSlmiR172aOE线与中的观测结果形成对比拟南芥［39，48，49，50，60]，表明番茄miR172s主要通过卵裂调控转录，可能较少受到反馈调控的影响。

miR172可以被其他miRNAs控制的其他转录因子调控

SlmiRNA172a过表达影响果实的成熟SlAP2a。当我们研究关键基因(MADS-RIN,中国北车，HB1,也不)，我们发现mRNA的水平比对照组高出三倍中国北车突变体从成熟开始(1厘米果实后30天)就比WT多，但在成熟期没有变化rin，也不或Nr突变体(无花果。11和附加文件1）.SPL-CNR编码SBP-box (SQUAMOSA启动子结合蛋白样，SPL)转录因子中国北车epimutation镇压SlCNR表达与抑制成熟[36，94，95]。SlCNR以水果特异性的方式表达，在成熟开始时最高，跟踪SlmiR172在中国北车并建议SlmiR172在成熟过程中受到SPL-CNR和其他转录诱导剂的负调控。

SPL7是SPL家族的成员，结合GTAC基序，调控miR398、miR397、miR408和miR857的表达，这些基因也在缺铜条件下被诱导拟南芥［96，97]。镇压拟南芥由miR156调控的SPL3导致从营养期到花诱导的转变。SlSPL-CNR的同源物是AtSPL3（At2g33810)，并且在3 ' -UTR中包含miR156结合位点，这意味着SlSPL-CNR可以由SlmiR156在成熟。miR172转录本被显性基因下调Congrass1（Cg1)突变和两个串联miR156基因在玉米中的过表达，表明反向调控关系[98，99]。

像番茄这样的肉质水果的成熟是由一个复杂的多基因调控网络控制的，受许多内部和外部信号的影响。在此之前，我们报道了SlAP2a在成熟过程中，作为番茄果实成熟的负调节因子，调节乙烯的产生和类胡萝卜素的色素沉着。我们专注于鉴定靶向的mirnaSlAP2调控开花和果实成熟的基因。我们发现miR172可以抑制SlAP2a转录物积累和促进成熟通过调节乙烯和类胡萝卜素色素沉着。证明mir172a引导的切割SlAP2a转录本为这方面的成熟调控提供了分子机制，为肉质水果作物品质和营养价值的改良提供了候选遗传靶点。

miR172a OE载体的构建及植物转化

预测的pre-miR172序列的403-bp片段(补充数据1)从BAC克隆中扩增得到Mboi00361222 - t7用特异性引物PCR检测

(弗兰克-威廉姆斯5‘-GCGCGCTCTAGAGTATATATATGTACTTGGATTTGTA-3’,

启5“-GCGCGCGAGCTCGAACCCCAGTATATACAAAACCCT-3”)。

的片段miR172a前体经凝胶纯化，由Xba我和囊I，并在CaMV 35S启动子控制下克隆到转化二进制载体pBI121中。将转化的质粒载体导入农通过电穿孔将菌株LBA4404转化为WT番茄cv。AC，如所述[42]。

植物材料和处理

转基因植物和对照植物在康奈尔大学(Ithaca, NY, USA)的标准温室条件下种植。温室配备了加热、冷却和补充照明系统，植物也使用了缓释肥料。我们收集了不同类型和阶段的组织:L(叶)、F(花)、D20 (1cm果实后20天)、MG(成熟的青果)、B(破果)、B1(破果后1天)、B3(破果后3天)、B7(破果后7天)。由于对照系和转基因系的果实在1cm后的不同天数达到破断期，因此mg期对照系和转基因系分别在1cm后的33天和28天采集果实。通过标记1厘米(开花后7-8天)果实来测量成熟时间，并记录从1厘米到b期的天数。每个基因型至少25个果实用于本试验。开花时间是通过两种不同的测量来计算的(i)从播种到完全开花的天数，以及(ii)第一次开花后产生的叶片数量。

RNA分离及凝胶印迹分析

收集不同发育阶段的番茄果实，立即用液氮冷冻，- 80°C保存。总RNA分别从5株植物、营养组织和花的25个花和果实以及每个发育阶段的果实样本中提取，详见文献[One hundred.]。为了定量总RNA，使用NanoDrop ND-1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)。

RNA印迹分析，将总RNA 20 μg在含有7.5% (v/v)甲醛的1% (w/v)琼脂糖凝胶上分离，印迹到Hybond N膜(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)上，方法如下[42]。根据膜供应商的方案，在80°C下孵育2小时，然后预杂交3小时，并在65°C下杂交至³²p标记的随机引物DNA探针，如前所述合成[101]。杂交至少16小时，滤网在含有0.1%十二烷基硫酸钠的2X SSC中洗涤，然后在65℃下用含有0.1% SDS的1X SSC洗涤。信号强度通过使用Kodak X-OMAT-AR胶片(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)在−80°C下使用两个强化屏进行放射自显影。

为了进行miRNA分析，将50 μg的总RNA负载在20%聚丙烯酰胺/7 M尿素变性凝胶上，并印迹到Hybond N膜(Amersham Biosciences)上。寡核苷酸反义tomiR172a末端标记γ-³²P使用T4多核苷酸激酶(New England Biolabs, Osaka, Japan)在42°C下杂交到miRNA印迹，杂交缓冲液中含有5X SSC, 0.5% SDS, 50 mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)和5X Denhardt 's溶液[102]。滤网在2X SSC和0.1% SDS的混合物中在42℃下洗涤两次。如上所述，捕获信号强度。

乙烯和类胡萝卜素的测量

在不同的成熟阶段从每行收获25个果实，并将它们集中起来，使用配备火焰电离检测器的惠普HP 5890系列气相色谱仪测量乙烯水平和类胡萝卜素含量，如前面所述[103，104，105，106]。果实在测量乙烯前3小时收获，并在室温下储存以减少收获应力。整个水果密封在250ml密闭罐中，室温保存2小时，用于测量乙烯的产生，从室中取出1ml顶空气体，注入气相色谱仪(Hewlett- Packard 5890 series II;惠普(hewlett - packard)http://www.hp.com)配备火焰电离检测器和活性氧化铝柱。十(10)ppm乙烯作为标准(Airgas, Inc.;http://www.airgas.com)用于定量乙烯浓度，并按果实质量归一化。

类胡萝卜素提取和HPLC定量采用[104，105，106]。用600 μl四氢呋喃/甲醇和12.5 mg MgCO的混合物匀浆200 mg冷冻果皮_3..2H₂O.匀浆用自旋x型滤器旋转过滤，加入550 μl四氢呋喃重新提取。加入150 μl的25% NaCl，将类胡萝卜素分成325 μl的石油醚。提取液经蒸发干燥。将干提取物悬浮在甲基丁基醚:甲醇(500:475)中，通过注射器过滤器(GE Osmonics)过滤。高效液相色谱柱为C30反相柱(250 × 4.6 mm)，采用顶部高效液相色谱系统和PDA-100光电二极管阵列检测器(Dionex Corporation, CA, USA)进行分离。洗脱梯度运行5分钟至100%甲醇，20分钟至95% t-丁基醚，5分钟至95% t-丁基醚，最后5分钟将系统返回到100%甲醇。每次运行前，用100%甲醇平衡柱10分钟。使用纯化标准品和/或色素特异性吸光度光谱来鉴定特定色素。

修饰的5 ' RNA连接酶介导的RACE用于定位mRNA切割位点

RNA连接酶介导的cDNA末端(5 ' RACE)快速扩增使用Gene Racer Kit (Invitrogen, CA, USA) A进行少量修饰[20.]。利用热酚法从果实和花的不同发育阶段提取了大量的总RNA [j]。107]并用无rnaase的DNAase (RNeasy Mini Kit, Qiagen Sciences, MD, USA)处理。总RNA浓度采用ND-1000 v3.1.0 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE)进行定量。保利(A)⁺用Oligotex mRNA Midi Kit (Qiagen, CA, USA)从500 μM的总RNA中提取mRNA。

按照说明书(Gene Racer Kit, Invitrogen)用100 nM poly(A)连接RNA适配器、反转录和5 ' -RACE PCR。⁺信使rna。用Gene Racer 5’引物(5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’)和Gene Racer 3’引物(5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’)扩增非基因特异性的5’-RACE产物。使用Gene Racer 5’巢式引物和基因特异性引物进行基因特异性5’-RACE反应，步骤如下:PCR产物凝胶纯化，使用TA TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen)克隆到质粒载体上，使用Illumina平台测序。

半定量RT-PCR分析

RT-PCR分析采用上标III逆转录酶(Invitrogen)和oligo-dT引物，从3 μg的总RNA合成第一链cDNA。PCR采用SlAP2b-特异性引物(补充表S1)在94°C下进行1次循环，持续3分钟;30次循环，94°C 1分钟，50°C 2分钟，72°C 10分钟;其中以第一链cDNA作为模板。

在当前研究中使用和/或分析的数据集可根据通讯作者的合理要求提供。

ACO1：

1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶;

ACS2：

1-氨基环丙烷1-羧酸合成酶

AP2：

APETALA2

B:

断路器的水果

B1:

断路器后1天

B3:

断路器后3天

B7:

破碎后7天

BAC:

细菌人工染色体

中国北车：

无色non-ripening

有限公司：

君士坦斯

哭：

中一种

CYC-B：

番茄红素-β环化酶

D20开头:

1厘米果实后20天

DCL:

Dicer-like

DXS1：

1-脱氧-d -木质素糖5-磷酸合酶

F:

花

英国《金融时报》：

开花地点

女朋友：

绿色的肉

胃肠道：

GIGANTEA

gl15：

glossy15

Gr：

Green-ripe

HB1：

Hd-zip同源盒蛋白-1

高效液相色谱法:

高效液相色谱法

李:

叶

RIN：

成熟抑制剂

MG:

成熟的青果

microrna的:

微

ND:

NanoDrop

也不：

NON-RIPENING

Nr：

Never-ripe

OE:

超表达

PDA:

马铃薯葡萄糖琼脂

PDS：

八氢番茄红素desaturase

体育史:

光敏色素

π：

PISTILLATA

pri-miRNA:

原转录RNA

PSY1：

植物烯合成酶

RISC:

rna诱导沉默复合体

RNA:

核糖核酸

SFT：

单花桁架

TOE1：

eat1目标

TOE2：

eat2的目标

WT:

野生

ZDS：

ζ-胡萝卜素desaturase

我们感谢我们实验室的所有同事提供了有益的讨论和技术援助。我们非常感谢编辑和审稿人对稿件的批判性评价，并为稿件的改进提供了建设性的意见。

本研究由韩国国家研究基金会(NRF)资助，由韩国政府(MSIT)资助(No.;NRF-2018R1A2B6001781)和美国国家科学基金项目IOS-1339287。

从属关系

1. 顺天国立大学农业教育系，韩国顺天

   郑美英和李道镇

2. 孟加拉国农业大学遗传与植物育种系，孟加拉国迈门辛格2202

   Ujjal Kumar Nath

3. 博伊斯汤普森植物研究所，康奈尔大学，伊萨卡，纽约，美国

   Julia Vrebalov, Nigel Gapper和James Giovannoni

4. 庆北大学园艺系，韩国大邱

   Je Min Lee和Chang Kil Kim

5. 美国农业部/农业研究处，罗伯特·w·霍利农业与卫生中心，伊萨卡，纽约，美国

   詹姆斯Giovannoni

贡献

MYC进行了实验并分析了数据。UKN写了手稿。JV、NG、JML、DJL分析数据并修改稿件。JG和CKK计划，执行和监督实验，并严格修改手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到张吉金或詹姆斯Giovannoni。

伦理批准并同意参与

分析中使用的植物材料和种质按照美国康奈尔大学博伊斯·汤普森植物研究所的机构指南进行维护。本文不包含任何人类或动物的研究，也不涉及任何濒危或受保护的物种。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。

出版商的注意

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