中国小麦地方品种耐缺磷性状的表型和遗传变异

背景

缺磷是影响全球作物生产的一个主要限制因素。为了解中国707个地方小麦品种在施磷(AP)和不施磷(NP)处理下的15个耐磷性状的遗传变异。共使用18594个单核苷酸多态性和38678个多样性阵列技术测序标记检测AP和NP下的标记-性状关联。

结果

从707个中国小麦地方品种中筛选出前10个极耐基因型和后10个极敏感基因型，进行育种和遗传分析。利用CMLM和SUPER方法对13个性状进行分析，共得到55个显著标记(81个标记-性状关联)。它们分布在1A、1B、2A、2B、2D、3A、4B、5A、5B、6A、6B、6D、7A和7B染色体上。考虑到连锁不平衡衰减距离，在AP和NP条件下分别检测到25个和12个数量性状位点(QTL)，其中9个特异于NP。

结论

极耐磷的地方品种可作为耐磷品种的选育材料。该QTL可用于小麦的分子标记辅助选择。本研究结果为耐磷植物的遗传分析提供了新的思路，为耐磷品种的选育提供了参考。

磷(P)是植物生长所必需的大量营养素，但它也是全球作物产量的主要限制因素[1，2］．土壤中全磷含量丰富，但大部分不能被植物吸收。磷很容易与金属阳离子形成复合物，土壤中的微生物将磷转化为有机化合物[3.，4，5]，从而使土壤中没有磷。磷肥通常被用来解决这个问题。然而，大量施用化肥会引起肥料渗入水系的环境担忧，并加速不可再生磷酸盐资源的耗尽[6，7］．据估计，全球磷资源将在本世纪末耗尽[2，8］．因此，培育耐磷品种对可持续农业具有重要意义。

小麦(小麦L.)是最早被驯化的作物植物之一，在10000年前的陶器时代之前的新石器时代，近东新月沃土[9，10］．目前，小麦是种植最广泛的粮食作物，约占人类消耗热量的20%。磷是小麦生长发育的重要限制性营养物质。全球范围内，小麦产量受到磷缺乏的严重限制[11，12］．因此，耐磷小麦的发展至关重要。长白基因型是小麦改良的重要资源。中国小麦地方品种已被证明富含耐或抗非生物和生物胁迫的基因和等位基因[13，14，15，16］．因此，筛选耐磷基因型，了解中国小麦地方品种耐磷的遗传基础，对耐磷小麦品种的选育具有重要意义。

利用小麦双亲本群体的连锁作图技术对耐磷缺陷性状的遗传控制进行了广泛的研究。利用该方法已成功鉴定出耐磷缺陷性状的QTL [17，18，19，20.］．另一种可能对改善缺磷耐受性有更大潜力的方法是在一个大的遗传多样性面板中识别由于不同选择压力造成的等位变异。通过全基因组关联研究(GWAS)，这种自然等位变异的磷缺乏耐受性已确定拟南芥［21),山羊草属tauschii［22,大豆23，但小麦还没有。因此，我们的目标是通过GWAS在小麦中识别这种等位变异。这些发现将为提高磷缺乏症的耐受性提供新的见解。

小麦生长前期的磷营养对小麦最终产量至关重要。生长早期缺磷会导致分蘖发育和头部形成的大量减少，即使后来提供了充足的磷，植株也无法从中恢复[24，25］．因此，了解耐磷苗期的遗传控制，开发耐磷品种具有重要意义。本研究以707个地方小麦品种为研究对象，研究了15个耐磷缺陷性状苗期的表型变异。然后对这些地方品种进行耐磷性评价，为今后选育耐磷小麦品种寻找合适的种质资源。最后，我们使用57272个多态性标记进行了GWAS，以确定标记-性状关联(MTAs)。

表型变异

为了研究施磷(AP)和不施磷(NP)条件下707个地方小麦品种对缺磷的表型响应差异。研究了15个性状在苗期缺磷的影响及其遗传变异。各性状在基因型间均存在显著差异(p< 0.001;方差分析;表格1)．磷处理对各性状(p< 0.001;表格1)．除干根冠比(DRS)、鲜根冠比(FRS)和根径(RD)外，缺磷对几乎所有性状均有负面影响。AP处理的变异系数为1.22 ~ 49.09%，NP处理的变异系数为1.21 ~ 48.40%2)．

广义遗传力(H²AP下，根叉(RF)的遗传率为0.16 ~ 0.85,NP下，根尖(RT)的遗传率为0.15 ~ 0.772)．RD在两种条件下均表现为低遗传力。Shannon-Weaver多样性指数(H”)，各性状在AP和NP处理下的多样性分别为0.28 ~ 0.86和0.28 ~ 0.87;除RT外，其他性状都表现为中等到高的多样性(Table2)．

相关分析

AP下，相关系数范围为0.018 ~ 0.976(表33.；AP下的相关关系如下对角线)。除DRS、FRS和RD外，15个性状间均呈显著正相关。DRS与茎干重(SDW)、鲜重(SFW)、茎长(SL)、茎根总长(TL)呈显著负相关。DRS与其他性状呈显著正相关，与RD、RF、rt不显著相关，FRS与SL呈显著负相关，与其他性状呈显著正相关。除DRS和根体积(RV)外，RD与FRS呈显著正相关，与其他性状呈显著负相关。

在NP条件下，相关系数范围为0.033 ~ 0.9653.；在NP下的相关性显示在对角线上)。除DRS、FRS和RD外，其他性状均呈显著正相关。DRS与RD、SDW、SL呈显著负相关，与除SFW外的其他指标呈显著正相关。FRS与RD、SFW、SL呈显著负相关，与其余呈显著正相关。除根系干重(RDW)、RV、SDW和SFW外，RD与其他性状均呈显著负相关。

AP和NP处理下，根表面积(RSA)和总根长(TRL)的相关性最高。除DRS、FRS和RD外，所有对相关性均为显著正相关。在6个根系形态性状(RF、根长(RL)、RSA、RT、RV和TRL)中，相关性呈中至高正相关。另一个根系形态特征RD与RF、RL、RSA、RT和TRL均呈负相关。

主成分分析

采用相对性状值进行PC分析。前3个pc累计解释表型变异量(PVE)为82.98% (Table4)．PC1解释了57.84%的表型变异。除DRS、FRS和RD外，其他性状都是PC1特征向量内的重要因子。PC1代表植物生物量和根系构型，因此可以定义为生物量和根系因子。PC2(本征值为2.53)解释16.84%的表型变异。在PC2的特征向量中，DRS和FRS是影响缺磷条件下根系和地上部磷吸收的重要因子。因此，PC2可定义为根冠比因子。PC2的TL、SL、SFW、SDW和RT的相对值均为负，表明增加根冠比会降低TL、SL、SFW、SDW和RT。PC3的特征值为1.24，其中RD是唯一重要的表型变异因子，解释了8.29%的表型变异。PC3的TL、RL、SL、FRS、DRS、TRL和RT的相对值为负，表明RD的增加将对应TL、RL、SL、FRS、DRS、TRL和RT的减少。

耐小麦基因型的筛选

采用加权方法[26]，综合价值(年代计算各性状的耐磷指数(PDTI)，以评价小麦对缺磷的耐受性。极高或极低的树种年代值列在附加文件中1S1:表。一个高年代值表示高容错。小麦地方品种分为−2.16(加入号AS661384)至2.52(加入号AS661809) 3类(图6)。1)．第一组共有173份(年代≥0.5;归类为高耐受性)。组2(−0.5≤年代< 0.5;中等耐受性)包括353个品种。其余品种(年代< 0.5)为敏感。到达更高的年代值也有更高的PDTI(附加文件1:表S1)。说明这两种指标均可用于缺磷小麦地方品种的筛选。

分子标记和群体结构

剔除数据缺失标记> 20%和小等位基因频率(MAF) < 0.05的标记后，保留57,272个多态性标记。基于“中国春天”物理图谱v1.0，共定位了21503个A基因组、25365个B基因组和10404个D基因组。

基于delta-K模型[27]时，K = 5的delta-K值最高。地方比赛分为五个小组，分别为207场、185场、128场、105场和82场。第一亚群包括新疆冬春小麦带的所有地方种族，主要来自北方冬小麦带和黄淮兼性河谷的地方种族。第二亚群主要由长江中下游秋种春小麦带和南方秋种春小麦带的地方品种组成。第3亚群主要由西南秋种春小麦带的地方品种，以及黄淮流域兼性小麦带和长江中下游流域秋种春小麦带的部分地方品种组成。第4亚群主要包括来自青藏高原春冬小麦带的地方品种以及来自西南秋种春小麦带、北方春小麦带和西北春小麦带的部分地方品种。第5亚群是一个混合群，包括来自东北春小麦区和其他小麦区部分地区的大部分地方种族。

AP和NP处理下幼苗性状有显著位点

利用TASSEL的压缩混合线性模型(CMLM)，对57272个标记进行GWAS分析，检测AP和NP下15个性状的显著性标记。Bonferroni-corrected阈值(−log . log .₁₀^（p）≥4.76，α = 1)进行显著性标记。在AP处理下，13个性状(PVE: 2.60 ~ 4.94%)检测到61个显著标记，代表82个MTAs(附加文件2:图S1及附加文件3.:表S2)。这61个显著标记分布在1A、1B、2A、2B、2D、3A、4A、4B、5A、5B、5D、6A、6B、6D、7A和7B染色体上。在NP条件下，10个性状(PVE 2.66 ~ 5.40%)检测到22个显著标记(34个MTAs)2:图S1及附加文件3.:表S2)。这22个标记分布在染色体2D、3A、3D、4B、5B、6A、6B、7A和7B上。

利用基因组关联与预测集成工具(GAPIT)中逐步排他性关系(SUPER)方法下的混合线性模型的解算，对TASSEL的结果进行了GWAS验证。与TASSEL结果比较，TASSEL鉴定的55个显著标记(81个MTAs)在GAPIT中被SUPER法确认。这55个显著标记被用于进一步分析。基于连锁不平衡衰减距离，我们认为5.98 Mb区域内的显著标记构成了单个QTL [28］．由此可知，AP处理下检测到25个QTL, NP处理下检测到12个，两者处理下检测到3个QTL。因此，9个QTL是NP特异性的。

在AP条件下，共鉴定出12个性状的25个QTL，分布在1A、1B、2A、2B、2D、3A、4B、5A、5B、6A、6D、7A和7B染色体上（额外的文件3.:表S2)。RT中，根鲜重(RFW)、DRS、RF、RSA、SDW、TRL、SL、RDW、RL、RV和TL的QTL数分别为7、6、5、5、3、3、3、2、1、1、1和1个。在NP条件下，共鉴定出10个性状的12个QTL，分布在1A、1B、2A、2B、2D、3A、4B、5A、5B、6A、6D、7A和7B染色体上（额外的文件3.:表S2)。对于RT、RV、SDW、RDW、RF、RFW、RSA、SFW、SL、TRL，我们分别鉴定了6、2、2、1、1、1、1、1、1、1、1、1和1个QTL。

在两种条件下均鉴定出3个QTL: QTL- 2d -3、QTL- 4b -2和QTL- 7a -1（额外的文件3.:表S2)。这3个QTL分别位于染色体2D、4B和7A上，在两种条件下均得到稳定表达。因此，9个QTL是NP条件特有的。这表明这些QTL仅发生在缺磷胁迫下。

GWAS显示多效性。共鉴定出7个多性状QTL。QTL-2D-3在NP条件下与RDW、RF、RFW、RSA、RV和TRL 6个性状相关，在AP条件下与RF、RFW、RSA、RT、SDW、TRL 6个性状相关，在NP条件下与RT相关。相关分析表明，6个性状之间的相关系数为0.578 (SDW与TRL之间)~ 0.976 (RSA与TRL之间)。

根系作为植物吸收和利用磷的重要器官，已被用于筛选耐磷小麦基因型[29］．苗期往往决定了成熟期的性状，且两个阶段的性状密切相关。田间试验中检测到的与氮吸收率相关的QTL与温室水培中与幼苗性状相关的QTL共定位[30.］．此外，Chr. 2A和6A的根毛QTL也与产量相关性状相关[31］．以上结果表明，苗期的养分吸收和利用会影响成熟期的表型。各性状对缺磷的响应差异显著。大多数表现为中等至高遗传力(表2)，揭示了它们在我们下一次全球气候变化研究中分析的潜力。大部分性状呈显著相关，其中6个根系性状呈中度至高度相关。在之前的研究中也报道过小麦根苗性状之间的高相关性[32，33，34，35］．这些研究表明，幼苗根系性状是一起遗传的，很难独立选择其中一个性状。

在这里，前三个pc解释了80%以上的表型变异，并包括所有测试性状(表4)．第一个PC主要反映了12个性状的贡献(除DRS、FRS和RD外)。第2个pc和第3个pc分别反映根冠比和RD的贡献。结果表明，根冠比的增加导致地上生物量的减少。NP处理下的DRS、FRS和RD均高于AP处理，其他性状均低于AP处理。根冠比的增加在应激反应中已经被报道过[28，36］．植物可以通过增加根冠比来促进对磷的吸收和利用，以应对低磷胁迫[37］．“中国春”对缺磷敏感(年代=−1.16)，与前人研究一致[19，26，38］．说明利用S值筛选小麦耐小麦基因型是一种可靠的方法。最后，选择了10个极敏感和10个极耐的地方品种进行遗传分析和选育耐种1:表S1)。

SUPER方法是一种用于鉴定QTL的高效GWAS方法，它提取了一小部分单核苷酸多态性(SNPs)，并将它们用于FaST-LMM [39］．该方法保留了FaST-LMM的计算优势，提高了统计能力[39］．在CMLM检测的116个mta中，SUPER法共检测出81个(69.83%)。与CMLM相比，使用SUPER识别的mta数量大大增加(附加文件2:图S1)。然而，从不同算法的分位数-分位数(Q-Q)图显示，CMLM拟合优于SUPER(附加文件2:图S1)。先前的研究也显示了类似的结果[40，41］．

7个QTL均存在多效性。不同高度相关性状的QTL可能位于同一染色体区域[42］．结果发现，除DRS、FRS和RD外，所有性状在两种条件下均显著正相关。6个根系形态性状呈中度至高度相关(表2)．在以前的研究中已经观察到多效性[19，32，33，43］．QTL-2D-3位于Chr. 2D 186.65 Mb，在NP下与RDW、RF、RFW、RT、TRL、RSA和RV相关，在AP下与RF相关。在之前的研究中，在Chr. 2D上发现了与p利用效率相关的QTL。44］．我们发现，QTL-7A-1位于Chr. 7A的52.03 Mb，在AP下与RT和RFW相关，在NP下与RT相关。这表明QTL-7A-1在AP和NP条件下调控RT，在AP条件下调控根系发育。此前的研究发现，Chr. 7A可能在磷缺乏的反应中发挥重要作用[44，45］．

对应用磷和不应用磷的707个中国地方小麦品种的15个性状进行了评价，选择了10份极耐和极敏感材料作为进一步研究的种质材料。AP和NP共鉴定出25个QTL, 12个QTL，其中9个是NP特异QTL。共有7个QTL显示多效性，其中几个QTL已被鉴定。本研究结果为耐磷植物的遗传分析提供了新的思路，为耐磷品种的选育提供了参考。

植物种质资源

本研究使用的707份材料来自一个小麦地方种族核心集合[46源自中国10个农业生态区(补充文件4：表S3)。

温室实验和表型数据收集

所有地方品种均在四川农业大学小麦科研究所的温室水栽栽培。本研究采用完全随机设计，每次重复3次。温室环境、水培系统和表型数据收集如前所述[26，47，48］．简单地说，AP和NP处理包含了改良的霍格兰营养液[26，47，48，49含或不含NH₄H₂阿宝₄(分别为1更易/ L)。2组幼苗分别在AP下生长3 d，在AP和NP下生长12 d。每4天更换一次溶液。生长12天后，按照我们之前描述的方法收集所有性状的表型数据[28］．

表型数据分析

为了消除环境影响，在SAS中使用MIXED程序对三个重复的最佳线性无偏预测(BLUP)值进行分析[50］．每个性状的BLUP值被用来确定描述性统计，进行方差分析检验，并获得H”和Pearson相关系数，使用IBM SPSS Statistics for Windows 20.0 (IBM公司，芝加哥，伊利诺伊州，美国)。的H²是用公式计算的吗H²=V_G/ (V_G+V_E/r),V_G为基因型方差，V_E为环境方差，r为重复次数[51］．为了筛选p -不足-耐受，我们使用加权方法获得年代各长白基因型值。的年代值是用下面的方法计算的\(S={\sum}_{i=1}^k ri Yi/{\sum}_{i=1}^k ri \)［26］．

基因分型和群体结构分析

采用CTAB法提取基因组DNA。通过双酶法构建基因分型测序文库(96-plex) [52]，并在Illumina HiSeq 2500系统上进行测序。使用Tassel管道完成SNP调用[53］．SNP的物理距离基于中国春季参考序列v1.0 [54］．去除没有物理距离的snp。采用连杆不平衡k数邻域imputation方法提高imputation精度[55］．最终保留18,594个snp，缺失数据≤20%，MAF≥0.05。此外，我们之前研究中的38678个DArT-seq标记也被用于GWAS [46］．

使用structure 2.3.4评估种群结构，实现基于模型的贝叶斯聚类分析[56］．根据混合模型，以10000个重复的烧伤组和10000个重复的MCMC组估计K = 1 ~ K = 10的群体遗传聚类。每个K设置5次。使用STRUCTURE HARVESTER确定最佳K值[57实施埃文诺方法[27］．5次重复实验的最佳对齐方式是使用clusterpp [58］．

GWAS

总共有57272个标记(18594个SNP标记和38678个DArT-seq标记)用于GWAS，使用TASSEL 5.2.60 [59］．使用压缩混合线性模型检测标记-性状关联[60，61)与问矩阵和亲缘矩阵作为协变量，由TASSEL v5.2.60。利用SUPER法对TASSEL v5.2.60的显著性标记进行了鉴定[39]在政府资讯科技署[62]已在R 3.6.3中实施[63］．利用TASSEL和GAPIT鉴定的显著性标记进行进一步分析。基于bonferroni更正p-value threshold α = 1[62-64]，设置显著标志的阈值为-log10(p) = 4.76。使用R 3.6.3[绘制GWAS结果的Manhattan和Q-Q图。63正如我们之前的研究[28，46］．

在当前的研究中使用和/或分析的数据集可从通信作者在合理的要求。在这项研究中使用的snp数据在ENA在https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/ERZ1309082(分析加入:ERZ1309082)。

记者:

应用磷

BLUP:

最佳线性无偏预测

CMLM:

压缩混合线性模型

DArT-seq:

分集阵列技术测序

DRS:

干燥的根冠比

FRS:

新鲜的根冠比

GAPIT:

基因组关联与预测集成工具

GWAS:

全基因组关联研究

H”：

Shannon-Weaver多样性指数

H²：

广义遗传

加:

轻微的等位基因频率

放在:

Marker-trait协会

NP:

不适用的磷

病人:

磷

PC:

主成分

PDTI:

说明培育宽容指数

通过:

表型变异解释

qq情节:

Quantile-quantile情节

QTL:

数量性状位点

理查德·道金斯:

根直径

RDW:

根干重

射频:

根叉

RFW:

根鲜重

RL:

根的长度

RSA:

根表面积

RT:

根技巧

房车:

根卷

SDW:

射干重

SFW:

芽鲜重

SL:

拍摄长度

单核苷酸多态性:

单核苷酸多态性

超:

逐步排他性关系下混合线性模型的求解

S值:

综合价值

TL:

茎和根的总长度

实验室:

总根长

作者感谢中国农科院李利辉博士提供的植物材料。

国家重点研发计划项目(2016YFD0101004和2017YFD0100900)，国家自然科学基金项目(31771794)，四川省科技厅优秀青年基金项目(2016JQ0040)，四川省科技厅关键技术研发计划项目(2016NZ0057)，成都市科技局国际科技合作项目(2015DFA306002015-GH0300008-HZ)。资助机构没有任何作用，但为这项研究提供了资金支持，包括实验设计、数据收集和分析以及手稿的准备。

作者指出

1. 林宇和陈光登对这项工作的贡献是平等的。

从属关系

1. 四川农业大学麦科研究所，成都温江611130

   林宇，杨锡兰，张正利，蒋晓军，吴方坤，石浩然，王庆，周坤玉，李彩霞，马健，郑友亮，魏玉明，刘亚西

2. 四川农业大学资源学院，成都温江611130

   Guangdeng陈

3. 河南科技学院生命科学与技术学院，河南新乡，453003

   海盐胡

4. 西南作物基因探索与利用国家重点实验室，成都温江611130

   郑友亮，魏玉明，刘亚熙

贡献

YL和GDC进行数据分析并起草稿件。HYH、XLY和ZLZ分别进行表型评价和关联作图分析。XJJ、FKW、HRS、QW、KYZ和CXL分别进行表型评价和数据分析。JM帮助起草了这份手稿。YLZ参与了研究的设计。YMW协调了研究，并帮助起草了手稿。YXL对本次研究进行了设计和协调，并对稿件进行了修改。所有作者已阅读并批准最终稿。

相应的作者

对应到媒体魏或桠溪刘．

伦理认可和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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