羊茅和黑麦草DNA重复序列的比较分析及一种新的黑麦草着丝元件的鉴定

背景

在世界范围内，牧草是家畜的重要食物来源。增加对它们基因组的了解可以加快培育质量更好、对生物和非生物胁迫具有更强抗性的新品种。最广泛种植的牧草是四倍体黑麦草(Lolium)和二倍体及六倍体羊茅(羊茅属）.在这项工作中，我们研究了5种羊茅和2种黑麦草以及1种羊茅和2种黑麦草的重复DNA序列及其对基因组大小的贡献。

结果

利用Illumina测序技术产生的部分基因组序列与RepeatExplorer管道进行全基因组比较分析。反转录转座子是7种牧草中最丰富的重复类型。Ty3/gypsy家族的Athila元素在羊茅和黑麦草之间的拷贝数差异最为显著。序列数据使长末端重复序列(LTR)元件Fesreba在所有物种的着丝粒区和(近)着丝粒区高度富集。结合Fesreba元件特异性探针的荧光原位杂交(FISH)和着丝粒组蛋白H3 (CENH3)抗体的免疫染色显示它们共定位，并表明Fesreba可能在着丝粒功能中起作用。

结论

对一组羊茅和黑麦草的重复组比较分析为它们的基因组组织和分化提供了新的见解，包括LTR元件Fesreba的组装。在羊茅和黑麦草的着丝区发现了一个新的LTR元素Fesreba。它可能在它们的着丝粒的功能中起作用。

禾本科植物是世界范围内家畜的重要食物来源，具有重要的生态环境功能。tribe Poeae是Poaceae家族中最大的部落，其最大的亚部落Loliinae的物种生长在一系列栖息地，包括湿地，干燥地区以及寒冷和温带气候的地区;有些甚至能很好地适应山区、北极和亚南极地区的极端条件[1]。Loliinae亚部落包括一个世界性的属羊茅属它的卫星属[2，3.]。羊茅属是豆科中最大的属，包含600多种，以及Torrecilla和Catalán [4]区分了其两种主要的进化路线:阔叶和细叶(图2)。1）.阔叶羊茅属种(以下简称“羊茅”)包括羊茅亚属，它产生了Lolium一种(以下简称“黑麦草”)，羊茅属的姊妹类群。1） [1]。草类的进化，包括Loliinae，伴随着频繁的多倍体和杂交事件，大约70%的禾本科物种是多倍体[6]。Loliinae的物种具有2.6 Gbp/1C至11.8 Gbp/1C的大基因组[7，8]。

这项研究的重点是来自Schedonorus亚属的物种，这是一个具有不同倍性水平的物种复合体[7，9其中包括广泛用于草料和草坪的重要物种。虽然有些梭梭属植物是二倍体，例如羊茅属pratensisHuds。(2n = 2x = 14多花黑麦草林。(2n = 2x = 14l为L. (2n = 2x = 14)，大多数种是异源多倍体[10，11]，包括四倍体f . glaucescens木香。(2n = 4x = 28f . maireiSt. Yves (2n = 4x = 28)和六倍体f .季Schreb。(2n = 6x = 42f . gigantea(l)斯德。(2n = 6x = 42) [3.，11]。羊茅比黑麦草对非生物胁迫的耐受性更强，为牲畜提供高质量的饲料，特别用于草坪种植。黑麦草产量高，营养价值高，多作为牧草栽培。已经开发了羊茅和黑麦草的人工属间杂交品种，以结合这两个属的最有利特征[12，13，14]。

虽然小雪草和黑麦草已经被深入研究，但它们的进化和大多数多倍体代表的起源仍然不清楚[11，15，16]。与其他具有大基因组的物种一样，羊茅和黑麦草的核基因组包括大量不同的重复DNA序列[17，18]。它们在基因组中的扩增，伴随着种间杂交和多倍体化，扩大了基因组的大小[19，20.，21，22，23，24]。然而，这些过程可能已经被基于重组的机制所抵消，这些机制已经移除了核基因组的大部分[25，26，27]。

重复的DNA元素可能在核基因组中扮演不同的角色。串联组织的核糖体RNA基因和端粒序列分别是核仁组织区和染色体末端的关键组成部分。着丝体区域拟南芥，Brachypodium水稻和玉米部分是由长约130 bp的特定卫星dna形成的[28，29，30.，31]，而在包括谷类在内的其他植物物种中，这些区域是由含有色域的Ty3/gypsy反转录转座子的大块形成的[29，32，33，34]。在f . pratensis，一个假定的优先定位于着丝体区域的长末端重复序列(LTR)元件已被确定[35]。除了阐明染色体结构域的分子组织外，核基因组重复部分的表征还有助于细胞遗传标记的开发[21，35，36]。重复DNA序列也被广泛用于研究遗传多样性以及基因组进化和物种形成过程[37，38，39，40]。

本研究的主要目的是阐明包括天然多倍体种在内的近缘陆地禾本科植物的重复景观及其对基因组大小和基因组分化的影响。我们在10种代表性的羊茅和黑麦草的核基因组中鉴定了重复DNA序列。我们对重复DNA序列进行了全局分析，并在部分Illumina测序后表征了它们的丰度和可变性。此外，我们鉴定并组装了一个LTR元件的DNA序列，该元件在所有10个基因型的着丝粒和(近)着丝粒染色体区域高度富集。着丝粒特异性组蛋白H3变体CENH3与LTR元件的共定位表明其在着丝粒功能中的作用。

基因组大小估计

对碘化丙啶染色的细胞核进行流式细胞分析以估计核DNA含量(图2)。2）.由于所分析物种之间的基因组大小差异较大，因此使用了两个内参标准:Pisum一简历。Ctirad (2C = 9.09 pg DNA) [41),Secale cereale简历。Dankovske (2C = 16.19 pg DNA) [41]。所有相对DNA含量直方图均为两个优势峰，分别对应于样品和标准品的G1核。由此测定的2C核DNA含量范围为5.32 pg / inl . multiflorum场均20.17分f . gigantea。单倍体基因组(1Cx)的大小为2.43英寸f . mairei到3.36磅f . gigantea(表1）.其余代表性的羊茅和黑麦草的1Cx大小相似(~ 2.7 Gb)。

重复DNA序列的重复组成及比较分析

通过RepeatExplorer管道进行种间比较、重建和主要重复序列家族的量化[42]。该过程包括将所有被分析物种的同源重复家族分组在同一集群中，促进了单个重复元件的组装，鉴定和定量。

在所有材料中，LTR逆转录因子是核基因组中最丰富的成分(表2)2,无花果。3.）.Ty3/gypsy元素的丰度是Ty1/copia反转录转座子的4倍以上(表1)2）.小雪草和黑麦草在拷贝数上的最大差异是来自阿齐拉支系的LTR元件。而两者的核基因组Lolium该元素丰富的物种占其基因组的~ 25-30%，而同源的Athila元素仅占羊茅核基因组的~ 5-7%(表5)2）.相当大一部分基因组为未分类的LTR序列，这表明独特的LTR序列频率较高。DNA转座子和长穿插核元件(LINE)的拷贝数较低，串联重复序列占基因组序列的1.5% ~ 8%以上(表1)2,无花果。3.）.

与RepeatExplorer的比对分析表明，大部分同源重复家族的聚类都包含来自所有材料的reads，并且在羊茅和黑麦草中存在大量相似的序列。在雪中，f . mairei和f . glaucescensDNA重复序列相似性最低。黑麦草DNA重复序列的组成和丰度高度保守。串联组织重复序列是所研究的羊茅和黑麦草中差异最大的元素，其中一些重复序列是物种特有的(图2)。4、附加文件1:表1)。除了串联重复序列外，一些小的序列簇只包含来自少数物种的reads。羊茅和黑麦草内部和之间的大多数重复元件的物种特异性变异只有在使用SeqGrapheR对单个重复簇进行详细分析后才能确定(图2)。5a - c)。详细的分析显示，存在物种特异性DNA序列，可用于开发分子和细胞遗传学标记。

为了证实硅测定的差异，我们使用Southern杂交分析了选择的重复DNA元素。我们为那些似乎具有物种特异性变异的DNA重复序列设计了特定的探针。在CL1簇中重建的Ty3/gypsy Athila元件的探针显示，羊茅和黑麦草之间的拷贝数差异最大(表1)2)对黑麦草基因组DNA的杂交信号较强，而对羊茅基因组DNA的杂交信号不强或较弱(图2)。5d).同样，在CL38簇中重构的Ty3/gypsy Athila元件的探针，大部分包含羊茅属序列读取(图2)5b)仅用羊茅基因组DNA提供强可见信号(图2)。5e).最后，用探针对CL20中鉴定出的Ty3/gypsy ogrea - tat反转录转座子进行Southern杂交。该探针由代表雪羽的结构设计而成(图2)。5c)，在所有分析的羊茅上提供强杂交信号，在黑麦草上提供低强度杂交信号(图2)。5f).一般情况下，Southern杂交得到的信号强度与计算机识别的拷贝数相对应。

着丝粒组成

利用Illumina测序技术获得的部分基因组序列数据，可以重建所有10份羊茅和黑麦草材料中几乎完整的着丝粒LTR元件。对这种名为Fesreba的元素的详细表征证实，它属于Ty3/gypsy Chromoviridae谱系。其逆转录酶(RT)结构域的系统发育分析显示与Cereba元件密切相关(图2)。6)，早前在大麦(大麦芽） [43]。

Fesreba的RT区探针和LTR区探针的Southern杂交[j]35]显示它们存在于本研究中包括的所有羊茅和黑麦草中(附加文件)2:图S1)。相似的杂交模式表明，这些物种的Fesreba重复DNA元件之间存在序列保守性。结果表明，Fesreba在DNA序列水平上具有较高的相似性(Fesreba的大多数丰富拷贝在羊茅和黑麦草内部和之间的DNA水平上具有至少92%的相似性)，但在黑麦草中丰度较低。为了确认Fesreba拷贝数的差异，我们使用液滴数字聚合酶链反应(ddPCR)对RT结构域和LTR序列进行了定量分析。结果证实，羊茅中Fesreba的拷贝数比黑麦草高两倍(附加文件)3.表2)。该分析还表明，分析的大多数基因型中，Fesreba的LTR区拷贝数是其编码区拷贝数的5至50倍3.表2)。

为了确认Fesreba在着丝粒染色体区域的优先定位，我们使用来自其RT区域和LTR区域的探针对有丝分裂中期板进行了荧光原位杂交(FISH)。在所有的羊茅和黑麦草中，这两个探针都优先定位于所有染色体的着丝粒区域(图2)。7）.尽管RT结构域的杂交信号几乎只在着丝粒区域被观察到，但来自非编码LTR区域的探针在着丝粒和/或着丝粒周围区域产生了更强的信号，在染色体臂上产生了较弱的信号f . pratensis［35]。Fesreba染色体远端LTR部分的弱信号表明，在整个基因组中存在独特的LTR，并且与Fesreba的LTR非编码部分相比，其编码序列的拷贝数更高。

除了本研究中包括的羊茅和黑麦草外，FISH还使用相同的探针在相关禾草物种的有丝分裂中期板上进行了检测，包括燕麦、大麦、黑麦、面包小麦和小麦山羊草属tauschii。RT编码域的高度同源性使其在所有物种中都能成功地原位定位。然而，Fesreba LTR区的探针只提供了可见信号答:漂白亚麻纤维卷(附加文件4:图S2)。最后，用着丝粒特异性组蛋白H3变体CENH3进行免疫染色[44]将FISH与Fesreba的RT域和LTR区探针相结合，在所有研究的羊茅和黑麦草中发现了重叠的信号(图2)。8、附加文件5:图S3)。

由于基因组冲击，多倍体物种的1x大小通常(但并非总是)低于它们的祖先[25，45]。在这项研究中，我们进行了重复原子的比较分析，并分析了DNA重复序列对基因组大小的影响羊茅属和Lolium倍性不同的种。该集合由六倍体组成f .季无性系种群。季和f . gigantea;四倍体f . glaucescens和f . mairei;还有人工的同源四倍体f . pratensis简历。Westa,l . multiflorum简历。水户市,l为简历。海王星在繁殖计划中发展。我们使用流式细胞术估计核DNA数量，正态性检验证实数据集具有正态分布。我们的结果表明六倍体可能发生基因组变化f .季四倍体黑麦草与其可能的祖先相比。虽然天然多倍体的1x大小存在差异f .季以及它可能的父母(f . pratensis和f . glaucescens)是小的，它们在统计上是显著的(P< 0.01)。多倍体后获得的四倍体黑麦草品种也是如此。基因组缩小被检测到的情况下f .季(期望值与估计值相差约2%)和四倍体l为(降低~ 1%)。在四倍体品种l . multiflorum，检测到基因组大小略有增加(~ 4%)，与Kopecký等相对应。[8]。多倍体后获得的四倍体羊茅品种，其1Cx值差异无统计学意义(P> 0.01)。

DNA反转录转座子是植物核基因组变异的主要贡献者[24，46，47]。已经开发了各种方法和工具来研究核基因组的这些重要部分，其中之一是RepeatExplorer，它有助于从头重复识别和表征[42，48]。该管道使用基于图的聚类和分析下一代测序数据来重建和表征特定物种的DNA重复序列，或比较不同基因型的DNA重复序列组成[23，24，49，50，51]。该管道在多样性研究中经常用于重建DNA重复序列，为重复序列屏蔽创建重复序列数据库[19，46，48]，并鉴定适合作为分子细胞遗传学探针的串联组织重复序列[35，51，52，53]。

我们的研究表明，Ty3/gypsy元素对羊茅和黑麦草基因组大小的影响最大。Ty3/gypsy元素也丰富禾本科品种，包括小麦、水稻、玉米和大麦[8，54，55，56]。在大麦中，大约50%的基因组由15个高拷贝转座元件(TE)家族组成，其中Angela谱系(Ty1/拷贝家族)的元件最为丰富，占基因组的近14% [56]。Ty3/gypsy超家族的数量是Ty1/copia超家族的1.5倍[56]。

羊茅属和Lolium属包含密切相关的物种复合体，因此在本研究中观察到DNA重复序列的高度同源性。主要的区别在于拷贝数。在LoliumTy3/gypsy Athila LTR逆转录因子占物种核基因组的~ 25%，而在雌性中占四倍体核基因组的~ 0.7%f . glaucescens和f . mairei在分析的其他样本中，这一比例约为6%。这表明阿西拉的爆发与LTR元素有关Lolium物种形成。te的激活和整合(例如，由于环境变化)可能导致Athila元素以物种特异性的方式快速爆发[46，47，57]并影响进化和物种形成[46，58]。在某些物种中，谱系特异性逆转录因子数量的快速增加也会导致基因组显著扩增[24，58，59，60]，这在我们研究的羊茅和黑麦草中没有观察到。

在这项工作中鉴定的物种特异性DNA元件由串联组织重复序列表示(附加文件)1:表1)。在其他植物物种中也发现了独特的串联重复序列，由于它们的属或种特异性，它们已被广泛用于分子细胞遗传学(例如，使用FISH识别染色体)[61，62，63，64]。串联重复序列最初鉴定于f . pratensis染色体4F可用作FISH的探针来鉴定物种的单个染色体[18，35及其栽培品种的比较核型分析。目前的工作导致鉴定了其他假定的串联组织重复序列，属或种特异性(附加文件1:表1)。这些观察结果扩大了其他羊茅和黑麦草种染色体比较核型和鉴定的潜在细胞遗传学标记的数量。

尽管基因序列f . pratensis染色体4F显示了相对较多的串联重复序列，它们都不定位于染色体着丝粒区域[18，35]。然而，有丝分裂中期染色体上其他类型的DNA重复序列的定位显示，一个未表征的DNA元件CL38优先定位于着丝粒区域f . pratensis染色体(35]。本研究重建了CL38重复序列的全部同源DNA元件，并明确了其性质。其编码结构域的系统发育分析(图2)。6)证实了与Ty3/gypsy Chromoviridae谱系的其他植物着丝体元件(如Cereba-like元件)的密切关系[43]。Hudakova等人的研究表明，大麦染色体的着丝粒区优先定位于Cereba元件。33]，随后对Ty3/gypsy家族玉米着丝粒逆转录转座子谱系中的着丝粒特异性元件进行了更复杂的研究[20.，34]。这些研究暗示了te在结构水平上的作用及其对着丝粒结构的影响。李等。[65]表明，Cereba元件与组蛋白H3变体CENH3密切相关，后者在着丝粒功能中起作用。着丝粒特异性元件Fesreba的共定位，在这项工作中与组蛋白CENH3重建(图3)。8、附加文件5(图S3)，表明该元素在羊茅和黑麦草着丝粒的功能中也起作用。

对10种羊茅和黑麦草的基因组进行部分测序，结果显示逆转录转座子的重复序列丰富。这些比较重复组分析增加了对羊茅和黑麦草基因组组织的认识，并证实了它们之间的密切关系羊茅属和Lolium。最显著的差异是观察到的阿西拉元素，它的丰度是它的5倍Lolium比羊茅属。高度分化的DNA重复序列以串联组织重复序列为代表，这是物种特异性细胞遗传标记的候选序列。除了串联重复序列外，还鉴定了羊茅和黑麦草内部和之间大多数重复DNA序列的其他物种特异性变异。我们组装了一个几乎完整的LTR元件Fesreba，发现它在所有物种的着丝粒和(近)着丝粒染色体区域高度富集。FISH结合Fesreba探针和CENH3抗体免疫染色显示它们共定位，并表明Fesreba可能在着丝粒功能中起作用。

植物材料

多年生黑麦草GR3320 (2n = 2x = 14)，羊茅属。季(2n = 6x = 42)，羊茅属giganteaGR11759 (2n = 6x = 42)羊茅属maireiGR610941 (2n = 4x = 28)种子来自Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (Gatersleben, Germany)基因库。的种子羊茅属pratensis简历。结果(2n = 2x = 14)来自Dr. Arild Larson (Graminor, Norway)。多年生黑麦草简历。海王星(2n = 4x = 28);多花黑麦草简历。Kuri1 (2n = 2x = 14)和两个市售品种，Lolium。multiflorum简历。(2n = 4x = 28)和羊茅属pratensis简历。Westa (2n = 4x = 28)，从Dr. Vladimír Černoch (DLF Seeds, Czech Republic)获得。羊茅属glaucescens基因型C-45 (2n = 4x = 28)来自Seed Bank, W. Reg。p.i.车站，普尔曼，华盛顿州。

大麦种子(大麦芽)的简历。莫雷克斯，黑麦(Secale cereale)的简历。Dánkowskie Diament和燕麦(燕麦属漂白亚麻纤维卷)的简历。Atego来自莱布尼茨植物遗传研究所和作物植物研究所基因库。的种子小麦简历。中国春由日本京都大学远藤隆史教授(Takashi R. Endo)获得山羊草属tauschii(血统AL 8/78;V. Jaaska，爱沙尼亚大学，塔尔图)由Valárik博士(捷克共和国实验植物学研究所)提供。豌豆种子(Pisum一简历。红麦和黑麦(Secale cereale简历。Dankovske)，作为流式细胞分析的内部参考标准，由我们中的一位(JD)提供，并可在捷克共和国实验植物学研究所(https://olomouc.ueb.cas.cz/en/technology/flow-cytometry-1/reference-dna-standards）.

核基因组大小的估计

核DNA量的测定参照Doležel等。[66]遵循奥托的两步程序[67经过修改。碘化丙啶染色的分离细胞核样品，用配备532 nm激光的Sysmex CyFlow Space流式细胞仪(Sysmex Partec, m nster，德国)进行分析。两个参考标准被用来估计DNA的绝对单位。豌豆(Pisum一简历。Ctirad;2C = 9.09 pg DNA) [41]作为估计DNA含量的内部标准，除了f . mairei，而黑麦(Secale cereale简历。Dankovske;2C = 16.19 pg DNA) [41]被使用。每株植物在三个不同的日子里被分析三次。每个样品至少分析了5000个核。单个样品的核量计算公式为:2C核DNA含量(pg) =参比标准品2C核DNA含量×样品G₁峰值平均值/标准G₁峰的意思。

测定了每株植物的平均核DNA含量(2C)， 1 pg DNA = 0.978 × 10⁹英国石油公司(68]。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)确定1Cx大小之间差异的统计学意义。采用NCSS 97(统计解决方案，科克，爱尔兰)进行分析。采用显著性水平α = 0.01。

系统发育分析

Loliinae亚族的系统发育分析基于Catalán等人发表的数据。[3.]。ITS区域序列从NCBI GenBank下载(GB代码:AF303401-407, AF303410-416, AF303418-419, AF303421-425, AF303428, AF478475-476, AF478498-499, AF519975-981, AF519983, AF532937, AF532939-948, AF532951-952, AF532954, AF532956-960, AF532962-963, AF543514, AF548028, AJ240143, AJ240146, AJ240148, AJ240153, AJ240155-157, AJ240160, AJ240162, AY099007, AY118087-088, AY118090-092, AY118094-096, AY228161)。Brachypodium distachyon(国标AF303339)作为外群种。使用MAFFT v7.029(−-localpair—maxiterate 1000)完成多序列比对[69]，用PhyML 3.0构建系统图谱[70]在SeaView v5.0.2中实现5]。近似似然比检验[71]评估分支支持。最终的系统发育树用FigTree (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）.

Illumina测序和数据分析

根据制造商的建议，使用NucleoSpin PlantII试剂盒(Macherey-Nagel, d ren，德国)分离基因组DNA，并使用Nextera®DNA样品制备试剂盒(Illumina, San Diego, CA, USA)制备Illumina文库。简单地说，50 ng的DNA片段化，纯化，并根据协议扩增。单个文库中的DNA浓度用量子位荧光仪测量，调整为等摩尔浓度，并在测序前汇总。使用Illumina MiSeq进行DNA测序，单端或对端测序可产生高达500 bp的reads。序列读取保存在序列读取档案(BioProject ID: PRJNA601325，编号SAMN13866227, SAMN13866228, SAMN13866229, SAMN13866230, SAMN13866231, SAMN13866232, SAMN13866233, SAMN13866234, SAMN13866235, SAMN13866236)中。

使用FASTX-Toolkit(−q 20 -p 90;http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html）.使用独立版本的RepeatExplorer管道进行了重复序列家族的详细表征[37]在IBM服务器上运行，该服务器拥有16个处理器、100gb RAM和17tb磁盘空间。第一步，根据Novák等人，使用RepeatExplorer管道对基因组重复部分进行比较分析。[49]。根据Novák等人的研究，使用代表相同读取量的随机数据集(0.5×单个条目的覆盖率)，使用基于图的方法重建重复元素。[48]。RepeatExplorer管道使用不同的工具(例如，BLASTN和BLASTX，系统发育分析)对组装序列进行表征[37，48]。串联组织重复序列经Dotter [72]。

第二步，将RepeatExplorer管道应用于包含所有以特定前缀标记的物种的合并数据集，进行比较分析[49]。然后使用聚类的结果创建重复的数据库。Illumina reads数据库保存在Sequence Read Archive(编号:SRX7566047-SRX7566056)。由不同类型的重复DNA元素组装而成的组合可在网上公开获得(https://olomouc.ueb.cas.cz/en/content/dna-repeats)和Dryad数字存储库(doi:https://doi.org/10.5061/dryad.xksn02vch）.

南部杂交

基因组DNA对应3 × 10⁶一个1Cx核基因组的拷贝被有III酶(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)。DNA片段在1.2%琼脂糖凝胶中电泳分级，然后转移到Hybond™N+尼龙膜上(GE Healthcare, Chicago, IL, USA)。探针由f . pratensis基因组DNA作为模板，用生物素标记的dUTP (Roche, Mannheim, Germany)和特定引物(Additional file)进行聚合酶链反应(PCR)6表S3，附加文件7:图S4)。在68°C下进行Southern杂交，并用化学发光核酸模块(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)检测杂交信号，严格率为90%。杂交信号在医用x射线膜蓝(爱克发医疗保健，Mortsel，比利时)的化学发光衬底上可视化。

ddPCR

根据从Fesreba反转录转座子组装的DNA contigs，在反转录转座子中有两个具有独特限制性位点的限制性内切酶(下丘脑-垂体-肾上腺轴的我和下丘脑-垂体-肾上腺轴的II)被识别并用于进一步分析。简单地说，根据制造商的建议(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)消化3 μg基因组DNA，然后稀释1000倍，达到0.06 ng/μl的起始浓度。按照制造商的建议，使用EvaGreen Supermix (Bio-Rad实验室)、模板DNA和Fesreba特异性引物，在QX200液滴数字PCR机(Bio-Rad实验室)上进行ddPCR6表S3)。对每个加入进行了三个独立的重复分析。

细胞遗传学定位和免疫染色

用FISH在有丝分裂中期板上对选定的重复序列进行细胞遗传学定位。根据Křivánková等人的方法制备染色体涂片。[35]，按照Neumann等方法进行免疫染色。[73]。根尖在冰水中保存28 h;在LB01缓冲液中冲洗[74];在3.7%甲醛中固定25分钟;用2%纤维素、2%果胶酶和2%细胞解旋酶在1×磷酸缓冲盐水(PBS)中37℃下消化90分钟。取下盖片后，先用1倍PBS洗涤，然后用PBS-Triton缓冲液(1倍PBS, 0.5% Triton X-100, pH 7.4)洗涤25分钟，再用1倍PBS洗涤。用抗草CENH3一抗孵育[75]，载玻片在PBS-Tween缓冲液(1倍PBS, 0.1% Tween 20, pH 7.4)中洗涤25分钟，然后与抗草CENH3一抗(PBS-Tween稀释1:200)在4℃下孵育过夜。第二天，载玻片用1倍PBS洗涤，用抗兔Alexa Fluor 546二抗(Thermo Fisher Scientific/Invitrogen)在PBS- tween缓冲液中稀释1:250，室温下1小时检测CENH3抗体，然后用1倍PBS洗涤。FISH前，用乙醇:乙酸(3:1)固定液和3.7%甲醛在室温下稳定免疫荧光信号10分钟。在1倍PBS中洗涤三次后进行FISH。

FISH探针来源于Fesreba元件的RT和LTR区域，用特异引物PCR标记为地高辛-11- dutp或生物素-16- dutp (Roche Applied Science)6表S3)。根据Křivánková等方法进行FISH和杂交位点检测。[35]。用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)对染色体进行反染色，并装在Vectashield (Vector Laboratories)上。用Axio成像仪检查载玻片。Z2显微镜(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)配备Cool Cube 1 (Metasystems, Altlussheim, Germany)相机，使用ISIS 5.4.7 (Metasystems)软件进行图像处理。最后的调整是在Adobe Photoshop 12.0中进行的。

所有相关的支持数据集都包含在本文及其附加文件中。支持本文结论的数据集可在Sequence Read Archive (accession: SRX7566047-SRX7566056)和Dryad repository (doi:https://doi.org/10.5061/dryad.xksn02vch;https://datadryad.org/stash/share/8pm4qJ41tIJaXNd7EYkan125DKR-Vi8BINbF4HSobVg）.

1 c:

Holoploid基因组

残雪:1

单倍体基因组

2 c:

DNA复制前G1核的DNA量

4 f:

染色体4羊茅属pratensis简历。Fure

英国石油公司:

碱基对

CENH3:

着丝粒组蛋白H3

肤色线:

通过RepeatExplorer分析获得的同源序列聚类

客户关系管理:

玉米中的着丝粒反转录转座子

Cy3:

Cy3荧光染料

DAPI:

4, 6-diamidino-2-phenylindole

ddPCR:

液滴数字聚合酶链反应

背景:

脱氧核糖核酸

dUTP:

2三磷酸脱氧尿苷5

远:

季Schreb。无性系种群。季

FGI:

羊茅属giganteal . GR11759

备受:

季Schreb。无性系种群。glaucescens

鱼:

荧光原位杂交

FITC:

异硫氰酸荧光素

菲利普-马萨:

羊茅属maireiGR610941

基维辛迪:

羊茅属pratensisHuds。简历。Fure

FPW:

羊茅属pratensisHuds。简历。Westa

G1:

细胞周期G1期

英镑:

Gigabase双

ID:

身份证号码

线:

长时间散布的核元素

LM2:

多花黑麦草简历。Kuri1

LMM:

多花黑麦草林。简历。水户市

LP2:

多年生黑麦草l . GR3320

LPN:

多年生黑麦草l .简历。Neptun

LTR:

长端重复

μl:

微升

NCBI:

国家生物技术信息中心

吴:

纳克

PBS:

磷酸盐

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

答:

沙克

pH值:

氢势

rDNA:

核糖体DNA，带有核糖体RNA基因的DNA

核糖体rna:

核糖体RNA，参与核糖体结构和蛋白质合成的RNA

RT:

逆转录酶

SSC:

柠檬酸钠盐

TE:

转座因子

我们感谢H. Tvardíková和E. jahnov的技术支持，P. Navrátil的技术支持，V. Černoch(捷克共和国DLF种子公司)和M. Valárik(捷克共和国实验植物学研究所)提供的植物材料。

这项工作得到了ERDF项目“植物作为全球可持续发展的工具”的支持。CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827)。计算支持由国家电网基础设施元中心(批准号:项目编号:LM2010005(大型研究、开发和创新基础设施项目)。资助者在研究设计、数据分析和解释或撰写手稿方面没有任何作用。

从属关系

1. 捷克科学院实验植物学研究所，区域生物技术和农业研究中心，Šlechtitelů 31, CZ-77900，捷克共和国奥洛穆茨

   Jana zwyrtkov， Alžběta n me kov， Jana Čížková， Kateřina Holušová， Veronika kapustov， Radim sva ina, David Kopecký， Jaroslav Doležel和Eva Hřibová

2. Genómica营养中心Agroacuícola, Las Heras 350，智利特木科

   布拉德利·约翰·蒂尔

贡献

JZ为测序准备DNA，分析Illumina序列数据，进行DNA重复序列重建和进一步的重复序列分析。JC和DK用流式细胞术估计基因组大小;KH和BJT进行Illumina测序;JZ, DK, VK和AN进行细胞遗传学分析，包括免疫- fish。RS和JZ进行了ddPCR并对结果进行了解释。EH和JD为研究做出了智力贡献，并对重要的智力内容进行了批判性的修改。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到伊娃Hřibova。

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

开放获取本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和来源，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可协议中，除非在材料的署名中另有说明。如果材料未包含在文章的知识共享许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超过允许的用途，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。创作共用公共领域免责声明(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文中提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。

转载及权限