小生长素Up RNAgydF4y2BaS对吲哚-3-乙酸的分布有影响，对增加种子大小有潜在作用gydF4y2Ba南芡实gydF4y2BaSalisbgydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

水生gydF4y2Ba南芡实gydF4y2BaSalisb。小麦在中国和印度是一种重要的经济作物。不幸的是，低收益率的限制严重阻碍了市场的增长。揭示种子大小控制对作物改良具有重要意义。在此，我们通过杂交南芡实和北芡实(WT)，获得了一个种子较大的新杂交种(HL)。然而，控制种子大小的功能基因和分子机制gydF4y2Ba南芡实gydF4y2BaSalisb。尚不清楚。本研究以HL和WT果实发育过程中生长素信号转导通路中的差异表达基因为研究对象，探索参与调节种子大小的候选调控基因。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

用LC-MS和免疫荧光法检测了WT和HL果实两个生长阶段吲哚-3-乙酸(IAA)的浓度和定位。虽然两品系间IAA含量无差异，但IAA分布存在显著差异。为了阐明这一机制并寻找这种差异背后的关键基因，我们对两个生长阶段的幼果进行了RNA-seq，并选择与生长素转导通路相关的差异表达基因进行进一步分析。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

混合动力gydF4y2Ba南芡实gydF4y2BaSalisb。表现出明显的杂种优势，产生了不带刺、薄包衣、大种子，这是导致HL产量显著高于WT的原因gydF4y2Ba小生长素Up RNAgydF4y2Bas (SAURs)介导的IAA定位调节种子大小gydF4y2Ba南芡实gydF4y2BaSalisb。我们发现，一些SAURs可能是生长素转导途径的正介质，从而促进了观察到的杂种优势。gydF4y2Ba

芡实，普通话又称“狐仁”和“钱实”，是一种gydF4y2Ba南芡实gydF4y2BaSalisb。，一个n我mportant food, ornamental, and medicinal species widely distributed in the southern region of China and North Bihar, India [1gydF4y2Ba］．由于其淀粉含量高(超过70%)，通常被认为是水生食品;此外，在一些地区，人们更喜欢吃芡实籽而不是米饭，因为它的升糖指数低[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．此外，芡实也是一种常见的中药材，其抗抑郁、抗氧化、抗糖尿病等药理作用已被大量研究证实[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

南芡实gydF4y2BaSalisb。可分为两种主要类型:北芡实(野生型或WT)和南芡实(SE)型，如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．WT分布在大多数地区，其种子小而多刺，包衣薄，而SE主要在江苏和安徽种植，其籽粒大而无刺，包衣厚[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．WT的产量大约是SE的3倍，这主要是因为SE的特点是荚率低。然而，SE的种子比WT的种子更美味，这表明两种类型之间存在淀粉结构的差异。因此，为了获得高产量和美味种子的作物，我们在2015年杂交WT和SE，经过三代自交成功培育出杂交种(HL)。HL产生无刺组织和大种子，这与SE的特征更相似，但其生长模式更类似于WT(图5)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(c, f, i)。叶外浮叶(盾状叶，>直径1.8 m)为绿色，上面不带刺，下面为红色或紫色，多刺。花是单生的，有四个宿存的和不带刺的萼片，连同几个紫色花瓣。下子房，在每朵花的下面，发育成一个海绵状的浆果状果实，不带刺，每个成熟的果实含有60-90个种子，有薄薄的黑色种皮。麻花苜蓿具有较高的产量优势，试验区麻花苜蓿平均产量可达4875公斤/公顷gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}比2018年WT的产量高出35%。但在单株种子数上，WT和HL没有显著差异，表明HL的产量评价主要取决于种子的大小和重量。在之前的研究中，我们没有检测到WT和SE在DNA水平上的差异，这表明这两种类型属于同一物种，因此转录差异一定是导致它们表型差异的原因。gydF4y2Ba

众所周知，内源植物激素在分子水平上在植物生理和生化过程中发挥关键作用[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．在植物生长调节剂中，生长素(吲哚-3-乙酸，IAA)调节整个植物的发育过程[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．IAA影响细胞分裂和细胞伸长;此外，所有高等植物的某些产量性状在很大程度上依赖于这种小有机酸分子。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．植物结构已被证明与产量直接相关，并由pin-form 5b (PIN5b)通过IAA内稳态、运输和分布的变化控制[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．此外，IAA的这些作用已经在许多基因研究中得到证实，这些研究通过控制IAA的代谢、IAA分布模式的改变和植物对IAA信号的响应来调控IAA [gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．此外，研究iaa信号转导通路中基因在生长素介导的生物过程中的作用越来越有意义[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．到目前为止，植物中已经发现了大量的IAA信号转导通路中包含的IAA相关因子，包括F-box TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE 1/生长素信号F-box PROTEIN (TIR1/AFB)生长素共受体、生长素响应因子(ARF)转录因子和生长素/吲哚-3-乙酸(Aux/IAA)转录抑制因子[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．生长素刺激TIR1/AFB和Aux/IAA蛋白之间的相互作用，然后诱导Aux/IAA的降解和ARF因子的释放，从而促进一组生长素响应基因的快速转录，这些基因涉及植物的多种过程，如胚胎发生和器官发生[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．因此,gydF4y2Ba小生长素Up RNAgydF4y2Ba（gydF4y2Ba阿富汗二月gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba糖苷水解酶3gydF4y2Ba（gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba),gydF4y2Ba辅助/ IAAgydF4y2Ba基因是三个主要的生长素反应基因家族;不幸的是，关于SAURs的功能研究一直滞后[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．据报道，SAURs的遗传功能包括延长大豆下胚轴和促进拟南芥下胚轴和雄蕊丝伸长，这表明SAURs在调节细胞膨胀中起作用[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．在之前的一项研究中，OsSAUR39被证明通过调节生长素的合成和运输来影响水稻产量，这意味着SAURs具有调节作物产量的潜在能力[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．目前尚不清楚SAURs和iaa信号转导通路是否与HL中种子尺寸增大有关。gydF4y2Ba

由于在中国和印度，WT的分布比SE的分布要广泛得多，以往的研究大多采用WT作为实验材料，因此本研究仅采用WT作为野生型对照[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．目的:探讨促进小麦种子大小的潜在功能基因gydF4y2Ba南芡实gydF4y2BaSalisb。，we subjectively divided growth into stages I through V according to fruit growth regulation in南芡实gydF4y2BaSalisb。，一个fter observing largely difference in phenotype and IAA distribution between WT and HL. Then, RNA-seq was performed on fruits at stages II and III to identify the differentially expressed genes (DEGs) involved in the IAA signal transduction pathway. These results indicated that SAURs-mediated localization of IAA regulates seed size in南芡实gydF4y2BaSalisb。gydF4y2Ba

HL能产生更大的种子和籽粒gydF4y2Ba

在生长21周后，两种植物成熟并收集种子。值得注意的是，在我们的数据中，两品系的单株种子数没有任何差异(WT平均约为1170粒/株，HL为1180粒/株)，这说明两品系的产量差异可能与种子大小和重量有关。尽管HL的粒重(1.1 - 1.7 g)远远大于WT的粒重(0.5 - 0.9 g)，但我们更关注的是种子的大小而不是重量，因为在繁殖生长过程中，种子大小的快速变化最明显的是重量的增加[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．将所有种子在阳光下进行短暂干燥，然后记录WT和HL的种子大小和粒数。如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba， HL (B)的籽粒比WT (A)大。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac显示，虽然HL的种皮明显较厚，但种子的尺寸越大，籽粒越大。gydF4y2Ba

两个试验品系的果实长度在生育期差异显著gydF4y2Ba

进一步了解的生长规律gydF4y2Ba南芡实gydF4y2BaSalisb。，we divided development into five stages (I through V), as in rice studies [31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．在第一阶段，果实生长缓慢;阶段II，果实大小无明显增长;III期果实生长较快;第IV阶段果实接近成熟，第V阶段果实进入后期成熟(图5)。gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)。我们根据生长模式收集了第10周的所有果实，更重要的是，这一阶段的果实生长导致了两个品系以后发育的差异。如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba在III期，HL的果实长度大于WT (gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)，因此，我们选择阶段II和阶段III的样品(果宽见图。gydF4y2BaS2gydF4y2Ba)。此外，HL和WT在水位线以上每周都产出1-2个果实。gydF4y2Ba

IAA在HL中的定位与在WT中的不同gydF4y2Ba

植物激素在植物生长和作物产量中起着重要作用。IAA是年轻组织中最活跃的效应器之一[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．我们测定了两种品系果实在生长初期的IAA含量，发现两种品系果实在生长第III期没有差异(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).然而，IAA在细胞水平的浓度和定位都至关重要，它们必须控制细胞活性和/或其命运[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．因此，为了研究IAA在同一时期果实中的定位，对切片果实进行免疫荧光染色。令人惊讶的是，在III期，WT将游离iaa分配到其特殊组织中，刺痛更频繁，而HL果实中的荧光信号集中在子房和雄蕊(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).在II阶段发现了类似的结果(图。gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)，阴性对照见图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac.这一最有趣的发现表明生长素信号响应在调节子房大小以及随后的种子大小方面具有潜在作用。我们还在大小相近的SE果实中检测到游离iaa信号的定位(图。gydF4y2BaS4gydF4y2Ba)。结果表明，游离IAA只存在于SE果实的雄蕊中，说明3种类型对IAA的利用存在差异。但也有可能SE的果实(即使大小相近)处于生长后期，因为SE的果实生长速度远远快于WT和HL。gydF4y2Ba

RNA-seq和转录组组装gydF4y2Ba

三一学院进行了一系列的从头组装。为了在发育过程中获得有用的转录组信息，利用Illumina Hiseq X10建立了12个cDNA文库，并对末端序列进行了读取。如表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba从HL和WT的cDNA文库中共获得630,221,090个clean reads。Q30和Q20质量分数平均基数分数分别为94.6和98.1%，数据质量较高。装配序列的相对长度是装配质量的重要评价标准，装配clean reads的汇总统计如表所示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．使用Trinity汇编器，生成了197,253个unigenes，平均长度为959 nt, N50为1574 nt，总长度为189,170,382 nt。总unigenes包括44,511个(22.57%)小于300 nt, 151,012个(76.55%)长度在301 - 5000 nt之间，1730个(0.88%)长度大于5000 nt。这些结果证明我们的样本具有高质量的测序和组装。gydF4y2Ba

注释和GO分类gydF4y2Ba

对组装的197253个unigenes的注释显示，44363个(22.49%)、18229个(9.24%)、26746个(13.56%)、9633个(4.88%)、3632个(1.84%)和2879个(1.46%)分别在GO、Pathway Pfam、TMhmm、Eggnog、SignalP和Uniprot数据库中具有显著相似性。总共有71399个unigenes(36.20%的unigenes)在至少一个数据库中被成功注释gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba共44,363个unigenes被分配到三个主要域;“细胞成分”、“分子功能”和“生物过程”。gydF4y2Ba

SAURs诱导HL和WT之间IAA信号转导通路的差异gydF4y2Ba

KEGG Pathway数据库记录了细胞中分子相互作用网络和物种特异性变异[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．根据上述IAA定位的研究结果，我们将重点放在了生长素转导通路相关基因上。路径如图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba一个;简单地说，生长素促进TIR1/AFB与Aux/IAA蛋白相互作用，导致Aux/IAAs降解，释放ARF抑制剂，下游SAURs、GH3和Aux/IAA随后被激活。我们比较了HL和WT在II和III阶段的转录组:只有SAURs在整个通路中显示出显著差异(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).然后，所有unigenes注释用gydF4y2Ba东盟地区论坛gydF4y2Ba，gydF4y2Ba辅助/ IAAgydF4y2Ba，gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba或gydF4y2Ba阿富汗二月gydF4y2Ba进行比较(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab). SAURs有明显的差异，而其他3个家族在两个生育阶段之间没有任何变化。值得注意的是，SAURs的单基因数在4个科中最少，说明SAURs的功能冗余度较低gydF4y2Ba南芡实gydF4y2BaSalisb。有趣的是，这一发现表明SAURs在对IAA的反应中发挥了重要作用，并可能在HL中上调了种子大小。gydF4y2Ba

RT-qPCR验证RNA-seqgydF4y2Ba

为了评估DEGs表达的有效性，我们用RT-qPCR方法检测了参与生长素转导通路的10个候选unigenes (2-ARFs, 3-AUX/IAAs, 2-GH3s和4-SAURs)(所有10个unigenes的详细信息见表)gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)。选取HL和WT三期果实进行RT-qPCR分析，以β-actin作为内参基因。如图所示。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba从RT-qPCR和RNA-seq结果来看，这些DEGs大部分表现出相似的表达模式，说明来自转录组数据的结果是可靠的。gydF4y2Ba

杂交品种在生长和产量方面往往表现出超过亲本的表现型，这种现象被称为“杂交活力”或“杂种优势”[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．由于杂种优势对产量的影响，杂交水稻在很大程度上为解决全世界数亿人的粮食问题作出了贡献[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．最近，随着生活水平的提高，人们更加注意健康和美味的食物。gydF4y2Ba南芡实gydF4y2BaSalisb。被认为是大米和小麦的合适替代品，因为它分布广泛，有一种蜡状的味道[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．然而，该作物的发展面临着许多问题，如种植成本高，产量低。为了克服这些问题，我们花了许多年的时间选择优势系并进行杂交，直到最后，一个HL被开发出来。令我们惊讶的是，与WT相比，新杂交种表现出明显更高的产量;除此之外，它还表现出一些有利的性状，包括无刺和大量蜡质的种子。通过与亲本WT的产量性状比较，发现其籽粒大小远大于WT，表明籽粒大小是提高其产量的关键因素。此外，黄花莲的高产也与其较重的种子有关，但种子重量主要取决于种子的大小，特别是在灌浆前的过程中，说明种子大小在评价黄花莲的产量方面起着至关重要的作用gydF4y2Ba南芡实gydF4y2BaSalisb。在其生殖器官生长过程中[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．水生植物种子通常具有较高的水分，这导致种子重量误差较大[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．因此，本研究以种子大小为主要观察指标，探讨其功能基因和分子机制gydF4y2Ba南芡实gydF4y2BaSalisb。gydF4y2Ba

建立一种生长模式gydF4y2Ba南芡实gydF4y2BaSalisb。，we divided the phases of fruit development into five stages according to average fruit growth above the water. Fruit growth rate is low over the first two stages, especially at stage II, which suggests that during these stages, vegetative and reproductive organs grow together. In contrast, over the remaining three stages, reproductive growth allows only fruit generation and growth [42gydF4y2Ba］．V期生长显著下降可能是由于果实成熟后水分的流失[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．HL的生长阶段划分是基于水稻研究的，这对HL和WT的样本选择和时间过程研究至关重要。正如预期的那样，我们观察到在研究的两个品系之间果实生长速率有显著差异。导致这种差异的因素成为我们研究的重点。gydF4y2Ba

虽然杂种优势已成功地应用于提高小麦产量，但其中的分子机制仍不清楚[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．由于杂种优势诱导的生长差异在很大程度上可以通过转录组分析来揭示，我们对这两个品系进行了RNA-seq分析[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．生长素的浓度在不同的组织中不同，介导不同的发育结果，并有助于生长素的功能多样性[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．在我们的研究中，两种植物材料在早期的IAA含量没有表现出任何差异，但在相同的生长阶段，两个品系的IAA定位是不同的。植物组织能迅速感知生长素水平的变化并作出反应。这些反应涉及几大类生长素反应基因[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．我们假设，在WT中，在这个早期阶段刺恰好构成了一种天然的保护屏障，这一过程使用了大量的IAA，而HL只在发育的卵巢和雄蕊上投入IAA。这也解释了为什么HL的子房比WT稍大。我们推测，HL中IAA对子房的伸长作用受到了HL和WT之间IAA分配方式差异的影响。在SE果实中，IAA信号主要分布在雄蕊附近，这可能是由于SE的生长速度比WT和HL快，花期更长。此外，值得注意的是，这一过程可能是由SAURs介导的，因为在生长素转导途径中，只有该基因家族在两个生长阶段的两个品系之间作为差异表达的基因集被检测到。某些SAURs促进植物组织中的细胞膨胀的事实支持了这一假设[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．IAA信号转导通路中的许多基因已被报道影响种子的发育[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．然而，也有一些基因参与其中gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba由于GH3中大量的unigenes，这些基因在HL中被发现上调。这些差异并没有引起gh3表达的显著差异。在此之前，转录组学分析在种子样品gydF4y2Ba南芡实gydF4y2BaSalisb。提示PAL和p450相关基因通过影响苯丙类化合物的生物合成来促进种子的成熟，表明基因或通路在促进种子发育中起着至关重要的作用gydF4y2Ba南芡实gydF4y2BaSalisb [gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．与以往研究不同的是，我们采用WT和HL两种类型的果实进行RNA-seq分析，并认为iaa相关基因是种子发育的潜在功能基因。我们的研究不仅提供了更完整的解读和更精确的注释gydF4y2Ba南芡实gydF4y2BaSalisb。但也指出了促进种子发育的潜在机制。gydF4y2Ba

综上所述，通过表型观察、IAA检测和RNA-seq分析，我们的结果逐渐揭示了SAURs可能介导了HL中IAA的定位，从而调节了种子的大小。此外，我们还对参与种子形成的功能基因和分子机制进行了初步研究gydF4y2Ba南芡实gydF4y2BaSalisb。gydF4y2Ba

混合动力gydF4y2Ba南芡实gydF4y2BaSalisb。杂交优势显著，产生了不带刺、薄包衣、大种子，这是导致HL的产量显著高于WT的原因。通过研究，我们发现一些SAURs可能是生长素转导途径的正介质，从而导致了观察到的大种子。这些SAURs的基因功能gydF4y2Ba南芡实gydF4y2BaSalisb。，而且the underlying mechanisms deserve further investigation.

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

南芡实gydF4y2BaHL和它的父母，北戈登芡实(gydF4y2Ba大肠猛鲑gydF4y2Ba， WT)及南芡实(gydF4y2Ba大肠猛鲑gydF4y2Ba， SE)作为本研究的植物材料。WT种子于2001年从野外(江苏高油湖)获得，在江苏省种子育种基地试验田培育;SE种子从野外(江苏苏州)获得，也在江苏省种子育种基地试验田培育，该试验田为本次科研使用提供了许可。HL(含3系)由母株WT与SE杂交生成FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba2015年江苏省高邮(E119°30′，N32°58′)杂交;后来,FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba被选中并自花授粉产生FgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba2016年中国江苏省南闸(E119°10′，N33°18′)地区;和FgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba个体被用来产生FgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba2017年江苏高邮(E119°30′，N32°58′)自交受精;最后,FgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba代和亲本均在江苏省种子育种基地(江苏高邮)试验田培养。本研究所用植物材料均由江苏省种子育种基地提供。所有样品的采集完全符合国家和地方立法许可，采集这些植物不需要特别许可。植物材料由吴启南教授正式鉴定，该材料的凭证标本保存在南京中医药大学。HL和WT于2018年4月22日采用完全随机区组设计进行三次重复播种。每个地块由160条独立的线组成，每条线与相邻的线相隔2米。本研究选取这两个品系进行表型性状测定和转录组分析。采集指定发育阶段采样的幼果，保存在−80℃下，用于RNA-seq和RT-qPCR分析。种子于2018年9月9日成熟采集;选择10个重复，分别为产量性状; additionally, each sample had at least three biological replications to minimize systematic errors.

IAA量化gydF4y2Ba

IAA通过液相色谱-质谱(LC-MS)定量，基本如所述[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．简单地说，50 mg冷冻组织均质于500 μL提取缓冲液(异丙醇:双蒸馏水:乙酸= 2:1:0.002,vol/vol/vol)中。在冰上摇30分钟后，向每个样品中加入1毫升二氯甲烷，再摇30分钟。4℃，13000 g离心5 min;下相在氮气流下干燥，并与甲醇重新溶解。将每个样品溶液注入反相C中gydF4y2Ba_18gydF4y2BaHPLC柱(2.1 mm × 100 mm, 2.7 μm, Agilent, USA)用于LC-MS(岛津LC-30超高高效液相色谱系统，岛津，日本;AB Sciex QTRAP 5500, Sciex，美国)分析。外部标准采用IAA标准(≥98%，45,533,Sigma, USA)。gydF4y2Ba

免疫荧光染色gydF4y2Ba

对水果切片进行IAA免疫荧光染色如下:简单地说，使用冷冻刀(CM1950, Leica Microsystems，德国)切割60 μm的水果切片，贴在玻片上，然后在上升和下降乙醇溶液中脱水。在0.1% (v/v) Tween 20磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中洗涤三次10分钟后，切片在室温下用5% (w/v)牛血清白蛋白在PBS中预处理1小时，以减少非特异性结合，然后在4℃下与抗iaa抗体(1:200,AS09 421, Agrisera，瑞典)孵育一夜。用0.1% (v/v) Tween 20在PBS缓冲液中洗涤三次10分钟后，切片用Alexa Fluor 594(1:200，山羊抗兔IgG (H + L)， SA00006-4, Proteintech Group, USA)作为二抗在室温黑暗中孵育1小时。样品在0.1% (v/v) Tween 20 PBS中洗涤3次10分钟。使用Carl Zeiss Axio Scope荧光显微镜(德国哥廷根)对切片进行成像。用PBS代替一抗孵育的样本作为阴性对照，本研究中未发现二抗的非特异性结合。gydF4y2Ba

RNA提取，cDNA文库制备和测序gydF4y2Ba

在提取总RNA前，将12个冷冻组织样本分别在液氮下充分研磨。RNA质量用Agilent 2100 BisAnalyzer (J06-02, Agilent, USA)和RIN≥7和的样品进行测定gydF4y2Ba\(\frac{28S}{18\mathrm{s}}\ge 1.5 \)gydF4y2BaRNA-seq分析。使用Qubit RNA BR检测试剂盒(Q10211, Invitrogen, USA)测定RNA浓度。gydF4y2Ba

构建cDNA文库时，每个样本以5 μg总RNA为模板。使用Illumina公司的NEBNext Ultra RNA文库准备试剂盒(E7530S, NEB, USA)生成一系列对应的文库，并对每个样本应用索引代码。简单地说，mRNA是用寡聚物(T)珠从总RNA中纯化出来的。RNA裂解是在NEBNext第一链合成反应缓冲液(5X)中二价阳离子存在的高温下进行的。用随机六聚物引物和M-MLV逆转录酶合成第一链cDNA。随后使用DNA聚合酶I、RNase H、dNTP和缓冲液进行第二链cDNA合成。然后，纯化cDNA片段，末端修复，加入poly (A)，然后进行适配器连接。选择的连接产物进行扩增，随后由Gene Denovo生物技术有限公司(北京，中国)用Illumina HiSeq TM X10测序。gydF4y2Ba

差异表达mrna的鉴定gydF4y2Ba

高通量测序后，将未知碱基过多(> 5%)或低质量碱基(> 30%的碱基质量评分≤20)的原始reads排除，以获得清洁reads。然后三一学院将每个样本中剩下的清晰读数组装起来gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba与de Bruijn图。gydF4y2Ba

单基因序列使用以下公共数据库进行注释:通用蛋白(Uniprot)、基因进化谱系(Eggnog)、Pfam蛋白域数据库(Pfam)、信号肽服务器(SignalP)、基于隐马尔可夫模型的跨膜蛋白数据库(TMhmm)、京都基因与基因组百科(KEGG)和基因本体(GO)。单基因序列用BLASTx比对，e值< 10gydF4y2Ba^{−5gydF4y2Ba}，只有当“-max_target_seq”为“1”时，注释才会被保存。gydF4y2Ba

用RSEM对差异表达进行估计和检验gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba软件采用EM法。我们以每千基每百万的片段数(FPKM)量化了基因表达水平，计算了错误发现率(FDR)，估计了折叠变化(FC)和对数gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba俱乐部的价值观。显示FDR≤0.01和估计绝对对数的转录本gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(FC)│≥1被认为表达差异显著。gydF4y2Ba

实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析gydF4y2Ba

使用TRIzol (T9424, Sigma, USA)和1 μg用于cDNA合成，使用PrimeScript RT Master Mix kit (RR036A, TaKaRa，中国)提取RNA。RT-qPCR使用QuanStudio 3仪器(Applied Biosystems, USA)，使用5 μL cDNA、NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus (E096-01B, Novoprotein, China)和两个基因特异性引物各0.2 μL(表gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)，最终体积为20 μL。热循环阶段包括50℃2分钟，95℃10分钟，随后在95℃15秒，55℃1分钟，72℃30秒的40个循环。分离曲线验证了单个产物的扩增。以β-actin为内参基因归一化，采用比较Ct (ΔΔCt)法分析各基因的相对表达。参考前人的研究选择内参基因[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．简单地说，用Primer Premier 5设计基因特异性引物，扩增后用熔融曲线检验。利用BestKeeper软件根据阈值循环(Ct)值对各候选内参基因的表达稳定性进行比较和排序。本研究认为标准偏差值小于1的内参基因表达稳定，变异系数越小表明内参基因表达越稳定。每次扩增反应均重复3次。gydF4y2Ba

数据分析gydF4y2Ba

所有数据均以均数±均数标准误差表示。两组间的差异用gydF4y2Ba学习任务gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism 6.0软件(GraphPad software, Inc.)进行统计分析。gydF4y2Ba

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。资助机构在设计研究、收集、分析和解释数据以及撰写文章方面的作用应在此请求中声明。所有Illumina测序数据已存入NCBI序列读取档案(SRA)，注册号:PRJNA628746 (gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA628746gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

霍奇金淋巴瘤:gydF4y2Ba

混合线gydF4y2Ba

WT:gydF4y2Ba

北戈登芡实(野生型)gydF4y2Ba

国际宇航科学院:gydF4y2Ba

Indole-3-acetic酸gydF4y2Ba

TIR1 /空军基地:gydF4y2Ba

运输抑制反应1/生长素信号F-box蛋白gydF4y2Ba

东盟地区论坛:gydF4y2Ba

生长素响应因子gydF4y2Ba

阿富汗二月gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

小生长素上RNAgydF4y2Ba

GH3gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

糖苷水解酶3gydF4y2Ba

辅助/ IAAgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

生长素/ Indole-3-Acetic酸gydF4y2Ba

度:gydF4y2Ba

差异表达基因gydF4y2Ba

质:gydF4y2Ba

液相色谱-光谱法gydF4y2Ba

PBS:gydF4y2Ba

磷酸缓冲盐gydF4y2Ba

Uniprot:gydF4y2Ba

通用的蛋白质数据库gydF4y2Ba

蛋酒:gydF4y2Ba

基因进化谱系数据库gydF4y2Ba

包含了:gydF4y2Ba

Pfam蛋白结构域数据库gydF4y2Ba

SignalP:gydF4y2Ba

信号肽服务器数据库gydF4y2Ba

TMhmm:gydF4y2Ba

基于隐马尔可夫模型的跨膜蛋白数据库gydF4y2Ba

KEGG:gydF4y2Ba

京都基因和基因组百科全书数据库gydF4y2Ba

走:gydF4y2Ba

基因本体数据库gydF4y2Ba

FPKM:gydF4y2Ba

每千基每百万的碎片gydF4y2Ba

罗斯福:gydF4y2Ba

计算错误发现率gydF4y2Ba

舰队指挥官:gydF4y2Ba

褶皱变化gydF4y2Ba

RT-qPCR:gydF4y2Ba

定量实时聚合酶链反应gydF4y2Ba

ΔΔCt:gydF4y2Ba

比较CtgydF4y2Ba

我们也感谢Editage (gydF4y2Bawww.Editage.cngydF4y2Ba)进行英文编辑。gydF4y2Ba

感谢国家自然科学基金(81773854)的资助;江苏省中药材资源产业化协同创新中心项目(2016);江苏省研究生研究与实践创新计划项目(KYCX19_1247;KYCX19_1333)。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 南京中医药大学药学院，江苏省南京市仙林路138号，210023gydF4y2Ba

   黄志恒，包珂，景宗辉，王茜，段慧芳，朱亚英，张森，吴启南gydF4y2Ba

2. 江苏省中药资源产业化协同创新中心，江苏南京210023gydF4y2Ba

   黄志恒，包珂，景宗辉，王茜，段慧芳，朱亚英，张森，吴启南gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

QW和ZH设计并监督了研究。ZH, ZJ和KB进行了研究。QW和HD对结果进行分析并撰写稿件。YZ和SZ在数据分析过程中提供了有益的建议。ZH和QW在文章撰写过程中提供了建议。KB提供了棉花田管理方面的帮助。所有作者阅读并批准了最终稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba甄秦安吴gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

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