水稻回交渐渗系(BC)中lncrna的全基因组鉴定与整合分析₂F_12.）

背景

远缘杂交是创造水稻种间遗传变异和培育新品种的重要途径。为解决水稻科学问题，已构建了大量回交渐渗系。然而，对栽培稻、野生稻及其BIL后代中关键调控因子lncRNA的研究报道甚少。

结果

这里，使用高通量RNA测序技术探讨LNCRNA的功能特征和差异o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.和公元前3年₂F_12.后代。共筛选出1254个lncrna，以及子代与子代之间差异表达的lncrna数量o .漂白亚麻纤维卷明显少于后代和O. longistaminata.．一些LNCRNA调节多于一个mRNA，89.5％的LNCRNA通过靶基因的表达调节通过CIS.代理。共有78个lncrna和271个mrna被280个mirna靶向，22个lncrna被预测为20个microrna的前体。一些mirna被发现以自身潜在的前体lncrna为靶点。在三个子代中，超过50%的lncrna表现出亲本表达水平优势(ELD)，大部分lncrna表现出ELD- o。漂白亚麻纤维卷而不是eld-O. longistaminata.．进一步分析表明，LNCRNA可能调节植物激素相关基因的表达和适应性o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.和他们的后代。

结论

综上所述，这些结果为阐明不同lncrna的功能特征和表达差异提供了有价值的线索o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.及其Bil Pronsies，并扩大了我们对稻米中LNCRNA的生物功能的理解。

米 （栽培稻L.）是世界人口的主食之一，其产量对于全球粮食生产至关重要。随着基因组大小和高质量参考基因组的优点，大米被广泛被认为是典型的模型植物，以研究单子叶植物的遗传结构和功能。Genus.选用已进化成24种，包括2种栽培种(o .漂白亚麻纤维卷和o . glaberrima)及22种野生物种[1，2］．经过长时间的人工选择，栽培水稻失去了许多重要的有用基因。然而，野生稻经历了恶劣的自然环境，含有大量有价值的基因，是水稻育种的宝贵资源[3.］．具有优良基因和远缘遗传关系的不同物种之间的种间远缘杂交是创造遗传变异和培育新品种的重要途径，也是基因组进化和物种形成的重要驱动因素[4］．从野生稻中鉴定和利用具有农艺性状的有价值等位基因，通过杂交回交将其引入栽培稻，是扩大栽培稻遗传多样性的一种普遍接受的有效策略[5，6］．在过去的几十年里，人们构建了大量的回交渐渗系(backcross -渐渗系，BILs)来研究水稻的抗旱性等科学问题[7，8基因组结构[3.，杂种不育性[5基因、miRNA和代谢分析[2，9］．O. longistaminata.是一种多年生野生稻，广泛分布在热带非洲，对生物和非生物胁迫，强根茎，长花药和自我不相容的强烈抵抗力[10.，11.，12.］．

长链非编码RNA (Long non-coding RNA, lncRNA)是指长度超过200bp且无蛋白编码能力的RNA。lncrna参与多种分子和遗传机制，包括转录水平、转录后水平和表观遗传水平[13.，14.］．LNCRNA参与许多生物学过程，包括人肿瘤细胞的生长，植物形态发生，生物胁迫和非生物威胁[15.，16.，17.］．lncrna的功能分为信号、诱饵、引导和支架四类[18.］．具体地，当它们充当信号分子时，LNCRNA可以调节基因的空间/时间表达[19.］．lncrna可作为mirna的诱饵或靶拟态物参与维持基因表达的稳定性[20.，21.，22.］．lncrna还可以引导核糖核蛋白复合物定位到特定位点，发挥其引导作用[23.］．此外，lncrna可以作为支架与转录因子形成骨架复合物，调控上下行效应元件，进一步激活或抑制基因的转录[24.］．此外，lncrna可以通过在转录水平调控蛋白编码基因的表达CIS.- 或者反式监管。当lncRNACIS.-调控靶基因，它是从其靶基因所在的核酸链中编码的。相反，lncRNA编码的核酸序列与目的基因编码序列不在同一个核酸链上反式-调控靶基因。例如，一个lncRNA (COLDAIR)CIS.- 解释这一点开花基因座C.（方法）基因，在拟南芥中的开花时间的调节中非常重要;寒冷也反式- 解释这一点方法基因与蛋白质复合物PCG结合[25.，26.］．此外，lncrna可以作为microrna (mirna)的前体，部分lncrna还可以直接与mirna结合调节其功能[27.］．虽然在以往的研究中已经鉴定出了大量的lncrna，但对其生物学功能的研究仍处于起步阶段，尤其是在植物中。

近年来，高通量测序技术常被用于检测低水平表达的转录本，识别大量在生物过程中发挥重要作用的mrna、小rna和lncrna [15.，16.，28.，29.］．在我们以前的研究中，基因和miRNA的表达模式o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.和他们的3个BIL子代进行了实验，并探索了mirna对基因的调控[2］．本研究采用高通量链特异性RNA测序(ss-RNAseq)技术，研究lncrna及其靶基因的表达差异及特征o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.和他们的三个BILs (BC₂F_12.)的后代(L1710、L1817和L1730)。我们还研究了这些物种中作为mirna前体或靶模拟物的lncrna。进一步分析表明，亲本表达水平显性(ELD)现象在3个子代中最为常见。这为揭示野生稻杂交回交基因渗入的分子机制提供了有价值的线索。

测序数据概述

探讨lncrna的表达特点及其在肿瘤中的作用o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.本研究采用链特异性RNA-seq (ssRNA-seq)技术。总体而言，每个样本平均获得13.70 Gb数据，3个生物重复之间的基因表达相关性较高，平均系数(R²)的0.98(补充图S1)．平均为101,808,785 (L1710)、91,859,276 (L1817)、88,566,772 (L1730)、98,879,278 (o .漂白亚麻纤维卷）和103,545,393（O. longistaminata.）生成的原始读数分别产生，其中超过94％的读数是干净的读取（补充表S1)．15个ssRNA文库测序获得的所有干净reads上传到NCBI 's Sequence Read Archive (SRA)数据库(https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi?view=announcement）使用加入号SRR9822767-SRR9822781。重新组装和映射后，约为56％的清洁阅读O. longistaminata.在三个子代中，70%的读数是干净的o .漂白亚麻纤维卷被唯一定位到水稻参考基因组(Supplementary Table S1)和66,338个转录本被鉴定为已知mrna。此外，将已知信息无法识别的mrna和转录本剔除，其余转录本(下文称为新转录本)进一步确定为lncrna的候选转录本。结果共组装了16038个新转录本，其中大部分的转录本长度在4500 nt以内，包含10个以上外显子的转录本比例较高，而近一半的基因只有一个转录本(Supplementary Table S)2)．

LNCRNA的识别与序列特征

来识别o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.及其三个BIL后代，使用三种软件（CPC，CNCI和TXCDSPREDICT）和PFAM蛋白质数据库预测了16,038个新转录物的编码能力。通过预测其编码能力，共鉴定了总共6719个新的LNCRNA（图。1a)，通过RSEM软件定量分析筛选出1254个新的lncrna(图1)。1b,表1及补充表S3.)．另外，通过与mrna的序列比较，对所鉴定的lncrna进行序列特征分析。lncrna的长度在200 ~ 18313 bp之间，平均2348 bp，比已知mrna(平均1708 bp)长(图2)。2一种）。大约50％的LNCRNA长度超过2000磅，其中42克尔中的42磅长于10,000bp。编码LNCRNA的基因的外显子数与已知的mRNA编码基因的基本上一致，49.8％的LNCRNA编码基因和53.2％分别含有1-3个外显子（图。2b）。最着名的MRNA（87.1％）和LNCRNA（70.1％）衍生自具有一个或两个转录物的基因（图。2c). lncrna编码基因的GC含量在23.45 ~ 78.93%之间变化，平均为46%，其中大部分(79%)GC含量小于50%(图2)。2d)，而已知mrna编码基因的GC含量在28.73 ~ 84.16%之间，平均为52.88，其中GC含量超过50%的占55%。综上所述，lncRNA和mRNA序列特征多样化，lncRNA长度大于已知mRNA，但编码lncRNA的基因外显子数小于编码mRNA的基因，lncrna编码基因的GC含量也低于已知mrna编码基因。

采用RSEM软件计算lncrna和mrna的表达水平。表达lncrna和mrna的数量o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.他们的三个生物后代显示在表格中1，并且它们的特定FPKM值显示在补充表S中3.．如图所示。1B，70.5％（884个中的1254个）的LNCRNA在所有五条线中表达。仅在一行中表达的LNCRNA数量最多（35）O. longistaminata.最少(6)o .漂白亚麻纤维卷(无花果。1b）。此外，使用电池可视化表达的LNCRNA和MRNAs的分布（图。2E＆F）。结果表明，在染色体1和2上表达了超过50％的LNCRNA和超过40％的MRNA，表达的LNCRNA的百分比高于表达的MRNA在染色体1,2和11上的百分比。

五行中的差异表达的LNCRNA

lncrna和mrna的FPKM值(Supplementary Table S .3.)分析各组间lncrna / mrna的差异表达o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.和他们的三个有|日志的BIL后代₂FC | ≥ 1 and FDR ≤ 0.001 by DEseq software. The analysis of the differentially expressed lncRNAs (DE-lncRNAs) was shown in Fig.3.．与亲本相比，de - lncrna在后代中大多上调(图2)。3.a).此外，子代与子代之间的DE-lncRNAsO. longistaminata.(平均458个，其中69.2%在子代中上调)显著高于子代。o .漂白亚麻纤维卷(平均267个基因，58.1%的基因在后代中表达上调)。同时，与两个亲本相比，三个子代分别发现了41个和185个常见的de - lncrna(图)。3.在这些已鉴定的常见de - lncrna中，子代中上调lncrna的数量也高于下调lncrna的数量(图2)。3.C＆E）。上述结果表明，三个BIL后代和父母之间存在更大的差异O. longistaminata.，而在BIL子代中上调的de - lncrna可能发挥了关键作用。在三个子代的差异分析中，L1710对L1817中发现了299个DE-lncRNAs, L1710对L1730中发现了458个DE-lncRNAs(图)。3.a).这一现象与L1710和L1730株高差异最大是一致的。为了更详细地分析，我们统计了3个子代与亲本相比具有不同fold变化(FC > 2、FC > 10、FC > 50、FC > 100、FC > 200)的DE-lncRNAs(补充图S)2)．随着de - lncrna FC的增加，比较组的lncrna数量增多，后代与亲本株高差异较大。例如，在三个子代和o .漂白亚麻纤维卷，L1710中具有FC> 2的DE-LNCRNA的数量最多，而具有FC> 50/100/200的DE-LNCRNA的数量是L1730中最大的。

LNCRNA靶蛋白编码基因的预测及其GO分析

lncrna发挥生物学功能的一种方式是通过调节蛋白编码基因的表达CIS.要么反式互动。lncrnas可以通过一个调节靶基因的表达反式- 三和三CIS.-Reguted方法（CIS_MRNA_UP10K，CIS_MRNA_OVERLAP和CIS_MRNA_DW20K）（图。4a). cis_mRNA_overlap类可以进一步划分为10个子类(图1)。4b).目前的数据显示，523个lncrna中有89.5%(468个)通过调控靶基因的表达CIS.- 为此，其中45.3％（212例468）属于CIS_MRNA_DW20K监管类。这些结果表明CIS.监管而不是反式- 是主要的调节类型，和CIS.-调控位于靶基因下游20 kb处的lncrna是常见的CIS.- 在本研究中预测的LNCRNA-mRNA调节对中的类型。如补充表S所示4，共检测到431对lncRNA-mRNA调控对o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.及其三个BIL后代，其中373 mRNA是潜在的297lncRNA的靶标，表明一些LNCRNA可以同时调节多个MRNA。

为了进一步了解de - lncrna在其中的作用o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.以水稻基因组为参考，对所有对照组的de - lncrna的靶基因进行GO富集分析(图)。5)．结果表明，DE-LNCRNA的潜在靶基因显着富集（P< 0.001)。5)．此外，在细胞组分类显著富集GO项中，de - lncrna的潜在靶基因百分比低于水稻基因组(背景)，而在分子功能和生物过程类显著富集GO项中，de - lncrna的潜在靶基因百分比高于水稻基因组(背景)。这一现象表明，在分子功能和生物学过程范畴上显著富集的de - lncrna靶基因可能在调控的生长发育中发挥重要作用o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.和他们的三个BIL后代。

LNCRNA作用作为miRNA的前体

lncrna可以作为microrna (mirna)的前体。为了筛选这5个序列中的mirna前体，我们使用BLAST将lncrna的序列与miRbase数据库进行比对。如表所示2，共预测22个表达的lncrna为20个mirna的前体，其中18个lncrna为5个系谱的de - lncrna。大多数lncrna作为一个miRNA的前体，而其中两个(ltcon_00035053, ltcon_00007959)作为多个miRNA的前体(表)2)．此外，几个lncrna也可能是同一个miRNA的前体。例如，ltcon_00034708和ltcon_00034707都是miR396c的前体(表2)．另外，超过50%的预测为miRNA前体的lncrna被发现转录自2号染色体。使用RNAfold web服务器预测lncrna和miRNA前体的二级结构，可视化它们之间的关系。预测ltcon_00057871的二级结构包含多个茎环结构，其中一个是miR1850的潜在前体(图)。6)．前体经酶处理后最终形成成熟mirna (miR1850.1, miR1850.2和miR1850.3)。

lncRNA作为mirna的诱饵或靶模拟物的分析

LNCRNA可以用作直接或间接调节靶基因表达的诱饵[30.］．进一步探讨三种rna (lncRNA, miRNA, mRNA)在肿瘤中的作用o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.和他们的三个BIL后代，相互作用网络是基于之前的miRNA测序研究构建的[2］．网络中280个mirna共靶向78个lncrna和271个mrna (Supplementary Table S)5)．统计显示，72.2%(202 / 280)的mirna仅靶向mrna (Supplementary Table S5)．例如，OSA-MIR156K靶向8 mRNA（图。7A)，其中三个在水稻生长中被发现是重要的。具体来说，两个mrna (LOC_Os02g04680.1和LOC_Os02g04680.2)是两个转录本OsSPL3 (SQUAMOSA启动子结合蛋白like3)，水稻中的强调根冠发育[31.］．另一个mRNA (LOC_Os08g39890.1)为osspl14 / ipa1.，它可以监管DEP1（密集和直立胰腺1)，是影响株高和穗长的关键基因[32.］．此外，只有少量的miRNA（3.2％，9个，共280只）仅靶向的LNCRNA（补充表S.5， 图。7b).有24.7%(280个mirna中有69个)mirna同时靶向mrna和lncrna(补充表S)5)．进一步分析发现，只有5种mirna靶向lncrna多于mrna(图)。7c)，且当mirna同时靶向mrna和lncrna时，大多数mirna靶向mrna多于lncrna(84.1%， 58 / 69)，这表明在大多数情况下lncrna与mirna的结合能力弱于mrna。例如，osa-miR172d-5p靶向2个lncrna和7个mrna(图)。7d)，其中3个mrna (LOC_Os03g51030.1、LOC_Os03g51030.2和LOC_Os03g51030.3)为3个转录本凤凰（光敏色素的)，在控制水稻节间伸长中起多重作用[33.］．此外，有6个miRNA靶向等量的MRNA和LNCRNA（图。7e）。不同的miRNA也可以同时调节多个相同的目标（图。7F）。有趣的是，发现七个miRNA瞄准自己的潜在前体LNCRNA（表3.），表明这些LNCRNA不仅作为miRNA的前体，而且也可以与它们结合以参与靶基因表达的调节。

亲本表达水平显性分析

表达水平显性(Expression level dominance, ELD)是指某些基因在后代中的表达水平接近亲本一方，但不同于亲本另一方。最近，许多关于杂交种及其亲本的研究发现，mrna的表达在后代中表现出亲本ELD [2，29.，34.］．根据Yoo等人定义的标准。［34.，将基因表达模式分为12类，如图所示。8．超过50%的lncrna表现出亲本ELD (II、XI、IV和IX类)，约40%的lncrna在所有三个子代中均表现出越位上调/下调(III、VII、X、V、VI和VIII类)。此外，lncrna的数量显示亲本ELD-A (A代表o .漂白亚麻纤维卷)高于亲本ELD-B (B代表O. longistaminata.)。为了进一步了解ELD表达模式lncrna可能的生物学功能，我们将其潜在的靶mrna用于GO富集分析。如补充表S所示6在美国，大约30%的lncrna在每个子代中都有潜在的靶mrna。在L1817和L1730 GO的细胞组分、分子功能和生物学过程三个分类中，lncrna的靶蛋白数量显示ELD-A高于ELD-B (Supplementary Fig. S .)3.)．然而，在L1710的三个GO类别中，lncrna显示ELD-A的靶标数量都小于ELD-B。此外，在所有三个子代中，ELD-A lncRNAs靶标均在“细胞”、“细胞部分”和“细胞器”区域富集，而ELD-B lncRNAs靶标均在“膜”区域富集(Supplementary Fig. S .)3.)．此外，ELD-A lncRNAs靶点在L1710的‘binding’位点富集，而ELD-B lncRNAs靶点在L1817和L1730的‘binding’位点富集(补充图S)3.)．在L1710和L1730中，ELD-A lncRNAs靶点富集在‘cellular process’区域，而在L1817中，ELD-B lncRNAs靶点富集在这一区域(Supplementary Fig S)3.)．ELD-A lncRNAs靶标在L1730的“代谢过程”项中富集，而ELD-B lncRNAs靶标在L1710和L1817的“代谢过程”项中富集(补充图S)3.)．总之，非上瘾基因在比尔后代和父母之间的比较中占了大多数，而且，所有三个后代（L1710，L1817和L1730）偏向o .漂白亚麻纤维卷．

QRT-PCR验证数据

为验证测序数据的准确性，随机选取9个lncrna及其可能的靶基因进行qRT-PCR分析。结果显示，测序数据与qRT-PCR结果基本一致(图1)。9），表明测序数据是可靠的。用于QRT-PCR的引物在补充表S7中列出。

近年来，lncrna作为一种调节性rna已成为研究热点。随着测序技术的发展，lncrna已经被发现在植物生长和有性生殖中发挥关键作用[14.，35.］．具体地，研究表明，LNCRNA参与植物的雌性/雄性不育[36.，37.，38.，39.[植物应激响应过程[40，41］．到目前为止，没有关于LNCRNA表达模式的报告及其在其父母的BIL后代的功能。基于我们之前对mRNA和miRNA表达模式的研究o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.他们三个生物的后代[2]，对lncRNA表达模式的研究将有助于我们进一步了解BIL后代基因相对于亲本差异表达的调控因素。

lncrna可能参与调控植物激素相关基因的表达o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.和他们的BIL后代

植物激素可以独立地或以各种协调方式调节植物生长，开发和分化的生理反应。植物激素含量受相关基因表达的影响，而后续受到各种因素的转录和转录后水平的调节调节[29.，42，43］．许多下调多聚腺苷酸化(DPA)的lncrna参与了水稻ABA的生物合成、运输和代谢，从而激活了一系列应激反应基因的表达[44］．如下所述，在本研究中，一些LNCRNA靶向嗜酸甘油蛋白（GA），乙烯和生长素相关基因，其调节效应可能会对水稻的生长和发育产生影响。LTCons_00063919目标D35 / OsKO2(LOC_Os06g37364，补充表S4），编码一个ent-kaurene氧化酶(KO)的催化赤霉素生物合成，而没有该基因的水稻表现出严重的矮化表型[45］．SLRL1（loc_os01g45860），成员肝基因家族，ltcon_00002962靶向(补充表S4)， GA诱导表达SLRL1，过表达也会导致水稻的矮化表型[46］．GID2.(LOC_Os02g36974)为ltcon_00033182的靶基因(Supplementary Table S4)，在GA信号转导中调控一个抑制因子(SLR1)的降解，当水稻出现严重矮化表型时GID2.基因突变[47］．此外，预测ltcon_00032876为目标OSCTR2.(LOC_Os02g32610，补充表S4），并且RAF样蛋白质组成型三重反应1（CTR1）参与乙烯受体信号转导，以调节大米中的多种生长和发育过程[48］．此外,osarf24.是ltcon_00025454的靶基因(Supplementary Table S4)，低表情Osarf23.和osarf24.会降低水稻对生长素的反应，从而影响水稻的生长和形态发生[49］．因此，针对植物激素相关基因的lncrna可能调控植物的生长发育，影响植物的株高o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.和他们的BIL后代。

lncrnas可能会调节适应性o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.和他们的BIL后代

研究表明，LNCRNA参与植物对各种生物和非生物应激的反应[40，44，50］．Jain等人。［41]从24个水稻抗稻瘟病系中鉴定了多个lncRNA候选基因，揭示了它们在水稻抗稻瘟病中的调控作用。许多含有DPA的lncrna可能在水稻在各种非生物胁迫(如热、冷、干旱和盐胁迫)下的生长中发挥重要作用[44］．如补充表S所示4, LTCONS_00033755目标trehalose-6-phosphate磷酸酶（OsTPP1，loc_os02g44230），这是一个成员TPS /泛太平洋伙伴关系基因家族。的过表达OsTPP1能增强水稻对冷、盐胁迫的耐受性，同时激活多种胁迫响应基因的表达[51］．编码的蛋白质GF14e(LOC_Os02g36974, ltcon_00033182的靶向基因，补充表S4）影响防御反应基因，细胞死亡和对细菌枯萎病和鞘疱疹的表达[52］．同时，编码的蛋白质OsGF14e，正调控水稻穗瘟病抗性[53］．此外,WRKY13(LOC_Os01g54600)是ltcon_00010291的目标(补充表S4)，已知WRKY13可直接抑制WRKY42，而WRKY42可负调控水稻对稻瘟病菌(magnaporthe oryzae.)，通过抑制JA信号相关基因[54］．而且，OsPCF5由LTCons_00010204定位（补充表S4)，作为TCP转录因子家族的成员，OsPCF5在水稻应对低温胁迫中起负作用[55］．因此，上述四种LNCRNA可以调节抗病相关基因的表达o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.和它们的BIL后代，从而影响它们的适应性。

lncrnas可能会规范增长o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.通过竞争性地将miRNA与MRNA联系起来

一些lncrna作为诱饵与mirna结合，使这些mirna不能正常与靶基因结合，从而影响其对靶基因的调控[20.］．在水稻花药、雌蕊和种子中发现了2种lncrna分别吸附miR160和miR164 [35.］．本研究预测ltcon_00001063能竞争性结合miR169f。1与miR169o配合OSHAP2G.(LOC_Os07g41720)和OSHAP2H.(LOC_Os03g44540)，为HAP复合体HAP2亚基的两个编码基因[56］．由此推测，ltcon_00001063可能参与了水稻生长发育过程中HAP2亚基基因表达的调控。此外，预测ltcon_00034806和ltcon_00034805与miR172d-5p竞争结合光敏色素的（凤凰；LOC_Os03g51030)，调控水稻节节伸长，在水稻营养生长期起关键作用[33.，57］．因此，LTCONS_00001063，LTCONS_00034806和LTCONS_00034805可以通过具有特异性mRNA的竞争性结合miRNA来调节miRNA靶基因的表达水平，然后参与水稻的连接阶段的茎的生长过程。

两组间lncRNA表达的差异o .漂白亚麻纤维卷比BIL后代之间的小O. longistaminata.

我们以前的研究主要探讨了基因表达和miRNA条例o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.他们三个生物的后代[2］．本研究对这些物种中lncrna及其潜在靶基因的表达特征进行了研究。这两项研究发现了一些共同之处。例如，之前的研究表明，后代和后代之间的deg的数量O. longistaminata.比后代和o .漂白亚麻纤维卷．类似地，子代与子代之间的de - lncrna的数量O. longistaminata.也高于后代和o .漂白亚麻纤维卷在这项研究中。此外，前期研究表明，多数基因表现出亲本的ELD，且有多个ELD-A (A代表o .漂白亚麻纤维卷）基因比Eld-B（B代表O. longistaminata.)基因在三个后代中被观察到。同样，在本研究的三个子代中，超过50%的lncrna显示亲本ELD，且显示亲本ELD- a的lncrna数量高于显示亲本ELD- b的lncrna。以上结果表明，在BIL子代和亲代之间lncRNA表达的差异o .漂白亚麻纤维卷比BIL后代之间的小O. longistaminata.．以往的研究表明，大多数BIL后代的染色体补体是遗传自轮回亲本o .漂白亚麻纤维卷［2］．因此，LNCRNA表达差异的最可能原因是BIL后代和每个父母之间的遗传背景差异。

本研究采用高通量ss-RNA-seq技术，探讨lncrna的功能特征及差异o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.和他们的三个BIL后代。lncrna在5个细胞系中均有表达。对de - lncrna的分析表明，3个子代之间lncrna的差异o .漂白亚麻纤维卷，包括de - lncrna的数量和倍数变化，均大于3个子代之间的O. longistaminata.．此外，与亲本相比，大多数de - lncrna在后代中表达上调。部分lncrna能调控mrna的表达，其中大部分为CIS.监管。当mrna和lncrna同时被靶向时，大多数mirna靶向更多的mrna而不是lncrna。一些mirna被发现以自身潜在的前体lncrna为靶点。三个子代中有超过一半的lncrna表现出亲本ELD，且有大量的lncrna表现出亲本ELD- o。漂白亚麻纤维卷高于父母的父母 -O. longistaminata.，这表明三个后代都倾向于o .漂白亚麻纤维卷．进一步分析表明，lncrna可能参与调控五种植物激素相关基因的表达，并调控其适应性。综上所述，这些结果为阐明不同lncrna的功能特征和表达差异提供了有价值的线索o .漂白亚麻纤维卷，O. longistaminata.及其自生物的后代，并扩大了我们对水稻中LNCRNA的生物功能的理解。

植物材料

栽培稻ssp。籼稻简历。9311年,O. longistaminata.和他们的三个BILs (BC₂F_12.)后代(L1710、L1817和L1730)为材料。这些材料均来自武汉大学生命科学学院李少青博士的实验室，中国武汉。BC的建设₂F_12.由4个步骤组成：1）o .漂白亚麻纤维卷(母系)与O. longistaminata.(父系)产生F1杂种;2)与亲本杂交一代进行回交o .漂白亚麻纤维卷(母性)产生BC₁F₁；3)公元前₁F₁个人（父亲）被回交o .漂白亚麻纤维卷(母性)产生BC₂F₁；4）BC₂F₁最后产生于公元前₂F_12.通过11代单粒下降法自花受精。3个子代的基因组组成基本相同，大部分遗传自栽培稻(o .漂白亚麻纤维卷)，而其中只有10%到15%是遗传自O. longistaminata.［2］．如Cao等[2， 3个赤霉素后代的株高不同。其中5个株系成熟期株高排序为L1710 <o .漂白亚麻纤维卷< L1817 <O. longistaminata. < L1730 [2］．种子萌发的后代和o .漂白亚麻纤维卷播种于土壤中，30天后移栽于武汉大学温室内。的根状茎O. longistaminata.也分块种植。在拔节-孕穗期采得5个株系3个生物重复的茎，立即用液氮保存，用于后续RNA提取。

RNA文库的构建和测序

采用TRIzol试剂按照制造商(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)的方案提取5个品系茎的总rna。纯度、浓度及OD值_260./ od.₂₈₀采用Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent RNA 6000 Nano Kit)检测各样品中总RNA的比例。使用Ribo-Zero™rRNA去除试剂盒从总rna中去除核糖体rna (rRNA)，然后将rna随机碎片化。以片段RNA为模板，以随机的六碱基序列为引物，逆转录合成第一链cDNA，然后用dUTP替代dTTP合成第二链cDNA。然后通过cDNA末端修复、添加poly a -尾端和adapter、Uracil-N-Glycosylase酶切、多轮PCR扩增构建测序文库。对所有文库进行了质量控制和定量分析。最后，利用Illumina HiSeq 4000平台对15个文库进行测序，生成150 bp的配对端reads。每个株系都有3个生物重复进行测序。

数据过滤、序列比对及汇编

为了进一步确保rRNA未在原始reads中出现，使用短reads比对工具SOAPnuke (v1.5.2)将reads与核糖体数据库进行比对[58]，并删除对齐的读取(最多允许5个不匹配)。去除带有适配器的reads、N比大于10%且质量较差的reads后，将过滤后的reads与水稻参考基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_001433935.1)使用HISAT2软件(v2.0.4) [59]并使用Stringtie重新组装（v1.0.4）[60］．为了获得重新组装的转录物的位置关系，将它们与使用沟槽（v2.2.1）的工具之一与已知的MRNA和LNCRNA进行比较，而是将其与已知的MRNA和LNCRNA进行比较（V2.2.1）[61[然后使用绒毛（袖扣的一个工具，v2.2.1）合并最终转录物[61］．

鉴定MRNA和LNCRNA

参考Liu等人的研究鉴定了LNCRNA。［39.］．利用蛋白数据库Pfam预测组合转录本(FPKM≥0.5,Coverage > 1, Length > 200)的编码能力。http://pfam.xfam.org/）[62]和三种软件，包括编码潜能计算器(CPC, v0.9-r2, http://CPC.cbi.pku.edu.cn）[63，编码-非编码索引(CNCI，https://github.com/www-bioinfo-org/CNCI）[64]和txcdspredict（http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/jksrc.zip.)．四种判断方法具体阐述如下:1)如果转录本映射到Pfam数据库，则识别为mrna，否则识别为lncrna;2) CPC_threshold = 0，值大于0的转录本为mrna，否则为lncrna;3) CNCI_threshold = 0，值大于0的转录本为mrna，否则为lncrna;4) txCdsPredict_threshold = 500，值大于500的转录本为mrna，否则为lncrna。当上述四种方法中至少有三种一致时，转录本最终被鉴定为mrna或lncrna。

lncrna的差异表达分析

使用Bowtie2软件(v2.2.5)将Clean reads与参考基因组进行比对[65]，然后用RSEM (v1.2.12)计算转录本的表达水平[66］．RSEM软件采用的归一化方法为FPKM，公式为:FPKM =\（\ frac {10 ^ 6c} {nl / {10} ^ 3} \）．In this formula, ‘C’ is the number of unique fragments for the target gene, ‘N’ is the total number of fragments which were uniquely matched the reference genome, and ‘L’ is the total number of bases in the coding region of the target gene. The calculated FPKM values, representing the gene expression levels, can be directly used to compare the gene expression differences among different samples. Correlations for three biological replications were calculated based on FPKM values using cor function in R (v3.3.0,https://www.r-project.org/)．软件DEGseq [67[用于分析比较组的差异。在本研究中，表现出折叠变化（Fc）≥2的转录物（|₂FC | ≥ 1) and the false discovery rate (FDR) ≤ 0.001 were regarded as significantly differentially expressed transcripts. The differentially expressed lncRNAs were screened from the differentially expressed transcripts according to the ID of lncRNAs.

lncrna靶基因鉴定及GO分析

lncrna通过两种方式调控靶基因，包括CIS.- 和反式监管。当lncRNA扮演CIS.-调控作用，lncRNA在染色体上的位置与靶基因接近，故选择lncRNA邻近的mRNA作为其靶基因;当lncRNA扮演反式-调控作用，不依赖于与靶基因的位置关系，其靶基因可以通过计算结合能来预测。具体来说，根据Liu等人的研究[39.]，分析靶基因三个步骤：1）统计上分析所有识别的LNCRNA和MRNA之间的相关性（Spearman值≥0.6和Pearson值≥0.6）;2）确定LNCRNA播放CIS.-当它们位于目标基因上游10 k或下游20 k内时的调控作用;3)当lncrna不在该范围内时，使用RNAplex分析lncrna与mrna的结合能。如果结合能小于- 30，则判定为具有反式监管的效果。此外，如果lncRNA与目的基因存在重叠，将其进一步划分为10个亚类(如lnc-overlap-mRNA和lnc-anti -overlap-mRNA)，这将有助于加深我们对lncRNA的理解CIS.- lncRNA的规管详情[68，69］．此外，所有比较组中发现的差异lncrna (de - lncrna)的潜在靶基因均通过WEGO网站(http://wego.genomics.org.cn)，以水稻基因组为背景。

预测lncRNA作为miRNA前体

为了预测可能是microRNAs (miRNAs)前体的lncRNAs，使用BLAST工具将所有lncRNAs与miRbase (http://www.mirbase.org.）[70］．当MiRNA前体序列的LNCRNA序列的覆盖率超过90％时，LNCRNA被认为是miRNA前体，并且miRNA的前体序列来自先前的数据[2］．lncRNA和miRNA前体的二级结构由RNAfold web服务器绘制(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)．通过Cytoscape软件显示lncRNA、miRNA和mRNA的交互网络关系(v3.7.1，http://www.cytoscape.org)．

QRT-PCR验证数据

为了验证本研究中的LNCRNA测序数据的准确性，从所有表达的LNCRNA随机选择9LNCRNA和它们的预测潜在靶基因并通过定量实时PCR（QRT-PCR）验证。使用Trizol试剂（Invitrogen）提取来自五条线的茎的总RNA，并用随机引物逆转录。使用Primer 5.0软件设计LNCRNA / mRNA特异性引物（http://www.premierbiosoft.com/index.html.)．使用ABI步骤一加上实时PCR系统（Applied Biosystems，USA）中的SYBR @ QPCR混合物（Toyobo）进行PCR扩增。如前所述用三种生物学重复和三种技术重复处理QRT-PCR反应[29.］．此外,OsActin1［71]作为内控基因，对每个lncRNA/mRNA阈值循环反应进行归一化。

在当前研究期间分析的数据集可在NCBI序列读取存档（SRA）存储库中（https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi?view=announcement)， 15次运行的登录号为SRR9822767-SRR9822781。水稻参考基因组的网络连接为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_001433935.1．蛋白质数据库pfam的网页是http://pfam.xfam.org/．miRbase的网络链接为http://www.mirbase.org.．本研究中产生或分析的所有其他数据均包含在本文和附加文件中。

阿坝:

脱盐酸

BILS：

回交基因渗入行

CNCI:

Coding-Non-Coding指数

中国共产党:

编码潜在的计算器

CTR1:

组成型三重响应1

DE-lncRNAs:

差异表达lncRNAs

DEP1：

密集和直立胰腺1

分区:

聚腺苷酸化

古人说:

表达水平的主导地位

FC：

折叠变化

罗斯福:

错误发现率

方法：

开花基因座C.

遗传算法:

吉布林素

柯:

ent-Kaurene氧化酶

lncrana：

长非编码RNA

mirnas：

microRNA.

OsTPP1：

Trehalose-6-phosphate磷酸酶

光敏色素的：

凤凰

存在:

定量实时PCR

rrnas：

核糖体rna

OsSPL3：

SQUAMOSA PROMOTER-BINDING PROTEIN-LIKE3

SRA:

顺序读取存档

SS-RNASEQ：

股线特异性RNA测序。

不适用。

国家重点基础研究发展计划(no . 2013CB126900)。资助机构在实验设计、数据收集、分析和解释以及手稿准备中没有发挥作用。

作者笔记

1. 李孟娣和曹爱琴对这部作品贡献相当。

从属关系

1. 武汉大学生命科学学院杂交水稻国家重点实验室，武汉430072

   李孟迪，曹爱琴，王瑞华，李泽宇，李少青，王建波

贡献

JW和AC构思和设计了这项研究。ML和AC进行了大多数生物信息学分析并分析了大多数数据。ZL进行了一些生物信息学分析。RW执行了QRT-PCR实验。SL创建了BC₂F_12.线条并提供了实验材料，提出了对数据分析的一些关键建议并修改了稿件。AC负责种植材料。ML为来自所有作者的贡献编写了手稿。JW修改了稿件。所有作者均阅读并批准最终手稿。

相应的作者

对应到简帛王．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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