同源四倍体紫花苜蓿水分亏缺对牧草品质影响的遗传位点鉴定苜蓿L.）

背景

苜蓿因其对家畜的营养价值和对各种环境的适应能力，已成为世界上许多地区重要的饲料作物。然而，苜蓿品质相关性状的可塑性影响其对不同水分条件的适应性的遗传基础仍然很大程度上是未知的。

结果

在灌水梯度下，对198份紫花苜蓿核心种质的26个牧草品质性状进行了田间试验研究。品质性状与水分胁迫的回归分析表明，随着水分亏缺的增加，纤维相关性状与能量相关性状呈负相关。通过全基因组关联研究和测序分型，确定了100多个与不同水分处理下牧草品质相关的显著标记。其中131个标记与水分亏缺处理的多个性状相关。大部分相关标记与水分亏缺水平有关，说明牧草品质性状的遗传控制与胁迫处理有关。本文对24个与牧草品质相关的功能基因进行了注释，这些功能基因可能参与细胞发育或对水分胁迫的响应。

结论

本研究探讨了水分亏缺条件下牧草品质性状表型变异的遗传基础。本研究发现的SNP标记可为紫花苜蓿在保持牧草品质的同时增强耐旱性的遗传改良提供分子辅助选择。

苜蓿，“饲料女王”，是最富有成效和最优质的牧草作物。苜蓿品质已经取决于许多因素，包括蛋白质，纤维和木质素含量，相对饲料值，总消化营养素和其他物理和化学因素。苜蓿质量直接受到动物性能饲养价值的影响。纤维含量如酸性洗涤剂纤维（ADF）和中性洗涤剂纤维（NDF）是影响饲料质量的重要因素。苜蓿饲料含有35-55％的NDF，其贡献苜蓿的可消化能量值的〜20-30％，其余来自非纤维组件的剩余部分。相对馈送值（RFV）是一种工具，其主要基于其NDF内容来索引苜蓿品质。RFV指数估计来自ADF的苜蓿的可消化物质（DDM），并从NDF计算干物质摄入量（DMI）电位。然而，RFV具有重要的缺点，因为它没有考虑NDF消化率的变化如何影响苜蓿的能量含量或进气潜力。即使在未成熟的阶段收获时，苜蓿纤维的消化率也可能非常不同[1]．2004年，威斯康星大学的科学家设计了另一个指数，相对觅食质量（RFQ），用于估算饲料质量。RFQ采用纤维消化​​率和饲料的总消化营养素来估计摄入[2]．RFQ较RFV有所改进，因为RFQ能更好地反映动物饲养性能。RFQ强调纤维消化率，而RFV强调可消化干物质采食量。RFV继续被广泛用作评价牧草质量、比较牧草品种和价格的指标。然而，不同的纤维组分的消化率会导致不同的动物生产性能，当饲料与相似的RFV指数。

苜蓿饲料质量和产量受环境因素的影响，如土壤盐度和供水。灌溉不充分的苜蓿产量显着下降[3.]．干旱气候中的灌溉可以影响苜蓿干草的营养价值。干旱和高盐度是影响干旱和半干旱地区植物生长的主要因素。植物通过应力避免或耐压力应对这些挑战。耐胁迫植物在表型可塑性中进化了某些自适应机制，以实现不同程度的耐受性，而应力避免是植物最小化不良反应的能力。

表型可塑性的程度主要通过遗传变化确定。植物进化机制有助于适应选择性压力下的环境变化[4]．目前还不清楚植物表型可塑性是由特定的基因控制，还是在个体性状选择过程中上位性交互作用的结果。然而，遗传多样性和杂合性增强了对多变环境的适应性。识别植物的功能性状和可塑性是很重要的，这将有助于植物适应全球气候变化[5]．

分子标记的鉴定是遗传改善的标志物辅助育种的第一步。单核苷酸多态性（SNP）是一种在整个基因组中广泛存在的标记。发现SNP的高通量和高效方法之一是通过测序（GBS）进行基因分型，其主要用于玉米的系统发生和基因组 - 宽协会研究（GWA）[6]．它基于高吞吐量下一代测序[7]. 与商用SNP阵列相比，GBS具有成本低、省时、易于自动化等优点[8]. GWAS需要大量的标记在全基因组水平上对复杂性状进行定位。超过15000个单核苷酸多态性被用来鉴定与细胞壁生物合成和生物产量相关的重要标记M. Sativa.［9]．在苜蓿中，李等人[10.使用GBS标记来构建高密度连杆地图，代表高同时性之间的连接M. Sativa.及其野性相对，m . truncatula．

与传统的遗传定位不同，GWAS利用遍及整个基因组的数千个SNPs，利用连锁不平衡来识别与感兴趣性状相关的数量性状位点[11.]．若干因素可能会影响GWAS的能力来识别重要的关联，例如表型变异，单个数量，等位基因频率和人口结构[12.]．混合模型已被用来纠正人口结构，减少标志性关联的误报[13.]．Gwas已成功用于在一些主要作物中映射农艺性状，例如米饭，玉米，小麦，高粱和大豆[14.]．

苜蓿是一种同源四倍体物种(2n = 4X = 32)，苜蓿植株高度杂合子。在如此复杂的基因组中开发等位基因剂量的标记是一个相当大的挑战[15.]．紫花苜蓿品种是具有广泛遗传基础的合成群体，它们为GBS、GWAS和GS的应用提供了理想的体系。GWAS已被用于定位与苜蓿生物量产量、生物和非生物胁迫相关的数量性状位点[16.]．GWAS鉴定了与饲料质量相关的遗传标记[17.]．此外，利用近10000个SNP标记进行GS建模，进一步表明GS增加了紫花苜蓿生物量产量的遗传增益[18.]．

在本研究中，我们在198年苜蓿面板中评估了来自USDA-ARS西区植物介绍站的干旱耐受的198年苜蓿类别的面板中的26个牧草质量特征。大多数换乘在20世纪80年代收集在加拿大和美国北部和其他国家的旱地地区。在三个灌溉制度下在该领域中评估植物：含水良好，温和和严重的水缺陷。为了探讨饲料质量的遗传基础及其与水胁迫处理的相互作用，我们应用高通量基因组测序GBS，其次是GWAS，综合框架合并了QTL映射方法来研究Alfalfa质量特征的表型可塑性的基因组结构。水赤字的梯度。最终目标是在缺陷灌溉梯度下鉴定与苜蓿中饲料质量性状相关的遗传标志物，并根据遗传潜力使用密切关联的标志物用于高质量的苜蓿品种的育种选择，并降低环境的混杂性传统育种方法的病症。

牧草品质性状的表型变异

对26个品质性状进行了方差分析(ANOVA)，结果见表1．哺乳净能(NEL)平方和为0.29 ~ 130,770.31。大多数性状的差异具有统计学意义，概率< 0.0001。不同水分条件下的表型变异回归分析表明，水分亏缺对牧草品质有显著影响(图1)。1)．纤维相关性状ADF、aNDF、dNDF30、dNDF48均随水分亏缺而降低(图1)。11 - 4)。水分亏缺也降低了脂肪、RUP、IVDDM30和NDFD48的含量。1b 1 ~ 4)， TDNL、蛋白、IVDDM48和木质素略有下降(图1)。1c 1–4）。而能量相关性状包括：ME、NEL、TDN、NEM、NEG、RFV、ENE、DDM和NFC的值随水分亏缺而增加（图。1d，e和f）。水缺陷略微增加RFQ和灰分（图。1g 1-2）。

通过根据方法部分中所述的良好浇水和水赤字条件计算给定的加入中的每个性状的可塑性指数（PI）估计表型塑性。总的来说，与木质素，脂肪和蛋白质相比，水缺陷条件下发现了更高的PIS（图。2)．在水胁迫处理中，在温和的胁迫下发现比严重应激的高分压力更高的PIS。其中，分别在RFQ中发现最高的PI，分别为0.55,0.77和0.75，分别用于对照，轻度和严重的干旱条件。最低的PIS出现在DMM中，对照，温和和严重干旱分别为0.12,0.18和0.16。与温和的治疗相比，其其余的性状显示出严重的干旱较高的PIS。PI值在DMI和ANDF，ENE和NEL之间非常相似，而TDN和ME。

随着干旱程度的增加，纤维相关性状与能量相关性状的相关系数（r）降低。其中ADF、aNDF、RUP、木质素dNDF30和dNDF48与其它品质性状呈负相关，且相关系数随干旱程度的增加而增加（图1）。3.A，B和C，蓝色面板）。在能量相关性状之间发现阳性相关性（图。3.B和C，右下角的红色面板）。随着干旱的增加，相关性增加。当植物在严重干旱下时，这些性状之间发现了最高的R值（图。3.c） 是的。然而，干旱处理后，脂肪和其他性状之间没有显著变化（图。3.b和c)。

使用饲料质量特征的种质分析

用26个牧草品质性状的平均值进行聚类分析。两个大聚类和14个亚聚类，如图所示。4．第一个大集群包含8个子集群。该聚类中大部分种质来自美国和加拿大，其粗蛋白质和rfp等品质性状相对较高(表S1），所以我们将其命名为较高的牧草质量集群（图。4高级集群)。这一群中有两种检测，Rambler和Saranac，它们对盐/干旱敏感(图1)。4，子轮座5和8）。底部聚类进一步分为6个含有全世界种质的亚型蛋白剂，包括旧品种和具有相对较低的饲料质量的背板（图。4集群,底部)。Malone、Mesa Sirsa和Wilson这三个耐盐/耐旱的检测在这个集群中。4结果表明，耐盐/耐旱的紫花苜蓿种质品质较低，而敏感的紫花苜蓿种质品质较高。

全基因组牧草品质协会

利用GWAS对筛选出的10327个GBS标记与26个品质性状表型数据的组合进行了混合线性模型分析。分位数-分位数图（QQ）显示了富水对照（A）、轻度（B）和重度（C）水分亏缺的标记-性状关联曲线。5)．如图。5，期望(x轴)和观察(y轴)之间的一致差异P.-value表示整个基因组的X = Y偏差。标记-性状关联的显著性呈负对数P-值在y轴上。在大多数不相关的SNPs中，只有少量的真实关联被显示出来。总体而言，除灰分外，其他性状的显著性均较低(图1)。5a).轻胁迫下品质性状的标记-性状关联最为显著(图5)。5b).与轻度胁迫相比，重度胁迫的显著性水平更低(图5)。5c)。

在所分析的26个性状中，ash、NDFD48、dNDF30、dNDF48、NFC和TDNL具有最显著的标记性状相关性(图。6(b, e, h, k, n和q)。在重度胁迫下发现了相似的关联谱，但显著性低于轻度胁迫下(图5)。6c、f、i、l、o和r)。6a，d，g，j，m和p）。在鉴定的标志物中，最高有效标志物与灰分有关，它们位于染色体2,6,7和未知染色体（U）上（图。6b)。在相同的染色体上也鉴定了与NDFD48相关的显着标记物（图。6e）在低于胁迫下但不受控制和严重应激（图。6d和f）。显着的标记与DNDF30和DNDF48相关，它们位于染色体1,2,3和8上（图。6在轻度干旱中发现了与NFC和TDNL相关的标记，它们位于染色体2、6和7上(图1)。6, n, q)。

不同干旱处理下多个品质性状的共同标记

尽管质量特征中确定了不同的基因座，但多个特征中发现了常见标记物（表格2)．标记S1_110050725在CTL的CTL染色体4上鉴定的ADF也与其他10个特征显着相关，包括DDM，ENE，IVDMD30，IVDMD48，ME，NEG，NEL NEM，蛋白质和TDN（表2，顶行）。类似地，CTL中的DMI1标记S1_305729816也与其他6种其他性状相关联：IVDMD30，IVDMD48，NDFD48，RFQ，TNDL和粗蛋白质含量。ADF中标识的标记S1_231443201与DDM，ENE，ME，NEG，NEL，NEM，TDN和TDNL共享其关联。在温和胁迫下鉴定为灰分的染色体6和未知标记S1_292679040的四个标记（S1_197238737-90）也与6种其他性状有关。标记S1_351118210和S1_276968205分别在CTL中鉴定的S1_276968305和S1_276968305分别鉴定为IVDMD48和灰分，与5个其他特征显着相关。用于DMI1的标记S1_174013573也与严重应力的DMI，脂肪，RFQ和RFV相关。与ASH相关的八个标记也与NDFD48，NFC和TDNL相关联（表2)．另外，分别在四个，三个和两个特征中鉴定了九个，十八和五十五个标记。剩余的标记与一个特征有关（表2，底部）。有趣的是，大多数具有较低的高显着标记P.值及更高R²是常见的标记之一，表明这些标记可能对干旱条件下牧草品质有重要影响。其中10个标记与3个性状(NDFD48、NFC和TDN)相关。的P.这些标记的值范围为4.01E-08 (S1_21394491) ~ 5.79E-16 (S1_197238737)，标记的R²分别为0.22至0.38（表2)．为了监测不同处理下群体的遗传结构，我们利用所有处理的平均值，将与CTL显著相关的标记、轻度和重度干旱处理与已鉴定的标记进行了比较。在对照组鉴定的68个标记中，平均也鉴定了17个标记(图。7a).在轻度胁迫中鉴定出的70个显著标记中，只有10个在平均胁迫中也鉴定出了显著标记(图1)。7a).在严重干旱中鉴定出的67个标记中，平均也有20个标记(图5)。7一种）。我们还比较了直接在三种治疗中确定的常见标记。每对处理之间有3种常见标记物（图。7b). 3个处理中均只发现2个标记(图5)。7b)。

鉴定更接近重要标记基因座的功能基因

使用显着标记的侧翼序列，我们对参考序列进行了爆炸搜索，以识别重要标记基因座的潜在候选基因。鉴定的标记，发现23例依赖于已知基因附近m . truncatula基因组(表2)．在水分充足条件下鉴定的细胞中，与DMI1相关的标记S1_305729816接近程序性细胞死亡。与灰分相关的标记S1_371197359与网状蛋白B2重叠。与NFC相关的标记S1_153379823与镉/锌转运atp酶相邻。在轻度水分亏缺条件下鉴定出多个标记，其中标记S1_292679040与细胞色素P450家族蛋白相邻;标记S1_300540244与udp -糖基转移酶相邻;S1_311409163紧邻exostosin;S1_62932631邻近螺旋环螺旋dna结合域蛋白;S1_309228882与类胡萝卜素裂解双加氧酶相邻;S1_130145842与RING锌指蛋白相邻; S1_294827153 was adjacent to auxin-binding protein ABP19a; S1_274178328 was adjacent to E3 ubiquitin protein ligase XBOS32; S1_319319782 was adjacent to IQ calmodulin-binding motif protein; and S1_380790483 was adjacent to Feronia receptor-like kinase. Three markers, S1_20593175, S1_368369179 and S1_92116984 associated with dNDF30 and dNDF48 were in close vicinity to LRR-receptor-like kinase, HASTY1 and OPT family oligopeptide transporter, respectively. Of those identified under severe water deficit, markers S1_108148173, S1_259198355 and S1_261323300 were adjacent to TIR-NBS-LRR resistance protein, interferon-induced guanylate-binding protein and peroxidase family protein, respectively. Another marker S1_310998070 associated with fat was adjacent to RNA-binding (RRM/RBD/RNP motif) protein.

轻度干旱可降低苜蓿纤维含量，提高其消化率

生产高质量的苜蓿需要了解环境和饲料管理措施如何影响作物的生长和发育。环境、植物反应和营养价值之间存在因果关系。一般来说，产量与饲料品质呈负相关。在常规管理下，苜蓿产量在早春和夏季增长最快，而品质在炎热的夏季下降。高品质牧草频繁采伐往往导致产量低[19.]．在之前的研究中，我们鉴定了22个与不同水分亏缺条件下紫花苜蓿产量相关的标记[20.]．其中15个标记与本研究鉴定的品质相关标记一致，表明这些标记可能参与了苜蓿产量和品质性状的调控。有趣的是，其中14个与dNDF30相关，表明干旱胁迫下可消化中性洗涤纤维与产量相关。据报道，饲料的可消化NDF在成熟期可降低40%以上[21.]．木质化过程在成熟过程中变得活跃，木质素、纤维素等复杂碳水化合物被富集并结合在一起形成维管和木质部组织，支持植物生长和养分运输系统[22.]．然而，木质素是一个基本上难以丧失的化合物。细胞壁中的木质素通过瘤胃微生物降低纤维素和半纤维素的消化率[23.]. 鉴于苜蓿品质与成熟期产量呈负相关，这可能表明与NDF相关的基因座也可能影响水分亏缺下的苜蓿产量。

任何阻碍植物发育的因素都有利于牧草品质的维持。如果一株植物在生长过程中受到胁迫，通常会产生较短、较细茎、叶面较厚的紫花苜蓿。另一方面，高温会促进牧草生长，对牧草品质有负面影响。紫花苜蓿是相对耐旱的，因为它更深的根系允许紫花苜蓿吸收深层土壤的水，并迅速从干旱条件恢复。然而，当蒸腾作用超过水分吸收时，对植物施加的胁迫影响代谢、发育、生长并最终影响产量。水分亏缺促进营养生长减少，促进早熟。有人认为，轻度干旱胁迫可能有利于牧草品质，因为干旱胁迫会加速苜蓿向生殖生长的转变[24.]. 此外，短期干旱胁迫下叶片比例越大，饲料品质和消化率也越高[24.]．然而，如果干旱胁迫过于严重，并且延长时期，植物应激是永久性的，可能无法恢复。

Alfalfa纤维由三种组分组成：纤维素，半纤维素和木质素。增加饲料的纤维含量通常会降低其能量含量。在纤维级分中，纤维素是动物消化的主要化合物，而木质素在瘤胃和下肠中几乎难以消化。在我们的研究中，Drouground均显着下降，ADF，ANDF和木质素均又增加了能量相关的特性，如TDN，ENE，DDM，NFC，RFV和RFQ。细胞壁重塑是植物对非生物应激的共同响应。随着干旱胁迫下大幅改变的生物质组成，细胞壁中的纤维素含量显着减少。干旱胁迫通过酶促糖化增加纤维素转化率，影响细胞壁结构刚性。在干旱胁迫下，细胞壁组成和细胞壁塑性程度在基因型中显着变化。然而，在不同水平的抗旱之间发现了弱相关性，表明其独立的遗传控制。

水分亏缺条件下牧草品质的遗传结构

在与不同灌溉发作下的饲料质量相关的标记中，少数标记在含水量和水赤字条件下共同，而大多数均依赖于治疗（图。6)，表明它们的依赖基因控制。表型均值用于GWAS时，能量相关性状DDM、TDN、ENE、ME、NEM、NEG和NEL与DMI、DMI1、RFV和RFQ之间存在相似的关联模式。这些性状对平均值的遗传响应可能表明它们之间存在共同的遗传基础。这是合乎逻辑的，因为所有这些都是与能源相关的特征。

在GWAS中，我们只发现了九九的相关标记，这些标记具有跨水缺陷治疗的一致效果（图。6b)。其余的差异与各自的治疗相关。有趣的是，与由严重水缺水鉴定的那些相比，约2倍的标记与温和的水缺损有关（图。6B)，表明轻度水分亏缺对牧草品质性状的遗传响应比重度胁迫和对照更有利。在之前的研究中，我们在同一组材料中鉴定了22个与水分亏缺条件下生物量产量相关的标记[20.]．这些标记物在充分浇水的对照组中没有发现。同样，在本研究中，在对照条件下没有发现与水分亏缺下牧草品质相关的标记。在苜蓿品质性状全基因组关联和遗传选择研究中，在苜蓿1、2、4、5、7和8号染色体上鉴定了10个与酸性洗涤木质素(ADL)、NDFD和CP相关的SNP标记[17.]．蛋白质含量是影响苜蓿品质的另一个重要因素。在这项研究中，我们确定了与CP和RUP相关的14种标记，在所有水条件下，表明这些标志物可能在蛋白质合成中发挥常见作用，无论水条件如何。但是，基于遗传位置，这些标记没有与先前报告的那些重叠17.]．这可能是因为两项研究中使用的苜蓿种质和应激治疗的遗传背景不同。由于天旱耐受性是复杂的性状并受到遗传和环境相互作用的影响（G X E），因此相关原因变体的等位基因效应可能受到应力的治疗的影响。因此，我们不能直接解决有条件中性等位基因是否以比组成型遗传变异的速度更快地累积遗传变异。例如，当发生严重的水缺损与轻度胁迫和浇水良好的对照时，显着降低了显着标记的数量。这可能表明植物关闭了一些代谢途径，以节省能量，以在严重干旱胁迫下实现干旱避免。由于较低的变化，在严重干旱条件下，QTL检测的功率也可能降低。

推测与牧草品质相关的候选基因

在23个与牧草品质性状相关的注释基因中，有3个基因在充足水分条件下被鉴定出来2)．编程的细胞死亡（PCD）蛋白与DMI1，CP，RFQ，TDNL，NDFD48，IVTDMD-30和IVTDMD-48相关。植物中的PCD是发展和防御机制的重要组成部分。它是植物中二次细胞壁形成期间的重要过程[25.]．PCD与多个性状的关联表明，PCD通过多种途径参与牧草品质调控。网状样蛋白B2 (RTNLB2)与灰分和TDNL相关。据报道，拟南芥RTNLB2位于内质网中，参与调控受体向质膜的转运[26.]．另一种可能是镉/锌转运atp酶(cadA)与NFC相关。在拟南芥中，cadA位于液泡中，参与镉、锌或钴的转运，可能通过液泡隔离具有解毒功能[27.]．在轻度水赤字下鉴定了十四个基因（表2)．其中，细胞色素P450与灰分，DNDF48，NDFD48，NCF和TDNL相关。P450家族蛋白质是植物中的大型酶促蛋白质，在植物发育中发挥作用，生物和非生物应激反应[28.]．许多P450单氧基酶如肉桂酸酯4-羟化酶（C4h）和阿错5-羟化酶（F5H）是木质素生物合成中的关键酶[29.]．Sakiroglu等人。（2012）使用F5H作为木质素合成途径中的候选基因之一，并分析了二倍体苜蓿三胎的外显子1和2的单倍型，发现外显子2具有最多的SNP。但是，在F5H和细胞壁生物合成的外显子2之间发现了薄弱的关联[30.]．udp -糖基转移酶(UGT)与灰分、NDFD48、NFC和TDNL相关。UGT在脱落酸(ABA)稳态中发挥作用，调节植物对干旱、寒冷和盐度等环境胁迫的响应[31.]．在以往的研究中，在8号染色体上发现的另一个编码糖转移酶的基因也与ADF、NDF、木糖等几个品质性状有关[9]．环锌指蛋白(RZFP)在轻度水分亏缺条件下与灰分、NFC和TDNL相关。据报道，AtRZFP的过表达通过增强ROSs的清除能力，维持Na，从而增强盐和渗透耐受性⁺和K⁺稳态，调整气孔孔，以减少水分损失，积累可溶性糖和脯氨酸以调节渗透潜力[32.]．当拟南芥中过表达ATRZFP时，脯氨酸和可溶性糖含量增加[32.]．e3 ubiquitin蛋白质连接酶Xbos32与灰分和NFC相关。通过修饰UPS相关蛋白质，提出了E3 UB-Ctigase在控制蛋白质周转方案中的作用，并在植物反应期间促进核蛋白质组可塑性对环境应激信号进行贡献[33.]．IQ钙调蛋白结合基序蛋白与灰分有关。高等人。［34.据报道，OSA-MiR369C的基因编码IQ钙调蛋白结合基质蛋白影响了几种非生物胁迫下的植物生长调节，例如水稻的温度，干旱和盐度。本研究中钙调蛋白结合蛋白的鉴定支持该调节剂是通过钙信号通路响应非生物胁迫的重要参与者的假设[35.]．在严重的水分亏缺条件下鉴定出5个基因2)．其中，TIR-NBS-LRR蛋白与灰分和NFC相关。植物TIR-NBS-LRR基因家族含有大类疾病抗性基因[36.]．本研究对与干旱相关的ir - nbs - lrr基因的鉴定表明该基因可能在干旱响应中发挥作用。有证据表明，NBS-LRR基因ADR1的过表达增强了拟南芥的耐旱性，而ADR1可能在抗病性和耐旱性之间信号网络的交叉对话中起信号转导作用[37.]．干扰素诱导的鸟苷结合蛋白(IIGBP)与灰分和NFC相关。IIGBP是一种由干扰素诱导的GTPase，在指导炎症小体亚型特异性反应及其对多种微生物病原体的细胞自主免疫的后果中发挥作用[38.]. 过氧化物酶家族蛋白与灰分和NFC有关。过氧化物酶反应直接参与植物细胞对不利环境条件的保护。植物过氧化物酶对生物和非生物胁迫的反应有多种作用。Ⅲ型过氧化物酶RCI3参与了高亲和力钾摄取转运体HAK5的诱导[39.]．此外，在植物防御机制中，过氧化物酶可能具有细胞壁交联活性[40]．一种rna结合(RRM/RBD/RNP基元)蛋白与严重缺水条件下的脂肪相关。rna结合蛋白(RBP)在转录后基因调控中发挥重要作用。最近对植物rbp的研究表明，它们除了在不同的发育过程中发挥作用外，还参与植物对各种环境条件的适应[41.]．尽管在缺水条件下发现的其他基因在应激反应中没有直接作用，但它们参与了细胞发育的不同过程。例如，生长素结合蛋白(ABP)在轻度水分亏缺下与灰分、NFC和TDNL相关。有人建议,在拟南芥转化涉及广泛的细胞响应生长素,要么作为响应的主要监管机构,如界面进入细胞分裂,或者作为一个微调装置的调节生长素早期反应基因的表达(42.]．

在本研究中，我们在赤字灌溉践行中的田间试验中的198苜蓿牧师面板中评估了26个牧草质量特征。我们的研究结果表明，水缺陷降低了纤维内容和增强的能量相关性状。在RFQ和质量平均值之间获得最高的相关系数，支持RFQ与RFV相比估计总牧草质量更准确。只有少量标记通常与所有治疗相关联。大多数相关标志物依赖于水缺陷治疗，表明不同水平的饲料质量特征的不同遗传对照。虽然报告了GWA对饲料质量进行了报道，但我们是第一个解决水资源缺陷下饲料质量性状的表型可塑性遗传基础的遗传基础。从本研究中获得的信息将通过提高饲料质量的同时增强干旱/耐盐性/耐盐性来对Alfalfa的遗传改善有用。

植物材料

从USDA-ARS西部地区植物引种站获得了198份具有抗旱潜力的苜蓿种质。大多数种质是在20世纪80年代在加拿大和美国北部收集的，包括不列颠哥伦比亚省、萨斯喀彻温省、马尼托巴省、爱达荷州、蒙大拿州、内布拉斯加州、华盛顿州、北达科他州和南达科他州。最初收集项目的目标是对在干旱胁迫环境中存活25年或以上的苜蓿林进行取样。其余的材料来自不同的国家，其中12份来自阿富汗，2份来自中国和俄罗斯，1份来自下列国家：阿尔及利亚、保加利亚、印度、黎巴嫩、德国、西班牙、土耳其、阿曼和也门（表S）1)．本研究中使用的所有植物材料均由美国农业部(USDA-ARS)西部区域植物引种站提供。

田间试验

现场试验如前所述(Yu, 2017)。对198份紫花苜蓿材料进行无性系繁殖。2016年，这些克隆植物被移植到华盛顿州州立大学灌溉农业研究与推广中心的罗萨农场。如前所述(Yu, 2017)，对这些地块进行了充足的灌溉控制、轻度和重度干旱胁迫。

苜蓿抽样和饲料质量测量

在不同水分胁迫处理的田间样地采集地上部样品，并对其进行质量分析。植物样品在60°C的烘箱中干燥。然后在Wiley Mill (Thomas Scientific, US)进行研磨，最后在Cyclotec 1093取样磨(Foss, Hillerød, Denmark)进行研磨，通过1毫米的筛网。用近红外反射光谱(NIRS)对样品粉末进行加载和测量。光谱采用扫描单色仪(FOSS NIR Systems 6500, Silver Spring, MD, USA)采集，光谱范围为400 ~ 2500 nm。发表的NIRS联盟方程13AH50.2-eqa (NIRS饲料和饲料检测联盟，http://nirsconsortium.org）被用来预测质量因素。

统计分析

对表型数据进行了与基因型随机效应的差异分析和干旱治疗的固定效果。回归图（图。1）和相关系数（图。3.）使用JMP13（SAS Institute，NJ）获得。使用非线性映射方法进行聚类分析，以研究使用现场实验中的质量特征的组合来研究198种附加的关系。在使用JMP基因组学评估的特征之间进行相关分析（SAS Institute，NJ）。

为了估算表型可塑性，根据valladares等，计算可塑性指数，[43.] 如下：

其中PI为塑性指数，M_最大限度是治疗平均值的最高值和m_闵是群体中某一特定性状的处理平均值的最低值。

基因分型结果进行排序

根据制造商的协议(Qiagen, CA)，从个体中采集叶片样本，使用Qiagen DNeasy 96植物试剂盒进行DNA提取。甲基化敏感限制性内切酶EcoT221用于DNA消化，然后构建文库。基因组文库使用Illumina HiSeq2000进行测序。FastQC (v0.11.2)用于序列读取的初始质量检查(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)．栈中内置的Process_Radtags用于反卷积和清除测序读取[44.]．然后将得到的高质量的读数与m . truncatula参考基因组（MT4.0 V1）（www.phytozome.org/m.．truncatula)使用Burrow Wheelers Alignment工具(版本0.5.9)，使用默认的对齐参数[45.]．>缺失50%，MAF < 5%的基因座被移除。过滤后，得到10,327个SNPs，平均个体深度为27 X。GBS的Row数据提交给NCBI Sequence Read Archive，生物项目ID: PRJNA287263，生物样本登录号:AMN03779142 - SAMN03779330。

基因组关联分析

筛选后的标记数据使用Bradbury等人的TASSEL进行GWAS。46.]．混合线性模型用于如前所述的GWAS [20.]．以0.05的Benjamini错误发现率(FDR)作为识别显著标记-性状关联的阈值[47.]．

本研究中产生或分析的所有数据均包含在本文及补充文件中。GBS原始数据提交至NCBI数据库，生物项目ID: PRJNA287263。

阿坝:

脱落酸

ADF:

酸性洗涤纤维

andf：

用淀粉酶分析中性洗涤剂纤维

ANOVA：

方差分析

CP：

粗蛋白

CTL：

控制

糖尿病:

干物质

DDM：

消化的干物质

DMI:

使用NDF摄取干物质

DMI1:

使用NDF和NDFD的干物质摄入量

eNE：

估计净能量

罗斯福:

错误发现率

GBS:

基因分型结果进行排序

g:

基因选择

GWAS:

基因组协会研究

IVDDM30：

30-H体外可消化干物质

IVDM48：

48小时体外可消化干物质

我：

代谢能量

nem：

维护净能量

否定:

净增益能量

DNDF30：

30-h消化NDF

DNDF48：

48小时可消化NDF

NDFD48：

48小时NDFD

警队辨称:

泌乳的净能量

NFC:

非纤维碳水化合物

德尼尔斯：

近红外光谱

PCD：

已编程的细胞死亡

PI：

可塑性指数

QTL：

定量特质基因座

RFQ：

相对觅食质量指标

RFV：

相对饲料价值指数

RUP:

瘤胃未解决的蛋白质

SNP：

单核苷酸多态性

流苏:

关联、进化和连锁的性状分析

TDN:

总可消化养分

TDNL：

豆类的总可消化营养素

我们感谢Martha Rivera夫人为她的技术援助和数据收集。

本研究得到美国农业部NIFA_AFRP资助编号2015-70005-24071和农业研究服务基地基金的部分支持。

隶属关系

1. 美国农业部 - 农业研究服务，植物种质介绍和检测研究，24106 N Bunn Road，Prosser，WA，99350，美国

   林森、塞萨·奥古斯托·麦地那、比尔·博格、胡金国、于龙溪

2. 华盛顿州立大学灌溉农业推广与研究中心，美国华盛顿普尔塞尔布恩路24106号

   史蒂文·弗兰森

3. 华盛顿州立大学富兰克林县推广办公室，404西克拉克街，帕斯科，华盛顿，美国

   史蒂文诺伯格

贡献

LXY计划和设计了这项研究，进行了基因分型和数据分析。BB和SF进行了野外工作和饲料质量测试。LXY, SL, JH和SN撰写了手稿。LXY, SL准备了这些数字。LXY, SL和CCM对稿件进行了修改。作者阅读并批准了最终稿件

通讯作者

对应到龙西宇．

伦理批准并同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

相互竞争的利益

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意事项

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