CRISPR / Cas9-mediated突变GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在水稻的简历。中华11号赋予抵抗力GydF4y2Ba黄oryzaeGydF4y2BaPV。GydF4y2BaoryzaeGydF4y2Ba没有屈服罚款GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

稻米细菌枯萎病GydF4y2Ba黄oryzaeGydF4y2BaPV。GydF4y2BaoryzaeGydF4y2Ba（GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba），是东南亚和西非毁灭性的水稻病害。GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba已知，该基因是白叶枯病的一个主要易感基因，由来自亚洲或非洲的四种不同转录激活因子(TAL)效应靶向GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba菌株。然而,GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba叶片背景中的单一敲除或启动子突变体是适度的抗体甚至易于非洲的GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba菌株。因此，在这项研究中，我们被淘汰了GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在水稻的简历。中华11型疾病评估背景。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在本研究中，CRISPR/Cas9被用来破坏GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba通过对水稻基因组中相应的编码区进行修饰。中华11 (GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba）.总之，我们获得了九个不同GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba突变的等位基因。除了对亚洲具有广谱抗性GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba株，检测突变等位基因也表现出对非洲强阻力GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba应变AXO1947。此外，表达GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在血管组织中检测到，包括茎，叶护套，叶片和根。中断GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba增加株高而不降低产量。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

中断的GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在中华11背景中，能够赋予非洲的强烈抵抗力GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba菌株AXO1947和亚洲GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba应变PXO86。GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba在正常生长条件下具有正常的生殖生长和较高的株高。这些结果意味着GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba可以作为更好的测试线GydF4y2Ba甜蜜的14.GydF4y2Ba单克拉特突变体在Kitaake背景中的诊断套件用于米饭的抗性。在利用时需要考虑遗传背景和增加的植物高度GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba用于抗性水稻育种。GydF4y2Ba

稻米细菌枯萎病GydF4y2Ba黄oryzaeGydF4y2BaPV。GydF4y2BaoryzaeGydF4y2Ba（GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba），是东南亚和西非的毁灭性水稻疾病[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］．该病原体含有III型效应剂，可通过III型分泌系统直接注入水稻细胞[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］．转录激活子样(TAL)效应子，是主要的毒性效应子GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba，功能类似真核转录因子，通过与靶基因启动子中的效应结合元件(effitor -binding elements, EBEs)结合，诱导靶基因表达[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］．TAL效应子由一个n端III型分泌信号、一个c端核定位信号和激活域和一个中央重复域组成。中心重复区域由1.5-33.5个串联重复组成，通常有33-35个氨基酸长，每个重复区域的第12位和第13位氨基酸被称为重复可变二残基(RVDs) [GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．RVDs的数量和顺序决定TAL效应器的识别特异性[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

ossweets.GydF4y2Ba编码一系列糖转运蛋白的糖，分为3个植物发血[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］．GydF4y2Baossweets.GydF4y2Ba进化支III (GydF4y2BaOSSWEET11.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba）据报道是能够诱导易感响应时通过人工TAL效应诱导的[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］．然而，目前只有他们三个人（GydF4y2BaOSSWEET11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba)被认为是由GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba与田地隔离;相应的GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba能够诱导另外两个的菌株GydF4y2BaOsSWEETGydF4y2Bas (GydF4y2BaOSSweet12.GydF4y2Ba要么GydF4y2BaOSSweet15.GydF4y2Ba）尚未确定[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba］．此外,GydF4y2BaOSSWEET11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba是主要易感对象GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］．GydF4y2BaOSSWEET11.GydF4y2Ba是由TAL效应体PthXo1和GydF4y2BaOSSweet13.GydF4y2Ba通过PthXo2或PthXo2样TAL效应，而GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba是四种不同的TAL效应器的靶点，即AvrXa7、PthXo3、TalC或Tal5 [GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba］．AvrXa7, PthXo3, PthXo1, PthXo2和PthXo2样TAL效应器在亚洲菌株中存在[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba］．TalC和Tal5仅从非洲菌株中分离得到，整个非洲都存在TalCGydF4y2BaXOOGydF4y2Ba而Tal5在一半的菌株中存在[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba］．因此,GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba是所有测序的非洲的目标GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba菌株和大多数亚洲人GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba菌株。GydF4y2Ba

自从GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba激活GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba通过与启动子区特异的EBEs结合，对启动子区进行基因编辑，获得抗性水稻植株GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba或通过在抗病水稻种质库中鉴定天然的ebe突变等位基因[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］．隐性抗性(GydF4y2BaR.GydF4y2Ba)基因GydF4y2Baxa41 (t)GydF4y2Ba，这是自然的ebe突变等位基因GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba，已在非洲水稻品种被认定[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba］．GydF4y2Baxa41 (t)GydF4y2Ba在启动子区域与AvrXa7、PthXo3和Tal5 EBEs重叠，缺失18bp，因此对GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba取决于AVRXA7和PthXO3的毒力[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba］．由于TALC结合位点在启动子区域GydF4y2Baxa41 (t)GydF4y2Ba是完整的，所有的测序非洲GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba菌株藏有滑石效应器，GydF4y2Baxa41 (t)GydF4y2Ba无法赋予非洲的抵制GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba压力(GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba］．遗传修饰的稻植物，在启动子区改变预算外开支GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba表现出抵抗力GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba取决于相应的TAL效应，发育正常[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba］．然而，先前的研究发现，在滑石EBE是突变的启动子GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba导致了对非洲菌株BAI3的敏感反应，该菌株在Kitaake背景中依赖滑石粉的毒性[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba］．最近，研究人员发现，仅在Kitaake背景中的TalC EBE突变仍然不能赋予非洲菌株耐药性;相反，Kitaake背景中的一个五倍突变启动子株系(PthXo1、PthXo2、TalC、AvrXa7和Tal5 EBEs突变的水稻)对非洲菌株AXO1947具有中等抗性[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba］．此外,GydF4y2Ba甜蜜的14.GydF4y2Bakitaake背景中的单敲除突变体也易于非洲菌株AXO1947，中位数滞后长度约为10厘米，而GydF4y2Basweet13; sweet14GydF4y2Ba双敲除突变体对非洲菌株表现出完全抗性[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba］．所有这些以前的研究证明了的那单淘汰赛GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在成本背景下无法赋予非洲菌株的抵抗力。然而，GydF4y2BaOSSWEET11.GydF4y2Ba和GydF4y2BaOSSweet13.GydF4y2Ba不是非洲人的目标基因吗GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba菌株。从理论上讲，这两种基因的突变不应有助于北虾对非洲的抵抗力GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba菌株。目前的知识不能解释不同突变体的疾病反应。GydF4y2Ba

OSSweet14.GydF4y2Ba，编码有七个跨膜螺旋的糖转运体，以质膜为靶点，主要负责蔗糖和葡萄糖的转运[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］．TAL效应体通过诱导水稻的表达来转移水稻的营养资源GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba］．的GydF4y2BaSWEET11GydF4y2Ba和GydF4y2BaSWEET12GydF4y2Ba单突变体GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba没有明显的形态缺陷[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］．然而，双突变体较小，并且具有从叶子出口蔗糖的能力损害[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］．虽然大米GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2BaT-DNA插入突变体显示AVRXA7和PTHXO3特异性隐性抗性，纯合突变体具有显着的发育缺陷，包括小种子和严重的生长迟缓[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba］．纯合的植物需要〜30天达到14天龄常规植物的大小[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

在我们的研究中，我们使用CRISPR/Cas9对编码区域进行突变GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在水稻的简历。中华11 (GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba)以测试是否中断GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在中华11背景中，将导致广谱耐受性GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba包括那些来自非洲的菌株。这将帮助我们知道是否GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba是一个更好的测试仪线GydF4y2Ba甜蜜的14.GydF4y2Ba水稻抗枯萎病诊断试剂盒Kitaake背景中的单敲除突变体，以及利用时是否需要考虑遗传背景GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba用于抗性水稻育种。而且，评估GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba农艺性状将帮助我们理解GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba正在开发中，在利用时将提供更多的信息GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba水稻抗病基因敲除突变体的研究。GydF4y2Ba

世代水稻系编辑在GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba编码区域(GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba）GydF4y2Ba

修改GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在水稻的简历。中华11是一种CRISPR/Cas9基因，主要针对两个编码区GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba基因组序列建造并转变为中华11背景。靶I和靶II分别位于第1和第3外显子（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba一种）。聚合酶链反应（PCR）和测序用于检测在水稻转化的修改。两个水稻品系，GydF4y2BaCR-S14-2GydF4y2Ba和GydF4y2BaCR-S14-6GydF4y2Ba，在t中含有题联的纯合突变体等位基因GydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba一代（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab)，其余4个株系在T中含有双等位突变等位基因GydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba代，即GydF4y2BaCR-S14-1GydF4y2Ba那GydF4y2BaCR-S14-9.GydF4y2Ba那GydF4y2BaCR-S14-10GydF4y2Ba和GydF4y2BaCR-S14-29GydF4y2Ba；在TGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba或t.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba的一代。根据测序结果，在突变等位基因上进行了修饰GydF4y2BaCR-S14-1-IGydF4y2Ba是一样的，在GydF4y2BaCR-S14-6GydF4y2Ba，所以获得了总共九种遗传突变等位基因（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab）。GydF4y2Ba

突变等位基因的6个含有移码突变，即，GydF4y2BaCR-S14-1-IIGydF4y2Ba那GydF4y2BaCR-S14-2GydF4y2Ba那GydF4y2BaCR-S14-6GydF4y2Ba那GydF4y2BaCR-S14-9-IGydF4y2Ba那GydF4y2BaCR-S14-9-IIGydF4y2Ba和GydF4y2BaCR-S14-29-IGydF4y2Ba．另外三种突变等位基因，GydF4y2BaCR-S14-10-iGydF4y2Ba那GydF4y2BaCR-S14-10-IIGydF4y2Ba和GydF4y2BaCR-S14-29-IIGydF4y2Ba，包含在帧内突变（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab).在一些突变转录本中也扩增并确认了突变(附加文件)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.由于OSSweet14是含有七种跨膜螺旋的糖转运蛋白，因此蛋白质的功能在螺旋上强烈取决于螺旋。用于预测突变等位基因编码的蛋白质的跨膜螺旋[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba］．所有帧突变体等位基因在仅具有一个甚至没有跨膜螺旋的蛋白质编码，而所有内型突变体等位基因编码含有五个或六个跨膜螺旋的蛋白质（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba和GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.跨膜螺旋的缺失极有可能破坏转运蛋白的活性。这可能表明所有的GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba突变等位基因编码蛋白质而不进行糖运输能力。GydF4y2Ba

CR-S14GydF4y2Ba赋予了强烈的非洲抵抗力GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba应变AXO1947GydF4y2Ba

中华11含有隐性抗性等位基因GydF4y2BaOSSweet13.GydF4y2Ba，这是PthXo2 EBE区域的删除，导致PthXo2无法识别(补充文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.PXO86起源于菲律宾GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba依赖于AvrXa7的激活GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba毒力的表达，而T7174（NCBI：TXID342109）是一种日本菌株，用于毒力为AVRXA7和PTHXO2。是一致的GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Bakisitake突变体在以前报告的kitaake背景中，GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba对PXO86和T7174都产生了强烈的抵抗(附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba和表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba］．此外，GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba对经受考验的亚洲人表现出了广泛的抵抗GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba菌株（表格GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

要测试的疾病反应GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba到GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba依赖于毒力的滑石，非洲起源的菌株GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba含有滑石的菌株（AXO1947）接种GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba和中华11由叶片剪切方法。用AXO1947接种每个突变等位基因的至少三种植物。接种后的十四天，中华11显示对AXO1947的敏感性，同时GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba赋予对AxO1947的强抗性，平均损伤长度小于2cm（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.这就证明了GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在中华11号背景下，AXO1947遭到了强烈的抵制。GydF4y2Ba

为了确定突变等位基因是否仍然是可诱导的，PXO86和不育的HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO被接种GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba中华11号带注射器。的表达水平GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在接种后0和48 h用qRT-PCR检测突变等位基因。PXO86能诱导两种突变等位基因的表达GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba和GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在中华11号（附加档案GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.该结果证明了突变等位基因仍由AVRXA7诱导，并且阻力反应是由OSSweet14转运蛋白活性的破坏引起的。GydF4y2Ba

CR-S14GydF4y2Ba是否提高了植株高度和正常的生殖生长GydF4y2Ba

OSSweet14.GydF4y2Ba利用qRT-PCR检测水稻植株各组织的转录本;茎中含量最高，其次是叶鞘和叶片(图2)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa).的表达方式GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在GydF4y2BapOsSWEET14:格斯GydF4y2Ba在控制中使用β-葡糖醛酸酶（GUS）报告基因的转基因水稻植物GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba启动子。与qRT-PCR结果一致的是，茎中的大部分细胞类型都有较强的GUS活性，主要在叶鞘和叶片的叶脉中(图2)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab和d).与的表达模式一致GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在稻草数据库中[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba]，根中GUS酶活性也较高;然而，没有维管束的根尖缺乏GUS活性(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaG）。在穗尖头中检测到低GUS活性，包括PALEA，LEMMA和花药（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bae和f）。这表明了GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba主要表达于水稻植物的维管组织中。GydF4y2Ba

要验证的影响GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba稻米发展中断，GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba中华11年在中国广东省的一个稻田中生长。GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba与中华11号同时发芽转入稻田，未见生长阻滞(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种）。自从GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba成绩单茎高度积累，我们测试是否淘汰赛GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba影响成熟阶段的茎直径和植物高度。使用双尾学生进行统计分析GydF4y2BaT.GydF4y2Ba反对中华的测试11.没有显着差异（GydF4y2BaP.GydF4y2Ba > 0.05) in stem diameter was detected betweenCR-S14GydF4y2Ba中华11号(图)GydF4y2Ba4.GydF4y2BaC和附加文件GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.然而，GydF4y2BaCR-S14-2GydF4y2Ba那GydF4y2BaCR-S14-9-IGydF4y2Ba和GydF4y2BaCR-S14-9-IIGydF4y2Ba比中华11比中华11更高，这相当于植物高度的近似8％（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab和附加文件GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.对2019年中国广东的茎粗和株高进行了两个季节的记录。这表明GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba导致植株高度增加。GydF4y2Ba

另外，我们检查了是否中断GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba影响水稻的生殖生长。每个突变等位基因至少15株，中华11株30株。对主要穗的千粒重、结实率和产量进行了评价。该评估在2019年进行了两个季度。1000粒重量GydF4y2BaCR-S14-2GydF4y2Ba和GydF4y2BaCR-S14-9-IIGydF4y2Ba略高（GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05) than that of Zhonghua 11, whileCR-S14-6GydF4y2Ba和GydF4y2BaCR-S14-9-IGydF4y2Ba没有显著差异(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba> 0.05)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba和额外的文件GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.这表明GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba不影响正常生长条件下水稻植株的生殖生长。所有这些结果表明，破坏GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在正常生长条件下增加株高而不降低产量。GydF4y2Ba

在天然种质储层中，在启动子区域中扰乱EBES中断的隐性抗性等位基因能够赋予抗性GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba菌株的毒性取决于相应的TAL效应物。而TAL效应体在抗性品种的选择压力下能够适应隐性抗性等位基因。近年来，许多PthXo2-like, AvrXa7/PthXo3-like, TalC-like和PthXo1-like TAL效应已被鉴定GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba能够激活表达的菌株GydF4y2BaOSSweet13.GydF4y2Ba那GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba要么GydF4y2BaOSSWEET11.GydF4y2Ba在不同的水稻品种[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba］．例如,GydF4y2BaOSSweet13.GydF4y2Ba_{成套工具GydF4y2Ba}在成本背景中，这是天然ebe-突变等位基因GydF4y2BaOSSweet13.GydF4y2Ba，PthxO2是非诱导的。但是，两个pthxo2样的故事效果（tal5GydF4y2Ba_{LN18GydF4y2Ba}和tal7.GydF4y2Ba_{PXO61GydF4y2Ba})能激活的表达GydF4y2BaOSSweet13.GydF4y2Ba_{成套工具GydF4y2Ba}诱导敏感的反应[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba］．这些结果表明，可以通过新颖的TAL效应的出现以及启动子区域的工程来克服隐性电阻。GydF4y2BaOsSWEETGydF4y2BaS基因不足以产生持久和广谱的抗性GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba．结果，我们直接淘汰了GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在中华11背景直接（GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba）为了赋予所有的所有GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba依赖的菌株GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba诱导毒力自花11包含隐性PthXo2 EBE突变等位基因（附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba能够对依赖于PthXo2和AvrXa7毒力的菌株产生完全耐药性，如GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba应变T7174(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.此外,GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba还赋予了完全抵抗非洲菌株AXO1947，这取决于滑石粉GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba就职。然而，疾病反应与北叶片背景中的疾病反应不一致。GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba敲除突变体或GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba叶片背景中的启动子突变体易于Axo1947 [GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba］．这种不一致意味着其他易感目标可以在北叶遗传背景而不是中华遗传11中诱发。2018年，一篇研究论文报告说明术图GydF4y2Ba_{MAI1GydF4y2Ba}来自非洲GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba菌株MAI1能够激活两个易感基因的表达(GydF4y2BaOsTFX1GydF4y2Ba和GydF4y2Baoserf＃123.GydF4y2Ba）在日本晴背景和诱导易感响应[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba］．这表明非洲人GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba菌株可能能够诱发其他易感基因在Kitaake背景之外GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba毒性。的GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在Kitaake背景单敲除突变体易患AXO1947。这表明水稻品种的遗传背景可能影响的电阻响应GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba敲除突变体。这个假设可以通过杂交来验证GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba与Kitaake，并检查FGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba代工厂。如果Kitaake背景下，F存在新的敏感指标GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba代植株含有纯合子GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba等位基因会显示疾病表型应答偏析。造成这种疾病应答差另一种可能性是脱靶效应。诱变GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在中华11背景中，通过对两个靶位点的CRISPR/Cas9靶向介导，target I位于第1外显子，target II位于第3外显子(图2)。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.诱变GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在Kitaake背景是介导的仅由一个目标网站，是同一网站的目标我在花11（Kittake目标：5'-GCATGTCTCTTCAGCATCCCTGG-3'与目标I（GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba）：5'-catgtctctcagcatcctgg-3'）。这意味着中华11次目标II的离心效应可能导致疾病反应的差异。这可以通过生成新的来验证GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba敲除突变体中花11的背景与CRISPR / Cas9靶向目标I或其它不同的靶位点。GydF4y2Ba

滑石和Tal5是在启动子区定位不同预算外开支2个TAL效应GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba．所有的非洲序列GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba菌株含有滑石粉或同时含有滑石粉和Tal5，表明全非洲GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba菌株能够激活GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba］．的GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Bakitaake背景中的敲除突变体易受非洲起源的影响GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba菌株，而GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba是能够赋予AXO1947强阻力。这意味着GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba可以作为更好的测试线GydF4y2Ba甜蜜的14.GydF4y2Bakitaake背景中的单敲除突变体为米饭枯燥的诊断套件[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

CR-S14GydF4y2Ba植物比中华11高，在正常生长条件下没有生殖缺陷。自从GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在茎中具有最高的表达水平，增强的植物高度可能是由于茎中糖类效率较低，需要进一步研究。此外，GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba由于其在花药、外稃、外稃和雌蕊中的表达量较低，可能与生殖发育无关。这些结果表明，敲除突变体时应考虑株高的提高GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba被用来赋予对白叶枯病的抗性。的GydF4y2Ba甜蜜的14.GydF4y2BaKitaake背景中的单敲除突变体也显示正常生长[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba］．但是，纯合GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2BaT-DNA插入突变体显示出显着的发育缺陷[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba］．这可能是由于在水稻基因组的多个T-DNA插入，​​这些都没有在本文讨论[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

通过与3000个水稻基因组计划的3,010个水稻基因组[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba]，我们发现大多数SNP或IndelsGydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba基因组区域在未翻译的区域或内含子。在第3和第5个外显子中鉴定了两和四个SNP，第5个外显子发现了23种不同的诱导。但是，所有indel都在OSSweet14的C终端中，不会影响跨膜螺旋。因此，需要进一步测试那些indels abrogeT14的功能。此外，自然GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba需要发现非功能等位基因。GydF4y2Ba

本研究表明，干扰GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba在中华11背景中，能够赋予非洲的强烈抵抗力GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba菌株AXO1947和亚洲菌株PXO86，植物高度增强，没有收益率。这些结果意味着GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba可能比一个更好的测试线GydF4y2Ba甜蜜的14.GydF4y2Ba水稻抗枯病诊断试剂盒的Kitaake背景单敲除突变体。不同的疾病反应GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba和GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba叶片背景中的单一敲除突变体可能是由于遗传背景或偏离目标效果。这个假设需要通过实验证实。此外，天然非功能性GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba需要鉴定突变等位基因用于进一步的水稻育种应用。最后，需要在利用时考虑植物高度的增强GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba用于抗性水稻育种。GydF4y2Ba

水稻生长条件GydF4y2Ba

中华11 (GydF4y2Ba栽培稻GydF4y2Bal . ssp。GydF4y2Ba粳稻GydF4y2Ba简历。本研究采用中华11)。GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba是一种具有中华11基因背景的转基因水稻植株。至少15种不同的植物GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba在最佳生长条件下，线和超过30个中华11株植物生长在一个领域。我们既长大GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba2019年两季中华11号;第一季从3月到6月，第二季从8月到11月。该稻田位于中国广东广州。GydF4y2Ba

菌株与接种GydF4y2Ba

所有GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba在28℃下在PSA培养基（10g / L蛋白胨，10g / L蔗糖，1g / l谷氨酸，16g / L谷氨酸，16g / l琼脂，pH7.0）上培养菌株2天。将细菌悬浮在无菌水中GydF4y2Ba_600GydF4y2Ba0.5用于在稻壳上接种。用如前所述的叶片剪切方法执行细菌枯萎接种[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba］．接种48 h后采集接种水稻叶片进行基因诱导分析。接种后14天测定细菌损伤。的来源GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba本研究中测试的菌株列在附加文件中GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

基因表达分析GydF4y2Ba

使用Eastep®超级总RNA提取试剂盒（Promega）提取水稻叶片的总RNA，并使用Goscript TM逆转录混合物，寡核苷酸（DT）（USA）逆转录成单链cDNA。使用ITAQ通用SYBR Green SuperMix（Bio-Rad，USA）在Lighcycler480（Roche，瑞士）上执行实时定量RT-PCR。水稻泛素基因5的表达（GydF4y2BaUBI5.GydF4y2Ba)作为内参基因。特定的引物对GydF4y2BaUBI5.GydF4y2Ba分别为5 ' -AACCACTTCGACCGCCACT-3 '和5 ' -GTTCGATTTCCTCCTCCTTCC-3 '。本研究使用的引物均列于附加文件中GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

建设与水稻转化GydF4y2Ba

两个靶位点选择上的第1和第3外显子GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba并如上所述插入CRISPR / CAS9载体中[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］．上游的2 kb启动子片段GydF4y2BaOSSweet14.GydF4y2Ba转录起始位点扩增并在前面插入GydF4y2Ba格斯GydF4y2BapCAMBIA1301载体的报告基因。质粒被转化成GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2BaEHA105。中华11号的水稻转化过程如前所述[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

突变的测定GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba

两个目标的侧翼区域GydF4y2BaOsSWEE14GydF4y2Ba在独立TGydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba一代hygromycin-resistantGydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba线，两对引物，靶 - 滑石-F＆R及目标S14E3-F＆R被放大，并进行测序以确定潜在的改变。对于那些水稻品系与双等位基因的突变，修改在分离后代（T测定GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba)自花传粉的TGydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba植物。本研究使用的引物均列于附加文件中GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

的决心GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba形态学GydF4y2Ba

确定的形态GydF4y2BaCR-S14GydF4y2Ba在美国，每个株系至少测量了15株植物。测量每一有效分蘖第二茎段上直径为茎直径。以成熟水稻植株从地面到穗尖的长度作为株高。采用种子形态检测仪(SC-G, wseen, China)对粒重、填充粒数和空粒数进行称重和计数。然后计算主穗千粒重、结实率和产量。GydF4y2Ba

GUS活性的组织化学分析GydF4y2Ba

切割水稻组织并转移到含有GUS染色溶液（50mM磷酸钠，pH7.0,7％甲醇和1mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛醛糖苷的2mL微量离心管中在37℃下过夜，随后在乙醇系列中脱颖而出。在立体显微镜下观察染色的米纸。GydF4y2Ba

支持本文结论的数据集包含在本文及其附加文件中。GydF4y2Ba

我们感谢淡马锡生命科学实验室殷中超博士提供的GydF4y2BaXOOGydF4y2Ba来自华南农业大学的污渍和八辉刘刘辉，为CRISPR / CAS9矢量系统提供。GydF4y2Ba

国家自然科学基金项目(no . 31701403/31772384);国家重点研发计划项目(no . 2017YFD0100101);中国科学院自然科学基金项目(no . XDA24030201);广东省“珠三角人才计划”博士后项目。资助机构在设计、收集、分析、解释数据或撰写手稿方面没有作用。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 中国科学院华南植物园，华南农业植物分子分析与遗传改良重点实验室，广东省应用植物学重点实验室，广州510650GydF4y2Ba

   曾璇，罗玉芬，吴雅婷，沈淑娟，夏快飞，张明勇GydF4y2Ba

2. 中国科学院大学，北京100049GydF4y2Ba

   罗玉芬，吴雅婷，沈淑娟GydF4y2Ba

3. 2 .中国科学院核心植物园经济植物研究中心，广东广州510650GydF4y2Ba

   夏快飞，张明勇GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

XZ、YL、NV、SS和KX进行了实验。XZ和MZ设计了这个项目。XZ起草了手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba明永张GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放访问GydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中，除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中，并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途，你将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba．Creative Commons公共领域奉献豁免（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信贷额度中另有说明。GydF4y2Ba

再版和权限GydF4y2Ba