表达异源重组酶的植物的同源重组刺激

背景

CRISPR/Cas和TALEN技术的进步推动了目前对植物基因编辑机会的兴奋。CRISPR/Cas被广泛用于通过诱导靶向双链断裂(dsb)来敲除或修饰基因，这些双链断裂主要通过易出错的非同源末端连接或微同源介导的末端连接来修复，从而导致可能改变或取消基因功能的突变。虽然这些突变是随机的，但它们发生的频率足够高，可以通过筛查常规地识别有用的突变。相比之下，基因敲入用其他等位基因或具有特定特征修饰的拷贝来取代整个基因，目前还不太可能。在高等植物中，通过同源性定向修复的基因替换(或基因靶向)发生的频率极低，这使得筛选有用的事件变得不可行。同源性定向修复可能通过抑制非同源末端连接和/或刺激同源重组(HR)而增加。本文通过评价多种异源重组酶的表达对染色体内同源重组(ICR)的影响，为提高基因替代效率铺平了道路烟草植物。

结果

我们在烟草转基因系中以不同组合表达了几种细菌和人类重组酶，该转基因系含有高度敏感的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基ICR底物。利用病毒2A翻译编码系统实现了多个重组酶的协同同时表达。我们发现大多数重组酶显著增加花粉的ICR，其中减数分裂期间发生的程序化dsb将促进HR。DMC1表达对初代转化植株的ICR刺激最大，其中一株植株的ICR频率增加了1000倍。对T2纯合子株系的ICR评估显示，根据重组酶的表达，ICR的增加幅度在2- 380倍之间。相比之下，ICR在营养组织中仅适度增加，异种重组酶的组成性表达也降低了植物的育性。

结论

异源重组酶的表达可大大提高HR在植物生殖组织中的表达频率。将这种重组酶的表达与CRISPR/Cas9结合诱导dsb可能是从根本上提高植物基因替换效率的一条途径。

所有生物体的基因组都持续暴露于外源性基因毒性物质和内源性因素中，这些因素可能导致DNA双链断裂(DSBs)等关键DNA损伤。为了维持基因组的完整性，真核细胞进化出了强大而复杂的DNA损伤修复机制[1，2，3.]。dsb可通过同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)两种主要的相互竞争和部分重叠的途径修复[4]。NHEJ是一种容易出错的修复途径，它可以在DSB位点插入和/或删除短DNA序列，导致移码和无义突变，这一特征在最近开发的ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)和CRISPR(规则间隔短回语重复序列簇)基因编辑技术中被广泛利用。5]。另一方面，HR是一种保守机制，导致两个同源DNA序列之间的遗传信息相互交换，或者更常见的是在基因转换中，这种传递是单向的。这两种修复机制的存在取决于物种、细胞类型甚至细胞周期的阶段，其中NHEJ在大多数体细胞中占主导地位，而HR在酵母、种系细胞和哺乳动物胚胎干细胞中最有效[6]。

了解DSB修复机制对于作物改良的生物技术方法以及通过提高基因替代效率来治疗癌症和基因治疗非常有价值[7，8]。直到最近，植物的遗传修饰完全依赖于宿主NHEJ途径对转基因的随机整合[9]。这一过程的不可预测性以及在最终产品中引入除草剂或抗生素抗性标记的可能性使转基因生物(GMO)不太容易被公众接受。利用人力资源进行精确和有针对性的基因修饰(基因靶向)，可能有助于减轻这些公众关注的一些问题，并扩大可以实现的修饰范围。在植物中，由于NHEJ是植物细胞中DSB修复的主要途径，而HR修复的频率往往要低几个数量级，因此基因靶向(GT)一直难以捉摸。在过去几年中，利用合成的内切酶ZFN、TALEN和CRISPR-Cas，在将DSB靶向到基因组内的特定位点方面取得了重大进展[10，11，12]。NHEJ容易出错的修复会产生突变，从而使随意敲除基因成为可能。虽然dsb的存在是HR刺激的先决条件[13]，利用CRISPR-Cas9促进HR在目标基因组位点的DNA整合(即GT添加、替换或修饰基因)仍然是极其困难的。自发心率，在10的范围内⁻⁶，在植物转化中经常使用的体细胞组织中极低，并且需要进一步刺激HR机制才能使HR介导的GT常规实现。对植物HR的早期研究表明，这种刺激可能是通过植物中异源重组酶(即参与DNA修复和重组的基因)的表达来实现的。当用烟草植物,大肠杆菌RecA和RuvC重组酶已被证明可使染色体内HR增加10- 11倍[14，15]但RecA表达并未提高GT效率[16]。然而，酵母RAD54染色质重塑基因的表达被证明可以增加拟南芥中hr介导的GT的频率[17，18]。同样，在哺乳动物中，过表达真核RecA同源物Rad51可诱导HR增加20倍[19]而人BRCA2在酵母中的表达使HR增加了2 ~ 2.5倍[20.]。

在这项研究中，我们扩展了以前的工作，通过表达六种不同的异源重组酶，无论是单独的还是两种或三种的组合烟草，并评估其对染色体内HR的影响。我们使用人工自解离多蛋白从单个开放阅读框中协调过表达多个重组酶[21]。从口蹄疫病毒2A区提取的短肽(20aa)在多蛋白中分离出不同的编码序列。这种多肽在其羧基末端有效地将多蛋白解离或“裂解”成植物中离散的蛋白质产物[21，22]，是翻译“重新编码”的一个例子。为了便于评估其对HR的影响，将重组酶构建物引入含有β-葡萄糖醛酸酶(uidA)基染色体内重组(ICR)底物(N1DC4烟草品系)的转基因烟草植株中[23]。该转基因品系包含两个截断且部分重叠的uidA基因，在直接方向上与一个功能性的潮霉素抗性基因(hyg)相邻。这两个有缺陷的uidA基因之间的ICR恢复了可以通过组织化学染色检测GUS活性的功能标记。在这里，我们报告了表达单一和多个重组酶的转基因植物的幼苗和花粉中ICR的频率，并验证了该方法可能提高植物中GT频率的途径。

重组酶构建体的产生

我们在pGEM®-T Easy载体中构建了8个构建体，使单个和多个原核和真核重组酶的表达能够通过体外转录和翻译进行初步检查(图2)。1a) RecA和RuvC在植物中单独表达时可增加ICR频率[14，15，16]，组合成一个多蛋白结构。原核生物的RecG在DSB修复过程中对RecA和RuvC起不同的作用，以解决Holliday连接[24，25]，单独使用，以及作为RecA和RuvC的多蛋白(RecA:RecG:RuvC)。在所有三种细菌重组酶的n端引入核定位信号(NLS)。同样，制备了表达RecA真核同源物(Rad51及其减数分裂同源物DMC1)和Rad52(酵母和哺乳动物DSB修复所必需的)或Rad52:Rad51和Rad52:DMC1: Rad51多蛋白的构建体。所有构建体随后转移到植物转化质粒上(见方法)，并在烟草植物中表达(烟草)由CaMV 35S启动子组成。用于转化的宿主烟草系为性状优良的转基因株系N1DC4号。29日(23，26]，其中含有单个基于β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的转基因作为ICR的底物(图2)。1b和方法)。通过对幼苗和花粉进行组织化学染色，计数蓝点，可以很容易地监测恢复GUS基因功能的诱导和自发ICR事件。1b)确定ICR的频率。

2A多蛋白体外构建体的检测

在将多蛋白嵌合基因导入植物之前，首先从pGEM®-T Easy质粒中转录和翻译多蛋白嵌合基因，以检查它们是否存在共翻译切割。虽然我们之前的工作已经表明，当构建体被引入植物中时，裂解比在体外更有效[21]，当无法检测产品的抗体时，在体外检查表达产物是有用的在足底．SDS-PAGE [³⁵S]-蛋氨酸标记的小麦胚芽TNT®体系产品显示，所有预期的单个蛋白产品都存在，以及一些高分子量的未裂解多蛋白。例如，RecA:RecG:RuvC多蛋白结构的翻译(图2)。2a) RecA、RecG和RuvC的条带是离散的，RecA:RecG:RuvC多蛋白和部分“裂解”产物RecA:RecG和RecG:RuvC的条带是高分子量的(图2)。2b). RuvC和Rad51产物在其对应多蛋白的第三位时信号强度仍然清晰，但不那么突出。总体而言，小麦胚芽的结果表明，转基因适合在植物中表达，而不需要进行密码子优化。

主要烟草转化品种的生产和描述

将这些构建体导入烟草N1DC4，在磺胺选择下进行植株再生。有些转化植株发育受到严重影响，发育迟缓，叶片狭窄，花形态发生变化(图2)。3.A)，可能揭示了组成重组酶表达的多效性。考虑到不同植物表型的一些共性，这可能反映了重组酶表达导致的发育途径的生化扰动，而不是随机的基因组突变。有些品系产生的花粉很少或雌蕊比雄蕊大，从而降低了它们的育性。第一批再生植株的花粉GUS染色显示，与对照N1DC4植株相比，许多植株的ICR频率增加(图2)。3.b). ICR快照显示，所有在这个早期阶段(即转化是交错的，没有Rad51、Rad52和Rad51-Rad52的转化子)获得初级转化子的重组酶都在不同程度上强烈刺激了HR频率(图5)。3.b).与对照N1DC4植株相比，ICR频率为0.013 × 10⁻⁴其中，DMC1对ICR的影响最大，频率范围为3.167 × 10⁻⁴到14.442 × 10⁻⁴在六个独立的初级变压器，即高达1000倍的增长。

纯合子系幼苗和花粉的ICR频率

所有结构的主变形体继续收集，直到不再生产，即不是所有的主变形体都在图中表示。3.．所有具有单一转基因位点的初级转化子都产生纯合子植株系，以增加转基因的剂量，以便分析每系的重复植株。这是必要的，以便考虑到植物间的变异，以便对数据进行统计分析。不幸的是，图中ICR率最高的一些植物。3.B被证明有多个插入，不容易进一步研究。对单个植物的育性进行评分，以评估不同重组酶对减数分裂的影响，因为当减数分裂过程(如HR)被操纵时，育性降低是一种常见的表型。与N1DC4对照相比，大多数转基因品系每荚的种子数显著减少，尽管程度不同(图2)。3.c).这些育性的变化为同源重组酶在纯合子植物中持续表达提供了一些间接证据，并且可能在不同的植物品系中表达水平不同。不幸的是，每个结构产生的独立纯合子系的数量不允许进行可靠的统计分析。

T2种子在MS培养基上分3个重复发芽，培养6周后进行GUS活性染色，以评价体细胞营养组织的ICR。蓝点显示，表达Rad51重组酶的细胞系的ICR适度但显著增加。B和DMC1(图2)4a).将3 ~ 12株不同转基因系的纯合子幼苗生长至成熟，并对其花粉进行GUS活性染色(图2)。4b)评估减数分裂生殖组织的ICR。蓝色花粉粒的评分显示，与同一品系的幼苗相比，花粉的ICR显著增加。在有限的纯合子株系中，1个表达RecG的纯合子株系对ICR的刺激最强，达到380倍。RecA:RuvC表达植株增加29 ~ 54倍。人类重组酶Rad51和DMC1对花粉ICR的促进作用为18.8 ~ 91倍，但DMC1.11仅表现出2倍的适度增加。

基因编辑和基因靶向技术是基因治疗和作物改良中精确基因操作的有力工具。CRISPR/Cas9内切酶系统的发展使得基因组编辑在包括植物在内的高等真核生物中成为常规可行[10]。CRISPR已经以不同的效率用于靶向内源性[12，27，28]和人工报告基因[29]在植物中采用瞬态和稳态转化方法[30.]。然而，这些操作目前主要局限于通过NHEJ修复目标DSB的基因诱变，而HR基因替代在常规应用中仍然效率不高。最近利用CRISPR技术将选择性标记nptII通过HR整合到拟南芥ADH1基因中，但GT频率仍然很低[28，31]。采用双sgrna /Cas9可改善基因置换[32]和顺序变换[33拟南芥中的策略或水稻中相邻内含子的同时靶向[34]。基因替代也被用于培育抗草甘膦的木薯植株[35]和ARGOS8在玉米中的变异[36]。大多数报道的实验是在拟南芥和水稻中进行的，其中转化特别有效，可能不能反映大部分植物物种。此外，生殖减数分裂组织是拟南芥花dip转化的目标，而大多数物种的转化方法针对非减数分裂组织。在目前的工作中，我们通过在DSB修复的不同步骤中所需的多种细菌和人类蛋白质的表达，成功地增加了HR，为所有可转化植物的有效基因替换工具铺平了道路。

在酵母和动物中，Rad52在HR选择DSB修复途径中是必不可少的[37，38但是植物的Rad52同源物直到最近才被发现[39]。原核RecA及其真核同源物Rad51和DMC1结合DSB末端的单链DNA，启动同源性搜索，促进HR修复。虽然人类Rad51和Rad52的表达降低了哺乳动物细胞的HR [40]，酵母Rad52在降低NHEJ的同时，将人体细胞中GT的效率提高了37倍[38]。这些相互矛盾的发现可能与不同水平的蛋白质表达和这些研究中使用的重组底物的性质有关。我们在烟草中单独或联合表达了人类Rad51及其减数分裂对应物DMC1和Rad52。Rad51和DMC1均能显著提高转基因纯合子植株花粉的ICR，分别提高19倍和91倍，幼苗的ICR也有适度提高。由于在表达重组酶的转基因中存在多次插入和育性问题，表达所有三种重组酶(Rad52:DMC1:Rad51或R-D-R图)的植物。3.)不能在初级转化产生之后继续进行，但是，尽管该结构也显著增加了ICR频率，但没有证据表明它比单独表达DMC1更好。一株表达DMC1的初代转化植株的花粉ICR频率增加了1000倍。然而，该植物的纯合子后代没有产生足够的花粉，无法产生复制的统计验证数据。

转位酶RecG在停止复制叉的DNA修复中起关键作用[41，42]及dsb [43，44]，促进假日路口的分支迁移[24，25，45]。真核生物似乎没有核RecG同源物[46，47];相反，酵母和人Rad54已被证明可以促进体外合成Holliday连接(HJs)的分支迁移[48]。酵母Rad54在拟南芥中的表达可使GT增加10倍[17，18]。在这里，我们发现细菌RecG的异源表达可以使ICR频率增加380倍，如果在完整的GT试验中重复，可能对促进植物基因替换具有重要意义。

最后一个重组酶在我们的结构中，大肠杆菌RuvC，对于假日路口的解决是必要的[49]。RecA和RuvC先前已在烟草植物中表达，显示ICR增加10至11倍[14，15]。在这里，我们将它们一起表达，结果显示，在两个独立的纯合子系中，ICR分别增加了29倍和60倍，这表明表达这两种重组酶至少具有加性作用，也可能具有协同作用。

我们的研究结果表明，与幼苗相比，花粉中的ICR受到更多的刺激，这反映了减数分裂期间发生重组事件的可能性(尽管不能排除小孢子发生期间的额外事件)。因此，使用减数分裂启动子可能会进一步增加HR，这些启动子在减数分裂组织中提供比这里使用的CaMV 35S启动子更强的表达。例如，大麦DMC1启动子最近被证明具有花序特异性，在针对减数分裂组织的转基因实验中很有用[50]。来自减数分裂启动子的异源重组酶的表达可能有额外的好处，可以消除我们在一些品系的营养组织中由于组成性表达而出现的发育迟缓和异常表型。使用减数分裂启动子可能无法避免不育，但可以使用诱导启动子减少不育。例如，一个可调节的四环素诱导启动子可用于以最佳水平表达重组酶并避免其细胞毒性。或者，在一个旨在瞬时增加HR以促进crispr介导的GT的系统中，一旦所需的GT发生，表达重组酶的转基因盒可以通过异交快速去除。我们的2a多蛋白系统大大简化了异型杂交，因为所有重组酶和基因替代系统的其他元素(例如CRISPR-Cas9或其他靶向核酸酶)都可以编码在一个转基因中，作为一个单元易于去除。

ICR可能在减数分裂组织中受到最大的刺激，因为这些组织已经为HR修复DSB做好了准备。DNA双链断裂诱导已被证明在酵母中刺激重组高达2000倍[51]。最近，CRISPR被用于刺激拟南芥的ICR频率[52]。用dsb诱导的CRISPR核酸酶挑战我们的表达多种重组酶的转基因系，看看是否可以进一步刺激HR，从而可能提高基因替代效率，这将是一个有趣的事情。酵母Rad52在鸡DF-1细胞中的表达使两个CRISPR/Cas9靶点的基因替换增加了3倍[53]。在水稻中，利用强负选择标记和高通量转化和筛选，现在可以实现基因替代[54]。然而，到目前为止，这一系统仅适用于水稻，并不适用于所有植物。我们在花粉中的ICR/2A系统将有助于快速验证多个重组酶表达对HR的影响，并构建GT的调控网络。进一步的改进可以通过抑制竞争性的NHEJ途径，并将所有这些改进结合在crispr引导的双链断裂系统中来实现。

目前，CRISPR/Cas在植物生物技术中的应用仅限于基因编辑应用，但如果加入全基因替代(基因靶向)技术，将大大扩大其应用范围。本研究表明，几种细菌或真核重组酶或重组酶组合的表达可显著提高烟草的ICR。单重组酶DMC1、RecG和Rad51增加最多。如果这些HR刺激转化为全基因靶向分析，CRISPR/Cas的效率也被用于产生靶向双链断裂，它可能为高等植物的革命性基因替代方法铺平道路。

细菌和人类重组酶克隆

采用聚合酶链反应(PCR)扩增细菌重组酶RecA、RecG和RuvC的编码序列大肠杆菌染色体DNA作为模板和相应的引物(表1)，包含方便的限制位点。PCR产物在pGEM®-T Easy载体(Promega)上克隆并测序。SV40大t抗原核定位信号[14]由两个互补的寡核苷酸组成(表1)，并插入克隆的细菌重组酶的5 '端。以pFB530为模板，PCR扩增人重组酶Rad51、Rad52和DMC1的编码序列[55]、pFB581 [37]及phDMC1 [56]，以及相应的引物(表2)1）.如前所述，将多蛋白构建物组装在pGEM®-T Easy转录载体中[22]。

体外表达

多蛋白构建体与小麦胚芽转录-翻译系统(TNT®，Promega)一起使用，根据制造商的说明使用[³⁵5]-蛋氨酸(Amersham, Buckinghamshire, UK)。用10% SDS-PAGE分离放射性标记蛋白产品[57]并经放射自显影检测。

植物表达载体pGSC

nopaline合成酶转录信号(nos-Sul)下含有磺胺耐药基因的EcoRV片段被插入到靠近pGreenII 0000左边界的HpaI中[58来制造pGS质粒。用EcoRI和HindIII酶切pS/ntRecA，将含有CaMV 35S启动子、核酮糖-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)小亚基(rbcS) 5′先导子、SV40核定位和RecA n端的片段转移到pSP73 (Promega)中，得到pSP73-35S:N-RecA。用KpnI酶切该质粒，使其末端变钝，得到pSP73-35S:N-RecAΔKpnI。以该质粒为模板，利用PCR和含有KpnI(5’)和HindIII(3’)酶切位点的寡核苷酸扩增CaMV 35S启动子和红细胞的5’先导子(表5’)1）.PCR片段用KpnI和HindIII酶切，克隆到pLBR19中，以取代双CaMV 35S启动子[59]。利用PCR扩增和含有EcoRI(5 ')和SacI-SphI(3 ')的寡核苷酸，将pLBR19中较大的CaMV终止子(735 bp)替换为较小的终止子(221 bp)(表1)1)，产生p35S。用KpnI和SacI酶切该质粒，将释放的CaMV 35S盒式克隆到pGS中，制成pGSC二元载体。pGEM®-T Easy中构建的所有细菌和人重组酶均通过限制性内切酶转移到pGSC质粒中。

植物转化

将pGSC二值载体中的构建体转移到根癌土壤杆菌采用电穿孔法检测含有pSoup质粒的菌株LBA4404。根据Abbott等人的描述，利用农杆菌克隆转化N1DC4系烟草幼苗。[qh]60]。烟草N1DC4转基因系由瑞士弗里德里希·米歇尔生物医学研究所Barbara Hohn教授和德国卡尔斯鲁厄理工学院Holger Puchta教授赠送。在磺胺浓度为100 mg/l的条件下选择转基因株系，进行两轮生根后移栽到温室中。成熟时收集获得的初级转化子的花粉和种子。

转基因分离和种子评分。

将T1种子置于含有100 mg/l磺胺的MS培养基上，在16 H光照条件下生长2周后进行抗性评分。选择分离比为3:1的系作纯合子。每系6株抗性幼苗在温室中生长，收集T2种子。这些种子在磺胺存在下筛选，以检测纯合子系(100%抗性)。每个纯合子系和N1DC4对照种植3株，收集花粉和种子。将每株10个干豆荚的种子集合起来，用重量法估计其数量。

染色体内重组测定

N1DC4是一种纯合子系，含有以β-葡萄糖醛酸酶(GUS)为基础的转基因作为染色体内重组(ICR)的底物[23，25]。该转基因由两个有缺陷的GUS片段在直接方向上重叠而成，并由潮霉素抗性基因(hpt)分离。ICR恢复了GUS基因的功能，可以通过组织化学染色在幼苗和蓝色花粉上检测到蓝色斑点。为了确定体细胞中ICR事件的数量，对6周大的幼苗进行GUS活性染色[23]和在双筒显微镜下记录的蓝色斑点的数量。为了监测花粉的ICR，将3朵花的裂解花药组合在含有1 ml GUS染色缓冲液和20%甲醇的1.5 ml微管中，以抑制内源GUS活性。用血细胞计测定花粉浓度，以蓝色花粉数计算重组率。

统计分析

每个幼苗的蓝斑数、每荚的种子数和花粉的ICR分别拟合了一个单独的线性回归模型，并将模型中的基因型作为解释因子。使用角点参数化基因型因子，将每个测试基因型与对照基因型N1DC4进行比较，如果t统计量有相关的，则认为与对照显著不同P-value小于0.05。

在这项工作中使用的所有转基因结构和生成的ICR计数的原始数据都可以从Claire Halpin教授处获得。

拥有:

染色体内复合

NLS:

核定位信号;

GT:

基因打靶

CRISPR:

有规则间隔的短回文重复串

人力资源:

同源重组

双边带:

双链断裂

格斯:

β葡萄糖醛酸酶

NHEJ:

非同源端连接

我们要感谢德国马克斯普朗克植物育种研究所Bernd Reiss博士提供的RecA克隆，感谢伦敦英国癌症研究所Stephen West教授提供的hRad51、hRad52和hDMC1克隆。我们还要感谢瑞士弗里德里希·米歇尔生物医学研究所的Barbara Hohn教授和德国卡尔斯鲁厄理工学院的Holger Puchta教授的N1DC4转基因烟草品系。

本研究由BBSRC基金D12040资助，包括博士后研究员Abdellah Barakate博士和技术人员Ewan Keir先生的全职工资、耗材和必要设备。Abdellah Barakate博士在BBSRC (D19068)和Leverhulme Trust的相关资助下进行了下一代植物染色体内重组(ICR)的评分。

从属关系

1. 邓迪大学生命科学学院植物科学系，位于苏格兰邓迪市因弗高里市，dd25da

   Abdellah Barakate, Ewan Keir, Helena Oakey和Claire Halpin

2. 目前地址:细胞和分子科学，詹姆斯·赫顿研究所，因弗高里，邓迪，dd25da，英国

   Abdellah Barakate

贡献

AB和CH设计实验;AB和EK进行实验和数据分析;世卫组织进行统计分析;AB和CH写了手稿。所有作者都同意稿件。

相应的作者

对应到克莱尔·哈尔平．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

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