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红糖中黄酮类生物合成的综合代谢组和转录组分析(GydF4y2BaCarthamus Tinctorius.GydF4y2BaL.)在Meja治疗下GydF4y2Ba

摘要GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

红花(GydF4y2BaCarthamus Tinctorius.GydF4y2BaL.)是一种重要的现金作物,其中干管花不仅是染料和化妆品的重要原料,而且是中药广泛应用的重要草药。颜料和生物活性化合物由黄酮类化合物(主要是醌醌)组成,研究据报道,Meja可以促进醌杀菌剂的生物合成,但是Meja在红花中效果的机制仍不清楚。在此,我们试图使用代谢组科和转录组技术来分析红花麦哈治疗下黄酮类生物合成的分子机制。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

基于UHPLC-ESI-MS/MS检测平台和自建数据库(包括羟基红花黄色素a,HSYA),共检测到209种黄酮类代谢物,其中35种代谢物经MeJA处理后差异显著。其中24种代谢产物在MeJA处理后表达上调,尤其是HSYA。MeJA治疗后11种代谢产物表达下调。综合代谢组学和转录组学分析表明,MeJA可能上调类黄酮生物合成途径中上游基因的表达GydF4y2BaCHS.GydF4y2Ba那GydF4y2BaChis.GydF4y2Ba和GydF4y2BaHCTS.GydF4y2Ba)和下调下游基因的表达(如GydF4y2BaF3ms.GydF4y2Ba那GydF4y2BaANRS.GydF4y2Ba和GydF4y2BaANSs公司GydF4y2Ba),从而促进醌醌的生物合成,例如HSYA。通过实时PCR验证这些基因的转录表达。此外,两个基因的启动子(GydF4y2BaCTCHI.GydF4y2Ba和GydF4y2BaCtHCT公司GydF4y2Ba)在MEJA治疗下显着上调并分析。分别在启动子中发现7和3 Meja响应元素。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

Meja可能上调上游基因在类黄酮生物合成途径中的表达,并下游下游基因的表达,从而促进醌醌的生物合成。我们的结果为MEJA治疗下红豆油在红豆杉中的分子机制分析提供了见解和基本数据。GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

红花,GydF4y2BaCarthamus Tinctorius.GydF4y2BaL.,是Asteraceae家族的成员,是全世界重要的经济植物。其干燥的管状花是染料和化妆品的重要原料,也是中国中药中广泛应用的重要草药。作为一种中药,红花的干燥管花已经广泛用于改善脑血流量,治疗冠心病,高血压和脑血管疾病[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba].黄酮类化合物,特别是醌醌,与这些治疗效果有关。其中,HSYA是主要活跃组成部分。它具有抗氧化活性和心肌和脑保护作用[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

黄酮类化合物的生物合成途径已经很清楚,特别是在一些模式植物中,如GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba].查尔酮合成酶(Chalcone synthase, CHS)催化一个4-香豆素酰辅酶a分子和三个丙二酰辅酶a分子合成黄酮所需的皮质素查尔酮。它可以被羟基化或糖基化来生产carthamone或HSYA。查尔酮异构酶(CHI)可将柚皮素查尔酮转化为柚皮素。在红花,柚苷配基可以在6羟化位置和糖化在6和7的位置产生5,6,7,4“-tetrahydroxyflavanone-6 7-di-O -β-D-glucoside,也可以在6的位置和糖化5羟化位置的生产5,6,7,4 ' -tetrahydroxyflavanone-5-O -β-D-glucoside (neocarthamin)。此外,黄酮3-羟化酶(F3H)可将柚皮素转化为二氢山奈酚。然后将其转化为山奈酚,山奈酚再转化为槲皮素[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba].强调红花,对黄酮合成的研究逐渐增加。迄今为止,许多类黄酮生物合成基因已在红花中克隆,例如硫酮异构酶基因(GydF4y2BaChis.GydF4y2Ba) [GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba],查尔酮合酶基因(GydF4y2BaCHS.GydF4y2Ba) [GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba],黄烷酮3-羟化酶基因(GydF4y2BaF3hs.GydF4y2Ba) [GydF4y2Ba12GydF4y2Ba],UDP-葡糖醛糖基转移酶基因(GydF4y2Baugts.GydF4y2Ba) [GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]和莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶基因(GydF4y2BaHCTS.GydF4y2Ba) [GydF4y2Ba14GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)作为一种已知的外源诱导因子,参与植物从防御到生长发育的许多过程[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba].Meja对植物细胞工程进行特别兴趣,用于生产生物活性化合物[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba].据报道,在Meja治疗下可以刺激红花软管(主要是醌醌)[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba].然而,分子机制在很大程度上是未知的。GydF4y2Ba

最近,代谢组科在药用植物中的应用已经显着促进了植物中活性药物化合物的代谢途径的鉴定。基于UHPLC-ESI-MS / MS,广泛的目标代谢组种方法在植物代谢物的分析和鉴定领域中变得非常受欢迎,由于吞吐量,快速分离,高灵敏度和宽覆盖范围高的优点。我们的方法基于多反应监测(MRM)方法[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba],根据Chen等人的结果,具有自建化合物数据库。[GydF4y2Ba20GydF4y2Ba].这种方法已广泛应用于许多植物中的植物代谢物分析,例如米饭[GydF4y2Ba20GydF4y2Ba], 番茄 [GydF4y2Ba21GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22GydF4y2Ba],玉米[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba].此外,转录组和代谢组学的整合在揭示关键代谢途径的生物合成机制方面具有更大的优势[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26GydF4y2Ba].因此,通过两种技术分析MEJA处理下的黄酮类生物合成途径是可行的。GydF4y2Ba

在此,基于UHPLC-ESI-MS/MS检测平台和自建数据库(包括HSYA)筛选代谢谱和黄酮类化合物的差异代谢产物。此外,还对转录组测序和差异转录进行了分析。以KEGG途径为基础,进行综合代谢组学和转录组测序分析,并采用实时荧光PCR技术分析MeJA处理前后不同类黄酮生物合成基因的表达。克隆并分析了MeJA处理下显著上调的基因启动子。本研究结果为MeJA处理下黄酮类化合物合成的调控机制分析提供了理论依据和基础数据。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

代谢分析和差异类黄酮代谢物分析GydF4y2Ba

采用uhpc-ESI-MS/MS和自建数据库(包括HSYA)对红花中黄酮类代谢物进行了研究。共检测到209种黄酮类代谢物,包括62种黄酮类化合物、42种黄酮类C-糖苷、40种黄酮醇、20种黄酮类化合物、18种花青素、11种异黄酮、12种黄酮醇、2种黄酮类化合物、1种醌查尔酮和1种生物碱(补充表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba).GydF4y2Ba

正交部分最小二乘判别分析(OPLS-DA)用于具有较小相关性的变量。由于实验具有生物重复,因此将OPLS-DA模型的折叠变化和VIP值组合到筛网差分代谢物。MEJA处理和未处理材料之间存在35种显着不同的黄酮代谢物。其中,在Meja治疗后,24种代谢物,特别是羟基烷烷烃黄色A(HSYA)。在MEJA治疗后,11种代谢物在下调。(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa,b)在补充表中提供了不同的类黄酮代谢物的细节GydF4y2Ba2GydF4y2Ba。通过使用KEGG数据库筛选来自每个比较组的差分类黄酮代谢物。KEGG分类和富集分析表明,差异类黄酮代谢物主要涉及黄酮类生物合成的途径(KO00941)。(图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaC)。GydF4y2Ba

图。1GydF4y2Ba
图1GydF4y2Ba

微分代谢物的分析。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba差分代谢物的火山图。Volcanic绘图中的每个点代表代谢物,横坐标表示两个样本中代谢物的定量差异倍数的对数,纵坐标表示项目(VIP)值的变量重要性。该图中的绿色点表示下调差异表达的代谢物,红点代表上调差异表达的代谢物,黑点代表检测到的代谢物,但不显着不同。GydF4y2BaB.GydF4y2Ba代谢物的聚类热图。图中显示了三个生物重复。M-CK代表没有Meja治疗的红花,M-Meja代表用Meja治疗红花的花朵。GydF4y2BaCGydF4y2Ba未经MeJA处理的红花比较花的差异代谢产物KEGG分类。代谢物的比例和数量在图中标出GydF4y2Ba

转录组测序和差异转录分析GydF4y2Ba

测序混合红花样品的转录组。在未处理的样品中,获得6.50g清洁基碱(44,185,480读和43,921,238个清洁读数),Q30为92.40%。在Meja处理的样品中,获得了6.17g清洁基础(42,087,290根原料读数,41,720,790清洁读数),Q30为91.89%。用DESEQ2分析不同表达的基因。差异表达基因的总数为31,822(20,741个上调基因和11,081个下调基因)。(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba).GydF4y2Ba

图2GydF4y2Ba
图2.GydF4y2Ba

差异表达基因的火山曲线图。横坐标表示基因表达式的变化(日志GydF4y2Ba2GydF4y2Ba折叠变化),纵坐标表示显着表达基因的显着水平(-log10假发现率)。上调红色基因的表达,绿基因的调节情况下调,黑基因的表达没有显着差异GydF4y2Ba

通过使用KEGG数据库筛选来自每个比较组的差分黄酮代谢物转录物。该实验重点是苯基丙烷代谢途径的注释,包括类黄酮生物合成(KO00941),花青素生物合成(KO00942),异黄酮生物合成(KO00943)和黄酮和黄酮化生物合成(KO00944)。结果表明,Meja处理和未处理的材料(43例,KO00942,KO00943中的43例,KO00943中的43例,5kO00944,5k00943和5k00944)之间存在61种显着不同的类黄酮生物合成转录物。大多数转录物都参与了类黄酮生物合成(KO00941)。详细信息可以在补充表S中查看GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba。GydF4y2Ba

KEGG通路的转录组和代谢组综合分析GydF4y2Ba

结合UHPLC-ESI-MS/MS检测到的代谢组分,将其定位到类黄酮代谢途径上(包括ko00941、ko00942、ko00943、ko00944),构建红花综合类黄酮生物合成代谢通路图。(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)同时,在综合代谢图上表明了差分注释的代谢物与差分注释的基因一起。(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)综合代谢图谱显示,MeJA可能上调类黄酮生物合成途径中上游基因的表达GydF4y2BaCHS.GydF4y2Ba那GydF4y2BaChis.GydF4y2Ba, 和GydF4y2BaHCTS.GydF4y2Ba)可能下调下游基因的表达(例如GydF4y2BaF3ms.GydF4y2Ba那GydF4y2BaANRS.GydF4y2Ba, 和GydF4y2BaANSs公司GydF4y2Ba),从而促进醌醌的生物合成,例如HSYA。GydF4y2Ba

图3.GydF4y2Ba
图3.GydF4y2Ba

红花黄酮生物合成的代谢途径图。将代谢组分定位于类黄酮代谢途径(包括类黄酮生物合成途径(ko00941));花青素生物合成(ko00942);异黄酮生物合成(ko00943);黄酮和黄酮醇生物合成(ko00944)。向上箭头表示内容增加,向下箭头表示内容减少。对已报道的红花克隆基因进行了标记GydF4y2Ba

real-time PCR分析类黄酮生物合成差异表达基因GydF4y2Ba

采用实时荧光PCR技术对转录组数据进行验证。筛选出10个差异表达基因,包括GydF4y2Batrinity_dn28401_c0_g1GydF4y2Ba(注为GydF4y2BachGydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn36537_c1_g1GydF4y2Ba(注为GydF4y2BaHCT.GydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn37574_c1_g2.GydF4y2Ba(注为GydF4y2BaHCT.GydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn39063_c0_g1GydF4y2Ba(注为GydF4y2Ba霉GydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn43344_c1_g1GydF4y2Ba(注为GydF4y2BachGydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn41734_c0_g5.GydF4y2Ba(注为GydF4y2BaCHS.GydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn42700_c3_g2.GydF4y2Ba(注为GydF4y2BaF3h.GydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn43120_c5_g1GydF4y2Ba(注为GydF4y2BaANR.GydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn44094_c0_g1GydF4y2Ba(注为GydF4y2BaANS.GydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn44565_c1_g1GydF4y2Ba(注为GydF4y2BaF3m.GydF4y2Ba).用于该实验的引物可以在补充表中找到GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba。其中,HCT含有几种转移酶酶,其包括邻苯甲酸正羟基氨基酰基/苯甲酰转移酶,其催化了植物素生物合成的第一个致密的反应。F3H可催化合成N-末端黄烷酮3-羟化酶。F3M可以催化黄酮类化合物,NADPH,H.GydF4y2Ba+GydF4y2Ba和O.GydF4y2Ba2GydF4y2Ba进入3'-羟基酚蛋白和NADPGydF4y2Ba+GydF4y2Ba和h.GydF4y2Ba2GydF4y2BaO、 功能类似于F3H。FLS催化二氢黄酮醇生成黄酮醇。CHS催化一分子4-香豆酰-CoA和三分子丙二酰-CoA反应生成四羟基查尔酮。查尔酮异构酶将四羟基查尔酮转化为柚皮素。ANR和ANS都参与花青素的合成。结果表明,6个基因的表达,包括GydF4y2Batrinity_dn28401_c0_g1GydF4y2Ba(GydF4y2BachGydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn36537_c1_g1GydF4y2Ba(GydF4y2BaHCT.GydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn37574_c1_g2.GydF4y2Ba(GydF4y2BaHCT.GydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn39063_c0_g1GydF4y2Ba(GydF4y2Ba霉GydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn43344_c1_g1GydF4y2Ba(GydF4y2BachGydF4y2Ba) 和GydF4y2Batrinity_dn41734_c0_g5.GydF4y2Ba(GydF4y2BaCHS.GydF4y2Ba),显着上调和4个基因,包括GydF4y2Batrinity_dn42700_c3_g2.GydF4y2Ba(GydF4y2BaF3h.GydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn43120_c5_g1GydF4y2Ba(GydF4y2BaANR.GydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn44094_c0_g1GydF4y2Ba(GydF4y2BaANS.GydF4y2Ba) 和GydF4y2Batrinity_dn44565_c1_g1GydF4y2Ba(GydF4y2BaF3m.GydF4y2Ba),表达明显下调(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba从综合代谢图中可以看出,苯丙烷代谢途径中上游基因的表达随MEJA治疗而增加。基因表达的结果也表明这些基因可能参与代谢途径。GydF4y2Ba

图4.GydF4y2Ba
图4.GydF4y2Ba

10个黄酮类化合物合成途径基因的实时荧光定量PCR表达其中6个基因显著上调,4个基因显著下调。Gene1代表GydF4y2Batrinity_dn28401_c0_g1GydF4y2Ba(注为GydF4y2BaChi)GydF4y2Ba,Gene2代表GydF4y2Batrinity_dn36537_c1_g1GydF4y2Ba(注为GydF4y2BaHCT.GydF4y2Ba),Gene3代表GydF4y2Batrinity_dn37574_c1_g2.GydF4y2Ba(注为GydF4y2BaHCT.GydF4y2Ba),Gene4代表GydF4y2Batrinity_dn39063_c0_g1GydF4y2Ba(注为GydF4y2Ba霉GydF4y2Ba),Gene5代表GydF4y2Batrinity_dn43344_c1_g1GydF4y2Ba(注为GydF4y2BachGydF4y2Ba),Gene6代表GydF4y2Batrinity_dn41734_c0_g5.GydF4y2Ba(注为GydF4y2BaCHS.GydF4y2Ba),Gene7代表GydF4y2Batrinity_dn42700_c3_g2.GydF4y2Ba(注为GydF4y2BaF3h.GydF4y2Ba),Gene8代表GydF4y2Batrinity_dn43120_c5_g1GydF4y2Ba(注为GydF4y2BaANR.GydF4y2Ba),Gene9代表GydF4y2Batrinity_dn44094_c0_g1GydF4y2Ba(注为GydF4y2BaANS.GydF4y2Ba),Gene10代表GydF4y2Batrinity_dn44565_c1_g1GydF4y2Ba(注为GydF4y2BaF3m.GydF4y2Ba)GydF4y2Ba

类黄酮生物合成基因差异表达启动子的元素分析GydF4y2Ba

为了分析MejA调节基因表达的方式,克隆和分析了差异表达的黄酮化生物合成基因的启动子。因为没有来自红花的参考基因组序列,因此使用单一寡核苷酸嵌套的PCR(SON-PCR)克隆促进剂[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]. 在我们的研究中,MeJA的两个启动子显著上调了基因表达GydF4y2BaCTCHI.GydF4y2Ba和GydF4y2BaCtHCT公司GydF4y2Ba(命名GydF4y2BaPCTCHI.GydF4y2Ba和GydF4y2Bapcthct,GydF4y2Ba分别成功克隆,将片段克隆到T载体中并转化为GydF4y2BaDH5AGydF4y2Ba细菌。选择阳性细菌溶液进行测序。序列如图所示。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba。GydF4y2Ba

图5.GydF4y2Ba
图5.GydF4y2Ba

识别促进剂序列中发现的MEJA响应元素GydF4y2BaPCTCHI.GydF4y2Ba(GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba) 和GydF4y2BaPCTHCT.GydF4y2Ba(GydF4y2BaB.GydF4y2Ba).a是序列分析GydF4y2Bapctchi。GydF4y2BaB是序列分析GydF4y2Bapcthct。GydF4y2Ba通过PlantCARE分析序列(GydF4y2Bahttp://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare.GydF4y2Ba).黄色元素表示MeJA响应元素序列相同(DNA的感觉链),红色元素表示反向互补序列(DNA的反义链)GydF4y2Ba

使用Plantcare进行分析启动子的序列(GydF4y2Bahttp://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare.GydF4y2Ba) [GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba].ATG上游序列提交到web分析程序。的启动子中发现7种MeJA响应元素GydF4y2BaPCTCHI.GydF4y2Ba,而三个Meja响应元素可以在启动子中找到GydF4y2Bapcthct。GydF4y2Ba(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba)结果表明,MeJA可以通过这些元件调控这些基因的表达,从而促进醌查尔酮的合成。GydF4y2Ba

讨论GydF4y2Ba

MeJA可诱导许多次生代谢产物,如挥发物、二苯乙烯、类胡萝卜素、不饱和脂肪酸、类黄酮、番茄红素等[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba].黄酮类化合物是其中最多的化合物之一。然而,并非所有结果表明,Meja可以上调黄酮类化合物生物合成。Farag作出了分析GydF4y2Baerythrina lysistemon.GydF4y2Ba细胞悬浮培养响应于Meja诱导,结果显示,奥沙尔酸和脂肪酸的三苯甲酸和脂肪酸I.。羟基 - 十八二烯酸被引发响应Meja,而Pterocarpans I.e.Soneorautenol对Meja Elicitation的反应表现出下降[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba].我们的结果表明,可以诱导35种差异代谢的黄酮类化合物的24个组分,并降低了11种成分。GydF4y2Ba

据报道,来自红花的104种来自红花的化合物被分离并检测到[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba]. 在以前的研究中[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba检测到12种黄酮化合物,包括芦丁,HSYA,Kaempferol-3-O-β-D-Rutinoside,Kaempferol-3-O-β-D-葡糖苷,迦太基,曲霉素和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷。我们发现,MEJA治疗诱导了芦丁,HSYA,Kaempferol-3-O-β-D-Rutinoside,迦太基和槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷。在我们的结果中,UHPLC-ESI-MS / MS与自置数据库检测到209种黄酮化合物。我们以系统和全面的方式划刷了红花的化学成分,为未来提供了足够的利用率。UHPLC-ESI-MS / MS是彻底理解植物次生代谢物的有效方法。GydF4y2Ba

在以往关于MeJA调控黄酮类化合物生物合成的报道中,很多研究集中在基因表达分析上。在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba,Meja类似地诱导几乎所有的花青素生物合成基因的表达(GydF4y2Ba朋友GydF4y2Ba那GydF4y2BaCHS.GydF4y2Ba那GydF4y2BachGydF4y2Ba那GydF4y2BaF3h.GydF4y2Ba那GydF4y2BaF3'H.GydF4y2Ba那GydF4y2BaDFR.GydF4y2Ba和GydF4y2BaUFGT.GydF4y2Ba), 但GydF4y2Ba朋友GydF4y2Ba那GydF4y2BaCHS.GydF4y2Ba那GydF4y2BachGydF4y2Ba和GydF4y2BaF3h.GydF4y2Ba只有很低的水平。进一步分析表明,花青素生物合成的后期基因(如GydF4y2BaDFR.GydF4y2Ba和GydF4y2BaUFGT.GydF4y2Ba)被发现由Meja强烈地监管[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba].而在GydF4y2BaGynura Bicolor.GydF4y2Ba类黄酮生物合成基因的表达,GydF4y2BaGBCHGydF4y2Ba那GydF4y2BaGBCHI.GydF4y2Ba那GydF4y2BaGBDFR.GydF4y2Ba和GydF4y2BaGBANS.GydF4y2Ba,明显上调。与此相比GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba,被分类为类黄酮生物合成基因的基因被MEJA强烈地升级[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba].从上面的研究来看,可以表明,不同植物中的类黄酮生物合成基因的表达响应于MEJA治疗。在我们的研究中,Meja可以上调类黄酮生物合成途径中上游基因的表达(GydF4y2BaCHS.GydF4y2Ba那GydF4y2BaChis.GydF4y2Ba, 和GydF4y2BaHCTS.GydF4y2Ba)下游下游基因的表达(GydF4y2BaF3ms.GydF4y2Ba那GydF4y2BaANRS.GydF4y2Ba, 和GydF4y2BaANSs公司GydF4y2Ba),从而促进醌醌的生物合成,例如HSYA。Meja可能会上调表达GydF4y2Batrinity_dn28401_c0_g1GydF4y2Ba(GydF4y2BachGydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn36537_c1_g1GydF4y2Ba(GydF4y2BaHCT.GydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn37574_c1_g2.GydF4y2Ba(GydF4y2BaHCT.GydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn43344_c1_g1GydF4y2Ba(GydF4y2BachGydF4y2Ba), 和GydF4y2Batrinity_dn41734_c0_g5.GydF4y2Ba(GydF4y2BaCHS.GydF4y2Ba)表达下调GydF4y2Batrinity_dn42700_c3_g2.GydF4y2Ba(GydF4y2BaF3h.GydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn43120_c5_g1GydF4y2Ba(GydF4y2BaANR.GydF4y2Ba),GydF4y2Batrinity_dn44094_c0_g1GydF4y2Ba(GydF4y2BaANS.GydF4y2Ba), 和GydF4y2Batrinity_dn44565_c1_g1GydF4y2Ba(GydF4y2BaF3m.GydF4y2Ba),从而促进醌氨基氨基的生物合成(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba).当然,为了制定更多的确凿证据,需要一些其他实验,例如酶活性分析和转基因实验。GydF4y2Ba

在研究GydF4y2BaGynura Bicolor.GydF4y2BaDC。,一些基因在MEJA治疗下显着上调,例如GydF4y2BaGBCHGydF4y2Ba与MJ治疗前相比,表达量增加了100倍以上[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba].但是,我们的结果没有如此高的变化。主要原因可能是与MEJA打交道的不同方式。在以前的研究中,Meja被加入20毫升新的MS液体介质,在哪里GydF4y2BaGynura Bicolor.GydF4y2Ba华盛顿。在我们的研究中,MeJA被喷在健康的红花上。植物对MeJA的暴露量不同。GydF4y2Ba

由于红花中没有参考基因组,因此仍然难以克隆片段。然而,我们幸运地克隆了两个上调基因的推动者(GydF4y2BaHCT.GydF4y2Ba和GydF4y2BachGydF4y2Ba)在我们的实验中。序列分析结果表明,启动子上有MEJA响应元素,进一步证明了RT-PCR结果。我们的结果表明,Meja在黄酮类生物合成途径中上游上游基因的表达,并下游下游基因的表达,从而促进醌丘酮的生物合成,如HSYA,促进促进HSYA的基因MEJA仍然未知作为参与HSYA生物合成的基因尚未得到完全识别。在这个领域可以加强未来的研究。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

本文利用代谢组学和转录组学技术分析了MeJA处理下红花类黄酮生物合成的分子机制。基于uhpc-ESI-MS/MS检测平台和自建数据库(包括HSYA),共检测出209种黄酮类代谢物,其中35种代谢物差异显著。其中24种代谢产物在MeJA处理后表达上调,尤其是HSYA。MeJA治疗后11种代谢产物表达下调。综合代谢组学和转录组学分析表明,MeJA可能上调类黄酮生物合成途径中上游基因的表达GydF4y2BaCHS.GydF4y2Ba那GydF4y2BaChis.GydF4y2Ba和GydF4y2BaHCTS.GydF4y2Ba)和下调下游基因的表达(如GydF4y2BaF3ms.GydF4y2Ba那GydF4y2BaANRS.GydF4y2Ba和GydF4y2BaANSs公司GydF4y2Ba),从而促进醌醌的生物合成,例如HSYA。通过实时PCR验证这些基因的转录表达。此外,克隆并分析了在MEJA治疗下显着上调的两个基因的启动子。在启动子中发现了十个Meja响应元素。我们的结果为MEJA治疗下红豆油在红豆杉中的分子机制分析提供了见解和基本数据。GydF4y2Ba

方法GydF4y2Ba

植物材料GydF4y2Ba

本试验所用红花命名为川红花1号,由四川省农业科学院工业作物研究所栽培。由姚仁川赠送,经鉴定为红花(GydF4y2BaCarthamus Tinctorius.GydF4y2BaL.)裴金教授。它在成都中医药大学文江校区的药用植物园培养。主要根据前一份报告施用治疗方法[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]. 100美元 μM MeJA溶液(Sigma-Aldrich,瑞士)喷洒在健康的红花上3 花后天数(DAA)。对照组用相同的溶液,但不加MeJA。然后将花包在透明的塑料袋中,以防止挥发性植物激素的释放,并使诱导物或溶液被更高的吸收。治疗6天后 h、 取下塑料袋,采集花朵样本,立即在液氮中冷冻,并在室温下储存在冰箱中− 80 摄氏度。对5个红花花序进行RNA测序。由于RNA测序结果已通过本研究中的实时PCR实验(实验方法如下)验证,因此RNA测序没有重复。为了进行代谢分析,将10个红花属植物的花序混合为一个样品。进行三次生物复制以进行代谢组学分析。红花经MeJA处理或不经MeJA处理的花朵如图所示。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba。GydF4y2Ba

图6.GydF4y2Ba
图6.GydF4y2Ba

红花的花朵用或没有meja治疗。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba没有Meja(CK)治疗红花的花序。GydF4y2BaB.GydF4y2Ba用茉莉酸处理过的红花的花序。GydF4y2BaCGydF4y2Ba未经MeJA(CK)处理的红花管状花。用MeJA处理红花的管状花。酒吧是1 厘米GydF4y2Ba

用于代谢组学分析的样品制备和提取GydF4y2Ba

使用氧化锆轧机(MM 400,RETSCH)用氧化锆珠粉碎冻干的花朵,在30Hz下搅拌1.5分钟。称量100毫克粉末,并在4℃下用1.0mL 70%甲醇水溶液萃取过夜。在10000次离心后 GGydF4y2Ba10分钟,吸收萃取物(CNWbond碳-GCB SPE盒,250毫克,3毫升; ANPEL,上海,中国,GydF4y2Bawww.anpel.com.cn/cnw.GydF4y2Ba)和过滤(SCAA-104,0.22μm孔径;尖锐的,在LC-MS分析之前。GydF4y2Ba

UHPC条件GydF4y2Ba

使用LC-ESI-MS/MS系统(HPLC,Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A系统)分析样品提取物;MS,Applied Biosystems 6500 Q陷阱)。分析条件如下:UHPC柱,Waters ACQUITY UHPC HSS T3 C18(1.8 μm,2.1 毫米 × 100 毫米);溶剂体系,A水(0.04%醋酸):B乙腈(0.04%醋酸);梯度程序,0%B在0 最小值,11.0时95%B 最小值,12.0时95%B 最小值,12.1时为5%B 最小值,15.0时为5%B 最小值;流速,0.40 毫升/分钟;温度,40 摄氏度;和注射量,2 微升。将uhpc流出物连接到ESI三重四极线性离子阱(Q阱)-MS。GydF4y2Ba

ESI-q陷阱MS/MSGydF4y2Ba

质谱遵循Chen等人的方法。[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba].在三重四极线性离子阱质谱仪(Q陷阱)上获得了LIT和三重四极(QQQ)扫描,API 6500 QTRAP LC / MS / MS系统配备有ESI Turbo离子喷涂接口,以正离子模式操作由分析师控制1.6.3软件(AB Sciex,Waltham,Ma,USA)。ESI源操作参数如下:离子源,涡轮喷雾;源温度,500°C;离子喷雾电压(IS),5500 V;离子源气体I(GSI),天然气II(GSII)和帘式气体(CUR)分别设定为55,60和25.0psi;碰撞气体(CAD)很高。用QQQ模式进行10和100μmol/ L聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。获得QQQ扫描作为MRM实验,碰撞气体(氮气)设定为5 psi。 DP and CE for individual MRM transitions was performed with further DP and CE optimization. A specific set of MRM transitions was monitored for each time period according to the metabolites eluted within that period.

代谢产物的定性和定量分析GydF4y2Ba

本研究中黄酮类化合物的鉴定和定量是根据先前描述的计划多反应监测(MRM)方法进行的[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba].通过这种方法,陈先生在遗传和生物化学之间进行了基因组关联分析,并报告了840个代谢物,从中鉴定或注释了277 [GydF4y2Ba20GydF4y2Ba].在此基础上,建立了一个数据库。本研究中所有代谢物均由该数据库检测或注释。该数据库和方法已被广泛用于代谢产物的检测或注释,如Wang [GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]和刘[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba].这种方法也称为野生目标分析。由于HSYA不在数据库中,我们使用其标准示例(NO.: METR-15072815,成都曼斯特生物技术有限公司)建立图书馆并将其添加到自制数据库中。样品的代谢产物通过质谱法定义和定量分析。通过三重四极过滤每种物质的特征离子,在检测器中获得特征离子的信号强度。用多量子软件3.0.3分析色谱峰。每种化合物的综合面积峰用于PCA和OPLS-DA分析。GydF4y2Ba

差异代谢物分析GydF4y2Ba

主成分分析(PCA)能有效地提取主方差信息,在许多研究中得到了应用[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba].此外,正交部分最小二乘判别分析(OPLS-DA)用于具有较小相关性的变量。实验有生物重复;因此,将OPLS-DA模型的折叠变化和VIP值组合到筛分差分代谢物。通过R软件内置功能分析PCA(GydF4y2Bawww.r-project.org/GydF4y2Ba).参数:scale = true。通过LOG2转换原始数据后,数据被集中(均值)并由OPLSR分析。R软件中的Metabo分析师肛门。我们研究的主要步骤可以称为普遍研究[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba].筛选标准:1。代谢物必须表现出折叠变化≥2并折叠变化≤0.5。如果实验组中的代谢物超过对照组代谢物的2倍或小于0.5倍,则差异被认为是显着的。2.如果样品分组存在生物重复,则基于上述样品≥1的代谢物。VIP值表示模型中每组样本组的分类和辨别中相应代谢物组之间的差异的影响强度。GydF4y2Ba

RNA测序和注释GydF4y2Ba

如前所述进行RNA分离和纯化和cDNA文库构建和测序[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba].所有组织在干冰上研磨,总RNA采用TRIzol试剂(Invitrogen, CA, USA)制备。为了去除DNA,用脱氧核糖核酸酶(Takara,大连,中国)处理整段总RNA。分别使用NanoDrop 2000分光光度计(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)和Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies, CA, USA)测定RNA的数量和质量。用带oligo (dT)引物的磁珠从总RNA中分离mRNA;使用cDNA合成试剂盒(TaKaRa,大连,中国)合成cDNA,并将测序适配器连接到两端。文库制备在Illumina HiSeq 4000平台上测序,整合RSEM (RNAseq by Expectation-Maximization)软件从本实验室转录组数据库中获得的unigene序列进行注释。完整的转录组数据可以在国家生物技术信息中心(NCBI) SRA数据库(SRR10011980和SRR10011979)中找到。GydF4y2Ba

筛分差异基因GydF4y2Ba

deseq2 [GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba用于样品组之间的差异表达分析。DESEQ2要求输入的基因的未调节读数计数数据而不是RPKM(每千乘数百万),FPKM(每千千万百万的碎片)和其他标准化数据。读取基因计数是使用RSEM(RNASEQ通过期望最大化)计算的预期输出。预期计数通常低于读数。差异分析后,需要多个假设测试来纠正假设测试概率(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba值)与Benjamini-Hochberg程序获取错误发现率(FDR)时GydF4y2Ba2GydF4y2Ba折叠变化| ≥ 1and FDR < 0.05.

实时PCR分析GydF4y2Ba

如前所述进行实时PCR分析[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba].使用RNA提取试剂盒(Invitrogen,Ca,USA)分离总RNA,并且使用Prime Script Regent Kit(Takara,China)进行逆转录。用于扩增筛选基因的引物(GydF4y2BaCHS.GydF4y2Ba那GydF4y2BachGydF4y2Ba那GydF4y2BaHCT.GydF4y2Ba采用实时荧光PCR等方法设计引物5.0,并对部分红花进行扩增GydF4y2Ba28岁的年代GydF4y2Ba编码区域用作内部参考基因。底漆细节列于补充表中GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba. 所有引物均经琼脂糖凝胶电泳检测其特异性。RT-PCR采用SYBR prime-script RT-PCR试剂盒(Takara)进行,试剂盒有三个重复,循环条件按说明书设置。实验采用Bio-Rad-CFX96实时PCR检测系统(Hercules,CA,USA)。GydF4y2Ba

启动子克隆和序列分析GydF4y2Ba

由于红花没有完整的基因组序列,采用SON-PCR技术从红花基因组DNA中分离出黄酮类化合物基因的5′侧翼区。反应(50 200μL)进行 各dNTP的μmol,2 μmol底漆和2 LA Taq DNA聚合酶单位(Takara)。底漆详情见补充表GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba。将约2kb的所得PCR片段克隆到a中GydF4y2BapMD19-T型GydF4y2Ba矢量(Takara)和测序。用地点网状信号扫描程序分析黄酮基因启动子序列(GydF4y2Bahttp://bioinformatics.psb.GydF4y2Ba。Ugent.be/webbtools/plantcare [GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba];GydF4y2Ba

可用性数据和材料GydF4y2Ba

原始数据上传到序列读取存档(SRR10011980和SRR10011979)。GydF4y2Ba

缩写GydF4y2Ba

Chi:GydF4y2Ba

Chalcone异构酶GydF4y2Ba

CHS:GydF4y2Ba

Chalcone合成酶GydF4y2Ba

F3h:GydF4y2Ba

黄酮类化合物3-羟化酶GydF4y2Ba

UGT:GydF4y2Ba

UDP-葡糖醛糖苷转移酶GydF4y2Ba

HCT:GydF4y2Ba

羟基肉桂酰转移酶GydF4y2Ba

F3ms:GydF4y2Ba

黄酮3'-单氧基酶GydF4y2Ba

ANRS:GydF4y2Ba

花青素还原酶GydF4y2Ba

ANSs公司:GydF4y2Ba

花青素合成酶GydF4y2Ba

Meja:GydF4y2Ba

茉莉酸甲酯GydF4y2Ba

小桶:GydF4y2Ba

京都基因和基因组百科全书GydF4y2Ba

HSYA:GydF4y2Ba

羟基烷烃黄色A.GydF4y2Ba

CK:GydF4y2Ba

控制检查GydF4y2Ba

Meja:GydF4y2Ba

茉莉酸甲酯GydF4y2Ba

工具书类GydF4y2Ba

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    文章GydF4y2Ba谷歌学术GydF4y2Ba

下载参考GydF4y2Ba

致谢GydF4y2Ba

我们感谢曾胡博士和秦媛媛博士(美泰生物科技有限公司)。美国期刊专家(American Journal Experts, AJE)进行语言编辑(验证码:B631-386C-E812-C6A9-351B),姚仁川提供植物资料。GydF4y2Ba

基金GydF4y2Ba

该项目得到了中国国家科学基金会的补助金(81803669,81573544),为中国博士后科学基金会(2018M643790XB)提供了对代谢和转录的测试,为该研究的设计和写作提供了支持。GydF4y2Ba

作者信息GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

作者GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

JP构思和设计了实验。JC,JW和RW执行了实验。QW和BX有助于种植和样品收集。CR和QL有助于数据分析。jc写了稿件。所有作者讨论了结果并对稿件评论。作者读并批准了最终的稿件。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

通信GydF4y2Ba金培GydF4y2Ba。GydF4y2Ba

伦理宣言GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

这项研究没有直接涉及人类、动物或植物。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

附加信息GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

补充资料GydF4y2Ba

附加文件1:表S1。GydF4y2Ba

在红花样品和OPLS-DA结果中检测到209个代谢物的列表。表中列出了两百九种类黄酮代谢物细节。CK代表没有Meja的治疗,M-Meja代表Meja的治疗。在实验中进行了三种生物重复。GydF4y2Ba表S2。GydF4y2Ba35种代谢物的提取物在MeJA和未经处理的材料之间存在显著差异。CK代表没有MeJA的治疗。实验中使用了三个生物复制品。GydF4y2Ba表S3。GydF4y2Ba属于黄酮类生物合成的转录物的细节,在MEJA治疗后显着不同。M-CK代表没有Meja的治疗,M-Meja代表Meja的治疗。GydF4y2Ba表S4。GydF4y2Ba用于RT-PCR和启动子克隆实验的引物列表。GydF4y2Ba

权利和权限GydF4y2Ba

开放存取GydF4y2Ba本文根据创意公约归因于4.0国际许可证,这允许在任何中或格式中使用,共享,适应,分发和复制,只要您向原始作者和来源提供适当的信贷,提供了一个链接到Creative Commons许可证,并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明,否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中,除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中,法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用,您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本,请访问GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba. 知识共享公共领域放弃(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本条提供的数据,除非信用额度中另有规定。GydF4y2Ba

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陈,J.,王,J.,王,R。GydF4y2Ba等等。GydF4y2Ba红糖中黄酮类生物合成的综合代谢组和转录组分析(GydF4y2BaCarthamus Tinctorius.GydF4y2BaL.)在Meja治疗下。GydF4y2BaBMC植物BIOL.GydF4y2Ba20,GydF4y2Ba353(2020)。https://doi.org/10.1186/s12870-020-02554-6GydF4y2Ba

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关键词GydF4y2Ba

  • 类黄酮生物合成GydF4y2Ba
  • Meja治疗GydF4y2Ba
  • 代谢组学GydF4y2Ba
  • 转录组GydF4y2Ba
  • 分子机制GydF4y2Ba
  • HSYA.GydF4y2Ba
  • 红花GydF4y2Ba