结合遗传和转录组学方法鉴定鲜食葡萄果实大小相关的snp和indel

背景

由于消费者的偏好，浆果大小被认为是鲜食葡萄育种计划的主要选择标准之一。然而，浆果大小是一个复杂的数量性状，受多基因控制，其遗传决定浆果重量尚未完全了解。本研究的目的是利用转录组学方法进行标记发现，以鉴定和表征与鲜食葡萄果实大小相关的SNP和InDel标记。我们采用基于RNA-Seq、SNP/InDel搜索和验证的综合分析方法，对具有不同遗传背景的鲜食葡萄分离和品种进行了分析。

结果

使用转录组学方法(RNA-Seq)鉴定了30个snp和8个indel。这些标记是从红宝石x苏丹娜群体中发现的SNP/InDel中选择的，这些群体的浆果大小表型不同。38个SNP和InDel标记分布在8条染色体上。利用13个RxS分离体和41个不同遗传背景的鲜食葡萄品种，在3个季节进行了基因型-表型关联分析。结果表明，这些标记与浆果大小(10.2% ~ 30.7%)以及其他浆果相关性状(如长度和宽度)有一定程度的相关性。分析了SNP和/或InDel标记的共定位以及先前报道的与浆果大小相关的qtl和候选基因。

结论

我们鉴定了一组信息丰富且可转移的与浆果大小相关的SNP和InDel标记。结果表明，SNPs和InDels适合作为无核食用葡萄果实重量的候选标记。通过SNP/InDel转录组实验和qtl -连锁定位方法，鉴定了8、15和17号染色体上与浆果重量相关的基因组区域。在染色体3、6、9和14上发现了可能与浆果重量相关的新区域。

葡萄(葡萄(L.)是温带地区的主要水果作物，2017年收获面积690万公顷，同期全球产量为7430万吨[1]。葡萄是一种长寿的藤本植物，能适应各种气候。2，3.，4，5]。它具有高度的遗传和表型多样性，估计有5000 - 10000个葡萄品种[6，7]，包括整个属葡萄属有超过50种[8，9，10]。

尽管高遗传多样性是育种计划成功的一个优势[11，它也代表着一种挑战。现有基因型的鉴定对优化育种方案和培育新品种具有重要意义。然而，葡萄的幼期延迟了表型评估几年，特别是当果实特征是主要目标时。这意味着用于隔离维护和评估的劳动力和土地空间成本很高。因此，利用分子工具在新系发育的早期阶段提供表型信息，可以帮助选择(或丢弃)一个基因型子集，从而节省资源和时间。

由于消费者的喜好，鲜食葡萄育种的主要选择标准包括果实大小和无籽(或减少种子产量)[12]，以及味道和香气等感官特征。浆果大小和种子含量之间有很强的相关性，这可以用这个器官中特定生长激素家族(赤霉素)的表达来解释[13，14，15]。浆果大小经常处理在外地使用外源应用赤霉素酸(GA)_3.)，不同用途的葡萄酒和鲜食葡萄品种;在前者，目的是增加束松和通风，而在后者，它主要是用来增加浆果的大小[16，17]，对于达到商业规模的无籽葡萄品种尤其重要。

浆果大小是一种多基因数量性状。细胞增殖、细胞壁修饰、水和糖的转运等许多过程可能决定了其表达[18，19，20.]，这意味着许多基因可能有助于解释浆果大小的表型差异。尽管其相对较高的遗传性和生产影响，但浆果大小的遗传决定尚不完全清楚[18，19]。

在连锁群1、12中已经报道了几个与浆果大小相关的qtl [21]， 5,13 [22]， 8,11,17 [18]， 15 [23]和18 [24]。然而，QTL分析的低分辨率(Mbp量表)阻碍了它们在实践中作为有用标记的可转移性[25]。

基因VvCEB1和VvNAC26最近被报道为决定浆果大小的主要因素。VvCEB1是一种参与cv细胞大小调节的bHLH转录因子。赤霞珠[26]，而VvNAC26则被认为是在多种葡萄基因型中决定浆果大小变化的一个因素[27]。最近，我们利用转录组学数据报道并鉴定了一组与浆果大小相关的候选基因。候选基因编码bHLH转录因子、GDSL酯酶/脂肪酶、二苯乙烯合成酶、HSP17.9-D等[20.]。尽管有这些发现，遗传决定论和浆果发育背后的分子机制是复杂的，需要进一步的分析和数据来揭示它们的遗传结构。此外，有必要考虑到食用葡萄和酿酒葡萄在浆果大小方面的不同驯化过程[28]。在选择用于生产葡萄酒的基因型中，倾向于较小的浆果，以便积累更多的花青素色素，这些色素集中在果皮中[29]。酒cepages(特别是红色的)需要一定程度的涩味，这是由种子中的单宁提供的[28]。因此，葡萄酒和鲜食葡萄对赤霉素的反应也不同，赤霉素主要由种子提供。

果实大小是葡萄品种的重要经济性状[17];它构成了鲜食葡萄育种计划中浆果质量性状的主要选择标准之一，基于选择较大的浆果和集群的趋势，而不是葡萄酒品种拥有小种子浆果。因此，确定浆果大小变异的遗传基础将提供有关其遗传决定因素的宝贵知识[30.]，寻找能够通过标记辅助选择改善物种繁殖的分子工具[20.]。

分子标记的开发对苗木的早期选择无疑具有很高的价值[31，32]。然而，果实品质性状的标记仍然很少[33]。在为数不多的例子中，可口种子的存在/缺失标记已成功应用于MAS [34]，以及与麝香葡萄酒香气相关的标记物[33，35]和真菌疾病，如白粉病抗性[36，37，38]，主要用于食用葡萄品种的育种项目。

SNP/InDel作为新基因或等位基因变异的驱动因素，代表了遗传变异的宝贵来源，当产生的表型表现出有利的性状时，这些新基因或等位基因变异可能通过自然或人工方式被选择[28]。基于使用高通量测序的转录组测序的标记搜索导致快速发现集中在编码区域的多态性，避免了高度重复的基因组区域。它也成为检测因果变异/突变的有力工具[39，40，41，42]。尽管转录组测序数据(RNA-seq)付出了巨大的努力并提供了丰富的信息，但其在SSR、SNP和InDel等分子标记鉴定中的应用仍然有限[qh]43]。然而，据报道有少数例子[42，43，44]。

本研究的目的是利用转录组学方法进行标记发现，以鉴定和表征与鲜食葡萄果实大小相关的SNP和InDel标记。为此，我们使用了“Ruby无籽”x“Sultanina”(RxS)后代(N= 139)，一个群体包含具有浆果大小不同表型的分离体。在初步鉴定的数百个标记中，选择了30个snp和8个indel，并在(RxS)分离、鲜食葡萄品种和a的代表性基因型中进行了实验验证诉酿酒用葡萄核心集合。

与果实大小相关的snp和InDels的全球鉴定诉酿酒用葡萄基因组

利用RNA-Seq实验中收集的14个果实结实期和6-8 mm浆果直径期样品的可用数据，对与浆果大小相关的单核苷酸多态性(snp)和插入/缺失(InDels)进行了全球搜索。20.[附加文件1:表1)。

SNP/InDel调用是按照GATK软件推荐的最佳实践进行的[45]，并预先与的序列对齐葡萄使用Tophat [46[附加文件2:图S1)。共鉴定出771,118个snp和100,205个短indel。在这些索引中，55,989个对应于插入，44,216个对应于删除(图2)。1)。snp分布相当均匀诉酿酒用葡萄染色体(杆);数量最多的是chr 18(57,443)，最低的是chr 17(26,455)，平均每条染色体有37,709个snp(附加文件)3.:图S2A)。其中大部分位于参考基因组的内含子区(35.7%)，其次是外显子区(14.7%)、基因间区(14.3%)、下游(16.3%)和上游(10.3%)4:图S3)。非同义编码7.2%，基因内snp 8.6%。外显子区非同义与非同义的取代率为0.98。共观察到488,517个转换和284,341个转换，分别占63%和37%，转换/转换比(Ts/Tv)为1.7。在chr 18(7809)和chr 10(3251)上也发现了最多的InDels，平均每条染色体有5095个InDels(附加文件)3.:图S2B)。indel多位于内含子区(34.4%)，其次是下游(16%)、基因间(11.6%)、上游(10.4%)和外显子区(8.5%)5:图S4)。SNP和InDel密度在染色体间存在差异;然而，在chr 8中观察到的两种多态性密度最高(2.15 snp / Kb, 0.32 InDels / Kb)，而在chr 9中观察到的两种多态性密度最低(1.32 snp / Kb, 0.18 InDels / Kb)6:图5)。

与浆果大小相关的snp和InDels的计算机选择

为了选择与浆果大小相关的假定多态性，我们定义了一组候选制造商应该满足的标准(参见方法部分)。缺失的基因型数据(例如，缺失已鉴定多态性的reads)是最重要的过滤器，对应于SNPs的84.5%和InDels的77%(附加文件)2:图S1)。过滤后得到41,034个snp和7446个indel。剩余的snp和indel用固定指数(F_圣) 1 [47]，这意味着“大浆果”(LB)分离中相同表型类别的每个SNP或InDel的等位基因频率不同于“小浆果”(SB)分离中观察到的等位基因频率。F_圣分析选择了与浆果大小相关的382个snp和16个indel。推测的snp主要分布在5条染色体上:17(37%)、9(24%)、15(12%)、6(9%)和8(7%)。推定indel主要位于chr 6和chr 9(各占25%)和chr 11(12.5%)。

使用snpEff软件进行功能注释[48，根据诉酿酒用葡萄参考基因组(PN40024)(附加文件2:图S1)。此外，我们还进行了功能富集分析(Gene Ontology)，以确定382个snp所在的232个基因中主要的过度代表的生物过程。我们使用了ShinyGO平台[49，50[附加文件7:图S6)。我们的研究结果表明，氧化石墨烯的生物合成过程、刺激反应、发育过程、定位和甲基化类别在候选基因集中被过度代表(p< 0.01)(附加文件7:图S6)。

随后，根据其对CDS的影响，选择了177个假定的snp，其中84个为“非同义编码”，93个为内遗传(snpEff软件，见方法)。对InDels进行移码、内生性、电子学以及“剪接位点供体和“剪接位点受体”。经过深度覆盖分析，定义为与给定基因组位置重叠的reads总数[51]，选择68个snp和12个InDels设计特异性引物，使用高分辨率熔化分析(qPCR-HRM)进行验证。

因此，有一些实验步骤会导致需要评估的标记的减少，包括无法获得引物和PCR产物的序列。

共获得45个snp和12个indel的引物。考虑到:1)未观察到扩增产物，或2)获得模糊或无判别性的HRM/熔化曲线，丢弃SNP/Indel引物。随后，分别选取34组引物和10组引物进行SNPs和InDels测序确认。从中确认了30个snp和8个InDelS，验证率分别为88%(30/34)和80%(8/10)。

利用qPCR-HRM技术对与浆果大小相关的SNP和InDel候选物进行实验验证

为了通过qPCR-HRM确认和验证与浆果大小相关的snp和InDels，分别设计了30个snp和8个InDels的引物(附加文件)8:表S2和附加文件9表S3)。snp呼叫质量指数在3899 ~ 110535之间。选取扩增片段长度为79 ~ 183 bp的引物对，优化HRM和熔解曲线，获得较好的结果。

然后对6个果实重量表型不同的无籽RxS分离体和亲本进行多态性分析。验证了相同数量的转换和转换;最常见的变化是T- > C/C- > T和A- > C/C- > A，分别对应9个和6个snp。

亲本分离模式为' abxaa '和' abxab '，表明在第一种情况下，每个亲本分为小浆果(SB)或大浆果分离(LB)组，根据[20.];在后者的情况下，双亲都是杂合的多态性，并与SB或LB分离集分组。

38个多态性分布在第3、6、8、9、14、15、17和19号染色体上，但在第6、9、15和17号染色体上占82%1和2,无花果。2)。在第6、9和15号染色体上观察到snp和InDels的共定位，这表明含有与浆果重量相关的基因的可能性更高(图2)。2)。事实上，11个多态性位于chr 9(29%)， 7个位于chr 6。

这组38个标记与32个基因相连，27个基因含有snp, 8个基因显示InDels(表2)1和2)。有趣的是，两个基因在其序列中呈现出SNP和InDel，一个编码可能的丝氨酸结合子(Vitvi09g01251，两个SNP/一个InDel)，一个编码叶绿体磷酸加氧酶(Vitvi06g00063，一个SNP/一个InDel);后者基因与植物衰老有关[52]。

表现出与浆果重量相关的多态性的32个基因组是一个多样化的组(表1)1和2)，包括编码组蛋白去乙酰化酶6 (Vitvi17g00894)的基因，据报道，这是一种染色质重塑，有助于转录抑制[53]。此外，还鉴定出5个编码功能未知蛋白的基因，3个编码Myb家族对应转录因子的基因，1个BTF3同源基因4和抑制基因MYB5。在不同浆果发育时期，比较大、小浆果基因型时，这些基因的表达均无显著差异[20.]。氧化石墨烯类别生物合成过程和定位在这组基因中被过度代表(p< 0.05)(附加文件10:图S7)。

浆果重量snp / indel基因型-表型关联分析

使用全局线性模型(GLM)对结果进行分析[54]，以确定关于浆果重量的表型数据是否与候选标记提供的信息存在统计学关联。RxS后代个体的6、8、15和17 chr SNP和InDel标记与浆果鲜重(BFW)显著相关(p< 0.05)3.a).一组位于17号染色体上的6个候选snp，包含6.8 Mbp的区域，与浆果重量高度相关(表2)3.一个)。

测定了SNP和InDel标记与浆果品质性状(束重、浆果长度、浆果宽度和浆果体积)之间的显著相关性(表1)3.b、c、d和e)。与BWe显著相关的标记仅在chr 17中发现(表2)3.b).与BL和BWi显著相关的标记出现在6、8、15和17 chr (BL)和6、9、15和17 chr (BWi)(表1)3.c和d)。在chr 6,14和17中检测到与BV显著相关的标记(表1)4e)。

上述结果与随机森林(Random Forest, RF)分析结果一致（额外的文件11:图S8)和不平衡方差分析(附加文件)12(表S4)，这支持了与体重有关的标记的补充信息，并估计了它们对该性状的可能影响。RF回归结果显示，9个候选snp(7个位于chr 17, 1个位于chr 14, 1个位于chr 3)和1个位于chr 6的InDel (TSRNAINDELS120073669)通过1000个排列与浆果重量显著相关(p< 0.05)(附加文件11:图S8)。事实上，位于chr 17的6个snp(图2)。2)是BFW的最佳候选标记(p< 0.001)(附加文件11:图S8)。不平衡方差分析估计的标记对体重特征的贡献范围为1.4 - 33.0%(附加文件)12(表S4)，显示非加性参与。

随后，我们评估了SNP和InDel标记，以确定它们在41个具有不同遗传背景的品种中的信息量(图2)。3.)，包括21种鲜食葡萄品种，代表了智利葡萄园和其他国家种植最多的葡萄品种(附加文件)13(见表S5)，以及一个包含20个品种的核心集合，这些品种拥有大部分的东方无产者的遗传多样性诉酿酒用葡萄(附加文件14表6)。

使用GLM模型获得的结果显示，这些标记物与体重有一定程度的关联(10 - 30%)(表1)4a).事实上，snp和InDels与BFW显著相关(p< 0.05)， chr分别为3、6、8和154a)。SNP和InDel标记与浆果长度(BL)和浆果宽度(BWi)之间也存在显著相关性(p< 0.05)4前者为CHR 3、6、8、14和15，后者为CHR 3、8、14和15。

BL和BWi性状与解释变异比例的关联值分别为11% ~ 25%和11% ~ 32%。位于chr 3和15的TSRNASNPS120468689和TSRNASNPS120206839标记至少在一个季节中与上述3个性状表现出显著的相关性。

浆果重量差异表达基因、SNP/InDel多态性和qtl的整合

比较标记和候选基因之间的物理坐标，以评估含有候选snp和indel的区域的共定位，这些候选snp和indel与浆果重量和先前转录组学分析中鉴定的差异表达(DE)基因相关[20.]。在38个候选多态性所在的8个区间中，鉴定出190个来自不同浆果大小的无籽分离体的DE基因。每间隔DE基因数从15期的15个到14期的28个不等。这些结果总结在附加文件中15表S7。

数字4显示多态性与DE基因之间的共定位。DE基因与主成分分析(PCA-1)的成分1显著相关，该成分1解释了大(LB)和小(SB)分离在结实期和浆果6-8 mm直径期之间最大的表型差异，其橙色和青色分别表示在SB和LB中过表达。

在chr 3中鉴定出1个SNP和25个DE基因，其中4个与F-box蛋白At2g16365 (Vitvi03g00306)(0.96)、推定分泌蛋白(Vitvi03g01597)(0.98)、5 ' - amp激活的蛋白激酶γ亚基(Vitvi03g01483)(0.97)以及发病相关蛋白5 (Vitvi03g00124)(-1)的基因编码的PCA-1显著相关;前3个在SB中过表达，后3个在LB中过表达。我们还在chr 6中发现了3个snp，加上4个InDels和26个DE基因，其中2个与PCA-1显著相关，编码gcn5相关的n -乙酰转移酶(GNAT)家族蛋白(Vitvi06g00679)和地衣酶(Vitvi06g01917)，相关性分别为- 0.96和1，表明LB和SB分离中分别有高表达(图1)。4)。

在chr 8中发现了4个snp和25个DE基因，其中一个基因与PCA-1显著相关(- 0.96)，编码一个假定的线粒体2-氧戊二酸/苹果酸载体(Vitvi08g01801)，表明LB分离中过度表达。在chr 9中发现了8个snp + 3个InDels和25个DE基因，其中2个编码18.6 kDa的III类热休克蛋白(HSP) (Vitvi09g00045)和邻氨基苯甲酸n -苯甲酰转移酶蛋白2 (Vitvi09g01229)，它们与PCA-1负相关(- 0.95和- 0.96)，并且在LB分离中过表达。在chr 14中鉴定出1个SNP和28个DE基因，其中2个编码铜伴侣蛋白(Vitvi14g00270)和可能的半乳糖糖基转移酶13 (Vitvi14g02028)，这两个基因都与PCA-1显著相关(- 0.97和0.96，)，分别在LB和SB分离中过表达。在chr 15中鉴定出5个snp和1个InDel，以及15个DE基因，其中1个基因编码1个与PCA-1高度相关的o -酰基转移酶WSD1 (Vitvi15g00960)，表明其在SB分离中过表达(1)。在chr17中发现7个snp和25个DE基因，其中7个与PCA-1显著相关。两个编码扩张素- a15的DE基因(vitvi17g001251)和c2h2型锌指转录因子(Vitvi17g00658)呈负相关(- 0.99和- 0.97)，表明它们在LB分离中过表达。此外，DEAD-box atp依赖性RNA解旋酶30 (Vitvi17g01557)(0.99)、可能的金属-烟胺转运蛋白YSL7 (Vitvi17g01183)(0.99)、萌发样蛋白亚家族T成员1 (Vitvi17g01451)(0.96)、破裂花粉粒蛋白1 (Vitvi17g00070)(0.97)、LON肽酶n端结构域和RING finger蛋白1 (Vitvi17g00643)(0.96)的5个基因编码与PCA-1正相关，并在SB分离中过表达。最后，在chr 19中发现了1个SNP和21个DE基因，其中两个基因与PCA-1显著相关，编码5 ' - amp激活的蛋白激酶γ亚基(Vitvi19g00252)(0.97)和表皮特异性分泌糖蛋白EP1 (Vitvi19g00111)(0.95)，在SB分离中过表达(图19)。4)。

果实大小不同表型分离的snp和indel的鉴定

单核苷酸多态性(snp)和插入/缺失(InDels)是在所研究的所有物种中最丰富的多态性，包括植物基因组[55，56];两者在基因组中都是普遍存在的，尽管频率低于snp，但InDels在大小上表现出更大的多样性[57，58，59]。SNP标记在植物遗传研究中的大量应用是基于它们的稳定性、可用性、判别能力和可重复性[18，60，61，62，63]。InDel标记在植物诊断和系统发育研究中的适用性已得到证实。最近在大豆全基因组检测的基础上发现了用于基因组辅助育种应用的新型InDel标记[55]，葡萄[28]，桃子[63]，鹰嘴豆[64]，芸苔属植物拉伯［65和甜樱桃[66]等。与其他植物物种一样，葡萄中最常用的SNP应用集中在遗传多样性评估、品种鉴定、连锁图谱构建以及最近的表型-基因型关联研究[qh]18，27，30.，60，61，62]。

我们的方法是基于浆果发育早期个体(RxS杂交的分离)转录组的比较(附加文件)1:表1)。这些阶段对应于葡萄果实双s型生长曲线特征的第一部分。这两个阶段都与液泡变化相一致，液泡变化与水分和有机酸积累有关，导致细胞膨胀并同时决定最终的浆果大小([18，26，67，68];修订版20)。

本研究的第一种方法是针对从转录组学分析中推断出的DE基因中的snp进行研究，该分析比较了无籽分离体与不同浆果大小的差异[20.]。然而，这些snp显示出与浆果大小的关联相当有限。因此，在第二种方法中，所有最初确定的多态性都包括在分析中，而不管它们的基因组位置如何，遵循附加文件中提供的过滤和选择管道2:图S1观察到的snp分布诉酿酒用葡萄染色体与[30.]，数量最多的是chr 18(57,443)，最少的是chr 17 (26,455)3.:图S2A)。

结合转录组学数据的分析结果，讨论基因间序列等非编码区snp(14.3%)和InDels(11.6%)的鉴定是有意义的，其中一些可能是调控区。对这一发现最合理的解释可能来自这样一个事实，即葡萄藤的注释和其他植物基因组一样，基本上是一个自动化的过程，因此可能存在一些错误。基因间区多态性的检测结果与先前使用类似RNA-seq方法报道的结果一致[43，69，70]。这些结果可能意味着在当前的注释中没有考虑到一些编码区甚至完整的基因[69]。事实上，已经做出了一些努力来策划葡萄基因模型注释[71]，而RNA-Seq数据是一种有价值的工具，可以用于确认基因模型。此外，研究Sultanina基因组获得的证据[28]，可以鉴定出许多与参考基因组PN-40024推断的转录本不匹配的转录本。这种不一致在一定程度上可以解释为《苏丹》中存在比预期更大的抄本。因此，在使用参考基因组描述我们的转录本时，有可能这些“基因间”序列确实是基因或调控序列的一部分，实际上是“假基因间”序列。无论如何，考虑到基因功能注释或确定位于非编码区或调控区多态性的功能影响所固有的困难，我们选择位于编码区的snp进行进一步的实验评估[43]。

有趣的是，根据我们的RNA-Seq数据，在内含子区域也发现了snp和indel。尽管转录组学方案通过选择聚腺苷化RNA或减少核糖体RNA的存在特异性地增强成熟mRNA [72]，内含子多态性的存在可以用前mrna保留来解释[70，72，至少在某种程度上是这样。此外，我们的结果与先前报道的研究一致杨树黑质15%的snp位于内含子区域，使用类似的方法分析转录组数据以发现多态性[70]。事实上，这里描述的其中一个位于内含子区(TSRNAINDELS120073761)的indel已被实验证实(表1)2)。

通过一系列的筛选方法，我们确定了38个多态，30个snp和8个InDels(表)1和2)。他们是双等位基因，MAF至少为20%。21%的snp位于外显子，非同义和基因内变化分别占7.2%和8.6%。这些结果与利用HapMap2在玉米中报道的数据一致，其中21%的snp存在于基因内区域。这一证据表明，编码序列中的多态性比非编码区域中的多态性更少[73]。多态性分布在8条染色体上诉酿酒用葡萄,chr 3、6、8、9、14、15、17和19(图1)2)。有趣的是，这38种多态性中有82%只存在于4条染色体上(6、9、15和17)。此外，在chr 6、9和15中验证了snp和InDels的共定位(图2)。2)。

位于编码区具有非同义效应和基因内效应的snp被优先选择。根据这些变化对基因功能的可能影响，在编码区选择功能性非同义snp，这可能导致编码蛋白的氨基酸残基发生变化，干扰转录或蛋白质合成[73，74]，以及蛋白质结构特性的变化或功能的改变。由于其显著的影响，非同义编码snp被认为是表达调控的最重要驱动因素，因此是数量复杂性状关联研究的理想标记[73，75]。然而，它们的频率低于无声替代[73，74]。在水稻中使用类似的策略，大约有200个基因含有与辣椒被确认[73]，也报道了与玉米耐旱性相关的非同义snp [76]。由于这种类型多态性的数量要少得多，因此InDels的选择标准不那么严格。

snp /InDels标记与浆果大小的基因型-表型关联评价

我们选择用于验证SNP和InDel标记的平台是PCR结合高分辨率熔融(qPCR-HRM)分析，这是一种PCR后检测方法。选择它是因为它具有高灵敏度，速度，准确性和分析双链PCR产物解离的可行性，如snp, InDels [28，66，77，78]及SSRs [79]。扩增条件适用于每个SNP/InDel标记(附加文件8:表S2和附加文件9(见表S3)，获得可靠的HRM和熔解曲线，对分离剂和品种进行分析。

使用RxS杂交的13个分离片段进行基因型-表型关联，包括6个浆果重量表型差异的分离片段，以及另外7个浆果大小一致的分离片段。分布在chr 6、8、15和17的14个snp与BFW显著相关(表1)3.a).我们从GLM [54]， RF和不平衡方差分析，确认了与浆果重量相关的10个最重要的多态性，并估计了它们对该性状的可能影响。在chr 17中鉴定的7个候选snp中，有6个在一个包含6.8 Mbp的区域内，呈现出高达50%的基因型-表型关联;chr 6中描述的一个InDel (TSRNAINDELS120073669)与浆果重量显著相关。在chr 8中发现的4个snp覆盖了大约1.8 Mbp的区域，它们表现出高达50%的基因型-表型相关性，但比其他标记不稳定。

使用不平衡方差分析估计多态性对浆果重量的贡献范围在1.4到33%之间(附加文件)12(表S4)，以及与中特定区域相关的可能多态性连锁诉酿酒用葡萄染色体。这些结果可能意味着它们对浆果重量的贡献不是加性的，考虑到方差分析是一种单变量分析，每次测试评估一个标记，并且标记之间可能的等位基因相互作用，如上位性，没有考虑在模型中，这可以解释。总之，这些结果表明，snp和InDels这两组标记都有很好的机会作为底物来开发适用于食葡萄育种计划的选择标记。与其他品质性状显著相关的SNP和InDel标记包括BWe、BL、BWi和BV(表2)3.B, c, d和e)，这可能表明葡萄浆果相关性状的遗传决定因素之间可能存在相互作用[30.]。

考虑到多态性与浆果大小的分布和关联的多重证据表明，可能存在与该性状相关的区域，这解释了浆果重量的不同表型差异水平，基于观察到的多态性之间的相似关联，表现为块或qtl，可能源于低重组事件。

关于葡萄品种果实重量性状的SNP和InDel标记的信息量，我们的研究结果强调了在双亲本群体和具有不同遗传背景的品种中进行广泛验证的重要性。在双亲群体中进行的分析通常是针对特定群体的，需要在更广泛的遗传背景中进行测试[80]。

在chr 3、6、8和15上鉴定的标记物与体重之间使用GLM模型(10 ~ 30%)确定了显著相关性(p-value< 0.05)(表4a).此外，我们的结果还显示SNP和InDel标记与葡萄浆果相关性状如BL和BWi显著相关(表2)4b和c)。下一步的重点将是在一组广泛的鲜食葡萄品种中对这组标记进行评估，以选择它们的最佳组合作为BFW的选择工具。

整合转录组分析，包含候选snp / indel的区域和描述浆果大小的qtl

本研究鉴定的SNP和InDel标记分布在8条染色体上诉酿酒用葡萄(无花果。2)以及哪些基因参与了复杂的代谢途径。这些结果与在这组基因中确定的具有代表性的氧化石墨烯类别一致，如生物合成和发育过程、对刺激的反应、运输和定位以及染色质重塑(附加文件)7:图S6和附加文件10:图S7)。

分析了含有SNP和/或InDel标记的区域与先前报道的浆果重量qtl的共定位。在9个连锁群中报道了显著的qtl。例如，报道了位于LG8、LG11和LG17的浆果重量qtl [18]，解释了7%至31%的表型变异。我们的研究确定了三个LG8和LG17可能的共定位[18]及LG15 [23]。

在LG8中所描述的QTL之间的物理距离18]，在SxG人群和四个候选snp所在的区域中发现，对应于大约0.8 Mbp。与LG15果实重量相关的QTL鉴定出5个snp和1个InDel [23]。然而，为了估计它们之间的距离，无法获得该QTL的物理坐标。

在两个群体中鉴定出位于LG17的主要QTL。第一个是无核鲜食葡萄(MTP3140)，其中包括cv。其中一位父母的家谱是“Sultanina”，而另一位则对应于葡萄酒品种“西拉”和“歌海娜”(SxG)的杂交。据估计，LG17的QTL区间与基因型-表型相关性最高的6个snp组所在的6.8 Mbp区域之间的距离为1.9 ~ 2.1 Mbp，具体取决于所分析的群体[18]。在葡萄酒(100%有籽)和鲜食葡萄(部分无籽)群体中对该QTL的鉴定可能表明，与浆果重量的关联独立于主要特征的差异，如有无种子。这些qtl在葡萄酒和食用葡萄遗传背景的相同基因组区域的鉴定强烈表明，这是与浆果大小相关的关键遗传因素。

因此，本研究提供的多项证据证实了先前报道的LG15中与浆果大小相关的qtl [23]、LG8、LG11及LG17 [18]，强化了分布在不同基因组区域(LG)的几个基因可能支持该性状的最终表达的观点。

然而，本研究未发现LG1和LG12中描述的qtl与BFW相关的SNP和InDel标记[21]、LG5及LG13 [22]，及LG18 [24，34]，尽管后者与控制种子含量的主要QTL有关[34]。一种合理的解释可能是基于BFW选择具有不同表型的无籽分离，这可能掩盖了位于LG18的QTL的影响。

最近在chr 1中报道了与候选基因NAC26相关的snp与体重之间的显著关联[27]及《美国法典》第17、18及19条[30.]。考虑到BFW的多基因控制，有人提出不同的因果多态性可能在种群中分离[18，30.]。

本研究中发现的snp和InDels分布使我们能够在chr 3,6,9和14中发现四个与浆果重量相关的新区域。与浆果大小相关的38个SNP和InDel标记分布在32个基因上;在我们课课组之前的工作中，没有报道过具有不同浆果大小表型的分离体之间的差异表达(DE) [20.]。来自转录组分析的DE基因的共定位和鉴定出多态性的区域使我们发现至少190个DE基因被认为可能与浆果大小有关(图2)。4)。其中21个与PCA-1的关系特别有趣，并且在大型和小型无籽种族之间表现出更高的区分值。这组基因包括与转录调控、细胞壁修饰、金属离子、水和有机酸的运输、对生物/非生物胁迫的反应、蛋白质降解和蛋白激酶激活相关的功能类别[20.]。因此，DE基因与含有snp和InDels的区域的共定位可能支持观察到的候选多态性与浆果大小之间的关联，特别是在68个DE基因参与浆果大小决定的情况下[20.]。

例如，在chr 3报道的单SNP与预测的Ca2 +依赖性磷脂结合蛋白相关(表2)1)可能与膜联蛋白有关，膜联蛋白在信号传导和适应中起着相关作用，是寒冷、氧化、生理盐水和脱落酸(ABA)应激反应的关键因素[81]。在chr 3中还发现了4个与PCA-1显著相关的DE基因，它们编码F-box蛋白At2g16365蛋白、一个推定的分泌蛋白、一个amp激活的蛋白激酶γ调节亚基和一个发病相关蛋白5(附加文件)15:表S7);第一个和第三个可能分别参与蛋白质降解/蛋白酶体和蛋白质修饰/激酶，最后一个参与应激/防御反应[20.]。

Chr 6有4个InDels和3个SNPs，共定位了一个编码gcn5相关的n -乙酰转移酶(GNAT)的基因，该基因被认为是与染色质组装和DNA复制相关的转录激活因子[qh]82]以及可能与细胞扩增相关的expansin-A8(图2)。4)。在chr 8中发现了4个snp，它们与线粒体氧葡萄糖酸盐/苹果酸盐转运蛋白2共定位，在大浆果分离中也上调，可能与植物液泡运输和细胞膨胀有关[qh]83(图。4;额外的文件15表S7)。

在chr 9中鉴定的8个snp和3个InDels中，两个基因在编码热休克蛋白18.6 kDa III类和anthranilate N-benzoyltransferase 2蛋白的大浆果分离片段中被上调，这两个基因都与胁迫和防御反应有关，并与多态性共定位。编码WAX2蛋白和硼转运蛋白2的基因分别与植物干旱相关[j]。84]和细胞壁完整性[85，86]也位于同一基因组区域(图2)。4)。

在chr 15中发现了5个snp和1个InDel，它们与β -果糖糠醛苷酶(转化酶)、磷脂酰基转移酶、稻草人样蛋白6、转酮醇酶10和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AtPK2/AtPK19的基因编码有关，可能参与信号传导、激活和生物合成过程。在chr17中发现的21个DE基因中，有7个与浆果大小决定有关。20.]，包括扩展蛋白a15，在大浆果分离中上调，这可能最终导致大浆果表型，并且在该区域描述的SNP变异与浆果大小之间(图2)。4;额外的文件15表S7)。snp标记和LG17上的QTL共定位于一个候选的5mbp的驯化位点。10的遗传结构的研究诉酿酒用葡萄，支持了在驯化过程中等位基因(如这里描述的snp)对较大果实的正向选择的观点。的假定的同源物诉酿酒用葡萄细胞色素P450 78A的基因编码，该基因部分控制番茄的果实重量，并与其驯化有关[87]，在LG17中也与由[18]。这可能表明在生理和系统发育上较远的物种中，果实重控制的机制是守恒的。

我们的结果与假设一致，即编码区和基因启动子的变化在决定复杂性状方面同样重要[73]。在玉米中也观察到类似的结果，对数量性状的分析表明，79%的变异可能是由位于基因上或上游5kb的snp和indel来解释的[76]。

最后，利用RNA-Seq、SNP/InDel搜索和验证对不同遗传背景的葡萄品种和食葡萄分离进行综合分析，我们确定了一组信息丰富且可转移的与浆果大小相关的SNP和InDel标记。这些结果有助于更好地理解浆果大小等复杂性状，并有助于分子标记的成功转移，从而整合到标记辅助葡萄育种计划中。

我们利用RNA-Seq、SNP/InDel搜索和验证对不同遗传背景的葡萄品种和食葡萄分离进行组合分析，鉴定出一组信息丰富且可转移的与浆果大小相关的SNP和InDel标记。本研究结果表明，snp和InDels作为无籽食用葡萄果实重量的候选标记是合适的。通过基于SNP/InDel搜索的转录组实验以及qtl -连锁作图方法，鉴定了8、15和17号染色体上可能与浆果重量相关的区域。此外，在染色体3、6、9和14上发现了可能与浆果重量相关的新区域。

植物材料

“Ruby无籽”与“Sultanina”杂交(RxS)衍生的种群，n= 139)种植在智利圣地亚哥农业调查研究所(nia -La Platina)的拉普拉蒂纳实验站;葡萄藤通过格架系统(“西班牙parron”)进行种植，嫁接在cv上。' Sultanina '，在标准条件下按先前的[20.]。该种质属印度国家葡萄研究所鲜食葡萄育种项目。它可用于实验目的，因此已在许多先前的研究中使用[15，20.，24，34]。在这种情况下，在2010年至2012年的季节，它的浆果大小和相关的亚性状，以及一些性状，如糖含量和可滴定酸度，种子重量，轴结构和ga响应性等都被表型化了。

为了评估SNP和InDel标记的信息性，对41个具有不同遗传背景的品种进行了基因分型，其中包括21个食葡萄品种，其中包括智利葡萄园和其他国家种植最多的品种(附加文件)13(表S5)和20个品种，它们具有很大比例的东方无产者的遗传多样性诉酿酒用葡萄(附加文件14表6)。这一种质是在国际水稻研究所-拉普拉蒂纳建立的，由遗传资源组管理;在几个季节(例如，从2016年到2018年)，它已经表型化了许多性状，如浆果和种子鲜重、浆果长度和浆果宽度等(图2)。3.)。葡萄藤通过格架系统(“双围栏”)进行，每个基因型重复3至5次。葡萄藤品种在标准的浇水、施肥、病虫害防治和修剪条件下进行管理。所有实地试验都遵循机构指导方针和地方立法。

实验设计和样品收集

双亲加上6个RxS杂种(N= 139)与浆果大小和重量的不同表型(Fisher检验，p< 0.05)，即小浆果(SB)和大浆果(LB)，均无籽，按[20.[附加文件1:表1)。果实样品采集于坐果期(FST)和果实直径6 - 8mm (B68)，也对应于开花后30天和45天(e - l27和e - l31的物候期)[88，89])。每种基因型在两个或三个重复(克隆)中取样，后来被认为是生物重复。

RNA提取、测序和数据分析

果皮和中果皮组织均质化并一起分析RNA-Seq实验，如先前的[20.]。用改良的热硼酸盐法从3 ~ 4 g冷冻组织中分离总RNA [90]。测序前使用生物分析仪测定RNA完整性，选择RNA完整性值(RIN)大于7.0的样品。按所述进行样品测序[20.]。共14个样本诉酿酒用葡萄从RxS杂交的一组6个种族和亲本中获得(附加文件1:表1)。这个子集是先前描述的实验的一部分[20.]。在测序实验中，具有相同表型(SB或LB)的分离子被认为是生物重复。每个测序文库获得约1000万个单端reads，平均长度为50 bp。葡萄参考基因组(PN40024 12X.v1)的质量修剪(Q20)和比对[91]是按照描述完成的[20.]。超过20次点击的多次读取被丢弃。参考葡萄藤基因组和基因注释从GENOSCOPE数据库下载[92]。随后，使用VCost更新基因注释。V3注释[93，94]。本研究中使用的RNA-Seq数据可在NCBI的Sequence Read Achieve上获得[95) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)，研究编号为SRX366617 [96]。

SNP和InDel调用和注释

使用reads比对和Tophat mapper开发了SNP和InDel多态性的全局搜索，之前使用Picard Tools的remove_duplduplicate工具删除了pcr重复[97，98[附加文件2:图S1)。基因组分析工具包(GATK)的结构变异调用[46]和单倍型调用者工具用于识别snp和indel;对于后者，在分析的区域中执行重新对齐(附加文件2:图S1)。使用连续的数字将多态性命名为“TSRNASNP”或“TSRNAINDEL”。随后使用变体调用格式(VCF 4.0)工具筛选多态性[47]。采用以下标准筛选与浆果大小相关的推定多态性:i)双等位基因多态性的选择;Ii)无缺失数据;Iii)最小间距为100bp(“薄”);次要等位基因频率(MAF)为0.2，先前评估为0.1、0.2、0.3和0.4四个水平(附加文件)2:图S1)。此外，考虑到每个SNP或InDel的预期基因典型类别，在小浆果(SB)和大浆果(LB)的文库中也应用了1或0的固定指数(Fst)。例如，三个SB个体预测的一个SNP或InDel的相同基因型类别应该不同于LB个体的基因型类别。

使用变异注释和效应预测工具SnpEff软件对所选多态性进行功能注释[48，99]，根据基于葡萄基因组参考(PN40024 12X.1)(附加文件2:图S1)。选择基因内和非同义编码snp。

然后使用“整合基因组查看器”(Integrative Genomic Viewer, IGV)对具有浆果大小表型差异的11个无籽分离代表文库进行覆盖筛选SNPs和indel [One hundred.，101，102[附加文件2:图S1)。

基因本体分析

使用ShinyGO v0.61工具进行基因本体(GO)富集分析[49，50]。将查询基因的频率与全参考基因组进行比较诉酿酒用葡萄(PN40024)，在生物过程中寻找可能的富集。富集分析基于超几何分布，然后进行FDR校正。重要的政府运作条款(p< 0.05)。

引物设计

使用PRIMER 3软件设计特异性引物来验证snp和InDels [103]，其参数为:扩增子长度在80 ~ 160 bp之间，引物长度在18 ~ 23 bp之间，退火温度(Tm)在58℃~ 62℃之间。用opon软件对引物二聚体形成和引物互补性进行了计算机检测[104]。引物由Integrated DNA Technologies (IDT) (Coralville, Iowa, US)合成。额外的文件8:表S2和附加文件9表S3总结了用于高分辨率熔融分析(qPCR-HRM)的引物。

DNA提取

根据[28]。纯化后的DNA用无dnaase的RNAase A处理，按所述方法测定[28]。在分析中使用浓度高于或等于40 ng/uL的DNA样品。

高分辨率熔解分析(qPCR-HRM)对浆果大小相关snp /InDels的实验验证

snp的验证是根据[28]，经过修改。考虑退火温度(58°C, 60°C和62°C)和引物浓度(0.2 μM, 0.4 μM和0.6 μM)对每对引物的反应进行优化(附加文件)8表2)。就InDels而言，[77，78]根据退火温度(58°C, 60°C和62°C)和引物浓度(0.3 μM, 0.5 μM和0.7 μM)进行优化9表S3)。进行Real time PCR和HRM反应，并按[28]。反应以EvaGreen®为基础，引物浓度为0.2 μM ~ 1.1 μM，加1 ng DNA模板，总反应体积为10 μL。每个个体使用3个重复。基因型通过检查融化和HRM图进行手动分配，之前归一化和衍生化。

通过测序扩增产品(Macrogen Inc.，韩国)确认多态性，并将测序样本作为对照。品种‘Sultanina’和‘Ruby无籽’的qPCR-HRM扩增子以及RxS分离子的定量方法由[28];只有当DNA浓度高于或等于20 ng/uL时，样品才进行测序。使用Sequencher软件(Gene Codes Corporation)将SNP/InDel扩增片段与参比葡萄基因组进行比对。

利用随机森林分析、GLM模型、不平衡方差分析(ANOVA)分析snp /InDels与浆果重量的基因型-表型相关性

采用三种方法确定SNP/InDel标记与浆果品质性状的显著相关性:基于TASSEL的GLM、随机森林和不平衡方差分析（方差分析)，使用13个RxS隔离的子集。表型数据采用对数变换进行归一化，以满足统计分析中的正态性假设[27]。

利用TASSEL v.5.0软件中实现的全球线性模型(GLM)，利用SNP/InDel标记对2010、2011和2012季节的浆果鲜重(BFW)、束重(BWe)、浆果长度(BL)、浆果宽度(BWi)和浆果体积(BV)进行基因型-表型关联分析。54) . .利用38个SNP和8个InDel标记，对来自RxS杂交和亲本的13个无籽分离进行了基因分型。这组分离包括先前测序的6个分离和RxS杂交的7个分离，它们都在连续3个季节表型。GLM求每个标记-性状组合的普通最小二乘解[105，106]。方差解释和p-记录每个SNP/InDel标记的值。随后,一个随机森林为了确定SNP/InDel标记与体重之间的显著相关性，我们进行了RF分析和不平衡方差分析。RF对应于主要用于统计分类和回归的多变量分析。RF模型是使用训练数据的自举样本和树归纳中的随机特征选择创建的未修剪分类树或回归树的集合[107]。对于与浆果鲜重相关的snp和InDels标记，我们估计了该变量的重要性，这可以根据显著预测因子的相对排名来解释[108]基于对13个无籽分离组中观察到的表型值进行RF回归，这些分离组具有浆果重量和基因型数据的对比表型。分析采用1000个排列测试，randomForest的R统计软件包和ap-值为0.05。

然后使用非平衡数据和38个候选标记进行单因素方差分析(ANOVA)，以确定其个体效应(R²)根据所提出的模型，使用统计数据R包(r3.6.2) [109]。模型的决定系数用R表示，考虑均方和，

在哪里yij是观察我浆果鲜重表型根据基因型j为标志x;μ是总体均值;xj代表了基因型j标记的x;和ε是误差项。

利用GLM模型和41个葡萄品种估算与浆果重量相关的SNP和InDel标记的影响

利用在TASSEL v.5.0软件中实现的全球线性模型(GLM)，利用来自41个品种的表型和基因型数据以及2016、2017和2018季节浆果鲜重(BFW)、浆果长度(BL)和浆果宽度(BWi)的SNP/InDel标记进行基因型-表型关联分析。54]。对于每一个标记-性状组合，GLM求出普通最小二乘解，如[105]。方差解释和p-记录每个SNP/InDel标记的值。

本研究中使用的RNA-Seq数据可在NCBI的Sequence Read Achieve (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)， SRA研究注册号为SRX366617。

SNP (s):

单核苷酸多态性(s)

苏维埃社会主义共和国:

简单序列重复

InDel (s):

插入和删除

某人:

小浆果隔离

磅:

大浆果分离器

装备:

染色体

MAS:

分子标记辅助选择

SV:

结构变体(s)

cd (s):

编码DNA序列

走:

基因本体论

qPCR-HRM:

高分辨率熔融分析

QTL:

数量性状位点

格林:

连锁群;Bp:碱基对

作者感谢Paola Barba和她宝贵的团队在某些季节帮助收集表型数据。

本工作得到了ANID/FONDEF-Genoma计划资助项目G07I-1002和博士后资助项目ANID/FONDECYT资助项目3150519的支持。ANID/FONDECYT批准号1171378为本研究的验证步骤提供了支持。我们也感谢ANID/BASAL/AFB170001和ANID/FONDAP/15090007的批准。资助机构没有参与研究的设计、数据的收集、分析和解释，也没有参与本文的撰写。

从属关系

1. 智利农业调查研究所，la Platina, Santa Rosa 11610, Santiago, Chile

   Claudia Muñoz-Espinoza, Alicia Sánchez, josore Correa和patricia Hinrichsen

2. 智利圣地亚哥安德雷萨梅斯贝洛大学República 330号三楼Biotecnología蔬菜中心

   克劳迪娅Muñoz-Espinoza，阿隆索·埃斯皮诺萨，克劳迪奥·梅内塞斯和阿里埃尔·奥雷拉纳

3. 智利大学数学与物理科学学院数学建模中心(UMI2807-CNRS)和数学工程系，智利圣地亚哥Blanco Encalada大街2120号7楼

   Alex Di Genova和Alejandro Maass

4. 基因组调控中心，Av. Blanco Encalada 2085，三楼，圣地亚哥，智利

   Claudio Meneses, Alejandro Maass和Ariel Orellana

贡献

由CME、PH和AO进行实验设计;CME对数据进行分析和解释，进行生物信息学和统计分析，设计qPCR-HRM实验，收集表型数据，撰写论文初稿;PH指导表型;AD对NGS数据进行生物信息学分析;JC进行了统计分析;AS进行qPCR-HRM实验;AE进行统计分析;CM、AO、AM合作编辑稿件;PH严格审查了手稿并编辑了最终版本。所有作者都认可了最终稿。

相应的作者

对应到克劳迪娅Munoz-Espinoza或会长Patricio Hinrichsen。

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

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