比较转录组分析揭示了高分蘖和低分蘖基因型控制果园草分蘖生长的不同机制(Dactylis glomeratal .)

背景

分蘖是影响果园草产量和繁殖的重要农艺性状(Dactylis glomerata)，是一种重要的多年生牧草。虽然已经发现了一些影响分蘖起始的基因，但分蘖调控网络在很大程度上仍然未知，特别是在多年生牧草中。因此，阐明果园草分蘖的调控机制有助于多年生高产草的选择策略的制定。在这项研究中，我们从分蘖期植物的多个组织中获得了高通量rna测序数据，以鉴定高分蘖期和低分蘖期果园草基因型之间的差异表达基因(DEGs)。通过基因本体分析和途径富集分析，将分化位点与分蘖数多样性联系起来。

结果

在本研究中，在两种果园草基因型AKZ-NRGR667(一种高分蘖基因型)和D20170203(一种低分蘖基因型)之间鉴定出约26282个deg，分蘖数差异显著。途径富集分析表明，高分蘖基因型和低分蘖基因型的差异主要体现在与三种植物激素(即独脚金内酯(SLs)、脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)生物合成以及氮代谢相关的DEGs。我们还证实，在缺磷条件下，高分蘖型果园草基因型中编码DWARF27 (D27)、9-顺式-胡萝卜素9 '，10 ' -裂解双加氧酶(CCD7)、乳酸酯合成酶(CCD8)和更多腋窝分枝1 (MAX1)蛋白的主要SL生物合成基因的表达量比低分蘖型增加得更慢。

结论

本研究利用转录组数据研究了多年生牧草的分蘖机制。我们证明了SL、ABA和GA生物合成相关基因的差异表达模式可以在分蘖期区分高分蘖和低分蘖的果园草基因型。此外，高分蘖型果园草的SL生物合成核心相关基因对磷缺乏更不敏感，而磷缺乏会导致SL生物合成增加，这可能是果园草在分蘖调控中存在明显的SL生物合成方式。本研究发现了多年生禾草分蘖调控的候选基因，为多年生高产禾草育种新资源的建立提供了依据，为今后果园草分蘖调控分子机制的研究提供了新资源。

分蘖是草的一种特化分支，从基部节开始，通过自己的不定根独立于母茎生长[1，2］．更重要的是，分蘖是牧草的一个重要农艺特征，它最终决定了牧草的地上生物量和种子产量[3.，4］．Orchardgrass (Dactylis glomerataL.)是一种多年生冬草，原产于北非、西欧和中欧及亚洲温带地区[5］．果园草作为一种重要的多年生牧草，因其适应性强、营养价值高、生物量大而长期被广泛栽培[6］．在中国，果园草不仅是一种优良的牧草，也是人工草地上重要的混合草之一[7］．然而，作为多年生牧草，果园草的有性生殖和无性生殖都是直接通过分蘖进行的[4，8］．因此，分蘖对果园草的产量和繁殖具有重要意义。随着果园草基因组的发表[9]，揭示了果园草分蘖的调控机制，可用于开发高产多年生草的选择性育种资源。

分蘖是一个非常复杂的过程，受多种因素的影响，包括营养、激素和遗传因素。在这些因素中，氮对水稻分蘖的调控作用尤其显著，既能促进分蘖芽的萌发，也能促进分蘖芽的生长[10］．此外，赤霉素(gibberelllic acid, GA)、脱落酸(ABA)或独脚金内酯(SLs)均可抑制侧枝的生长[11，12，13，14，15]，而细胞分裂素(CKs)和油菜素内酯(BRs)可促进芽的生长[16］．最近有报道ABA和GA可以通过抑制SL的生物合成来促进分蘖的形成[17，18］．尽管许多研究表明分蘖的起蘖可以通过植物激素的协调作用而不是单一的激素来调节[19]，由于调节侧芽生长的植物激素的复杂性，目前还没有适用的模型来解释多种激素与分蘖开始之间的关系[13］．然而，一些影响分蘖起始的基因已经被鉴定出来，它们主要分为两类。由四个关键分蘖形成调控因子组成的一组已被克隆，包括MONOCULM 1（MOC1)，无分蘖1/不育和减少分蘖1 (moc3 ./TAB1/SRT1)，松弛的圆锥花序1（LAX1),LAX2,控制分蘖芽的形成[2，20.，21，22，23，24］．此外，据报道，MOC1和MOC3相互作用，通过上调基因的表达来调控分蘖芽的生长花器官1号（FON1)在大米中[25］．另一类包含与植物激素的生物合成和信号转导相关的基因，包括赤霉素2 beta-dioxygenase（GA2ox)，DWARF27（D27),DWARF53（D53)，以控制分蘖芽的生长[11，26，27］．例如，Lin等人报道D27参与调控水稻分蘖芽生长的独脚金内酯的生物合成[26］．此外，有报道称SLs可诱导D53被蛋白酶体降解，并以依赖于DWARF14 (D14)和DWARF3 (D3)的方式抑制D53促进腋芽生长的活性[27，28］．然而，尽管已经确定了一些影响分蘖起始的基因，但分蘖背后的调控网络在很大程度上仍然未知。更重要的是，迄今为止，分蘖的分子机制研究主要集中在一年生植物上。然而，分蘖是多年生植物比一年生植物更重要的方面，因为多年生牧草的分蘖会影响产量和无性繁殖[4，8］．由于多年生植物生命周期的复杂性，多年生植物分蘖的分子机制无疑比一年生植物更为复杂;因此，关于多年生植物分蘖的分子机制的研究很少。

然而，阐明分蘖的调控机制对于培育高产多年生草至关重要。因此，我们首次使用转录组数据来研究多年生果园草分蘖的机制。我们证明，高分蘖基因型可能由分蘖阶段SL、ABA和GA生物合成相关基因的低表达模式来区分，如MAX1而且ABA2．此外，高分蘖型果园草的SL生物合成核心相关基因对磷缺乏更不敏感，而磷缺乏会导致SL生物合成增加，这可能是果园草在分蘖调控中存在明显的SL生物合成方式。因此，本研究确定了多年生草分蘖调控的候选基因，可用于多年生草高产选育策略的制定，并为后续研究提供思路。

高分蘖和低分蘖果园草基因型的筛选与验证

432种果园草的分蘖表型(Dactylis glomerataL.)的基因型首次在现场观察和评价(表S1)．其中，鉴定出分蘖数差异显著的30个基因型，并在田间和盆栽试验中进行进一步测定。此外，这些基因型的倍性参照Xu等人的方法经流式细胞术鉴定为二倍体[29］．随后，从田间生长条件中鉴定出6个二倍体候选基因型，包括3个高分蘖和3个低分蘖基因型，以便在盆栽生长条件下进一步验证。最后，通过两次验证试验，筛选出高分蘖基因型(AKZ-NRGR667)和低分蘖基因型(D20170203)进行进一步研究。野外试验于春季至初夏在雅安(38°8′n, 103°14′e，海拔600 ~ 620 m，年平均气温16.0°C，年平均降水1015.2 mm，年平均日照时数1161.5 h，年平均无霜期283 d)进行。所有验证实验均遵循单变量控制、实验单元随机分布的原则，所有材料的原始状态为单一分蘖。果园草种子AKZ-NRGR667(注册号:113613667)AKZ-NRGR667)来源于美国国家植物种质资源系统(NPGS)。果园草种子D20170203;D20170203)来源于四川农业大学草地科学系。这些植物是在中国四川省雅安的四川农业大学的自然环境条件下在盆栽中种植的。 All the plant materials used in this study comply with Sichuan Agricultural University and local guidelines. Field studies comply with local legislation and Convention on the Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora.

组织收集和RNA提取

单蘖植物在硅砂中生长，每天提供定量营养液。选取45株大小相近、基因型均为AKZ-NRGR667和D20170203的植株，随机分为3个独立组，每组15个重复。所有植物都生长在日夜温度为22°C/15°C，光周期为14 h/10 h(昼夜)，相对湿度为70%的温室中[30.］．当芽长为0.5厘米时，从一组生物重复中同时收集四种不同组织(芽、芽基部、根和叶组织)的样本[25，31]，并将同一组的样本混合作为复制。样品立即冷冻在液氮中，并保存在−80°C，直到RNA提取和随后的转录组测序。

rna测序和数据分析

从样品中提取总RNA用于RNA-seq文库构建和测序。根据制造商说明，使用NEBNext®Ultra™Directional RNA Library Prep Kit for Illumina®(NEB, California, USA)从每个样品中提取约3 μg RNA，创建23个测序文库[32］．文库构建和转录组测序由诺金生物信息研究所(北京，中国)使用Illumina Novaseq 6000平台(Illumina, San Diego, CA, USA)进行。使用Hisat2 (v2.0.5)将得到的干净reads映射到园草参考基因组上，然后使用BLASTx进行搜索和注释，e值截止值为1.0E⁻⁰⁵．每个基因的阅读计数表示为每百万碱基对测序的转录序列的预期片段数(FPKM)。

使用DESeq2 R包(1.16.1)进行两组间的差异表达分析，并用调整后的基因进行差异表达分析P< 0.05和|log₂(FC)|≥1，经DESeq2鉴定为差异表达[33］．利用cluster Profiler R包对鉴定的差异表达基因(DEGs)进行基因本体(Gene Ontology, GO)富集分析。此外，GO术语与校正P< 0.05被认为在DEGs中显著富集[34］．最后，我们使用cluster Profiler R包，以最小e值作为过滤参数，测试了京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路中DEGs的统计富集程度。

利用R (v3.3.0)中的WGCNA包进行加权基因共表达网络分析(WGCNA) [35］．我们在至少两个样本中共选择了13345个FC≥2和FPKM>0的基因进行WGCNA。使用基因表达邻接矩阵来分析网络拓扑结构，在我们的分析中使用软阈值= 18。使用R包中其他参数的默认设置。通过比较所有基因中每对探针之间的连通性相似性来计算拓扑重叠矩阵[32］．

实时荧光定量PCR检测候选基因表达

根据目前分蘖机理的研究和我们的实验结果，我们选择了4种degDWARF27（D27)，9-顺-胡萝卜素9 '，10 ' -裂解双加氧酶（CCD7)，carlactone合酶（CCD8),腋窝分枝增多1（MAX1)的生物合成途径进行进一步验证。首先，通过实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测这4个基因在茎基部和根组织中的表达，验证RNA-seq结果的有效性。然后，我们进行了磷饥饿实验，进一步验证了这两种基因型在SL生物合成途径中的差异表达，因为植物缺乏磷会导致SL合成在体内增加[36，37］．磷饥饿试验中，24株基因型均为AKZ-NRGR667和D20170203的植株，大小相近，随机分为8个独立组，每组3个重复。其中4组为对照组，其余组为治疗组。所有植物在半强度Hoaglands上水培生长一个月，温室温度为22°C/15°C，光周期为14 h/10 h(昼夜)，相对湿度为70%。在Pi饥饿时间-过程实验中，各处理组采用不含Pi的半强Hoagland溶液。对照组用加Pi的半倍Hoagland溶液培养。分别在磷饥饿处理后0、4、8和12 h，对高分蘖型和低分蘖型的茎基进行取样，设3个重复。这些样品分别在白天收集，在液氮中快速冷冻，并在−80°C保存，直到RNA分离。

使用HiPure植物RNA Mini Kit (MAGEN, Guangzhou, China)从样品中提取总RNA。以1 μg RNA为模板，使用MonScript™RTIII All-in-One Mix with dsDNase (Monad, Wuhan, China)进行反转录。然后在Bio-Rad CFX Connect PCR检测系统(Bio-Rad, CA, USA)上使用MonAmp™SYBR Green qPCR Mix (Monad)进行qRT-PCR;qRT-PCR反应体积为10 μl, SYBR Green qPCR Mix 5.0 μl，每个引物0.2 μl, H₂O, 1 μl cDNA样品，4倍稀释。GAPDH作为内参基因[38］．相对基因表达水平用2^-△△Ct方法(39］．每个试验设3个重复。所有引物均使用Primer5设计(表S2)．

高分蘖和低分蘖果园草基因型的形态分析

从432份果园草基因型筛选中，分别获得高分蘖基因型AKZ-NRGR667和低分蘖基因型D20170203。在田间验证试验中，高分蘖AKZ-NRGR667和低分蘖D20170203的单分蘖分别形成82个和19个新分蘖(图S1C)。同样，在盆栽验证试验中，AKZ-NRGR667和D20170203的单个分蘖分别产生57个和13个新分蘖(图S1F).由此可见，高分蘖AKZ-NRGR667和低分蘖D20170203在田间和盆栽试验中分蘖数均存在显著差异(P< 0.01)。流式细胞仪分析显示，AKZ-NRGR667和D20170203均为二倍体基因型(图S2)，说明分蘖能力的差异不是由倍性的差异引起的，并且两个基因型在相同的环境条件下生长，说明这种差异不是由环境影响引起的。我们还发现AKZ-NRGR667株高中等，茎粗，叶片小，呈墨绿色(图S1而且S3)．此外，AKZ-NRGR667的韧性较D20170203强，有利于抗倒伏和高产。

RNA-seq数据分析

总共构建了23个合格的cDNA文库，并进行RNA-seq分析。RNA-seq分析的质量取决于测序的质量和生物重复之间的相关性。在我们的研究中，Q30值超过93%，GC百分比大于50%，错误率仅为0.03(表S3)．此外，干净的reads映射到超过70%的独特基因组位置(表S4)．映射到外显子区的干净读取率超过80%(表S5)．这些结果表明测序质量较高。此外，所有样本的FPKM值均采用Pearson相关系数(R²)和主成分分析(PCA)，如图所示S4总的来说，我们的数据被证实是可靠的，因此可以用于后续的分析。

高分蘖和低分蘖基因型不同组织间DEGs的分析

为了确定哪些DEGs与分蘖有关，在两个基因型的同一组织中进行了A(h)_B vs D(l)_B(分蘖芽)、A(h)_S vs D(l)_S(茎基)、A(h)_R vs D(l)_R(根)和A(h)_L vs D(l)_L(叶)4个比较，阈值为|log₂(FC)|≥1，P≤0.05。在此条件下，在A(h)_B与D(l)_B、A(h)_S与D(l)_S、A(h)_R与D(l)_R、A(h)_L与D(l)_L比较中，分别有16646(上调6460个、下调10186个)、15957(上调5812个、下调10145个)、13609(上调5134个、下调8475个)、14560(上调5041个、下调9519个)基因表达显著差异(图)。1a).我们在所有组织中都获得了大量的deg，特别是在分蘖通常发生的芽和芽基部组织的比较中。(无花果。1a).值得注意的是，与AKZ-NRGR667相比，检测的四个D20170203组织中有更多的DEGs，表达量更高，尤其是在芽和芽基部组织比较中(图1)。1b)。

deg的功能表征

为了检查所识别的DEGs的功能，进行了GO和KEGG通路分析。GO亚类分析显示，“DNA整合”、“DNA代谢过程”、“ADP结合”和“氧化还原酶活性”在A(h)_B vs D(l)_B、A(h)_S vs D(l)_S、A(h)_R vs D(l)_R、A(h)_L vs D(l)_L比较中显著富集(图)S5)．这些结果表明，AKZ-NRGR667与D20170203在DNA合成和ADP结合能力上存在差异。此外，KEGG分析显示，“二萜生物合成”、“氰基氨基酸代谢”和“氨基酸生物合成”在A(h)_B与D(l)_B比较中得到了丰富(图)S6A).“DNA复制”在A_HS和D_LS比较中高度富集(图S6B)，在A(h)_S vs D(l)_S比较中，27个与DNA复制相关的DEGs中有23个上调(表2)S6)．“类胡萝卜素生物合成”和“氨基酸生物合成”在A(h)_R vs D(l)_R比较中得到丰富(图S6C).“光合作用”在A(h)_L vs D(l)_L比较中显著增强(图S6在A(h)_L vs D(l)_L比较中，31个与光合作用相关的DEGs中有26个表达上调(表2 - 4)S7)．

总的来说，结合KEGG途径和GO亚类分析，AKZ-NRGR667和D20170203在DNA复制和光合作用相关基因的表达上存在差异。此外，虽然“二萜生物合成”、“氰基氨基酸代谢”、“类胡萝卜素生物合成”和“氨基酸生物合成”相关基因富集不显著，但它们可能与AKZ-NRGR667与D20170203分蘖能力的差异有关。

加权基因共表达网络分析

进一步，利用WGCNA对鉴别出的差异表达候选基因的共表达网络进行研究。根据所有样本之间的成对相关性和基因表达趋势，使用WCGNA R包对所有样本中的13345个基因进行归一化微阵列表达数据构建共表达网络。这些基因如图所示。2A，不同的颜色代表每个特定的模块，每个模块都包含一组高度相关的基因。该分析揭示了10个不同的模块(黑色、棕色、青色、绿色、黄绿色、品红、粉色、红色、绿松石和黄色模块)具有高相关值(图。2b).其中，粉色模块仅在AKZ-NRGR667内呈高度相关，而绿色模块仅在D20170203内呈高度相关(图2)。2b).值得注意的是，在10个不同的模块(棕色、青色、绿黄色、品红和黄色模块)中，有一半参与苯丙烷的生物合成和植物激素信号转导(图S7)．粉红色和绿色模块都与泛素介导的蛋白水解有关(图S8A和B)，表明泛素介导蛋白水解的差异可能是AKZ-NRGR667和D20170203的区别。此外，红色和蓝绿色模块参与光合作用(图S8C和D)，说明AKZ-NRGR667和D20170203的光合效率可能存在差异。我们发现绿色-黄色模块与植物激素生物合成有关，包括类胡萝卜素生物合成和二萜生物合成(图S8E)，提示AKZ-NRGR667和D20170203在激素生物合成方面存在差异。

四种分蘖调控途径分析

为了进一步了解DEGs在分蘖调控中的通路富集作用，我们首先比较了植物激素通路中关键基因的表达。已有文献报道SLs和ABA对分蘖的形成有抑制作用[13］．因此，我们比较的第一个和第二个途径分别是类胡萝卜素生物合成途径中的SL生物合成和ABA生物合成(图。3.)．首先，香叶酰香叶酰焦磷酸(GGPP)通过5种酶的作用转化为β-胡萝卜素:15-顺式植烯合成酶(crtB)、15-顺式植烯去饱和酶(PD)、ζ -胡萝卜素去饱和酶(ZDS)、原番茄红素异构酶(crtISO)和番茄红素β-环化酶(lcyB)(图5)。3.)．总体而言，AKZ-NRGR667中编码5种酶的DEG中，只有编码crtB的DEG下调。其次，β-胡萝卜素通过四种酶(D27、CCD7、CCD8和MAX1)和β-环羟化酶(LUT5)转化为玉米黄质(图5)转化为SLS9)．在SL生物合成途径中，编码这4种酶的4个DEGs在AKZ-NRGR667植株茎基部表达量较低，表明SLs的生物合成相对减少(图2)。3.a).在ABA生物合成途径中，玉米黄质经玉米黄质环氧化酶(ZEP)转化为紫黄质，紫黄质经紫黄质去环氧化酶(VDE)转化为玉米黄质。的表达式VDE相对于D20170203, AKZ-NRGR667茎基部紫黄素含量较高，说明AKZ-NRGR667中紫黄素含量较少。最后，紫黄素通过9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)催化生成黄硫素。黄嘌呤通过黄嘌呤脱氢酶(ABA2)转化为ABA，并通过酶(+)-脱落酸8 ' -羟化酶(ABAH)进一步羟化为8 ' -羟基脱落物(图2)。3.b).总的来说，ABA2表达下调，并且阿在AKZ-NRGR667中表达上调。这些结果表明，相对于D20170203, AKZ-NRGR667中SLs和ABA的积累可能更少。

最近有报道称GA引发SLR1退化，导致分蘖数减少[40］．因此，我们比较的第三个途径是二萜生物合成途径中的GA生物合成(图。4)．首先，GGPP在ent-copalyl diphosphate synthase (ent-CPS)的催化下转化为ent-copalyl- pp。然后，在ent-kaurene synthase (ent-KS)、ent-kaurene氧化酶(KAO)和细胞色素P450 88A1 (CYP 88A1)的催化下，ent-copalyl-PP生成GA12。随后，GA12被赤霉素20氧化酶(GA20ox)催化，产生一系列GA异构体。其中，GA 4、GA 9和GA 20均在GA2ox酶的催化下分别生成GA 34-、GA 51-和GA 29分解产物(图。4)．总体而言，AKZ-NRGR667中4个编码DEG的酶(即t- ks、CYP 88A1、GA20ox和GA2ox)表达上调，1个编码DEG的酶(t- cps)表达下调，表明与D20170203相比，AKZ-NRGR667中GAs的生物合成和降解能力分别降低和提高。与D20170203相比，AKZ-NRGR667能够积累较少的GA，这主要得益于编码- cps和GA2ox的两种deg。

此外，氮对分蘖的形成具有重要的调节作用[10］．因此，我们比较的第四个途径是氮代谢(图。5)．细胞外硝酸盐或亚硝酸盐通过硝酸/亚硝酸盐转运体(NRT)进入细胞，硝酸盐通过硝酸还原酶(NR)转化为亚硝酸盐。然后，亚硝酸盐转化为氨(NH_3.)经铁氧还原酶(NirA)还原，腈转化为NH_3.通过硝化酶(NIT)。NH_3.被转换为l-谷氨酰胺由谷氨酰胺合成酶(GS)催化形成l谷氨酸合成酶(GOGAT) -谷氨酸。NRT，NR，没用的人，GS,GOGAT相对于D20170203, AKZ-NRGR667分蘖芽表达上调，而仅NR而且没用的人AKZ-NRGR667的茎基均上调。NR，NirA，没用的人，GS,GOGATAKZ-NRGR667根相对于D20170203根表达上调。Nrt，没用的人,GSAKZ-NRGR667叶片相对于D20170203叶片表达上调。总体而言，AKZ-NRGR667的氮代谢比D20170203更活跃，说明AKZ-NRGR667可能具有更高的氮利用率。

磷饥饿条件下AKZ-NRGR667与D20170203之间SL合成基因的差异表达

基于目前对分蘖分子机制的了解和我们的研究结果，我们选择SL生物合成途径进行进一步验证。首先，四种DEGs的相对表达量(D27，CCD7，CCD8，MAX1转录组结果与qRT-PCR结果一致(图S10)．然后，我们进行了磷饥饿实验，进一步验证了AKZ-NRGR667与D20170203在SL生物合成途径上的差异，因为植物缺乏磷会导致体内SL合成增加[36，37］．在缺磷条件下，相对表达量CCD7而且MAX1AKZ-NRGR667中SL生物合成途径的表达显著低于D20170203 (P< 0.05)。蛋白的相对表达量D27而且CCD8AKZ-NRGR667基因的表达水平大多低于D20170203基因。6)．总体而言，相对于AKZ-NRGR667, D20170203的SL生物合成上调。

在这项工作中，我们发现AKZ-NRGR667与D20170203之间的表型差异(图1)S3)与先前有关株高与分蘖数成反比关系的研究结果一致[27，28，41，42，43，44，45，46，47]并且这些基因型也被参与激素生物合成的各种deg所分化。AKZ-NRGR667与D20170203分蘖能力的差异与倍性或环境条件的差异无关(图S1而且S2)．此外，AKZ-NRGR667与D20170203之间分蘖数的差异不是由分蘖芽休眠引起的，因为两个基因型的分蘖芽生长正常(数据未显示)。然而，它们之间的光合能力可能因叶片特征的差异而有所不同(图S3)．

在本研究中，通过详细筛选，大约26282个deg被确定为区分两种基因型的组织。在四种比较中，在A(h)_B vs D(l)_B和A(h)_S vs D(l)_S比较中观察到的DEGs最多(图2)。1a).这表明芽和芽基部组织的代谢过程比其他被测组织的代谢过程更分化。因此，芽和茎基部组织可能是调节分蘖形成的两个极其重要的组织。此外，与AKZ-NRGR667相比，这些DEGs在D20170203的芽或茎基部组织中表达量更高(图2)。1B)，这可能是分蘖表型差异的原因。

GO亚类分析显示，AKZ-NRGR667和D20170203在合成DNA和结合ADP的能力上存在差异(图S5)．对DEGs的KEGG通路分析也显示，相对于D20170203, AKZ-NRGR667的DNA复制和光合作用过程可能上调S6B和D)。一方面，AKZ-NRGR667叶片的深绿色表型可能与其较高的光合作用效率有关，这可以弥补其叶面积较小导致的光合作用下降。另一方面，通过KEGG分析推断DNA复制和光合作用在AKZ-NRGR667中起着重要作用，其特征是生长强劲。因此，AKZ-NRGR667与D20170203分蘖数差异的原因可能是DNA复制活性和光合作用。此外，一些DEGs参与植物激素的合成和氮代谢(图S6WGCNA还揭示了一些涉及泛素介导的蛋白水解、光合作用、氮代谢和植物激素生物合成的模块(图)S7而且S8)．因此，综合考虑WGCNA和KEGG途径的结果，我们证明了在分蘖阶段，SLs、ABA、GA生物合成相关基因表达模式的差异区分了高分蘖AKZ-NRGR667基因型和低分蘖D20170203基因型(图2)。3.，4而且5)．而SLs、ABA和GA在分蘖的形成中起着重要作用[13］．因此，我们的研究结果表明，在高分蘖型和低分蘖型基因型中，SLs、ABA和GA生物合成相关基因的表达存在差异，说明AKZ-NRGR667基因型和D20170203基因型之间SLs、ABA和GA的积累存在差异，这可能是导致它们分蘖表型不同的原因。

在目前的工作中，四个deg (D27，CCD7，CCD8,MAX1在AKZ-NRGR667的茎基中，参与SL生物合成的基因表达下调(图2)。3.a)，表明SL生物合成减少。因此，高分蘖AKZ-NRGR667中分蘖数量的增加可能是SL生物合成减少的结果，因为SLs是一类抑制芽生长以调节芽分枝的植物激素[15，48，49，50］．此外，的表达D3，D14，D53而且MADS57涉及SL信号转导[28，51]，在AKZ-NRGR667和D20170203之间无显著差异(表2 - 7)S8)．因此，我们认为AKZ-NRGR667与D20170203分蘖数的差异可能与SL生物合成的差异有关。

与D20170203相比，AKZ-NRGR667中ABA合成基因的低表达可能导致ABA的积累减少(图2)。3.b).这说明由于ABA抑制了侧芽的生长，AKZ-NRGR667芽的生长速度比D20170203芽快[13，52］．然而，ABA介导分蘖的分子机制尚不清楚。尽管据报道ABA水平通常在NCED活动增加时上升[53]，我们发现在D20170203中观察到的ABA生物合成的增加与ABA的上调有关ABA2以及对阿．这反映了不同物种ABA积累可能受不同关键基因的控制。基于这些结果，我们假设ABA2而且阿是ABA生物合成途径中的两个关键基因，控制着果园草芽的生长。

我们还推断，相对于D20170203, AKZ-NRGR667可能积累较少的GA，这主要是由于编码- cps和GA2ox的两种deg的结果(图2)。4)，这可能是两种基因型分蘖能力存在差异的原因。此外，GA能抑制分蘖，而GA能诱导高分蘖数GA2oxs超表达(11，54］．因此，过度表达GA2oxs是一种通过增加果园草分蘖数来降低GA水平和提高产量的明显方法。最近有报道称GA可引发SLR1的退化，导致植株分蘖减少[40］．然而,SLR1在我们的研究中，AKZ-NRGR667和D20170203在任何组织中几乎没有表达(表S8)．因此，我们假设GA通过GA- slr1途径以外的途径控制果园草分蘖。

基于上述结果，我们认为果园草分蘖能力可能是由与植物激素相关的复杂调控决定的。ABA和GA最近被报道通过抑制SL生物合成来促进分蘖形成[17，18］．然而，在我们的研究结果中，高分蘖AKZ-NRGR667的GA、ABA和SLs积累均较低，而低分蘖D20170203的积累较高。这说明AKZ-NRGR667与D20170203分蘖表型的差异可能不是GA与SLs或ABA与SLs相互作用产生的。综上所述，AKZ-NRGR667与D20170203相比，GA、ABA和SLs的积累可能减少，这可能解释了两者分蘖能力的差异。

在我们的研究中，与D20170203相比，AKZ-NRGR667中参与氮代谢的基因转录本更丰富(图。5)．据报道，植物组织中较高水平的氮促进活跃分蘖[55］．虽然枝条的分枝受到各种营养因素的影响，包括N、P和K [56，57]，在我们的实验中，两种基因型的营养供应是一致的。这些结果表明，AKZ-NRGR667可能具有较高的氮素利用率，这可能导致了所观察到的高分蘖表型。此外，氮代谢依赖于光合作用提供的能量，在AKZ-NRGR667和D20170203之间存在差异(图S6D)。因此，AKZ-NRGR667和D20170203氮素利用效率的差异可能部分是由于光合效率的差异造成的(图S6D).此外，据报道，植物氮和碳代谢之间的能量竞争可以通过提高光合效率来协调[D]。58]，表明由于AKZ-NRGR667相对于D20170203具有更高的光合效率，能够更好地协调氮和碳代谢以维持快速生长。

总的来说，我们发现并详细研究了4种途径，表明果园草分蘖可能受到植物激素和/或氮代谢介导的复杂机制的调控。在这些因素中，我们选择SL生物合成途径进行进一步研究，因为减少SL生物合成可以增加分蘖数。磷酸盐是SL生物合成的负调控因子，可改变SL生物合成基因的表达[59]，与磷相关的调控途径在本研究中无显著差异，说明AKZ-NRGR667与D20170203分蘖能力的差异与磷相关途径无关。因此，为了进一步验证AKZ-NRGR667基因型与D20170203基因型在SL通路上的差异，我们在标准和缺磷条件下进行了两次qRT-PCR实验。首先，四种DEGs的相对表达量(D27，CCD7，CCD8,MAX1)参与SL生物合成通路的转录组结果与qRT-PCR结果一致(图S10)．然后，我们进行了磷饥饿实验，进一步验证了AKZ-NRGR667与D20170203在SL生物合成途径上的差异。先前的基因表达分析表明，磷酸盐缺乏增加转录水平D27而且CCD8［59］．结合我们的缺磷实验结果，相对表达量CCD7而且MAX1AKZ-NRGR667中来自SL生物合成途径的表达量显著低于D20170203(图2)。6)．这一发现反映了高分蘖型果园草的核心SL生物合成相关基因比低分蘖型果园草对磷缺乏更不敏感。因此，我们推测这种由SL生物合成基因调节的敏感性解释了AKZ-NRGR667与D20170203分蘖数的差异。此外，在果园草中SL的生物合成似乎主要由两个基因控制(CCD7而且MAX1)根据上述结果，表明CCD7而且MAX1是两个关键基因，反过来通过SL途径调节果园草的分蘖过程。然而，关于SL生物合成的关键调控基因的信息很少[60］．因此，还需要对这两个SL通路基因进行深入分析，以详细确定它们的作用。

综上所述，我们利用转录组数据研究了多年生果园草的分蘖机制。我们证明，高分蘖基因型可能由分蘖阶段SL、ABA和GA生物合成相关基因的低表达模式来区分，例如MAX1而且ABA2，反之亦然。此外，高分蘖型果园草的SL生物合成核心相关基因对磷缺乏更不敏感，而磷缺乏会导致SL生物合成增加，这可能是果园草在分蘖调控中存在明显的SL生物合成方式。本研究发现了多年生禾草分蘖调控的候选基因，为多年生高产禾草育种新资源的建立提供了依据，为今后果园草分蘖调控分子机制的研究提供了新资源。

与本研究有关的所有数据均已以表格和/或图表形式包含在手稿中，作者很乐意根据合理要求分享分析/原始数据和植物材料。RNA-seq原始reads已存入NCBI数据库(登录号:SRR11362826 -SRR11362848)。植物材料由四川农业大学动物科技学院草地科学系提供。

遗传算法:

赤霉素

中正:

细胞分裂素

阿坝:

脱落酸

SLs:

Strigolactones

br:

Brassinosteroids

MOC1:

MONOCULM 1

MOC3 / TAB1 / SRT1:

单粒3/无分蘖1/不育和减少分蘖1

LAX1:

松弛的圆锥花序1

LAX2:

松弛的圆锥花序2

FON1:

花器官1号

问:

腋分生组织

GA2ox:

赤霉素2 beta-dioxygenase

D27:

DWARF27

D53:

DWARF53

D3:

矮人3

D14:

DWARF14

走:

基因本体论

度:

差异表达基因

WGCNA:

加权基因共表达网络分析

存在:

实时定量PCR

R2:

皮尔森相关

主成分分析:

主成分分析

GGPP:

Geranylgeranyl焦磷酸

ent-Copalyl-PP:

Ent-Copalyl二磷酸

ent-CPS:

Ent-copalyl二磷酸合成酶

ent-KS:

Ent-kaurene合酶

花王:

Ent-kaurene氧化酶

CYP 88 a1:

细胞色素P450 88A1

GA20ox:

赤霉素20氧化酶

crtB:

15-cis-phytoene合酶

帕金森病:

15-cis-phytoene desaturase

ZDS:

Zeta-carotene desaturase

crtISO:

Prolycopene异构酶

lcyB:

番茄红素beta-cyclase

LUT5:

Beta-ring羟化酶

齐柏林飞艇:

玉米黄质环氧酶

VDE:

黄质de-epoxidase

nc:

9-cis-epoxycarotenoid加双氧酶

ABA2:

黄氧素脱氢酶

阿:

(+)-脱落酸8 ' -羟化酶

NRT:

硝酸盐和亚硝酸盐转运体

NR:

硝酸还原酶

NH_3.：

氨

NirA:

Ferredoxin-nitrite还原酶

g:

谷氨酰胺合成酶

GOGAT:

谷氨酸合酶

没用的人:

腈水解酶

CCD7:

9-顺-胡萝卜素9 '，10 ' -裂解双加氧酶

CCD8:

Carlactone合酶

MAX1:

腋窝分枝增多1

不适用。

本研究得到国家自然科学基金(NSFC 31872997)和现代农工技术研究体系(No.CARS-34)的资助。所有这些资金都在研究和收集、分析和写作的设计中发挥作用。

作者指出

1. 徐晓恒和冯光艳对这项工作做出了同样的贡献。

从属关系

1. 四川农业大学动物科技学院草地科学系，成都

   徐晓恒，冯光艳，杨帅，刘秋旭，聂刚，杨忠富，杭林凯，张新全

2. 四川农业大学水稻研究所，成都

   岳阳梁

贡献

YL, LH和XZ构思并设计了实验。XX制备样品进行RNA测序，分析数据并进行qRT-PCR。XX和GF起草了手稿。YL, YS, QL, GN, ZY, LH, XZ对稿件进行了修改。所有作者均已阅读并批准最终稿。

相应的作者

对应到鑫泉张．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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