ATPIG-S，一种预测的糖基磷脂酰肌醇己酰胺酶亚基对花粉管生长至关重要拟南芥gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

糖基磷脂酰肌醇(GPI)的添加是几个翻译后修饰的蛋白质，以增加其对膜的亲和力。在真核生物中，GPI转酰胺酶复合物(GPI- t)通过转酰胺化反应催化预先组装的GPI锚定蛋白(GPI- anchored proteins, gap)的附着。的突变gydF4y2BaATGPI8.gydF4y2Ba（gydF4y2Bagpi8-2gydF4y2Ba)，推测是拟南芥GPI-T的催化亚基gydF4y2Ba，gydF4y2Ba通常通过雌配子体(FG)传递，表明FG可以耐受GPI转酰胺化的损失。相比之下，gydF4y2Bagpi8-2gydF4y2Ba几乎完全废除了雄性配子体(MG)的功能。然而，出人意料的发现是gydF4y2Bagpi8-2gydF4y2BaFGs的功能通常需要进一步研究。此外，由于GPI转酰胺化的损失而导致的MG特异性发育缺陷的特征仍然很差。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在这里，我们调查了损失的影响gydF4y2BaAtPIG-S,gydF4y2Ba两种GPI-T亚单位，在杂草形状中。喜欢gydF4y2BaGPI8-gydF4y2Ba2，我们表明突变gydF4y2BaATPIG-S.gydF4y2Ba（gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba）扰乱Lorelei（LRE）的协同局部化，对于FG的花粉管接收至关重要。仍然，gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba通常通过FG传输。反过来，gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba在花粉管出现和雌蕊生长过程中，雄配子体功能受到严重损害。A.gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba转基因补充了这些mg缺陷并实现了生成gydF4y2Ba猪-1 /猪-1gydF4y2Ba幼苗。然而gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba结果表明，AtPIG-S在孢子体中的功能没有得到改善gydF4y2Bapigs-1 / pigs-1 pPIGS: GFP-PIGSgydF4y2Ba萌芽后很快就死了幼苗。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

表征gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba提供了进一步的证据表明，FG耐受GPI越手丧失的损失多于MG，并且与FG相比的MG可以是研究GPI锚定作用的更好的单倍体系统。gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba花粉正常发展，因此代表了一种工具，其中GPI锚生物合成和对间隙的横向化已经解耦，提供了研究自由GPI在植物发育中的潜在方法。虽然先前报告了GPI生物合成突变体的男性生育缺陷可能是由于GPI的损失或缺乏GPI锚的差距，但我们的结果澄清了GPI缺陷花粉颗粒的成熟间隙的损失基础，如gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba仅在下游崩解步骤中有缺陷。gydF4y2Ba

在gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba（拟南芥）植物繁殖，花粉谷物在一朵花的柱头上，粘附在耻骨的乳头，并向它们引发兼容花粉晶的水化和发芽[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba]．在萌发后，花粉管将延伸穿过雌蕊的风格和传递道，并渗入胚珠室，其靶向雌性配子体（FG）并完成双重施肥。在FG的微囊末端发现的两个Synergidid细胞（Synergids）是转移细胞，其专门用于分泌因子，用于与花粉管的适当沟通和接收[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

Synergids在它们的微囊端产生高度致密的细胞壁和质膜膜的区域，称为由两个辛酸共用的丝状装置（FA）。FA中的广泛的血浆膜侵略性增加了合酶的总表面积，促进蛋白质和分子从细胞中分泌并产生有利于吸引力的细胞外微环境[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]和接待[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba]花粉管。进入子房室后,花粉管应对从助细胞的细胞化学引诱物,坚定不移地迁移到一个胚珠,进入胚珠micropylar开放,并达到足总助细胞的细胞,第一个物理点花粉管和助细胞细胞之间的联系(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．在一个合酶（接受合酶）中的花粉管生长和随后的精子细胞释放以诱导双重施肥的释放是共同称为花粉管接收的过程，该过程是在杂草形状中表达的基因调节的过程[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

在FG，Lorelei（LRE）中，一种预测的糖基磷脂酰肌醇（GPI）-Ashored蛋白（GAP）结合受体样激酶红糖（FER）以形成担心的共同受体复合物，以便对下游进行改变的未知配体的感知至关重要花粉管接收所需的信令[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．纯合子gydF4y2BaLRE-7 / LRE-7gydF4y2Ba［gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba]，gydF4y2BaFER-4gydF4y2Ba突变体[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),而gydF4y2BaLRE-7，FER-4gydF4y2Ba双突变雌蕊[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]均表现出相似的结实率降低水平(~ 80%)，表明这两种蛋白质在同一途径中共同发挥作用。使用一个gydF4y2BapLRE: LRE-cYFPgydF4y2Ba翻译融合构建体，我们以前表明种子集缺陷gydF4y2BaLRE.gydF4y2Ba可以完全救出突变体，并且LRE-CYFP定位在Synergid细胞的FA中[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．大约68％的所有CYFP信号中的Synergids表达LRE-CYFP在FA中积累。删除LRE中的预测Ω位点，预计GPI的残留物预计将被翻译，或完全消融LRE蛋白的C-末端中的GPI附着信号（气体）区域，显着地破坏了LRE的定位 -CYFP在FA。虽然这种突变体LRE-CYFP的定位中断的虽然暗示其未能接受GPI锚，但突变体完全补充花粉管接收和种子集缺陷gydF4y2BaLRE-7 / LRE-7gydF4y2Ba［gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］gydF4y2Ba．gydF4y2Ba甚至用FER的跨膜域取代LRE中的GAS区域，也完全互补gydF4y2BaLRE-7.gydF4y2Ba雌性育性缺陷，表明LRE能以完全不同的形式嵌入质膜，花粉管接受功能仍接近正常水平[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

为了解决GPI锚点和其他fg表达的gap的缺失是否被容忍，除了gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba我们之前也分析了GPI转氨酶(GPI- t)亚基的一个突变，GPI转氨酶是一种通过转酰胺作用将GPI锚定添加到gap中的交易复合体[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．插入T-DNA插入gydF4y2BaGPI8.gydF4y2Ba（gydF4y2Bagpi8-2gydF4y2Ba)，即GPI-T的催化亚基，对LRE-cYFP在增效剂FA中的极性定位的影响程度与GPI-T相似gydF4y2BaCIS.gydF4y2BaLRE的气体地区的资金。仍然，花粉管接待和种子套装gydF4y2BaGPI8-2 / +gydF4y2Ba雌蕊与野生型雌蕊难以区分，靠近正常gydF4y2Bagpi8-2gydF4y2Ba通过FG传输表明，FG中的间隙的GPI锚丢失不会破坏其功能。相比之下，传输gydF4y2Bagpi8-2gydF4y2Ba通过MG被废除和gydF4y2Bagpi8-2gydF4y2Ba纯合子无法建立[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．受影响的精确MG功能gydF4y2Bagpi8-2gydF4y2Ba并确认gydF4y2BaATGPI8.gydF4y2Ba尚未报告通过互补测定的Mg中的功能。因此，从施肥（花粉发育，花粉管出苗，花粉管生长和花粉管接收中的哪个方面被破坏到MG中表达的间隙的GPI锚损失仍然未知。gydF4y2Ba

正常功能gydF4y2Bagpi8-2gydF4y2BaFGS是非常出人意料的，因为GPI锚点除了间隙中是最复杂和最成熟的昂贵的脂质在真核中翻译后翻译改性[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba最有可能用作FG功能中许多其他间隙的膜附着的机制。获取关于GPI-T损失如何影响本研究的额外证据，我们研究了拟南芥FG和MG引起的突变引起的缺陷gydF4y2BaATPIG-S.gydF4y2Ba（gydF4y2BaAt3g07180gydF4y2Ba），酵母和人猪的同源物和GPI-T的推定亚基。此外，我们利用中断的T-DNA中的报告基因gydF4y2BaATPIG-S.gydF4y2Ba明确GPI-T中AtPIG-S缺失导致的特异性MG表型。gydF4y2Ba

GPI-T复合物在哺乳动物和酵母中分别由5个亚基PIG-K/GPI8、GPAA1/GAA1、PIG-S/GPI17、PIG-T/GPI16和PIG-U/GAB1 -组成[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]. 这些GPI-T亚基的拟南芥同源物已经被鉴定[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]由5个亚基 - 猪-K / GPI8组成（gydF4y2BaAT1G08750gydF4y2Ba），Gaa1（gydF4y2BaAt5g19130gydF4y2Ba), PIG-S (gydF4y2BaAt3g07180gydF4y2Ba), PIG-T (gydF4y2BaAT3G07140gydF4y2Ba）和猪肉（gydF4y2BaAT1G63110gydF4y2Ba）（Luschnig＆Seifert 2011）。其中，仅在拟南芥中更详细地表征了催化GPI8亚基[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．在这项研究中，我们发现gydF4y2BaATPIG-S.gydF4y2Ba拟议拟议的GPI-T亚单位在拟南芥中，即使它破坏LRE-CYFP的定位，也不会影响FG的功能。此外，我们的结果表明gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba由于花粉管出苗和管生长阶段的缺陷，通过Mg传输几乎完全被废除，揭示了GPI锚的重要性在花粉雌蕊相互作用期间对Mg表达的间隙。表征gydF4y2Ba猪-1gydF4y2BaGPI转运蛋白缺失花粉粒发育正常，成为GPI锚定生物合成和GPI锚定添加到gap的解偶联工具，为研究游离GPI在植物发育中的作用提供了可能的途径。恢复正常的试管生长gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba通过提供野生型副本的花粉gydF4y2BaATPIG-S.gydF4y2Ba融合到gydF4y2BaGFP.gydF4y2Ba并从自己的启动子表达（gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba)容许产生gydF4y2Ba猪-1 /猪-1gydF4y2Ba种子。我们的结果在本研究中报告使用gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba与使用的先前结果一致gydF4y2Bagpi8-2gydF4y2Ba并且表明FG比MG更容易耐受GPI-T功能和GPI锚的损失。gydF4y2Ba

的突变gydF4y2BaATPIG-S.gydF4y2BaLORELEI在助细胞丝状器中的定位被破坏gydF4y2Ba

为了检测GPI-T亚基的缺失（以及延伸到GPI锚定的缺失）是否会干扰拟南芥FG的功能，我们在FG中获得了一个T-DNA插入序列gydF4y2BaATPIG-T.gydF4y2Ba（gydF4y2Bapigt-1gydF4y2Ba)．猪T是GPI-T的中心成分，并且通过结合GaA1的腔域形成复合物的形成至关重要，该GPI-T的最大亚基可能将GPI呈现给复杂的反应中心和猪-S，a具有未知功能的外设组件[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]．正如所做的那样gydF4y2Bagpi8-2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]，我们在辛累克因的FA中使用了LRE-CYFP定位的破坏gydF4y2Bapigt-1gydF4y2Ba突变体作为标记，以表征FG中的ATPIG-T功能。令人惊讶的是，所有卵子都在gydF4y2Bapigt-1 / + pLRE: LRE-cYFP / pLRE: LRE-cYFPgydF4y2Ba雌蕊显示了一个本地化模式，它与野生型背景中的LRE-CYFP定位难以区分（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）尽管atpig-t预测，以编码GPI-T的功能重要亚基gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]．使用14天纯合的RT-PCR和RT-QPCR实验gydF4y2Ba猪-1 /猪-1gydF4y2Ba幼苗显示全长gydF4y2BaATPIG-T.gydF4y2Ba没有在gydF4y2Bapigt-1gydF4y2Ba树苗被截断了gydF4y2BaATPIG-T.gydF4y2Ba由外显子1-4组成的mRNA转录物，与野生型相比，其累积水平仅为40%（附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．基于这些结果，我们得出结论gydF4y2BaATPIG-T.gydF4y2Ba转录本缺乏外显子5，编码PIG-T的胞质结构域和内质网检索基序[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba[是否与这些部分转录物的较低水平相结合，仍然不足以导致FA中LRE-CYFP定位的显着降低gydF4y2Bapigt-1gydF4y2Ba合酶。后果，我们没有使用gydF4y2Bapigt-1gydF4y2Ba进一步研究GPI-T功能的破坏是否影响拟南芥FG功能。gydF4y2Ba

接下来我们获得了T-DNA突变系(gydF4y2Ba猪-gydF4y2Ba1）在gydF4y2BaATPIG-S.gydF4y2Ba，GPI-T的另一个推定亚基。纯合子gydF4y2Ba猪-1 /猪-1gydF4y2Ba无法获得(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，我们计算ifgydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba扰乱了gydF4y2BaLRE.gydF4y2BaLRE-cYFP在雌蕊杂合子中的定位分析gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba和纯合gydF4y2BapLRE: LRE-cYFPgydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．我们检测到LRE-cYFP的两种定位模式gydF4y2Ba猪-1 / +gydF4y2Ba雌蕊。在胚珠的一部分（〜60％，gydF4y2BangydF4y2Ba= 334;如图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae），我们在增量细胞质中检测到FA和斑块中的预期LRE-CYFP定位（图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaF)，如以前报导的那样[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．在剩余的胚珠中（〜40％，gydF4y2BangydF4y2Ba= 334;如图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae） LRE-cYFP定位在整个助细胞中异常扩散（图1）。gydF4y2Ba1gydF4y2Bag).观察到的两种定位模式与杂合子的胚珠相似gydF4y2Bagpi8-2gydF4y2Ba我们之前报道的雌蕊[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．在类似的测定条件下，野生型雌蕊中的近100％的胚珠携带gydF4y2Baplre-cyfp.gydF4y2Ba外源基因在增效剂中具有预期的极化LRE-cYFP定位模式(gydF4y2BangydF4y2Ba= 229;如图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae）。当在具有扩散定位的oblules内的FA内平均相对集成信号密度时gydF4y2Ba猪-1 / +gydF4y2Ba雌蕊，它们在FA中显示出的信号中的信号减少约50％，与在FA中的偏振LRE-CYFP定位的偏振LRE-CYFP定位中，相比，分散朝向Synergid细胞的脱氨基末端的信号。（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bah和i）。这些结果表明gydF4y2BaATPIG-S.gydF4y2Ba对于FA中LRE的偏振定位是重要的，可能通过将GPI锚介导对LRE-CYFP进行介导。gydF4y2Ba

传输gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba主要是在雄配子体中，由于花粉管的出现和生长缺陷gydF4y2Ba

LRE-cYFP在胚珠FA中的定位被破坏gydF4y2Ba猪-1 / +gydF4y2Ba雌蕊与我们无法识别gydF4y2Ba猪-1gydF4y2BaHomozygote表明ATPIG-S可能影响GPI锚，除了FG中的LRE和其他合酶表达的间隙。此外，它也可能在mg中发挥重要作用。因此，我们调查了这一作用gydF4y2BaATPIG-S.gydF4y2Ba通过计算传输效率（TE）的两种配子体gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba通过与链接的Basta电阻标记通过Gamteophytes突变gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba本文(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一种）。gydF4y2Ba

尽管扰乱了LRE-CYFP本地化gydF4y2Ba猪-1 +gydF4y2Ba雌蕊，抗basta种子的分离率gydF4y2Ba猪-1 / +gydF4y2Ba用野生型花粉授粉的雌蕊表明存在正常的TEgydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba通过FG (95%;表格gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．相比之下，只有2％的种子从野生型雌蕊收集，与agydF4y2Ba猪-1 / +gydF4y2Ba花粉是抗炸弹的，透露几乎完全废除gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba通过mg传输（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．此外，传输gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba通过MG无法通过有限的授粉恢复gydF4y2Ba猪-1 / +gydF4y2Ba在野生型雌蕊上花粉（表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，表明gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba通过MG不归因于野生型花粉的突变花粉;相反，这些结果指向固有的缺陷gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba花粉功能。gydF4y2Ba

识别缺陷的缺陷减少传播gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba通过雄配子体，我们利用gydF4y2Ba平台52：GUS.gydF4y2Ba基因的gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba T-DNA as a reporter to assess pollen development and function (Fig.2gydF4y2Baa） 是的。这个gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba突变发生在gydF4y2Ba四方/四方gydF4y2Ba甚至在花粉成熟后阻止微微孢子分离的背景[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba]，允许直接比较每个四面体中的野生型和突变花粉。来自的关注和解除花粉四分之三gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba/ +植物被染色Gus活性（gydF4y2BangydF4y2Ba= 100）并且在这两个情况下，gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba花粉颗粒（GUS阳性）具有与控制线上相同的野生型花粉（GUS阴性）无区别的形态，或控制线中的所有花粉粒（gydF4y2Ba平台52：GUS / +gydF4y2Ba没有任何四分之三gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba突变）（图gydF4y2Ba2gydF4y2BaB-e)，表示正常发育gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba花粉颗粒。此外，gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba花粉粒表达gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba类似于gydF4y2Ba平台52：GUS.gydF4y2Ba花粉四面体在野生型背景中，表明成熟gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba花粉颗粒在代谢上活跃和可行。gydF4y2Ba

什么时候gydF4y2Ba猪-1 / +gydF4y2Ba花粉颗粒越过野生型雌蕊，gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba花粉表现出明显的花粉管生长缺陷。不像野生型的雌蕊授粉与花粉携带gydF4y2Ba平台52：GUS.gydF4y2Ba在野生型背景(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bah），野生型雌蕊授粉gydF4y2Ba猪-1 /gydF4y2Ba+花粉表明许多非发芽或勉强出现gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba花粉管（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Baf和I和附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．许多gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba尽管进行了GUS染色并安装在载玻片上，花粉粒仍然留在柱头上，这表明这些花粉粒很可能成功地附着在柱头乳头上，这是花粉与雌蕊相互作用的关键第一步[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．发芽花粉管的花粉颗粒，平均最长gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba这些雌蕊的花粉管为0.38mm±0.09（gydF4y2BangydF4y2Ba= 5） ，而野生型gydF4y2Ba平台52：GUS.gydF4y2Ba花粉管生长雌蕊的整个长度，平均最长长度为2.13mm±0.15（gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)。在突变体gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba花粉缺陷主要在花粉管出现和生长的阶段显现，在一个很少观察到的一个例子gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba观察到沿胚珠的杂物的花粉管生长，扰乱了微囊引导（图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaG）。根据这些结果，我们得出结论gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba花粉在花粉管的出现和生长方面存在缺陷，而这些缺陷是造成花粉管几乎完全丧失传播的基础gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba通过花粉发生变异。gydF4y2Ba

的gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba转基因救出花粉管出苗和生长缺陷gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba花粉gydF4y2Ba

确认观察到的MG缺陷gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba花粉的破坏完全是由于gydF4y2BaATPIG-S.gydF4y2Ba基因，我们生成了一个gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba平移融合结构 bp上游序列gydF4y2BaATPIG-S.gydF4y2Ba转录起始位点驱动GFP表达融合到基因的n端gydF4y2BaATPIG-S.gydF4y2Ba基因组序列（附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一种）。遗憾的是，在类似于先前报道的GPI-T亚基融合构建体的T1植物的幼苗或花粉颗粒中，猪-GFP信号在幼苗或花粉中没有可检测到猪-GFP信号，ATGPI8-EGFP [gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．验证是否存在gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba表达，我们渗透gydF4y2Ba农杆菌gydF4y2Ba携带gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba构造成gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶子并检查叶子是否显示出猪的瞬时表达-GFP。我们检测到GFP信号gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba浸透的叶子gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Bac和e)，但不包括仅被辅助质粒浸润的叶子(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba有趣的是，GFP信号在浸润后3天没有被检测到，但在浸润后12天积累了大量的GFP信号，这表明虽然AtPIG-S-GFP融合蛋白是稳定的，但启动子活性gydF4y2Bappigs.gydF4y2Ba用于融合蛋白的构建体或掺入率入到GPI-T复合物中gydF4y2Ba我gydF4y2Ba非常低。额外的是，与ER中的GPI-T复合物的已知居留一致，路面细胞中的猪-GFP信号显示出暗示在ER中累积的蛋白质的本地化模式（附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2BaC）。gydF4y2Ba

检查是否gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba构建可以补充花粉管的出现和生长缺陷gydF4y2Ba猪-gydF4y2Ba1，我们分析了三个独立的T1转化夹线gydF4y2Ba猪-1 / +gydF4y2Ba背景(第7、15和25行)。在每个独立的转化株系中，我们鉴定出T2个体为杂合子gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba突变（由四分之三的GUS染色鉴定）并携带至少一个副本gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba转基因（基于与转基因连接的潮霉素抗性）并在互补实验中使用它们。野生型雌蕊用来自这些T2植物的花粉授粉，并在授粉后为18小时染色GUS活性。在所有三种独立的转化线中，gydF4y2Ba猪-GFP.gydF4y2Ba挽救了花粉管的出苗和生长缺陷gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba花粉，as.gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba花粉管（GUS阳性）生长了雌蕊的整个长度（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Baj).重要的是，野生型雌蕊最长的花粉管与3个独立转化株的花粉杂交后恢复到雌蕊全长，平均长度分别为2.2±0.16 mm、2.2±0.11 mm和2.14 mm±0.14 mm。此外，存在gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba转基因拯救了降低的TEgydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba通过mg突变，作为tegydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba突变率从0.02显著增加，无显著性差异gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba转基因与0.76的TEgydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba转基因（表格gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．虽然gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba没有在三种独立转化线中任一项的花粉颗粒或花粉管中产生可检测的GFP信号，花粉管生长缺陷的成功互补表明转基因可能表达。这些结果表明，花粉管的出现和生长缺陷gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba花粉携带gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba转基因恢复到正常水平。gydF4y2Ba

pigs-1 / pigs-1 pPIGS: GFP-PIGSgydF4y2Ba从种子外套出现后幼苗死亡gydF4y2Ba

尽管恢复了花粉管的增长，但三个独立的75株植物中gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba在转化株系中，我们从未检测到T2植株产生GUS（4:0 GUS+：GUS-四分体）纯合的花粉四分体gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba突变。这些结果表明，纯合子gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba由于胚或幼苗致死，T2植株中不存在或发生的频率很低。因此，我们分析了这些转化者，以获得建立失败的见解gydF4y2Bapigs-1 / pigs-1 pPIGS: GFP-PIGSgydF4y2Ba植物gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba互补线。gydF4y2Ba

由胚胎致死性引起的败育种子是某些基因型在后代中扭曲分离的一个原因，并表现为皱巴巴的棕色种子，如文献报道gydF4y2BaPNT1gydF4y2BaGPI生物合成缺陷的突变体[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]．在三个独立补充中的任何一个中没有观察到枯萎或皱纹的种子gydF4y2BaPIGS-1 / +，PPIGS：GFP-PIGSgydF4y2Ba行。此外，从第15行未成熟的角果包含类似数量的未受精，流产，和正常发育的种子在野生型(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba），建议没有可行的gydF4y2Bapigs-1 / pigs-1 pPIGS: GFP-PIGSgydF4y2Ba植物不是由于胚胎致命。gydF4y2Ba

我们接下来进行了两项实验来测试的可能性gydF4y2Bapigs-1 / pigs-1 pPIGS: GFP-PIGSgydF4y2Ba在明显正常的种子发芽后，植物在幼苗阶段死亡。首先，自带种子来自gydF4y2BaPIGS-1 / +，PPIGS：GFP-PIGSgydF4y2Ba在没有选择常规MS板（不含抗生素或Basta以选择补充，植物gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba转基因或者gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba突变,分别)。我们发现有几株幼苗生长迟缓，出种皮后不久就死亡(死亡率为18 ~ 29;表格gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．致死幼苗的存在依赖于存在gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba转基因，因为在后代没有致死的幼苗gydF4y2Ba猪-1 / +gydF4y2Ba，这缺乏补充转基因（表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．二、当自交种子时gydF4y2BaPIGS-1 / +，PPIGS：GFP-PIGSgydF4y2Ba植物，但不是来自gydF4y2Ba猪-1 / +gydF4y2Ba植物，被镀在含有basta(标记选择gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba除了抗菌和易感幼苗之外，突变还检测到致死的幼苗。与Basta易感幼苗不同，致死的幼苗既不含有胚根也不扎根，并在种子涂层出现后立即死亡（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa - c和表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．重要的是，在MS Basta板上观察到的致死幼苗与常规MS板上观察到的那些类似，因为它们没有产生真实的叶子，未能发育根，胚胎叶片呈浅色（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac).这些结果表明gydF4y2Ba猪-1 /猪-1gydF4y2Ba在存在的情况下建立种子gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba转基因，但在出种皮后死亡。gydF4y2Ba

我们设计了一种基于pcr的基因分型方法来验证致命幼苗的基因型是否确实存在gydF4y2Bapigs-1 / pigs-1 pPIGS: GFP-PIGSgydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaD-H和其他文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．为此，我们在两个独立的后代的三种幼苗中得分gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba转化子在带有basta的MS板上生长，汇集每种类型的幼苗，从它们中分离出基因组DNA，并进行两组PCR反应，一组用于评分gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba突变和另一个存在的存在gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba转基因和野生型拷贝gydF4y2BaATPIG-S.gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaD-H和其他文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．我们发现，只有混合致死苗，而不是basta抗性和basta敏感苗，是纯合的gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba突变，确认致死幼苗的基因型确实如此gydF4y2Bapigs-1 / pigs-1 pPIGS: GFP-PIGSgydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bag和h和附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．在苗木期间采取护理以防止种子涂层污染，以使种皮外套的母体二倍体基因型（gydF4y2BaGFP-PIGS pigs-1 / +gydF4y2Ba)与基于pcr的幼苗基因分型结果没有混淆。的确，缺乏内生的野生型gydF4y2BaATPIG-S.gydF4y2Ba致死幼苗样品中的带证实，我们的这种样品的幼苗收集是没有种子涂层污染的（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bah和附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．此外，PCR结果显示gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba转基因在共轭的抗菌和易感幼苗中进行偏析，并且汇集的巴斯塔 - 易感幼苗不包含gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba按预期突变（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bag和h和附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．这些结果表明虽然是gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba构建可修复花粉管生长缺陷gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba突变花粉并允许纯合gydF4y2Ba猪-1 /猪-1gydF4y2Ba要形成的种子gydF4y2BaATPIGS-GFP.gydF4y2Ba从本地表示gydF4y2Ba猪gydF4y2Ba启动子无法补充发育缺陷gydF4y2Ba猪-1 /猪-1gydF4y2Ba幼苗。或者，可以在与之紧密连接的另一基因中进行独立突变gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba T-DNA caused the seedling lethality ofpigs-1 / pigs-1 pPIGS: GFP-PIGSgydF4y2Ba幼苗。gydF4y2Ba

gpi -锚定gap的缺陷似乎并不会破坏FG的功能gydF4y2Ba

就像在gydF4y2BaCIS.gydF4y2BaLRE气体中的突变（GPI-T的基材）和gydF4y2Bagpi8-2gydF4y2Ba（GPI-T的组成部分），gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba也会破坏LRE-cYFP在FA中的极性定位，而不影响其自身通过FG的传输。另一种拟南芥GAP的GPI锚在其生物活性上是可缺性的[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]因此，LRE可能只是另一个GPI锚不影响其功能的间隙。如果是这样的话，那么LRE中的气体可能只是其复制品的遗迹，其中祖先的复制品含有一种功能上更相关的气体。gydF4y2Ba

不过,大概在gydF4y2Ba猪-1gydF4y2BaFGS，所有间隙都缺乏GPI锚，因此GPI锚不太可能添加所有FG表达差距的功能不重要。一种可能性是从二倍体保留成熟间隙gydF4y2Ba猪-1 / +gydF4y2BaMegaspore母细胞（MMC），经过减数分裂和兆内生的三种有丝分裂，可以支持成熟的功能gydF4y2Ba猪-1gydF4y2BaFG。为了支持这一假设，孢子花束二倍体酵母细胞具有中断gydF4y2BaGPI2.gydF4y2Ba基因产生能够发芽并完成最多四种有丝分裂细胞分裂的GPI缺陷的单倍体孢子[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]．另一种可能性是可以通过围绕FG的整数组织供应成熟的间隙，因为它已知的“膜涂布”允许在接触时转移动物细胞的细胞表面之间的间隙[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]．与这些可能性中的任何一种一致，涉及FG发育的几个间隙，如AGP4，AGP18，A36和A39具有突变缺陷，其在自然中是孢子体的[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

尽管如此，涉及花粉管接收的缝隙，如LRE和ENODLs，在本质上是配子体的[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba因此，从孢子形MMC或Integument组织加载不能完全解释为什么间隙缺陷的FGS仍然可以正常运作。有趣的是，LRE和Enodls在Synergid细胞中的功能，偏振细胞默认分泌途径是将蛋白质交通直接到FA的[gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba]．FA的细胞壁和膜的高密度内陷与gap中未裂解的GAS区域的疏水性相结合gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba增效剂可促进它们在FA中的封存[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．协同分泌的gap、ENODLs和LRE可进一步保留在gydF4y2Ba猪-1gydF4y2BaFA与受体样激酶的外域结合，如FER[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

最后，而且gydF4y2Bagpi8-2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba突变破坏了对FA的LRE-CYFP的极性定位，一些LRE-CYFP分子仍然达到FAgydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa-g）和gydF4y2Bagpi8-2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]合酶。由于GPI锚的高膜动态及其快速“巡逻”膜的能力，间隙具有在非常低的浓度下起作用的能力。gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba]．因此，对FA的LRE-CYFP定位的50％降低可能不足以对其起作用的能力产生负面影响。总之，Synergids的不寻常的结构和功能性能可以克服GPI锚吞噬缺乏对合酶表达的间隙和辛酸间隙的混淆遗传分析。gydF4y2Ba

ATPIG-S函数的损失导致花粉管出苗和管生长的缺陷gydF4y2Ba

与之相反gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba突变的投篮,gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba突变体MGS具有严重的生育缺陷。在这里，通过利用GUS记者gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba T-DNA we show for the first time that loss of AtPIG-S function in pollen (and by inference GPI transamidation-deficient pollen) have defects at the stages of pollen tube emergence and growth. Future investigations could focus on testing if low TE reported previously ingpi8-1gydF4y2Ba和gydF4y2Bagpi8-2gydF4y2Ba在花粉管出苗和花粉管生长方面的缺陷也是造成mg的原因。有可能是GPI锚点的缺失加上花粉表达的缝隙，比如gydF4y2BaLLG2gydF4y2Ba和gydF4y2BaLLG3gydF4y2Ba（LRE的Paralogs）gydF4y2Ba，gydF4y2Ba这对于维持花粉管的细胞壁完整性至关重要，可能在花粉中耐受性而不是FG，因为快速发育过程花粉必须在管道出现和生长过程中进行[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]．而LLG2/3在gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba由于浓度低，花粉管会很困难gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba花粉管生长，分析效果gydF4y2BaCIS.gydF4y2BaLLG2 / 3的气体区域中的突变类似于LRE中报告的那些[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba[可以证实我们的研究结果对GPI锚的增加，除了FG中，毫在MG中的间隙增加。gydF4y2Ba

我们的结果gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba（本研究）和gydF4y2Bagpi8-2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba25gydF4y2Ba致严重的Mg缺陷也与先前关于四个GPI生物合成基因中的突变的报道一致，导致男性生育率降低[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]．虽然所有四种GPI生物合成基因的突变体分析在Mg功能中建立了GPI的重要作用，但它们不能排除不存在自由，非蛋白质链接GPI的可能性下潜这些Mg缺陷。除了用作由GPI-T催化的透析反应中的晶体化合物之外，PRODETS中的证据表明，游离GPI在细胞膨胀中发挥独立和更重要的作用而不是成熟的空白[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]. 在这里，我们的研究通过靶向下游转酰胺步骤而不是GPI锚定生物合成，为花粉管出现和生长缺陷的可能性提供了支持gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba花粉颗粒是由于缺乏GPI锚对间隙附着。仍然，免费的GPI在花粉中可能是重要的，但对于我们的知识膜 - 局部的Pollen局部免费GPI尚未记录。因为gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba这也为研究游离GPI的体内系统提供了可能，因为游离GPI可能在植物体内积累gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba花粉粒，类似于酵母中GPI转酰胺缺陷突变体[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

可能的角色gydF4y2BaATPIG-S.gydF4y2Ba在拟南芥早期阶段的幼苗揭示拯救gydF4y2BaATPIG-S.gydF4y2Ba在雄配子体中的功能gydF4y2Ba

成功恢复gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba花粉管生长缺陷由gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba转基因证实了作用gydF4y2BaATPIG-S.gydF4y2BaGFP与AtPIG-S蛋白的融合并不影响其在GPI-T复合体中的功能。因此,gydF4y2BaGFP-PIGSgydF4y2Ba融合蛋白可用于免疫沉淀和解开拟南芥中GPI-T复合物的亚基组合物，类似于HA-PIG-S，其用于在CHO细胞中拉下GPI-T复合物[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]．但是，应该指出的是，在酵母中，gydF4y2Ba猪gydF4y2Ba同源物，GPI17，都没有共同纯化[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]也没有与GPI-T的其他亚基相互作用[gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

在MG中拯救ATPIG-S功能gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba转基因也让我们得以建立gydF4y2Ba猪-1 /猪-1gydF4y2Ba幼苗。像樟树的幼苗gydF4y2BaPeanut1（PNT1）gydF4y2Ba，是GPI生物合成所需的一种预测甘露糖转移酶[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，我们展示了这一点gydF4y2Ba猪-1 /猪-1gydF4y2Ba携带幼苗gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba转基因从种子涂层中出现，但很快就变成坏死。但是，不像gydF4y2BaPNT1gydF4y2Ba变种人gydF4y2Ba猪-1 /猪-1gydF4y2Ba携带种子gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba转基因没有皱纹和萎缩。此前，在表征非致病等位基因后，提出了在幼苗发育和后期植物开发中进行GPI崩解的作用，gydF4y2Bagpi8-1gydF4y2Ba，一个畸形突变gydF4y2BaATGPI8.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．然而，地上的器官gydF4y2Bagpi8-1gydF4y2Ba萌芽后15天的突变体甚至是非常微弱的，甚至没有产生根，尽管比野生型明显短。相比之下，gydF4y2Bapigs-1 / pigs-1 pPIGS: GFP-PIGSgydF4y2Ba幼苗从种皮中出苗后直接死亡。值得注意的是，母体种皮gydF4y2Ba猪-1 / +gydF4y2Ba也许有足够的二倍数来支持gydF4y2Bapigs-1 / pigs-1 pPIGS: GFP-PIGSgydF4y2Ba胚胎。gydF4y2Ba

仍然，仍然不清楚为什么gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba转基因未能补充幼苗函数，尽管先前报道，在拟南芥中，一个gydF4y2BaAtGPI8-EGFPgydF4y2Ba构建体也在其内源性启动子的2.1 kB下推动并没有补充所有gydF4y2Bagpi8-1gydF4y2Ba这种结构中的表型和荧光报告物是无法检测到的[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．因此，我们的构建中使用的启动子序列也可能缺乏gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba在发芽幼苗中充分表达所需的元素，在哪里gydF4y2BaATPIG-S.gydF4y2Ba表达（gydF4y2Bahttp://bar.utorto.ca/eplant/gydF4y2Ba). 我们在这里报告的结果并不能排除另一种原因，即在水稻后代中检测到的幼苗致死性gydF4y2Ba猪-1 /猪 -gydF4y2Ba1，gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba．有可能是一个紧密相连的突变或第二次T-DNA插入到邻近的基因中可能与gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba T-DNA and resulted in the seedling lethality. Performing complementation experiments withppigs：gfp-pigsgydF4y2Ba在额外的等位基因中gydF4y2BaAtPIGSgydF4y2Ba会有助于测试这种可能性。gydF4y2Ba

在开花植物繁殖期间，间隙介导多MG和FG功能。虽然GPI锚的损失除了间隙中没有导致FG中明显的表型，但它在MG中的重要性受到花粉管出苗和生长缺陷的影响gydF4y2Ba猪-1gydF4y2Ba突变体花粉。到目前为止，GPI锚点生物合成突变体的MG缺陷不能排除游离的、非蛋白连接的GPI的缺失导致MG缺陷的可能性。在这里，我们分析了GPI- t复合物中的一个假定亚基，该亚基参与GPI锚点翻译后添加到gap上，并表明之前发现的GPI缺陷花粉粒的MG缺陷可能是由于缺乏成熟的gap。gydF4y2Ba

我们还证实了FG中除了gap之外，GPI锚点的丢失并不影响其功能的发现。虽然大孢子母细胞可能在细胞分裂过程中向FG提供成熟的gap，但FG表达的gap(如LRE和ENODLs)中的花粉管接收缺陷起源于配子体。因此，我们提出，它们在fg表达的gap中锚定的GPI的重要性可能被它们的增效细胞的表达所掩盖，这样:(1)增效物质的特殊分泌系统足以将非GPI锚定的gap转运到质膜上，(2) FA的高表面积及其未裂解的GAS区疏水性足以使其在FA上隔离并发挥作用。因此，与FG相比，MG是检验gap作用的更好的单倍体模型。gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

哥伦比亚（Col-0）是本研究中使用的所有拟南芥种子的生态型。的gydF4y2BaGPI8-2 / +gydF4y2Ba（CS853564），gydF4y2Ba猪-1 / +gydF4y2Ba(CS807841),gydF4y2Bapigt-1gydF4y2Ba（Salk_099158）种子是在俄亥俄州哥伦布的拟南芥生物资源中心（Abrc）购买的。的gydF4y2Ba平台52：GUS.gydF4y2Ba野生型背景的基因之前已经描述过了[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba这是来自美国RI州普罗维登斯市布朗大学马克·约翰逊博士的捐赠。一旦手稿出版，新建立的转基因株系作为本研究的一部分。gydF4y2BaPLRE：LRE-CYFP / PLRE：LRE-CYFP，猪-1 /猪-1gydF4y2Ba；gydF4y2BapLRE: LRE-cYFP / pLRE: LRE-cYFP pigs-1 / +gydF4y2Ba， 和gydF4y2Bappigs：GFP猪，猪-1 / +gydF4y2Ba- 作者：本研究的第一个作者Nick Desnoyer将存入美国俄亥俄州哥伦布的拟南芥生物资源中心。本研究报告的所有拟南芥植物都是如上所述成长的[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

花粉管生长测定gydF4y2Ba

在体内花粉管中，如上所述进行生长测定[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba]．简单地说,gydF4y2Ba平台52：GUS.gydF4y2Ba或gydF4y2Ba猪-gydF4y2Ba将1 / +花粉越过指定植物的阉割阶段14雌蕊。然后在授粉后收集杂交的雌蕊18小时，固定在80％丙酮中，使用X-Gluc染色Gus活性[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]，安装在50％甘油中，并在Zeiss Axiovert 100显微镜中使用差分干扰对比光学器件进行成像。使用imagej使用雌蕊的光显微照片来测量花粉管长度。gydF4y2Ba

传输效率测定gydF4y2Ba

在14雌蕊去雄期进行互交。在有限授粉实验中，在解剖显微镜下用小于40粒花粉为雌蕊授粉。这些杂交的种子被放置在含有与T-DNA中抗抗生素或抗除草剂标记相对应的适当抗生素/除草剂的培养皿中。14天生的真叶和发育中的根的幼苗被认为是抗性的。gydF4y2Ba

幼苗致命的测定gydF4y2Ba

将种子置于带或不带basta的MS皿中，在4℃分层2天，在生长室孵育14天，在解剖镜下评分。在basta培养皿中，对三种类型的幼苗进行了评分。如果幼苗有真叶，而且所有的叶子都是绿色的，并且根系生长健壮，有根毛和次根，那么它们就被评为“抗basta”。如果萌发的幼苗胚胎叶发育完全，但真叶从未长出，胚根和根长出但不生长，2周后死亡，则判定为“敏感”。最后，如果从种皮中生长出来的幼苗只包含胚叶，既不包含胚根也不包含根，则被认为是“致命幼苗”。gydF4y2Ba

如果在没有Basta的没有Basta的板上镀种子，则获得两种类型的幼苗;我fseedlings contained true leaves and all leaves were green, and had robust root growth with root hairs and secondary roots, they were scored as ‘normal’ and if seedlings that began to emerge from the seed coat contained only embryonic leaves and contained neither radicle nor roots, they were scored as ‘lethal’ seedlings.

对于基因组DNA分离，在生长14天后收集幼苗，注意不要用种子涂层污染收集，特别是在致命幼苗的情况下。虽然在电镀后7-10天内检测到致命幼苗，但我们在生长后的14天后被评分并收集了三种类型的幼苗，因此可以分离和收集致命的幼苗而无需粘附在幼苗上并污染收集。避免种子涂层排列是必不可少的，因此种子外壳的二倍体母体基因型并未对幼苗的PCR基因分型进行了混淆。分别收集三种类型的幼苗，在液氮中汇集并冷冻，并如前所述从它们中分离出基因组DNA [gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba]．通过如下反应中的至少100ng基因组DNA以至少100ng基因组DNA进行PCR：步骤1：（1x）98.0℃2分钟;步骤2：（34x）30 s，56.0°C，20s，56.0℃，72.0℃，1分钟;步骤3：（1x）：72.0°C 2分钟。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上分离。使用的引物序列和预期的PCR产物尺寸在附加表中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

共聚焦显微镜gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba猪-1 /猪-1gydF4y2Ba或gydF4y2Ba猪-1 / +gydF4y2Ba突变体越过gydF4y2BaPLRE：LRE-CYFP / PLRE：LRE-CYFPgydF4y2Ba［gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]并建立gydF4y2Ba猪-1 /猪-1gydF4y2Ba，gydF4y2BaPLRE：LRE-CYFP / PLRE：LRE-CYFPgydF4y2Ba和gydF4y2Ba猪-1 / +gydF4y2Ba，gydF4y2BaPLRE：LRE-CYFP / PLRE：LRE-CYFPgydF4y2Ba线条分别。在安装未加压的14阶段雌蕊之后取出来自这些线的胚珠的共焦图像。使用Leica SP5共聚焦激光扫描显微镜系统进行荧光图像。对于CYFP成像，用488-NM激光激发样品，收集510和550nm之间的发射光谱。使用imagej软件处理YFP图像（gydF4y2Bahttp://imagej.nih.gov/ij/gydF4y2Ba)．通过ImageJ中的ROI Manager工具测量原始集成密度来量化YFP定位。gydF4y2Ba

RNA分离，RT PCR和RT-QPCRgydF4y2Ba

根据[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]．简而言之，每次生物重复，14天老gydF4y2Ba猪-1 /猪-1gydF4y2Ba收集col0和col0幼苗，速冻，在−80℃保存至RNA提取。两种基因型均采集3个生物学重复。RNA的分离和质量检查见[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．对于RT-PCR，使用SuperScript™IV First-Strand Synthesis System, ThermoFisher Scientific, Catalog #18091050从2 μg总RNA合成cDNA。gydF4y2Ba

PIGTgydF4y2BaPCR在gydF4y2Ba猪-1 /猪-1gydF4y2Ba使用以下程序使用引物对（P1 + P2）或（P1 + P4）扩增COL-0 cDNA：步骤1（1X）：98.0℃2分钟;步骤2（37X）：98.0℃，15s，55.0℃，15s，72.0℃，2分钟。使用的引物序列和预期的PCR产物尺寸在附加表中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

所有qPCR实验均采用以下qPCR程序:Step 1 (1X): 95.0°C for 10 min;步骤2:(40X) 95.0°C 10 min, 55.0°C 30 s, 72.0°C 30 s，数据采集和实时分析;步骤3 (101X): 45.0°C - 95.0°C 10s，步骤2后将设定点温度提高0.5°C，熔体曲线数据采集和分析启用。Ct值归一化为gydF4y2BaActin2 / 8.gydF4y2Ba．基因表达的相对水平根据[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]．对每个实验进行至少两种技术重复。QPCR反应中使用的引物列于额外的表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

克隆PPIGS：GFP猪gydF4y2Ba

的gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba用PrimeStar®GXLDNA聚合酶（Takara Bio Inc.;目录＃R050A）和DNA模板和额外表中列出的底漆产生构建体gydF4y2Ba1gydF4y2Ba并利用融合内HD克隆增强系统（Clontech，Catalog#639645）将其克隆到用SalI-HF（NEB，Catalog#R3138S）和AscI（NEB，Catalog#R0558S）线性化的pH7WG质粒中。将重组质粒转化到Stellar™ 在含有大观霉素（100μg/mL，Sigma-Aldrich，目录#85555）的LB平板上选择感受态细胞（Clontech，目录#636763）和阳性菌落。该构建体在转化为基因前经过序列验证（伊顿生物科学公司）gydF4y2Ba农杆菌肿瘤术gydF4y2Ba（GV3101 PMP90应变）。选择用于转化为拟南芥的正菌落也通过菌落PCR核实转基因的存在。gydF4y2Ba

植物转化gydF4y2Ba

猪-1 / +gydF4y2Ba杂合子的花序浸入含有转化液gydF4y2Ba农杆菌肿瘤术gydF4y2Ba（GV3101 PMP90应变）窝藏gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba质粒[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．耐霉素抗性转化体如[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]基于[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba20μg/mL。转化子的选择基于存在的真叶，这是只存在于抗潮霉素的植物。gydF4y2Ba

PPIGS的瞬时表达：尼古利亚纳·宾夕法尼亚州的GFP猪gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba农杆菌gydF4y2BaGV3101 :: PMP90菌株携带质粒gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba将GFP-PIGS融合蛋白在大肠杆菌中瞬时表达gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba如上所述[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba]．从渗透区域渗透后3天或12天服用叶打冲孔，并安装在50％甘油上。然后通过共聚焦显微镜分析叶盘的底表皮。使用488nm波长在Zeiss LSM 880 AXIOOBSERVER上的10.5％激光功率下进行图像。gydF4y2Ba

图像处理gydF4y2Ba

Photoshop CC 2018, Illustrator CC 2019 (Adobe，gydF4y2Bahttps://www.adobe.com/gydF4y2Ba）和imagej用于组装图像面板并准备数字。gydF4y2Ba

加入号码gydF4y2Ba

在这项工作中研究的基因数量：gydF4y2BaLRE.gydF4y2Ba（gydF4y2BaAt4g26466gydF4y2Ba)，gydF4y2BaAtGPI8 (At1G08750),gydF4y2Ba和gydF4y2BaATPIGT（AT3G07140）gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

在当前研究期间使用和/或分析的数据集可从合理的请求上从相应的作者获得。gydF4y2Ba

GPI：gydF4y2Ba

糖基膦酰氨基肌醇gydF4y2Ba

GPI-T：gydF4y2Ba

GPI逆向素酶复合体gydF4y2Ba

空白：gydF4y2Ba

GPI锚定蛋白gydF4y2Ba

FG：gydF4y2Ba

雌配子体gydF4y2Ba

MG:gydF4y2Ba

雄性配子化合物gydF4y2Ba

LRE:gydF4y2Ba

罗蕾莱gydF4y2Ba

F A：gydF4y2Ba

丝状仪器gydF4y2Ba

fer：gydF4y2Ba

费力尼亚gydF4y2Ba

te：gydF4y2Ba

传输效率gydF4y2Ba

存储卡：gydF4y2Ba

兆多摩尔母细胞gydF4y2Ba

This research was supported by a NSF grant to R.P. (IOS-1146090) and the Boynton Graduate Fellowship in Plant Molecular Biology, School of Plant Sciences, University of Arizona and University of Arizona Graduate Professional Student Council to N.D. We thank Dr. Xunliang Liu for generating the猪/猪，PLRE：LRE-CYFPgydF4y2Ba线。我们感谢Yadegari实验室帮助暂时表达gydF4y2Bappigs：gfp-pigsgydF4y2Ba在gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba．我们感谢帕蒂Jansma在Marley成像核心设施，以获得共聚焦显微镜。gydF4y2Ba

该研究得到了NSF授权支持R.P.（IOS-1146090）。N.D.是由植物分子生物学，亚利桑那大学植物科学学院和亚利桑那大学研究生职业学生委员会的植物分子生物学中的Boynton毕业生奖学金支持。这些融资机构都没有参与设计研究，收集，分析或解释数据，或写作稿件。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 亚利桑那大学植物科学学院，图森，阿兹，85721，美国gydF4y2Ba

   Nicholas desnoyer，Gregory Howard，Emma Jong＆Ravishankar PalanivelugydF4y2Ba

2. 目前地址：苏黎世大学植物和微生物生物学系107，CH-8008，瑞士苏黎世，ZurichgydF4y2Ba

   尼古拉斯DesnoyergydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

N.D.和R.P.设计了实验;N.D.建立了所有三种转基因素（gydF4y2BaPLRE：LRE-CYFP / PLRE：LRE-CYFP，猪-1 /猪-1gydF4y2Ba；gydF4y2BapLRE: LRE-cYFP / pLRE: LRE-cYFP pigs-1 / +gydF4y2Ba， 和gydF4y2Bappigs：GFP猪，猪-1 / +gydF4y2Ba）作为本研究的一部分生成gydF4y2Ba．gydF4y2BaN.D.，G.H.和E.J.进行实验;N.D.和R.P.写了这篇论文。所有作者都读过并批准了稿件。gydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2BaRavishankar Palanivelu.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。相应的作者是BMC工厂生物学的助理编辑。相应作者在编辑过程中没有作用。gydF4y2Ba

出版商的注意事项gydF4y2Ba

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开放获取gydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料包括在文章的创作共用许可中，除非在材料的信用线中另有说明。如果材料没有包含在文章的创作共用许可证中，而您的预期使用不被法律法规允许或超过允许的使用，您将需要直接获得版权持有人的许可。如欲浏览本许可证的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．“创作共用公共领域”豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。gydF4y2Ba

重印和权限gydF4y2Ba