在器官和时间尺度上的转录组学分析揭示了控制硫酸盐饥饿反应的基因调控网络茄属植物lycopersicum

背景

硫是生物分子的主要成分，是植物的必需元素。硫酸盐是土壤中硫的主要来源，缺乏硫酸盐会对植物生长和作物产量产生负面影响。硫酸盐缺乏对植物的影响已经在生理、转录组学和代谢组学水平上得到了很好的表征拟南芥以及数量有限的农作物。然而，我们仍然缺乏对大多数植物硫酸盐缺乏的分子机制和调控网络的透彻理解。在这项工作中，我们分析了硫酸盐饥饿对番茄植株转录组的影响，以确定时间和器官尺度上的调控网络和关键转录调控因子。

结果

硫酸盐饥饿降低了根和叶的生长，并伴随着器官转录组的重大变化，根系的反应暂时早于叶片。比较分析表明，拟南芥和番茄对硫酸盐饥饿的转录组反应在这两种植物之间是保守的，并允许在转录水平上特异性调节番茄的过程，包括内部磷酸盐水平的控制。整合基因网络分析揭示了硫酸盐饥饿过程中番茄根系和叶片硫酸盐同化、细胞周期、细胞分裂和光合作用相关基因时间表达的关键转录因子。有趣的是，其中一个转录因子与拟南芥硫酸盐饥饿反应的核心组成部分硫限制1高度一致。

结论

总之，我们的研究结果提供了第一个全面的番茄硫酸盐反应基因目录，以及新的调控靶点，为未来番茄和其他作物的功能分析。

硫(S)是生物体必需的营养物质，是重要的蛋白质生成氨基酸蛋氨酸(Met)和半胱氨酸(Cys)的主要成分，也是铁硫中心、S-腺苷蛋氨酸(SAM)、谷胱甘肽和辅酶a等许多辅酶和修复基团的主要成分[1，2]。因此，S直接参与植物的多种代谢过程，包括光合作用或硝酸盐还原和同化[2]。S也是葡萄糖苷硫代葡萄糖苷(GSLs)的一种成分Brassicales和烯丙基半胱氨酸亚砜葱属植物物种，参与防御反应的重要次生代谢物[1，3.]。重要的是，植物是动物和人类还原S的主要来源，动物和人类无法吸收无机S，必须从饮食中的有机化合物(如蛋白质)中获取。作为一种常量营养素，S在植物组织中的平均浓度相对较高(约为植物干重的0.1至0.5%)[4]。然而，S缺乏症已成为作物中日益严重的问题，主要原因是严格的工业排放法规和农艺做法的变化导致大气中S输入的减少，包括使用含S成分减少的肥料，减少使用含S的杀菌剂和集约种植制度，将S从土壤中清除[5]。5]。长期缺S导致光合速率、叶绿素水平和氨基酸含量降低，导致作物生长迟缓，产量、营养品质和口感下降[5，6，7]。此外，缺氮改变了其他营养物质的获取，如硝酸盐、磷酸盐、钼、硒和铁[8，9，10，11]。在此框架下，了解S饥饿反应的调控及其如何影响S的获取和代谢以及植物的其他过程已成为研究和作物改良的主要兴趣。

硫酸盐是土壤中硫的最稳定形式，因此是植物硫的主要来源[1]。硫酸盐通过高亲和硫酸盐转运体(SULTRs)的作用被根表皮细胞吸收[12]，主要是拟南芥中的SULTR1;1和SULTR1;2 [13，14]。然后，硫酸盐可以通过特定的转运体，如SULTR2;1和SULTR3;5运输到空中组织，或通过SULTR4;1和SULTR4;2的作用储存在液泡中[12{引文}。硫酸盐同化的第一步是由ATP硫化酶(ATPS)催化，生成5 ' -磷酸硫酸腺苷(APS)。此时，APS可被APS还原酶(APR)和亚硫酸盐还原酶还原为硫化物，并与o -乙酰丝氨酸(OAS)结合形成半胱氨酸，也可被APS激酶磷酸化为3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸酯(PAPS) [1，2]。PAPS可以作为硫酸盐供体合成多种硫酸盐代谢物，如gsl、油菜素内酯、磺类黄酮、植物磺代酮和磺代茉莉酸盐[3.]。

硫酸盐缺乏或饥饿会引发植物硫酸盐获取和代谢的重要变化，例如S储存化合物的分解代谢和S次生代谢物生物合成过程的抑制[15]。这些变化包括硫酸盐转运体的上调、OAS的积累和GSLs的降解[15]。这种复杂的植物代谢重排部分可以通过发生在转录和转录后水平的变化来解释。在转录水平上，s -响应元件(S-responsive elements, ures)序列已在水稻的启动子区域被鉴定出来SULTR的基因,4月基因和其他硫酸盐缺乏控制基因[16，17，18，19]。在过去的几年中，已经开展了多项工作，以确定控制硫酸盐饥饿反应基因表达的调节因子。利用遗传学方法，不同的转录因子(TFs)已被证明参与硫酸盐运输和/或同化控制，包括MYB家族成员，LONG HYPOCOTYL 5 (HY5)和EIL家族TF硫限制1 (SLIM1) [qh]20.，21，22，23]。SLIM1已成为控制硫酸盐缺乏反应的重要TF [24]。该TF是拟南芥中硫酸盐转运蛋白和GSL合成基因的转录调节因子，以及其他硫酸盐缺乏控制基因[23，24]。在转录后水平，microRNA395 (miR395)靶向低亲和力转运蛋白SULTR2;1和ATPS基因家族的三个成员[25]。miR395受到硫酸盐饥饿的高度诱导，并作用于下游的SLIM1控制硫酸盐同化和体内平衡[26，27，28，29]。此外，核蛋白MORE SULPHUR ACCUMULATION 1 (MSA1)已被证明控制SAM的生物合成，影响整体DNA甲基化并导致SAM的低甲基化SULTR1; 1和SULTR1; 2转运基因和APR3表明植物体内S稳态控制可能存在一种表观遗传机制[30.]。

近几十年来，利用-组学方法研究植物对S有效性的反应，极大地促进了我们对调节植物S代谢和体内平衡的分子机制和生理过程的理解[1，31]。利用转录组学方法已经确定了硫酸盐缺乏反应中差异表达的无数基因，主要是在拟南芥中[10，16，17，23，32，33，34，35，36，37，38),小麦［39，40，41，42]。转录组学数据的荟萃分析表明，硫酸盐缺乏反应基因在硫酸盐运输和代谢相关的生物过程中丰富，但也在细胞壁组织、蛋白质水解调节和碳氮代谢相关的过程中丰富[43]。硫酸盐缺乏反应也通过拟南芥和作物的代谢组学和蛋白质组学分析进行了探讨[10，17，32，35，44，45，46，47，48，49，50，51，52]。此外，集成多组学数据的系统生物学方法已被采用，以生成硫酸盐缺乏反应的整体视图[31]。这些综合方法已经允许识别参与硫酸盐缺乏反应的TF候选基因，如MYB28和MYB29 [44，53]， iaa28 [54，55]， NF-YA2和RVE2 [43]，除其他外[17]。

番茄(茄属植物lycopersicum)是世界上最重要的蔬菜作物之一[56]。2018年，世界番茄收获面积为470万公顷，年产量为1.82亿吨(http://fao.org/faostat/en/#data/QC)。西红柿结出的肉质果实对人类的饮食很重要，因为它是维生素和胡萝卜素的来源，如β -胡萝卜素和番茄红素[57]。硫酸盐缺乏严重影响番茄植株的生长[58，59，60，61，62]、生物量递减、蛋白质浓度、茎和根的总S [61，62]、叶绿素含量[59，60，61]，以及yield [63]。鉴于番茄在世界范围内的经济重要性，了解番茄在分子水平上对硫酸盐饥饿的反应并确定关键的调控成分对当前和未来农业情景下番茄的可持续生产至关重要。

在这项工作中，我们在时间和器官尺度上利用转录组学和网络分析确定了参与番茄硫酸盐饥饿反应的基因和生物过程。整合表达和调节tf目标相互作用数据使我们能够确定可能协调根和叶对外部硫酸盐有效性的时间生长反应的关键候选tf。

硫酸盐饥饿对番茄发育早期叶片和根系的生长有重要影响

如先前报道的其他番茄品种[58，59，60，61，62，63，我们发现，的增长茄属植物lycopersicum简历。硫酸盐饥饿对赚钱幼苗的影响较大。如图所示。1A，与充分营养条件相比，缺乏外部硫酸盐对空中组织的生长有明显的负面影响。这种效果从播种后第三周开始明显。叶片鲜重和总叶面积的多因子分析表明，硫酸盐有效性与时间因子(p-value < 0.001，双向方差分析，图。1b和图S1)，表明叶片对硫酸盐有效性的生长响应取决于植物发育阶段。因此，播种后2周，对照植株与硫酸盐饥渴植株之间无显著差异(p-值= 0.81)，而在播种后3周和4周，外源硫酸盐对叶鲜重和叶面积的依赖性较强(p-value < 0.001)。1b和图S1)。在根重方面，硫酸盐与时间之间也存在同样的相互作用，在播种3周和4周后，对照植株与硫酸盐缺乏植株之间的差异才显著(p-value < 0.001，图。1c).上述结果表明，从播种后3周开始，全株生长受到外源硫酸盐缺乏的严重影响。

与叶片重量和叶面积随时间变化的测量结果一致，叶片中有稳定的硫酸盐积累，在硫酸盐缺乏的植物中，在第3周和第4周被消除(图2)。1d)。相反，在对照条件下生长的植物根系重量随时间的增加不能用根系硫酸盐水平的同时增加来解释(图2)。1e)。此外，在营养充足或硫酸盐缺乏的植物根系中，没有观察到硫酸盐积累的主要差异(图2)。1e).综上所述，这些结果表明除了硫酸盐含量外，其他因素可能控制了根系对硫酸盐饥饿的生长反应。

硫酸盐饥饿以时间依赖性的方式促进叶和根转录组的主要变化

为了深入了解硫酸盐饥饿对叶片和根系生长抑制的分子机制，我们使用RNA-seq在时间和器官尺度上进行了转录组学分析。为了进行这项分析，考虑到三个独立的生物重复，在播种后2周、3周和4周提取根和叶的总RNA。使用kallisto将RNA-Seq数据与ITAG3.20转录组注释伪对齐[64]，得到每百万转录本(TPM)的规范化表达数据(表5)1)。

RNA-seq数据的主成分分析(PCA)表明，样品沿着第一个成分分离得很好，这解释了叶片和根样品中50%以上的变异(图2)。2)。有趣的是，在播种后2周，来自叶片的全营养和硫酸盐匮乏样品被分组在一起，表明在这个时间点的转录物表达谱相似(图2)。2)。相比之下，来自根组织的对照和硫酸盐饥饿2周后的样品分离得很好，这表明硫酸盐饥饿以器官和时间依赖的方式改变了植物转录组，在根组织中有较早的反应。

因此，在播种后2周，没有基因在对照和硫酸盐饥渴叶片中表达差异，而在根系中有438个基因在这个时间点(log . 2)表达差异₂Fold Change> 1, q值< 0.05)(图S2A和表S2)。此外，这438个基因中的55%随后在叶片中受到调控(241个基因，图S2B)，这表明整个生物体在发育过程中对硫酸盐剥夺有一个精心安排的反应。

硫酸盐饥饿在根和叶中有相当数量的基因差异表达:播种后3周有7024个基因，播种后4周有6163个基因，其中大部分基因在叶片中差异表达(图S2A和表S)2)。这种主要的植物转录组重编程与对照植物和硫酸盐剥夺植物在第3周和第4周之间观察到的叶片和根系生长差异有关，这表明基因表达的变化是观察到的表型的部分原因(图2)。1A和b)。

为了鉴定在硫酸盐饥饿、时间或硫酸盐饥饿-时间相互作用下差异表达的基因，我们使用sleuth对每个组织中的RNA-seq数据进行了多因素分析。66]。在根系中，6052个基因受时间的显著影响，3755个基因受硫酸盐饥饿的显著影响，714个基因受两者互作的显著影响(q值< 0.05,log₂FC > 1)。3.a).叶片受硫酸盐饥饿影响的基因数为6084个，受时间影响的基因数为7062个，受两者互作影响的基因数为4571个(q值< 0.05，对数为₂FC > 1)。3.b).与根组织相反，这些结果表明叶片对硫酸盐饥饿的反应与植物年龄有很强的依赖性。事实上，叶片中约90%的硫酸盐响应基因受到时间的显著调节(图2)。3.b)。

为了用另一种RNA定量方法验证RNA-seq分析结果，我们选择了根和叶中涉及硫酸盐代谢、转运和转录调控等不同分子和生物学功能的10个硫酸盐调控基因，以及一组功能未知的基因(表5)3.)。qPCR分析得到的表达模式与RNA-seq数据呈显著正相关(P< 0.0001;Pearson相关值0.89;图S3)，表明分析的大多数基因与RNA-seq分析鉴定的基因具有相似的表达模式。

番茄和硫酸盐拟南芥饥饿响应转录组的比较分析

在之前的研究中，我们鉴定了2046个受硫酸盐有效性调控的基因拟南芥利用转录组学数据的综合meta分析[43]。本荟萃分析包括不同发育阶段(从幼苗到幼苗)的根和叶样本。以番茄为例，多因子分析在根和叶中鉴定出7589个硫酸盐响应基因。为了比较拟南芥和番茄的硫酸盐饥饿应答转录组，我们首先对硫酸盐应答基因进行了同源分析。同源群的鉴定允许对来自多个物种的基因进行交叉比对[67]。我们使用了PLAZA 4.0数据库[68]以确定每个硫酸盐调节基因所属的同源群。因此，我们在番茄的7589个硫酸盐响应基因中鉴定出4262个同源基因家族，在拟南芥的2046个硫酸盐响应基因中鉴定出1338个同源基因家族(表5)4)。我们发现70%与硫酸盐应答基因相关的拟南芥同源基因家族也存在于番茄植株中(图2)。4a).这一结果表明，对番茄植株的RNA-seq分析捕获了之前在拟南芥中检测到的大多数硫酸盐应答基因家族。

对这两个物种共享的生物学功能的过度代表性分析揭示了几个氧化石墨烯术语，如“细胞氧化剂解毒”、“硫酸盐跨膜运输”或“硫利用”，预计在硫酸盐反应中是保守的(表5)5)。有趣的是，我们还发现了显著的富集(调整)p-值< 0.05)，在之前的研究中，硫酸盐饥饿反应(如与细胞壁或细胞分裂素运输相关的反应)的背景下，未对其进行功能分析(表S)5)。另一方面，在拟南芥硫酸盐响应基因的情况下，十字花科的特定氧化石墨烯术语(如GSL生物合成)是最具代表性的生物过程之一。4b和表S5)。这两个物种的同源基因列表之间的交集也检测到硫酸盐反应过程，这只在番茄植物中发现。这组基因中最具代表性的生物过程是“细胞对磷酸盐饥饿的反应”(图2)。4c和表S5)，这表明硫酸盐缺乏也会影响番茄植株内部的磷酸盐水平。具体来说，我们在这个生物过程中发现了52个基因，包括SPX基因(70]，磷酸酶以及编码通过膜脂重塑参与磷酸盐动员的酶的基因，如udp -磺基藜糖合成酶[71，72](图S4)。为了确定这组磷酸盐相关基因对硫酸盐饥饿番茄植株的反应，我们计算了硫酸盐饥饿和对照样品在两种组织中的平均变化倍数，然后进行了分层聚类分析。我们发现60%参与磷酸盐饥饿反应的基因(52个基因中的30个)在播种后3周和4周在硫酸盐饥饿植物的两个组织中表达水平较低(集群3，图S4)，这表明硫酸盐饥饿改变了内部磷酸盐水平。为了解决这一假设，我们在播种后3周测定了两种组织的内部磷酸盐水平。结果如图2所示。4D，表明硫酸盐饥渴植株在两个组织中都表现出显著高于对照植株的磷酸盐水平，叶片中磷酸盐积累量更高。

硫酸盐饥饿改变了番茄根和叶基因表达的时间动态

为了进一步了解硫酸盐饥饿对基因表达的时间模式和相关生物学过程的影响，我们计算了根和叶中每对硫酸盐和时间调控基因的Pearson相关指数。我们使用Dynamic treeccut进行了分层聚类分析[73]，并在根和叶中鉴定出硫酸盐和时间调控基因的6个共表达簇(图2)。5无花果。5b，图S5，图S6)。我们发现大部分基因(60%在根中，72%在叶中)包含在簇1和簇2中(图2)。5a和图。5b).因此我们决定更详细地分析这些群集。

如图所示。5c和图。5d，集群1和集群2在根和叶中的表达谱表现出相似的趋势。集群1中的基因随着时间的推移而受到抑制，在硫酸盐饥饿条件下，mRNA水平在第2周和第3周之间较早地下降。另一方面，在对照条件下，集群2中基因的表达在第3周至第4周之间略有增加，而在硫酸盐饥饿条件下，基因表达在第2周至第3周之间出现了重要的增加(图2)。5c和图。5d)。尽管簇1和簇2中包含的基因在根和叶之间的表达模式相似，但这些硫酸盐反应基因的特性在这些器官之间是不同的(表S6和表S7)。因此，我们在根和叶中发现了与簇1和簇2相关的不同富集生物过程。在根中，簇1富含与生长相关的基因，如“表皮细胞分裂”和“植物型次生细胞壁生物发生”，以及与氧化还原活性相关的过程，如“过氧化氢分解代谢过程”和“细胞氧化剂解毒”(图2)。5c和表S8)。在叶片中，我们发现参与光合作用、微管运动和与细胞分裂相关的几个氧化石墨烯术语(如“有丝分裂细胞周期检查点”或“有丝分裂纺锤体组织”)的基因富集9)。与光合作用相关的氧化石墨烯术语在该簇中尤其丰富，因此我们使用Mapman4注释框架更详细地分析了这些基因在不同初级代谢类别中的分布[74]。在光合作用中，大多数基因参与光反应，其次是卡尔文-本森循环和蔗糖/淀粉代谢(图S7A)。Cluster 1基因还参与初级代谢的其他方面，如氮同化和氨基酸生物合成以及脂肪酸生物合成(图S7A)。当使用Mapman4分析硫酸盐饥饿后叶片中所有差异表达基因时，也得到了类似的结果(图S7B)。另一方面，与光合作用相关的基因在根中表现不足(图S7C)，而其他代谢过程如细胞壁、脂质或氨基酸代谢在根和叶中表现相似(图S7B和图S7C)。在集群2的情况下，与该集群中硫酸盐饥饿引发的基因表达显著诱导一致，我们发现与细胞对S饥饿反应相关的生物过程中涉及的基因过多，例如4月基因(Solyc02g032860, Solyc02g080640和Solyc03g031620);对低硫的响应（路易斯安那州立大学)基因(Solyc03g096760, Solyc03g096770, Solyc03g096780)或硫酸酯转运蛋白(Solyc05g054740, Solyc04g054730, Solyc04g072760, Solyc12g056930)5c和表S8)。叶片中的簇2富含与应激反应和蛋白质磷酸化相关的氧化石墨烯(图2)。5d和表S9)。有趣的是，我们没有发现在叶片的簇2中与s -饥饿相关的过程的过度代表，正如在根中观察到的那样。事实上，参与硫酸盐饥饿反应的经典基因如SULTR，atp, 4月或路易斯安那州立大学属于集群6(图S6)，表明这些基因在发育过程中响应外部S的器官特异性表达。

综上所述，硫酸盐饥饿促进根和叶中大量基因的时间表达模式发生显著变化，其中许多与细胞生长、光合作用和硫酸盐吸收代谢相关的功能有关。此外，根系和叶片间主要基因共表达簇的比较分析表明，番茄植株对硫酸盐饥饿具有器官特异性反应。

番茄硫酸盐饥饿反应相关转录因子的鉴定

我们的研究结果指出，主要的转录组变化发生在番茄的根和叶响应硫酸盐饥饿。如拟南芥所述，其中一些变化可能归因于tf的转录调节。虽然在拟南芥中发现了一些控制硫酸盐反应的TFs [31]，到目前为止，还没有关于硫酸盐反应的TFs及其在番茄硫酸盐饥饿反应中的作用的信息。为了确定控制番茄硫酸盐饥饿反应的关键TFs，我们利用PlantRegMap获得的共表达数据和TFs - dna相互作用的调控信息，构建了根和叶的基因调控网络。75]。

在根的情况下，我们得到了一个由24个tf和172个靶点组成的基因调控网络(图S8和表S)10)。根调控网络的TFs分属于17个不同的家族(表5)11)，其中MYB和bZIP tf是最丰富的家族(分别有4个和3个成员)。同样，我们利用鉴定出的叶片硫酸盐调控基因构建了由45个tf和566个靶点组成的tf靶点网络(图S9和表S)12)。其中，ERF、TCP和WRKY是叶片网络中最丰富的TF家族，分别有7个和5个成员(表5)11)。值得注意的是，叶片调控网络中最丰富的TF家族并不与根网络共享(表5)11)，提示对硫酸盐饥饿的转录反应有器官特异性调控。

接下来，我们重点分析了预测靶基因过度代表生物功能(调整后)的tfp-值< 0.05)，以便将TF调节与功能过程的变化联系起来。如图所示。6a和图。6b，我们在根中发现了3个TFs，在叶片中发现了10个TFs，这些TFs可能控制参与硫酸盐饥饿反应、植物激素生物合成和信号传导、衰老等生物过程的基因。关联度最大的因子是根中的一个MYB TF (Solyc11g071300)和叶中的TCP 21 TF (Solyc03g006800)，分别有40个和71个目标(图2)。6a和图。6b).值得注意的是，MYB靶基因参与S的利用，而TCP21靶基因参与光合作用(图2)。6a和图。6b、表513)。

如上所述，我们的研究结果发现了硫酸盐饥饿反应中基因表达的重要变化，这表明在根和叶中都有不同组的tf参与。然而，我们发现了根和叶基因调控网络共享的一个TF，它在根中被早期诱导，但在叶中有较晚的响应(图2)。6c).该TF是EIL家族的成员，对应于乙烯不敏感的3- like 3 (EIL3, Solyc01g006650)。与拟南芥基因氨基酸同源性最接近的是SLIM1，它是硫酸盐饥饿反应的关键调控因子[23]。此外，氧化石墨烯富集分析表明，鉴定的番茄EIL3 TF可能控制一系列与硫酸盐饥饿相关的基因的表达，包括经典的硫酸盐应答基因，如路易斯安那州立大学s以及编码参与硫酸盐同化还原步骤的酶的基因(表s)14)。此外，我们发现60%的番茄TF靶基因与拟南芥预测的靶基因共享SLIM1,根据PlantRegMap，包括硫酸盐反应基因，如路易斯安那州立大学年代和SDIs(表5)14)。总的来说，我们确定了几个候选TF来介导根和叶中硫酸盐饥饿反应期间发生的转录组重编程，突出了EIL3 TF在番茄中可能的关键调节作用。

番茄植株对硫酸盐饥饿的时间和器官特异性转录组反应

我们目前对植物对硫酸盐有效性的转录组反应的理解主要是基于在模式植物中收集的知识拟南芥［31]。在拟南芥中进行的大多数分析不包含完整的转录组信息，因为它们是使用微阵列技术进行的[31，43]。另一方面，到目前为止，对硫酸盐有效性随时间变化的组织特异性反应的探索很少，大多数研究都是在拟南芥的苗期进行的。此外，虽然转录组学方法已被用于揭示小麦等作物的硫酸盐缺乏反应[39，40，41，42]，目前还没有对番茄硫酸盐缺乏反应的全转录组分析。在这项工作中，我们报告了利用RNA-seq对番茄植株硫酸盐饥饿反应的全面转录组分析，具有时间和器官分辨率。

我们发现硫酸盐饥饿对根和叶的生长有很强的影响，从播种后3周开始。生长抑制伴随着两个器官中基因表达的剧烈变化。对与硫酸盐反应基因相关的富集氧化石墨烯的分析使我们发现了与硫酸盐饥饿改变的植物生长相关的几个生物过程。迄今为止，一些研究已经证明，植物通过诱导高亲和力硫酸盐转运蛋白的表达来激活硫酸盐的吸收，以应对硫酸盐饥饿[15]。此外，已经确定植物在硫酸盐饥饿期间激活硫酸盐同化途径并降解谷胱甘肽和其他S化合物(如GSLs) [15]。正如预期的那样，参与硫酸盐运输和代谢的基因根据外部硫酸盐的可用性在番茄植株中进行差异表达，随着时间的推移，在硫酸盐饥饿的反应中被诱导。具体来说，我们鉴定了12个硫酸盐转运蛋白基因，3个atp和34月至少在一个样品中，硫酸盐饥饿显著调控的基因(q值< 0.05,log2FC > 1)15)。

我们的表达分析还发现了几个参与细胞壁生物合成和修饰的基因，这些基因的表达被硫酸盐剥夺改变。众所周知，细胞壁是植物生物量积累和细胞扩增的重要组成部分，两者是维持植物生长的互补过程[76]。然而，营养供应如何调节细胞壁的生物合成和组织仍然知之甚少[77]。在这项工作中，我们发现6的表达式XET在硫酸盐缺乏的植物中，基因随着时间的推移而减少(集群1，表S)6)。XET基因编码的酶具有松弛细胞壁的能力，影响细胞的扩增和生长[78]。因此，抑制XET硫酸盐饥饿基因可以部分解释所观察到的表型。因此，XET敲除突变体减少了细胞大小[79，80，81，82]，过表达或外源性应用XET蛋白会降低细胞扩增[83，表明对…的调控XET硫酸盐饥饿基因可能部分解释了所观察到的表型。

我们的表达分析还揭示了与生长抑制表型相关的器官特异性反应的显著水平。硫酸盐饥饿导致叶片中与光合作用相关的基因转录水平大幅下降，包括与光和碳反应相关的基因。考虑到众所周知的植物生长和光合作用之间的关系[84]，光合作用基因的低表达可能转化为生长下降，正如我们在硫酸盐饥饿的情况下观察到的那样。有趣的是，硫酸盐饥饿对其他光合生物(如微藻)的光合作用和生长也有类似的抑制作用杜氏［85),衣藻reinhardtii［86]，这表明硫酸盐饥饿对光合基因的调节可能在光合生物中是保守的。

磷酸盐水平受硫酸盐饥饿的调控

为了确定番茄植株对硫酸盐饥饿反应中的新的和特定的生物过程，我们将本研究中硫酸盐有效性调控的同源基因群与先前在拟南芥中报道的基因群交叉。43]。值得注意的是，番茄中70%的拟南芥硫酸盐响应同源基因也受到该营养素的调节(图2)。4a)表明拟南芥和番茄对硫酸盐的保守反应。另一方面，我们还在番茄植株中发现了一组完全由硫酸盐调控的同源基因，这些基因显示了过度代表的生物过程，包括“细胞对磷酸盐饥饿的反应”、“光呼吸”、“光系统中的光合电子传递”、“鸟氨酸代谢过程”、“蔗糖代谢过程”等(图2)。4c和表S5)，提示其他机制可能参与了番茄硫酸盐饥饿反应。

值得注意的是，硫酸盐在番茄植株中调控的同源基因中代表性最高的生物学过程是“细胞对磷酸盐饥饿的反应”，这表明硫酸盐缺乏影响了番茄植株内部的磷酸盐水平。与此结果一致的是，磷酸盐含量分析显示，在两个器官中缺乏硫酸盐的植物中，这种营养物质增加了。硫酸盐饥饿对拟南芥的磷酸盐水平也有类似的改变[10，11]，植物对缺硫的反应显示游离磷酸盐增加了3倍。磷酸盐水平的增加不是由于缺乏钾或铁等其他营养物质引起的[10]，表明硫酸盐和磷酸盐的体内平衡有特定的相互作用。

内部磷酸盐水平的增加可以通过硫酸盐饥饿期间磷酸盐运输的激活来实现，正如先前在拟南芥中所证明的那样[11]。虽然我们发现硫酸盐缺乏植物的两个器官中磷酸盐含量较高，但磷酸盐积累在叶片中较高，这表明磷酸盐从根到叶的转运增加。在拟南芥中，磷酸盐从根到茎的运输是由PHO1转运体介导的[87]，其表达在转录和翻译后水平受磷酸盐饥饿控制[9]。PHO1和PHT1;9是磷酸转运蛋白PHT1家族的成员，参与拟南芥硫酸盐饥饿过程中磷酸盐从根向芽转运的增加[11]。我们发现PHO1和PHT1基因家族的几个成员(Solyc02g088220, Solyc09g066410和Solyc09g090080;图S10)是由硫酸盐饥饿诱导的，表明硫酸盐饥饿促进了番茄从根到叶的磷酸盐运输。这些结果与之前在马铃薯和番茄中的研究一致，表明磷酸盐转运体StPT2和LePT1的转录水平在硫酸盐饥饿下增加[88，89]。

在拟南芥中，转录水平主要是磷酸摄取转运蛋白(PHT1;1, PHT1;2，和PHT1),PHO1基因不受硫酸盐饥饿的影响[11]，这表明硫酸盐饥饿条件下拟南芥和番茄对磷酸盐分配的控制机制存在显著差异。磷酸盐水平升高对硫酸盐饥饿反应的生物学作用尚不完全清楚。据报道，在硫酸盐饥饿的早期，磷脂会迅速取代亚脂[90]。这种对磷酸盐需求的增加可能需要在硫酸盐饥饿反应的后期加强对这种营养物质的获取。最近对拟南芥的研究表明，在培养基中重新添加硫酸盐可以恢复芽和木质部汁液中的磷酸盐水平[11]，表明硫酸盐和磷酸盐水平之间存在直接关系。然而，需要进一步的研究来解开硫酸盐和磷酸盐饥饿之间复杂的串扰。

番茄植株硫酸盐饥饿反应关键TFs的鉴定

整合基因表达数据和调控tf靶点数据的基因调控网络分析使我们能够确定在番茄植株发育早期参与硫酸盐饥饿反应的候选tf。在这两种组织中受硫酸盐饥饿调节的TFs中，我们发现了一个EIL家族的成员，其最接近的拟南芥同源物是SLIM1，这是硫酸盐饥饿反应的关键调节因子[23]。转录组分析slim1与WT植物相比，突变体硫酸盐转运体的上调程度较低，GSL基因的下调程度较低[23]。此外，在硫酸盐饥饿条件下，植物生长需要SLIM1 [23]。值得注意的是，据报道，来自水稻的SLIM1同源物补充了该基因slim1来自拟南芥的突变体，表明这组EIL TFs在控制硫酸盐饥饿反应中的功能保护[23]。我们的网络分析强调了这一点EIL3可能控制一组参与硫酸盐运输和代谢的重要基因，如拟南芥SLIM1(表5)14)。具体来说，我们发现60%的番茄预测目标EIL3也被称为SLIM1。

有趣的是,SLIM1转录物及其亚细胞定位不受硫酸盐缺乏的控制[23]，但最近的一项研究表明，SLIM1可以与E3泛素连接酶相互作用，提示SLIM1的泛素化和蛋白质降解可能在S代谢中控制SLIM1的功能[91]。相比之下，我们发现番茄的转录水平EIL3由于硫酸盐饥饿，番茄根系和叶片中的含量急剧增加。然而，我们不能排除硫酸盐饥饿也可能在翻译后水平上控制EIL3的功能。因此，需要进一步的工作来评估EIL3在番茄植株硫酸盐反应中的作用。

除了EIL3，我们的分析还发现Myb TF (Solyc11g071300)是根调控网络中连接最紧密的TF。根据其靶基因的功能分析，鉴定到的Myb TF可能参与控制细胞分裂，这是植物生长的重要生物学过程。与此一致的是，拟南芥同源物MYB3R-1和MYB3R-4作为调控细胞分裂的转录激活因子[92]。事实上，在双突变的拟南芥植物中，来自G2/ m特异性类的基因中有53.3%被下调。此外，研究发现，这两种MYB3R4 TFs在体外均与G2/M期特异性基因常见的顺式元件MSA基序结合[93]。这些数据表明，在硫酸盐饥饿条件下，MYB TFs可能在控制细胞分裂中起重要作用。

另一方面，叶子调节网络中连接最多的TF是TCP21 (Solyc03g006800)。根据其靶基因的GO富集分析，该TF与光合作用有关，光合作用是营养生长必需的代谢过程。有趣的是，拟南芥中的几个TCP TFs已被证明可以调节叶片的生长和发育[94]。拟南芥中番茄TCP最接近的同源基因是TCP19，该基因与TCP20以冗余方式参与控制叶片衰老[95]。我们的转录组学分析表明，鉴定的番茄TCP在硫酸盐饥饿期间在叶片中与光合作用相关的基因的表达减少，导致植物生长的强烈减少。因此，tps可能在硫酸盐饥饿期间对番茄叶片生长有重要的控制作用。

总之，我们的研究结果揭示了硫酸盐饥饿在番茄根和叶中引发的广泛转录组重编程，并强调了MYB、TCP和EIL3等tf在协调这一复杂反应中的作用。我们希望这项工作可以为进一步研究特定基因和过程的作用奠定基础，从而进一步了解番茄和其他作物硫酸盐饥饿反应的调控机制。

植物材料和生长条件

种子茄属植物lycopersicum‘Moneymaker’品种(从智利semilia市售)在0.5X Murashige和Skoog (MS)盐中培养4周[96[pH 5.7]，使用岩棉作为支撑材料。这种液体培养基每周更换两次，以保持恒定的营养浓度。对于在硫酸盐饥饿条件下生长的植物，MS培养基中含有的硫酸盐盐被等效的氯盐取代[97]。番茄植株在受控生长箱(Bioref-19, Pitec, Chile)中培养，LED灯(200 μmol m)⁻²年代⁻¹)，在22°C下，16-h光照/8-h黑暗循环。3个独立试验，每个重复使用3 ~ 5个不同的植株。

植物生长量化

为了确定生长相关参数，使用爱普生perfect V600照片扫描仪扫描叶片和根。利用ImageJ软件(v1.52)从扫描图像中确定总叶面积和主根长度(https://imagej.nih.gov/ij/)。用分析天平测定根和叶的总鲜重。

文库建设及RNA-Seq数据分析

播种后2周、3周和4周，将叶和根样品冷冻在液氮中，使用mirVana miRNA分离试剂盒(Invitrogen)分离RNA，按照制造商的总RNA分离说明进行分离。提取液采用柱上DNase I (TURBO DNase, Invitrogen)处理。使用TruSeq strand mRNA Library Prep kit (Illumina)，使用1微克DNase i处理过的RNA生成富集poly- a的测序文库。文库在NextSeq500系统(Illumina)上测序为75-nt单端reads。

使用FastQC 0.11.5版本对测序读数进行质量检查。考虑到测序reads的高质量，我们跳过了修剪过程，以避免任何潜在的偏差，如前所述[98]。为了量化注释基因的mRNA水平，测序reads与公开可用的伪对齐茄属植物lycopersicum转录组使用kallisto (v0.44) [64]。kallisto的转录本索引由番茄注释版ITAG3.2 (https://solgenomics.net/organism/Solanum_lycopersicum/genome)，其中包括35,768个cdna。平均而言，每个样本有3000万reads，其中2700万reads(90%)与番茄转录组伪对齐。估计的读取计数和计算的转录本每百万(TPM)被用于差异表达分析[66]。采用sleuth中实施的似然比检验(LRT) (v.0.30.0)对硫酸盐饥饿反应在各个时间和器官中的差异表达进行分析[66]，有三个独立的重复。我们通过设置任意q值阈值0.05和绝对对数来定义差异基因表达₂折叠变化(FC) > 1。

我们使用R包探针(v.0.30.0)执行了一个多变量线性模型来测试给定基因的表达是否可以用硫酸盐的可用性、时间或这两个因素的相互作用来解释[66]。为了确定每个因子的显著调控基因，我们还采用了q值阈值0.05和绝对对数₂每个因子至少有一个水平的FC > 1。使用R软件包dynamicTreeCut (v.1.63-1)对每个因子相关的基因共表达簇进行鉴定[73]，这是一种自动识别基因共表达簇的分层聚类方法。使用pcaExplorer (v.2.14.0)对表达数据进行主成分分析(PCA) [65]。

基因本体富集分析

使用BiNGO (v.3.0.3)进行基因本体(GO)富集分析[99)与茄属植物lycopersicum从PLAZA 4.0获得GO注释[68]。benjamin和Hochberg错误发现率(FDR)校正(< 0.05)应用于在使用BiNGO进行超几何检验后在各自基因集中获得的过度代表的GO项。我们过滤掉注释基因少于三个的GO术语，只使用与生物过程相关的GO术语。为了减少GO项之间的冗余，我们在BiNGO得到的分层GO树中选择了级别较高的被过度表示的GO项。

比较转录组学分析

为了确定拟南芥和番茄之间共有的硫酸盐饥饿响应基因，我们使用了同源数据库PLAZA 4.0 [68]为两个物种的基因分配一个共同的识别代码(同源基因家族ID)。我们使用VennPainter软件将这两个列表相交[One hundred.]来鉴定保守的和物种特异性的硫酸盐反应基因家族。拟南芥硫酸盐响应基因组是我们小组在最近的转录组荟萃分析中获得的[43]。以番茄为例，考虑到根或叶中硫酸盐因子或硫酸盐与时间的相互作用显著调控的基因(q值阈值为0.05，绝对值为对数)，从本工作进行的RNA-seq分析中获得了硫酸盐响应基因集₂fc > 1)。

基因调控网络分析

我们根据以下标准构建了每个器官的基因调控网络:首先，我们只纳入了硫酸盐或硫酸盐与时间因素相互作用(q值< 0.05，绝对对数)显著调控的基因₂fc > 1)。其次，根据PlantRegMap，我们只考虑有TF-target相互作用证据的基因[75以便预测直接的规章制度。第三，具有TF-target相互作用的基因对必须具有大于0.9的Pearson相关，才能获得tf与其靶基因之间相似的表达谱。通过这种方式，我们关注了tf及其靶点对硫酸盐饥饿的连贯时间反应。使用R包rsgcc (v.1.0.6)从每个组织中获得的RNA-seq数据确定Pearson相关性[101]。

使用Cytoscape 3.7对基因调控网络进行可视化和分析[102]。候选tf的选择考虑了它们的连通性和其靶基因的GO术语。

实时定量PCR (qPCR)

对于qPCR分析，按照制造商的说明，使用5X All-In-One RT MasterMix(加拿大应用生物材料公司)从500 ng总RNA中生成cDNA。采用PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems™)，在CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)中使用25 ng cDNA进行qPCR反应。使用Real-time PCR Miner 4.0软件分析原始荧光数据[103]来获得周期阈值和基因扩增效率。每个目标基因的表达均通过Actin-7基因(Solyc11g005330)归一化，通过RNA-seq分析，该基因在所有样品中显示稳定的mRNA水平。本研究使用的qPCR引物序列如表5所示16。

硫酸盐和磷酸盐含量分析

用Tabatabai和Bremner描述的浊度法定量硫酸盐含量[69，104]。根据制造商的建议，使用Malaquite绿色磷酸盐测定试剂盒(Sigma-Aldrich，目录号MAK307)测定磷酸盐含量。

在本研究中生成和分析的RNA-Seq数据集可在NCBI序列读取档案(SRA)存储库中获得，登录PRJNA629977，可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA629977。本研究过程中产生的所有其他数据都包含在这篇发表的文章及其补充信息文件中。

史:

硫

PAPS:

3 -phosphosulfate -phosphoadenosine 5

SULTRs:

高亲和力硫酸盐转运体

TFs:

转录因子

EIL3:

ETHYLENE-INSENSITIVE-LIKE3

SLIM1:

限硫标准1

gsl:

硫配糖体

SD1:

缺硫1

HY5:

长下胚轴5

MSA1:

更多的硫积累1

女士:

Murashige和Skoog盐

轻轨交通:

似然比检验

TPM:

每百万份转录本

舰队指挥官:

褶皱变化

走:

基因本体论

罗斯福:

错误发现率

qPCR:

实时定量PCR

方差分析:

方差分析

主成分分析:

主成分分析

xyloglucan endotransglucosylase /水解酶:

XET

路易斯安那州立大学:

对低硫的响应

EIL3:

乙烯不敏感的3-Like3

我们感谢来自iBio大学基因组学和生物信息学中心的jos Miguel Álvarez博士对本文的批判性阅读和有益的评论。我们要感谢西班牙Investigación国家局的“Severo Ochoa卓越研发中心计划”(授予SEV-2016-0672;2017-2021)，以支持本工作中使用的科学服务。

本工作得到了千年综合生物学研究所- iBio (Iniciativa Científica Milenio -ANID to E.A.V和J.C)， Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico FONDECYT 1170926 to E.A.V, FONDECYT 1190812和FONDECYT 1170913 to J.C, FONDECYT 3180269 to c.h, PCI-ANID REDES180097 to E.A.V, PCI-ANID REDI170024 to J.C和J.M，国家农业和食品研究与技术研究所(INIA) (RTA2015-00014-c02-01 to J.M)的资助，UE Prima (PCI2019-103610 to J.M)。这些资助机构没有参与研究的设计、数据的收集、分析、解释和撰写手稿。

从属关系

1. 智利南方大学科学学院Bioquímica y Microbiología研究所，瓦尔迪维亚，智利

   哈维尔·卡纳莱斯，费利佩·乌里韦，卡洛斯Henríquez-Valencia和卡洛斯·洛瓦扎诺

2. 千年综合生物学研究所，圣地亚哥，智利

   哈维尔·卡纳莱斯、费利佩·乌里韦、卡洛斯·Henríquez-Valencia、卡洛斯·洛瓦扎诺和埃琳娜·维达尔

3. Biotecnología y Genómica植物中心(CBGP)， Investigación y Tecnología国家农业和食品研究所(INIA)，马德里politcnica大学(UPM)，西班牙马德里

   杰昆·梅迪纳

4. 智利圣地亚哥市长大学科学学院Genómica y Bioinformática中心

   埃琳娜·维达尔

5. Escuela de Biotecnología，圣地亚哥市长大学科学学院

   埃琳娜·维达尔

贡献

J.C, j.m和E.A.V.构思了这项研究。j.c.， E.A.V, F.U, C.H.和C.L.进行了研究和数据分析。j.c, J.M和E.A.V写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到哈维尔-卡纳莱斯或埃琳娜·维达尔。

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

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