OsCAF2包含两个CRM域，是水稻叶绿体发育所必需的gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

叶绿体在植物的生长发育中起着重要的作用。叶绿体基因组包含大约20个II组内含子，这些内含子是由于核基因编码的蛋白质而剪接的。在玉米和玉米中，CAF2是剪接IIB组内含子的剪接因子之一gydF4y2Ba拟南芥。gydF4y2Ba然而，研究gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba水稻中的基因很少，而且gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba叶绿体发育的基因没有很好的特征。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在这项研究中，gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba通过编辑来获得突变体gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba基因的gydF4y2Banipponbare.gydF4y2Ba各种米饭。表型分析表明突变到gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba在最终导致植物死亡的播种阶段导致白果叶片，gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba突变体植株叶绿体较少，叶绿体结构受损。我们推测gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba可能参与IIA组和IIB组内含子的剪接，这与它的直系同源基因不同gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba和玉米。通过酵母双杂化实验，发现OSCAF2的C末端区域与OSCRS2相互作用并形成了OSCAF2-OSCRS2复合物。另外，oscAF2的N-末端区域与本身相互作用以形成同偶二聚体。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

在一起，这项研究改善了我们对OSCAF2蛋白的理解，并揭示了有关osomAF2在水稻中叶绿体发育的分子机制的额外信息。gydF4y2Ba

叶绿体是植物生长和发育的必要细胞器，因为它们通过CO的固定生成碳水化合物gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]. 叶绿体来源于原生质体，是半自治的细胞器[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]. 叶绿体基因组很小，编码大约100种蛋白质，主要负责光合作用、碳代谢和脂肪酸合成[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．许多研究表明，塑体编码的聚合酶（PEPS）和核编码聚合酶（Neps）在调节叶绿体发育中起关键作用。这些研究表明，叶绿体基因的表达需要核基因组编码的蛋白质[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]. 这些蛋白质参与叶绿体相关基因的转录和转录后修饰，如叶绿体DNA复制、RNA转录、RNA编辑、RNA稳定性和RNA剪接[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

RNA剪接过程是通过从前体信使mRNA（前体mRNA）中移除内含子来连接相邻的外显子[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]. 在里面plants, the introns of chloroplast genes are divided into two groups, known as group I and group II introns, based on their conserved primary and secondary structures, as well as the splicing mechanism of RNA splicing. Group II introns are further divided into two subgroups, subgroup IIA and subgroup IIB [7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]. 以前的研究表明，叶绿体基因的I组和II组内含子已经失去了自动催化剪接的能力，这些基因的内含子也失去了RNA催化中心所必需的元素[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．叶绿体RNA剪接需要募集由核基因编码的蛋白质。这些蛋白质充当叶绿体RNA剪接反应至关重要的剪接因子[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]. 在里面gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，叶绿体基因组包含20个II组内含子和1个I组内含子。在玉米和水稻中，叶绿体基因组由17个II组内含子和1个I组内含子组成[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．据报道，许多核基因编码蛋白质，该蛋白质充当剪接因子，这些因子涉及调节叶绿体RNA剪接。例如，戊庚二肽重复（PPR）蛋白和叶绿体RNA剪接和核糖体成熟（CRM）结构域蛋白涉及叶绿体基因内含子的调节[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

以前的研究也表明，许多PPR蛋白参与了不同植物物种II组内含子的剪接[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]. 例如，在玉米中，ZMPR4和ZMPR5促进基因的内含子剪接gydF4y2BaRPS12.gydF4y2Ba和gydF4y2BatrnggydF4y2Ba在叶绿体中[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]. 在里面gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba， AtOTP70和AtOTP51是内含子剪接所必需的gydF4y2BarpoC1gydF4y2Ba和gydF4y2Baycf3-2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]. 在里面rice, WSL4 and PGL12 participate in intron splicing ofrpl2gydF4y2Ba和gydF4y2BandhAgydF4y2Ba分别[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]. 在里面一个ctivation of the PPR proteins involved in chloroplast intron splicing leads to abnormal chloroplast development, with leaves showing chlorosis or albino seedling phenotypes [20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

除PPR蛋白外，一些含有CRM结构域的蛋白作为剪接因子调控叶绿体内含子的剪接。有报道称，含CRM结构域的蛋白质影响叶绿体的发育gydF4y2Ba答:芥,gydF4y2Ba玉米和大米[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．第一个CRM基因，gydF4y2BaCRS1gydF4y2Ba，并在玉米中克隆。ZmCRS1含有三个CRM结构域，这些结构域在体外具有较高的亲和力和特异性gydF4y2BaatpFgydF4y2Ba内含子，他们参与内含子剪接gydF4y2BaatpFgydF4y2Ba［gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]. ZmCAF1和ZmCAF2包含两个CRM结构域，每个结构域都可以与ZmCRS2相互作用，形成ZmCAF1-ZmCRS2和ZmCAF2-ZmCRS2复合物[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．ZMCAF1-ZMCRS2复杂是拼接子组IIB内含子的剪接，包括gydF4y2Barpl16gydF4y2Ba，gydF4y2BaRPS16gydF4y2Ba，gydF4y2BatrnggydF4y2Ba，gydF4y2Ba宠物gydF4y2Ba， 和gydF4y2Baycf3gydF4y2Ba［gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]. 在里面gydF4y2Ba答:芥,gydF4y2BaAtCAF1-AtCRS2复合物也促进了基因的剪接gydF4y2BarpoC1gydF4y2Ba和gydF4y2BaClpPgydF4y2Ba玉米叶绿体基因组中缺失的内含子[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．此外，早期的研究表明，ZMCAF2的C末端区域可以与ZMCRS2相互作用以形成ZMCAF2-ZMCRS2复合物，其需要从基因中拼接五个亚组IIB内含子gydF4y2BandhAgydF4y2Ba，gydF4y2BandhBgydF4y2Ba，gydF4y2BaRPS12.gydF4y2Ba，gydF4y2BapetBgydF4y2Ba， 和gydF4y2Baycf3gydF4y2Ba［gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．CFM2有四个CRM域。在玉米中，ZMCFM2需要拼接gydF4y2BaTRNL.gydF4y2Ba，gydF4y2BandhAgydF4y2Ba， 和gydF4y2Baycf3gydF4y2Ba内含子[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]. 在里面gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba，ATCFM2可以拼接gydF4y2BaTRNL.gydF4y2Ba，gydF4y2BandhAgydF4y2Ba， 和gydF4y2Baycf3gydF4y2Ba内含子，它影响剪接gydF4y2BaclpPgydF4y2Ba玉米叶绿体基因组中缺失的内含子[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．不同于其他蛋白的CRM结构域，CFM3包含三个CRM结构域，位于叶绿体和线粒体中。在gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba， AtCFM3a是拼接所必需的gydF4y2BandhBgydF4y2Ba内含子[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]. 在水稻中，已经鉴定出14种含有一个或多个CRM结构域的蛋白质[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．这gydF4y2Baoscfm3gydF4y2Ba突变体在幼苗中引起了叶绿体发育异常的白化表型。OsCFM3促进叶绿体基因的剪接gydF4y2BandhBgydF4y2Ba，gydF4y2Ba宠物gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaRPS16gydF4y2Ba［gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．之前的研究表明gydF4y2BaAL2gydF4y2Ba编码对ATCRS1和ZMCRS1同源的OSCRS1，并包含三个CRM域。但是，OSCRS1促进了I组的剪接（gydF4y2BaTRNL.gydF4y2Ba)和第二组内含子(gydF4y2BaatpFgydF4y2Ba，gydF4y2Barpl2gydF4y2Ba，gydF4y2BandhAgydF4y2Ba，gydF4y2BandhBgydF4y2Ba，gydF4y2Ba宠物gydF4y2Ba， 和gydF4y2Baycf3gydF4y2Ba）与同源蛋白质ATCRS1和ZMCRS1不同[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]. 据报道，OsCAF1包含两个CRM结构域，可通过其C末端区域与OsCRS2相互作用，并在水稻中形成OsCAF1-OsCRS2复合物。OsCAF1定位于叶绿体并影响IIA亚群和IIB亚群内含子的剪接[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]. 含有CRM结构域的其他蛋白质在水稻中的功能尚未被广泛研究。gydF4y2Ba

在这项研究中，我们生成了一个gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba利用CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)基因编辑系统，研究了OsCAF2在水稻叶绿体发育中的作用。我们的研究结果表明gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba导致叶片异常叶绿体发育和幼苗中的白化表型。叶绿体基因内含子剪接分析表明，散发胞胎亚群IIA和亚组IIB内含子的剪接促进了叶绿体发育。与ZMCAF2-ZMCRS2复合物类似，OSCAF2的C末端区域与OSCRS2相互作用并形成OSCAF2-OSCRS2复合物。有趣的是，OSCAF2还可以通过其N-末端区域与其自身相互作用，以形成调节水稻中叶绿体发育的二聚体。这些结果证明了Oscaf2在水稻叶绿体发育中的分子机制。gydF4y2Ba

OsCAF2功能的破坏导致白化表型gydF4y2Ba

根据以前的研究，基因同源gydF4y2BaZMCAF2.gydF4y2Ba和gydF4y2BaAtCAF2gydF4y2Ba来自玉米和玉米gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba从水稻基因组中鉴定并命名为gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba（gydF4y2BaLOC_Os01g21990gydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．这gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba包含6个外显子，总编码区为1824 bp，编码608个氨基酸。OsCAF2包含两个CRM域，但功能未知。为了研究OsCAF2的功能，我们构建了gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba基因编辑载体，包括在外显子1（两个CRM域的上游）和外显子3（第一CRM域）中的两个目标SGRNA，并将其转化为gydF4y2Banipponbare.gydF4y2Ba通过这一点gydF4y2Ba农杆菌gydF4y2Ba方法（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa-b）。在TgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba第三代，我们获得了15株植物。通过PCR扩增和测序gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba我们筛选了一个纯合突变体和一个杂合子植株，命名为gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba和gydF4y2Baoscaf2 / oscaf2，gydF4y2Ba分别(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2BaC）。一个或两个碱基插入的突变类型导致OSCAF2翻译的过早终止。表型观察表明gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba突变体表现为白化苗表型，在三叶期死亡，但杂合子不明显gydF4y2Baoscaf2 / oscaf2.gydF4y2Ba叶片呈绿色，生长正常(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad).为了研究OsCAF2的功能，我们得到gydF4y2Baoscaf2gydF4y2BaTgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba一代的gydF4y2Baoscaf2 / oscaf2.gydF4y2Ba杂合子植物（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一种）。这gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba突变体的gydF4y2Baoscaf2 / oscaf2.gydF4y2Ba杂合子植株也以白化的形式出现，然后在三叶期死亡。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).与野生型(WT)相比，其中的Chl a、Chl b、car和Chl含量gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba突变体叶片显著减少，几乎没有car和Chl b(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab） 。这些结果表明gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba对于叶绿体的发展是必要的，并且这种突变gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba导致幼苗中的白化表型。gydF4y2Ba

叶绿体发育的表达分析和光合作用相关基因gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba突变体gydF4y2Ba

进一步分析叶绿体发育受损对细胞的影响gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba突变体，测定叶绿体发育和光合作用相关基因的表达水平。pep和NEPs受叶绿体编码基因的转录调控，负责叶绿体的发育。NEP成分基因的表达水平gydF4y2Baosrpotp.gydF4y2Ba在里面gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba与野生型相比，突变型是正常的（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac).然而，除了基因gydF4y2BarpoAgydF4y2Ba，PEP组分基因的表达水平显著增加，包括gydF4y2BarpoBgydF4y2Ba，gydF4y2BarpoC1gydF4y2Ba， 和gydF4y2BarpoC2gydF4y2Ba， 在里面gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba突变体相对于wt（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac） 。相反，光合作用相关基因的表达涉及gydF4y2Ba红细胞表面gydF4y2Ba，gydF4y2Ba:gydF4y2Ba，gydF4y2Ba赫马gydF4y2Ba，gydF4y2Bachli.gydF4y2Ba，gydF4y2BapsbOgydF4y2Ba，gydF4y2Ba海姆gydF4y2Ba，gydF4y2BapsbAgydF4y2Ba， 和gydF4y2BaChlm.gydF4y2Ba大大减少了gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba突变体（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac).这些结果提示OsCAF2可能影响叶绿体发育和光合作用相关基因的表达水平。gydF4y2Ba

叶绿体发育缺陷gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba突变体gydF4y2Ba

为进一步研究白化叶片的表型gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba突变株，观察了野生型和野生型叶片叶绿体的超微结构gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba用透射电镜(TEM)观察苗期的生长情况。我们的结果表明，在WT叶片中发现完整的叶绿体结构和正常的基粒堆叠(图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaD-E），以及异常叶绿体结构和杂交的甘蓝板层叠堆gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba突变体（图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaF-G）。这些数据表明突变到gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba水稻叶绿体发育受损。这些结果也表明OsCAF2是叶绿体发育所必需的。gydF4y2Ba

OsCAF2影响II组内含子的剪接gydF4y2Ba

在gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba和玉米，Caf2促进了叶绿体RNA组IIB内含子的剪接[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．因此，我们研究了OsCAF2是否参与了水稻叶绿体RNA内含子剪接。水稻叶绿体基因组包含17个II组内含子和1个I组内含子。我们利用RT-PCR扩增了含有至少一个内含子的叶绿体基因，并比较了WT和WT的内含子剪接效率gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba变种人。我们发现IIA亚组内含子的异常内含子剪接(gydF4y2Barpl2gydF4y2Ba，gydF4y2BaRPS12.gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaatpFgydF4y2Ba)和亚组IIB内含子(gydF4y2BandhAgydF4y2Ba，gydF4y2BandhBgydF4y2Ba， 和gydF4y2Baycf3gydF4y2Ba） 在里面gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba突变体，与WTs相比（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）gydF4y2Ba．gydF4y2Ba然而，内含子的剪接gydF4y2BaTRNL.gydF4y2Ba（I组）在试验中未受影响gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba突变体（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．这些结果提示OsCAF2可能参与了IIA亚组和IIB亚组内含子的剪接，而不参与I组内含子的剪接。gydF4y2Ba

OsCAF2的表达模式和亚细胞定位gydF4y2Ba

根据水稻的基因表达和蛋白质工具(gydF4y2Bahttp://www.bar.utoronto.ca/efprice/cgi-bin/efpWeb.cgigydF4y2Ba),gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba在叶子中高度表达，但在尖峰和根系中发现了低或无法检测的水平。要验证结果，我们分析了表达式模式gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba在小麦抽穗期的不同组织中gydF4y2Banipponbare.gydF4y2Ba使用中存在。与根相比，其他组织的表达量显著增加，叶片中的基因表达量甚至超过1000倍(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一种）。我们的结果表明gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba绿色组织中表达量最高，特别是叶片。gydF4y2Ba

狼Psort（gydF4y2Bahttps://wolfpsort.hgc.jp/gydF4y2Ba)网站预测OsCAF2定位于水稻叶绿体。为了确定OsCAF2的亚细胞定位，我们构建了OsCAF2-GFP融合载体并将其转化到水稻原生质体中。p580空载体用作对照。结果表明，空载体在细胞核、膜和细胞质中有绿色荧光信号，但OsCAF2 GFP融合蛋白产生的信号与叶绿体自体荧光信号共定位，表明OsCAF2定位于叶绿体（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab,无花果。SgydF4y2Ba2gydF4y2Ba). 这一结果支持了OsCAF2在调节叶绿体发育中起重要作用的观点。gydF4y2Ba

OsCAF2的C末端区域与OsCRS2相互作用gydF4y2Ba

以前的研究表明，CAF2的N-末端区域与CRS2相互作用并在玉米中形成CAF2-CRS2复合物[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]. 为了证实水稻中CAF2和CRS2之间的关系，我们获得了水稻中CAF2的编码序列（CDS）gydF4y2BaOSCRS2gydF4y2Ba（gydF4y2BaLOC_Os01g04130gydF4y2Ba)从水稻叶片中构建用于酵母双杂交（Y2H）分析的OsCRS2-PGADT7（OsCRS2-AD）和OsCAF2-PGBKT7（OsCAF2-BD）载体。含有OsCRS2 AD和空BD载体或OsCAF2 BD和空AD载体的AH109酵母细胞能够在缺乏Leu和Trp（SD-T/L）的合成葡萄糖培养基上生长，但它们不能在缺乏Leu、Trp、His和Ade（SD-L/T/H/A）的培养基上生长。然而，含有OsCRS2 AD和OsCAF2 BD、OsCRS2 BD和OsCAF2 AD的AH109酵母细胞能够在SD-T/L和SD-L/T/H/A中生长（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba无花果。SgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．这些结果表明，OSCAF2可以与OSCRS2相互作用以在水稻中形成OSCAF2-OSCRS2复合物。然后，我们将OSCAF2蛋白截断为三个部分，命名为OSCAF2-N（N-末端），OSCAF2-M（中间）和OSCAF2-C（C末端）并重复Y2H实验（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).其中OsCAF2-M包含两个CRM域。OsCAF2-C与OsCRS2相互作用，而OsCAF2-N和OsCAF2-M不相互作用(图)。gydF4y2Ba5gydF4y2BaC，图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．这些结果表明，OSCAF2的C末端是与OSCRS2相互作用所必需的。gydF4y2Ba

OsCAF2通过N端区域形成同型二聚体gydF4y2Ba

为了研究oscaf2是否可以形成同态二聚体，我们进行了Y2H分析。简而言之，我们构建了oscaF2-AD和OSCAF2-BD载体，然后将它们与AH109酵母细胞共转换成。Y2H结果表明，OSCAF2可以自相互作用和形成同态二聚体（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba无花果。SgydF4y2Ba4gydF4y2Ba). 我们将OsCAF2分为上述三个部分，以进一步分析哪一部分负责形成均聚体。只有OsCAF2的N端区域能够与自身相互作用，但它不能与OsCAF2的M端或C端区域相互作用（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab,无花果。SgydF4y2Ba4gydF4y2Ba). 因此，OsCAF2的N端是形成同型二聚体所必需的。gydF4y2Ba

OSCAF2蛋白质具有两种具有同源性与ATCAF2和ZMCAF2的CRM结构域。我们的表型结果gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba突变株与白化突变株一致gydF4y2Baatcaf2gydF4y2Ba在里面gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba，由T-DNA插入获得[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]. 因此，我们怀疑CAF2的功能在细胞中可能是高度保守的gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba和米饭。在米饭，gydF4y2BaAL2gydF4y2Ba，gydF4y2Baoscaf1.gydF4y2Ba， 和gydF4y2Ba立方英尺gydF4y2Ba编码蛋白质包含CRM结构域，并且gydF4y2Baal2gydF4y2Ba，gydF4y2Baoscaf1gydF4y2Ba， 和gydF4y2Baoscfm3gydF4y2Ba突变体表现出白化叶片表型，叶绿体结构被破坏[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．研究表明，有14种蛋白质含有一个或多个CRM结构域，其中4种蛋白质含有两个CRM结构域[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．作为白血病表型gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba在突变体中，我们推测OsCAF2的功能与其他3个含有两个CRM结构域的蛋白不存在冗余。这些结果表明，CRM结构域蛋白在水稻叶绿体发育中起关键作用。gydF4y2Ba

据报道，CAF2是一种剪接因子，由参与基因内含子剪接的核基因编码gydF4y2BapetBgydF4y2Ba，gydF4y2BaRPS12.gydF4y2Ba，gydF4y2BandhAgydF4y2Ba， 和gydF4y2Baycf3gydF4y2Ba在玉米和gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．这表明Caf2调节叶绿体发育的分子机制在玉米和gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba．在这项研究中，通过分析叶绿体基因的内含子剪接，我们发现oscaF2促进亚组IIB和亚组IIA内含子的剪接。例如，OSCAF2的影响gydF4y2Barpl2gydF4y2Ba和gydF4y2BaatpFgydF4y2Ba内含子剪接，但ZmCAF2和AtCAF2不影响玉米和小麦中这两个内含子的剪接gydF4y2Ba答:芥。gydF4y2Ba然而，OsCAF2、AtCAF2和ZmCAF2都影响到的剪接gydF4y2BandhAgydF4y2Ba和gydF4y2Baycf3gydF4y2Ba内含子。因此，这表明与ATCAF2和ZMCAF2相比，OSCAF2具有保守但不同的作用。与水稻中的OscaF1和Al2类似，Oscaf2影响亚组IIA和子组IIB内含子的剪接[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]. OsCAF2调控叶绿体发育的分子机制可能不同于AtCAF2和ZmCAF2。OsCAF2在IIA亚群内含子剪接中的功能，如gydF4y2BaatpFgydF4y2Ba和gydF4y2Barpl2gydF4y2Ba内含子需要进一步研究。gydF4y2Ba

在植物中，叶绿体的发展主要分为三个步骤[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．NEP和PEP参与第二个和第三步骤以调节塑性基因的转录[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]. 在里面theoscaf2gydF4y2Ba突变体，NEP组分的表达水平（gydF4y2Baosrpotp.gydF4y2Ba）类似于WT，而PEP组件的表达（gydF4y2BarpoBgydF4y2Ba，gydF4y2BarpoC1，gydF4y2Ba和gydF4y2BarpoC2gydF4y2Ba） 增加。这可能是由反馈调节机制引起的：氯化体的损伤可能会诱导与PEP组分的基因转录。在许多叶绿体缺陷突变体中获得了类似的结论，例如gydF4y2BaASL3.gydF4y2Ba和gydF4y2Basal4gydF4y2Ba在大米。之前的研究表明gydF4y2BaASL3.gydF4y2Ba和gydF4y2Basal4gydF4y2Ba也表现出白化叶表型和表达水平gydF4y2BarpoBgydF4y2Ba，gydF4y2BarpoC1gydF4y2Ba， 和gydF4y2BarpoC2gydF4y2Ba在里面gydF4y2BaASL3.gydF4y2Ba和gydF4y2Basal4gydF4y2Ba显着增加[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．相比之下，光合作用相关基因的表达水平，如gydF4y2Ba红细胞表面gydF4y2Ba，gydF4y2Ba:gydF4y2Ba，gydF4y2Ba赫马gydF4y2Ba，gydF4y2Bachli.gydF4y2Ba，gydF4y2BapsbOgydF4y2Ba，gydF4y2Ba海姆gydF4y2Ba，gydF4y2BapsbAgydF4y2Ba， 和gydF4y2BaChlm.gydF4y2Ba降低。从质粒到细胞核的信号在细胞内可能不同gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba变种人。这一信号转导的结果也与先前的研究结果一致gydF4y2Baosptac2gydF4y2Ba突变型[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．因此，这些结果表明OsCAF2可能通过影响PEP和光合作用相关基因的表达来影响叶绿体的发育。gydF4y2Ba

据报道，在玉米中，CAF2通过其C末端区域与CRS2相互作用[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．CRS2是II组内含子剪接因子，可促进9个II组内含子剪接[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]. 基因表达分析表明，OsCAF2在叶片中的表达水平最高。OsCAF2的表达模式与OsCRS2相似。在本研究中，我们确定OsCAF2通过其C末端区域与OsCRS2相互作用。先前对单子叶植物和双子叶植物CAF2 C末端区域的分析，包括gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba研究发现，在玉米和水稻中，有一个保守的CAF2残基，形成了一个与CRS2蛋白相互作用所必需的疏水区域[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]. 在水稻中，OsCAF2可能通过这个保守的残基与OsCRS2相互作用。CAF2-CRS2复合物形成的分子机制在植物中可能是保守的。据报道，同型二聚体和异型二聚体可能比单个蛋白质具有生物学优势，可以促进产物的合成或调节伙伴酶结构域的活性[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．考虑到OsCAF2通过其n端区域形成的同源二聚体，我们猜测叶绿体的正常发育需要OsCAF2和OsCRS2的募集来形成OsCAF2-OsCRS2复合体，以及OsCAF2的同源二聚体来实现II组内含子的剪接。前期研究表明OsCAF1还包含两个CRM域，可以影响IIA亚群和IIB亚群内含子的剪接，以及in中的AtCAF1和ZmCAF1的同源基因gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba和gydF4y2Ba玉米gydF4y2Ba只宣传亚组IIB内含子的剪接[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]. 此外，OsCAF1与自身相互作用形成同型二聚体。在玉米中，ZMCR1包含三个CRM结构域，可形成同型二聚体，但CAF2是否形成同型二聚体在玉米和玉米中尚未见报道gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]. 因此，本研究为不同植物中CAF2蛋白的功能提供了新的线索，并为探索水稻叶绿体的发育提供了重要信息。gydF4y2Ba

本研究生成了白化白果致命gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba使用CRISPR/Cas9基因编辑系统的突变体。以下研究表明：gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba可能影响叶绿体发育，并可能参与IIA组和IIB组内含子的剪接gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba和玉米。Y2H分析显示OsCAF2的c端区与OsCRS2相互作用形成OsCAF2-OsCRS2配合物，OsCAF2的n端区与自身相互作用形成同源二聚体。这些发现提高了我们对OsCAF2蛋白的认识，并进一步揭示了OsCAF2调控水稻叶绿体发育的分子机制。gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

粳稻品种gydF4y2Banipponbare.gydF4y2Ba在日本按惯例种植。种子gydF4y2Banipponbare.gydF4y2Ba由中国浙江省杭州市的中国国家水稻研究所（CNRRI）提供。我们设计了两个目标站点gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba（gtgcggctgcacaccccgctcgg，aaggttattcaccgagtaggtgg）并构建了pc1300-gydF4y2Ba全民基本收入gydF4y2Ba:: Cas9-gXgydF4y2Ba^{OsCAF2-g1gydF4y2Ba}-GX.gydF4y2Ba^{OsCAF2-g2gydF4y2Ba}矢量，根据先前描述的方法[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．载体构建及相关引物测序列于表SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba．该载体变成了gydF4y2Banipponbare.gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba农杆菌gydF4y2Ba-介导转化。这个gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba用Sanger法鉴定阳性转基因植株的突变，并用简并序列解码法进行分析[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．我们获得的所有转基因植株及其后代均在中国浙江杭州中国农业科学研究院恒温温室(30°C, 16 h光照，8 h黑暗)下生长。gydF4y2Ba

色素含量测定gydF4y2Ba

测定叶绿素a (Chla)、叶绿素b (Chlb)、类胡萝卜素(Car)和总叶绿素(Chl)含量。简而言之，我们得到WT和gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba在幼苗阶段突变叶（0.2g）。将叶片切割并在5ml 95％乙醇中浸泡在黑暗条件下48小时。使用UV-1800PC分光光度计（Mapada，中国）在470nm，649nm和665nm下进行分光光度测量。根据以前的方法[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba[我们计算了WT和CHLA，CHLB，CAR和CHL含量gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba突变叶。gydF4y2Ba

透射电子显微镜(TEM)分析gydF4y2Ba

在三叶期，我们采集了野生型和野生型的样本gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba将突变体叶片切成0.1片 厘米 × 0.1 厘米件。样品在2.5%戊二醛中固定4小时 四点钟进门 摄氏度（pH 7.0），然后固定在1%的OsO4（pH 7.4). 固定样品用醋酸铀酰染色。在乙醇系列中脱水后，样品被嵌入丙烯酸树脂中。用日立7500（日本东京）透射电镜对样品进行染色和观察。gydF4y2Ba

RNA提取和定量实时PCR（qRT PCR）gydF4y2Ba

使用RNA提取试剂盒(美国Axygen)，按照制造商的协议从叶子中提取总RNA。根据说明书使用日本TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit合成第一链cDNA。qRT-PCR分析流程为:94℃5 min, 95℃15 s, 58℃50 s，共40个循环。这gydF4y2BaOsActin1gydF4y2Ba作为本研究的内参基因。根据2gydF4y2Ba^{-ΔΔctgydF4y2Ba}方法[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]. qRT PCR的所有引物如表S所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

Ⅰ组和Ⅱ组内含子的剪接分析gydF4y2Ba

我们使用RT-PCR对来自WT和WT的叶绿体基因的I组和II组内含子进行剪接分析gydF4y2Baoscaf2gydF4y2Ba突变体。RT-PCR步骤如下：94℃，5分钟，其次是30 s，58℃的30 s，72℃，45°C的30 s，72℃，72°的最终伸长步骤C持续10分钟。所有叶绿体RNA剪接分析引物列于表S中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

OsCAF2的亚细胞定位gydF4y2Ba

为了确认OsCAF2蛋白的亚细胞定位，全长gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba编码序列（去除终止码）被放大并克隆到pAN580载体中，以创建p580–2 × CaMV35S:：OsCAF2 GFP(gydF4y2BaOsCAF2-GFPgydF4y2Ba)质粒（表S）gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．这gydF4y2BaOsCAF2-GFPgydF4y2Ba载体构建引物如表S所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．水稻原生质体的制备和转化遵循上述方法[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]. 使用共焦激光扫描显微镜（蔡司LSM 780，德国）观察绿色荧光蛋白（GFP）的荧光。gydF4y2Ba

酵母双杂交（Y2H）分析gydF4y2Ba

的全长和截断的编码序列gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba,全身gydF4y2BaOSCRS2gydF4y2BaPCR扩增编码序列(表SgydF4y2Ba2gydF4y2Ba). 表S中列出了相关的PCR扩增引物gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．PCR扩增产物克隆到pGAD-T7或pGBK-T7载体中。根据制造商的说明，Y2H实验使用了克隆技术双混合系统。gydF4y2Ba

支持本文结果的数据集可根据合理要求从相应的作者处获得。当前研究中使用的DNA和基因组DNA的序列数据gydF4y2Baoscaf2.gydF4y2Ba和gydF4y2BaOSCRS2gydF4y2Ba可从GenBank/EMBL数据库获得，登录号为gydF4y2BaLOC_Os01g21990gydF4y2Ba，gydF4y2BaLOC_Os01g04130gydF4y2Ba分别可以从国家生物技术信息中心（NCBI）（OSCAF2基因ID：4326994，OSCRS2基因ID：4325801）提供。gydF4y2Ba

佩斯：gydF4y2Ba

Plastid-encoded聚合酶gydF4y2Ba

Neps：gydF4y2Ba

核编码聚合酶gydF4y2Ba

pre-mRNA:gydF4y2Ba

前兆信使mRNAgydF4y2Ba

PPR:gydF4y2Ba

五三肽重复序列gydF4y2Ba

客户关系管理:gydF4y2Ba

叶绿体RNA剪接和核糖体成熟gydF4y2Ba

CRISPR：gydF4y2Ba

聚集的规则间隔的短回文重复序列gydF4y2Ba

TEM：gydF4y2Ba

透射电子显微镜法gydF4y2Ba

Y2H：gydF4y2Ba

酵母2台混合动力gydF4y2Ba

存在:gydF4y2Ba

RNA提取和定量实时PCRgydF4y2Ba

GFP:gydF4y2Ba

绿色荧光蛋白gydF4y2Ba

cd:gydF4y2Ba

编码序列gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

该研究得到了中国国家自然科学基金的支持（美国专利31801333，31701390号），中央公有利益科学机构基础基础全国水稻研究所（2017 001-4）。融资机构为本研究提供了财务支持，包括实验设计和实施，采样和数据分析。没有资助者在数据收集和分析和编写手稿中发挥作用。gydF4y2Ba

作者笔记gydF4y2Ba

1. 沈岚、张强对这项工作贡献相当。gydF4y2Ba

隶属关系gydF4y2Ba

1. 中国农业科学院水稻研究所水稻生物学国家重点实验室，杭州，310006gydF4y2Ba

   沈岚、张强、温洪玲、胡光莲、任德勇、姜虎、李柱、高振宇、张光恒、郭龙彪、曾大丽、钱倩gydF4y2Ba

2. 重庆市农业科学院生物技术研究中心，重庆，401329gydF4y2Ba

   中威王gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

SL和ZQ设计了研究并撰写了原稿。ZQ, SL, WZW, WHL, HGL进行了所有的实验。RDY, HJ, ZL, GZY, ZGH, GLB负责数据分析，ZDL和QQ修改稿件。所有作者阅读并批准了手稿。gydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2Ba茜茜gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

出版商说明gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创意公约归因于4.0国际许可证，这允许在任何中或格式中使用，共享，适应，分发和复制，只要您向原始作者和来源提供适当的信贷，提供了一个链接到Creative Commons许可证，并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明，否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中，除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中，法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用，您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本，请访问gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。gydF4y2Ba

重印和许可gydF4y2Ba