小麦III类过氧化物酶基因家族成员，gydF4y2BaTaPRX-2A,gydF4y2Ba增强了对盐胁迫的耐受性gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

盐和干旱是制约作物产量的主要非生物胁迫。过氧化物酶(PRXs)参与多种非生物胁迫反应。此外，只有少数小麦PRXs在非生物胁迫响应机制中被表征。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在本研究中，一个新的小麦过氧化物酶(PRX)基因被命名gydF4y2BaTaPRX-2A,gydF4y2Ba克隆了小麦III类PRX基因家族的一个成员，并对其对盐胁迫的响应进行了研究。通过对12种植物中III类prx的鉴定和进化分析，提出了植物的进化模型gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba，表明在进化过程中发生了一些外显子融合事件。我们还在13个涉及我们的进化模型的PRX区域中检测到PRX域的正选择，并在进化过程中发现2 - 6个正选择位点gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba进化。定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)结果显示gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba在根组织中表达量高于在叶和茎组织中表达量。gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba非生物胁迫和激素处理如聚乙二醇6000、NaCl、过氧化氢(HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)、水杨酸(SA)、甲基茉莉酸(MeJA)和脱落酸(ABA)。转基因小麦植株过表达gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba对盐胁迫的耐受性高于野生型。共聚焦显微镜显示gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba-eGFP主要定位于细胞核。成活率、相对含水量、茎长均较高gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba-过表达小麦较WT小麦有显著差异，而根长无显著差异。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性增强gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba-过表达的小麦与WT小麦相比，导致活性氧(ROS)积累和丙二醛(MDA)含量降低。下游胁迫相关基因表达水平表明gydF4y2BaRD22gydF4y2Ba，gydF4y2BaTLP4gydF4y2Ba，gydF4y2BaABAIgydF4y2Ba，gydF4y2BaGST22gydF4y2Ba，gydF4y2BaFeSODgydF4y2Ba,gydF4y2Ba猫gydF4y2Ba表现出更高的表达gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba在盐胁迫下，小麦比WT过表达。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

结果表明:gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba通过清除ROS和调节胁迫相关基因在盐胁迫应答中发挥积极作用。gydF4y2Ba

高盐和干旱等非生物胁迫对植物发育和生物量形成产生深远的负面影响，导致全球作物产量显著下降[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．为了适应这些非生物胁迫，植物进化出了复杂的生理和生化机制来缓解胁迫相关的损伤，例如释放活性氧[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．先前的研究表明过氧化氢(HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)预处理可通过调节抗氧化酶活性、矿物质吸收和脯氨酸水平来提高小麦的耐盐性[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．在高等植物细胞中，ROS以多种形式存在，包括HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，超氧自由基(OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{．−gydF4y2Ba})和羟基自由基(OHgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)．活性氧是在非生物条件下产生的，通过破坏细胞膜脂类、核酸等引起细胞的快速损伤[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．植物通过激活抗氧化系统，建立了复杂的清除ROS系统，以维持ROS的稳定水平。在这种情况下，抗氧化系统主要是指几种内源性抗氧化酶对自由基的清除，如谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD) [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．据报道，抗氧化酶(如。gydF4y2Ba，gydF4y2BaAPX, CAT)在植物遭受盐胁迫时也发生改变[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．此外，据报道，prx可以通过催化氧化还原反应保护细胞免受ROS的侵害[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

prx存在于许多物种中，如微生物、动物和植物[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．这些化合物根据不同的分子结构和催化性能分为三个超家族。第一个超家族包括动物酶，如嗜酸性粒细胞PRX和GPX。第二个超家族广泛分布在许多物种中(细菌、动物、真菌、植物和酵母)。第三个超家族存在于植物、细菌和真菌中[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．根据原蛋白结构的不同，PRXs被分为三类:ⅰ类PRXs存在于细胞内，ⅱ类PRXs存在于细胞外，III类PRXs由大的多基因家族组成[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．I类prx在清除过量H中起关键作用gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]，第II类PRXs(发现于真菌中)参与土壤碎片的降解[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]， III类prx是植物特异性的[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．在异allo六倍体小麦中已鉴定出超过110个III类PRXs [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Ba包括138个第III类prx [gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．73个序列编码的III类prxgydF4y2Ba拟南芥,gydF4y2Ba玉米中已鉴定出119个III类PRXs [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba杨树trichocarpagydF4y2Ba包含93个第III类prx [gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

III类PRXs在植物发育过程中具有多种功能，包括细胞壁硬化、细胞壁成分交联、抵御病原体感染、HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba移走、伤害[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．研究了大量的prxgydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba并对其功能进行了验证。例如,gydF4y2BaAtPRX72gydF4y2Ba在木质化过程中起重要作用[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba),而gydF4y2BaAtPRX33gydF4y2Ba而且gydF4y2BaAtPRX34gydF4y2Ba在细胞伸长中起作用[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．一些研究已经证明了这一点gydF4y2BaAtPRX21, AtPRX62gydF4y2Ba,gydF4y2BaAtPRX71gydF4y2Ba作为对伤害和真菌胁迫的反应的一部分而分泌[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．的gydF4y2Ba陆地棉gydF4y2Ba基因gydF4y2BaGhPOX1gydF4y2Ba可通过产生活性氧引起棉纤维细胞伸长[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．据报道，一些PRXs通过协调水杨酸(SA)、茉莉酸(MeJA)和乙烯(ET)，在宿主植物对抗坏死性或生物营养性病原体的防御中发挥核心作用[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．例如,gydF4y2BaTaPRX111, TaPRX112gydF4y2Ba,gydF4y2BaTaPRX113gydF4y2Ba参与了植物对小麦线虫感染的反应[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．在水稻中，PRXs的表达模式显示出重要的功能多样性，特别是在对胁迫的响应中[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．的gydF4y2Ba玉米gydF4y2Ba插件可以gydF4y2BaZmPRX26gydF4y2Ba，gydF4y2BaZmPRX42gydF4y2Ba，gydF4y2BaZmPRX71gydF4y2Ba，gydF4y2BaZmPRX75gydF4y2Ba,gydF4y2BaZmPRX78gydF4y2Ba参与了对各种非生物胁迫条件的响应[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．此外，GPXs是PRX家族的成员，在植物中具有重要的功能。的gydF4y2Ba答:芥gydF4y2BaGPX基因,gydF4y2BaAtGPX3,gydF4y2Ba在干旱胁迫和脱落酸(ABA)介导的信号传导下，它是一种普通的清道夫和信号转换器[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．六个gydF4y2BaGPXsgydF4y2Ba在gydF4y2BaCucumis巨大成功gydF4y2Ba都对ABA处理和非生物胁迫有响应。此外，已知有5种水稻GPXs在对H的反应中发挥作用gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba而冷应激[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．一些小麦prx也被发现在抗旱性中发挥作用，正如微阵列实验所揭示的[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．两个小麦GPXs, W69和W106，在转基因中被证明可以提高耐盐性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

小麦是世界上一种重要的经济作物，但其产量常受非生物胁迫的限制[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．一些prx在抗盐胁迫中的作用已被报道;然而，这些反应背后的小麦PRXs分子机制仍有待充分了解。在这项研究中，我们克隆了一个PRX基因gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba从小麦(gydF4y2Ba小麦gydF4y2Ba)，并研究了盐胁迫的耐受性gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba在转基因小麦。进化分析表明，在此过程中可能发生了一些外显子融合事件和正向选择gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba进化。基因表达模式分析证实gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba干旱、盐、HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和ABA处理。我们的研究结果表明gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba通过提高抗氧化胁迫能力和调节胁迫相关基因来提高小麦的耐盐性。我们的工作将使研究人员对植物的非生物胁迫耐受机制有新的认识。gydF4y2Ba

分离与演化gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba

为了进一步了解III类PRXs基因的进化保守或差异，我们对III类PRXs的基因结构进行了识别、分类和描述。12个工厂的生产效益评估(gydF4y2Bat . aestivumgydF4y2Ba，gydF4y2Ba小麦属植物dicoccoidesgydF4y2Ba，gydF4y2Ba小麦属植物urartugydF4y2Ba，gydF4y2Ba山羊草属tauschiigydF4y2Ba，gydF4y2BaBrachypodium distachyongydF4y2Ba，gydF4y2Bao .漂白亚麻纤维卷gydF4y2Ba，gydF4y2Baz梅斯gydF4y2Ba，gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba，gydF4y2Ba葡萄gydF4y2Ba，gydF4y2Ba卷柏moellendorffiigydF4y2Ba，gydF4y2BaPhyscomitrella金属盘gydF4y2Ba，gydF4y2Ba、衣藻reinhardtiigydF4y2Ba)用HMMER 3.1和Pfam 32.0批处理模式进行鉴定，其中PRX结构域(过氧化物酶。嗯，PF00141.23)(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1和附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S2)。我们排除了这12种植物的非典型PRX，它们与PRX结构域的一致性< 50%gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表S3)。这些prx的分类基于两种方法，HMMER3.1扫描和邻居连接(NJ)系统发育重建(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S2和附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S1)。在12种植物中，PRXs结构域内的外显子-内含子结构也进行了研究gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S2)。gydF4y2Ba

其中，我们克隆了一个成员(命名为gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba)对小麦品种“苏麦3号”的prx进行了分析。预测的gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba开放阅读框(ORF)为1026bp，推导出gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba蛋白质由342个氨基酸残基组成。来自国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST(基本局部对齐搜索工具)结果显示，在基因组中发现了一个PRX基因(GenBank: AJ878510.1)gydF4y2Bat . aestivumgydF4y2Ba“夏延”的E值最小。我们对12个工厂的prx进行了本地BLAST测试，结果表明gydF4y2Bat . aestivumgydF4y2Ba插件可以TraesCS2A02G573900.1。cds1 from subfamily VI contained 100% sequence similarity withTaPRX-2A。gydF4y2Ba为了研究该无性系的进化，我们从这12种植物中重建了一个只包含VI亚科PRXs的小型NJ系统发育树，并比较了它们的结构特征(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa, b).如图所示，的外显子-内含子结构gydF4y2Bat . aestivumgydF4y2Ba克隆(TraesCS2A02G573900.1.cds1)为单外显子结构，而其余4个小麦和cds1为单外显子结构gydF4y2BaAe。tauschiigydF4y2Ba同源PRXs (Tdi_TRIDC2AG080470.2, Ata_AET2Gv21275100.1, tae_traescs2b02g6139001。cds1, and Tdi_TRIDC2BG088710.2) in this clade also had a one-exon structure, suggesting that this one-exon structure originated in these PRXs before theTriticum-AegilopsgydF4y2Ba(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

基于系统发育和外显子-内含子结构分析(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S2)，我们提出了一个进化模型来确定起源gydF4y2BaTaPRXgydF4y2Ba-2A (TraesCS2A02G573900.1.cds1)，参与了外显子融合过程(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).该模型表明被子植物和禾本科植物在羽化过程中发生了两轮外显子融合事件。第一次外显子融合事件(四个外显子变成三个外显子)发生在被子植物羽化过程中。类似于gydF4y2Bap .金属盘gydF4y2BaPRX (Pp3c19_20780V3.3)在四个外显子内包含一个保守的外显子-内含子结构，在PRX结构域附近有“001”外显子相。这种“001”外显子相内的4外显子结构在类似于2的祖先序列中保留了下来gydF4y2Ba美国moellendorffiigydF4y2BaPRXs (Smo_EFJ32905和Smo_EFJ15769)。然而，prx的外显子-内含子结构gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba(Ath_AT1G71695.1)gydF4y2Ba诉,酿酒用葡萄gydF4y2Ba(Vvi_VIT_18s0072g00160.t01),gydF4y2Bao .漂白亚麻纤维卷gydF4y2Ba(Osa_Os04t0688200-01)突变为“00”外显子相内的三外显子结构，提示在monocot-eudicot进化分裂之前，在“001”外显子相内的四外显子结构的最后两个外显子发生了一次外显子融合事件。第二次外显子融合(3个外显子变成2个或1个外显子)发生在禾本科羽化过程中。如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2BaA，在“00”外显子相内的三外显子结构的前两个外显子可能已经融合变成了“0”外显子相内的二外显子结构(gydF4y2Bab . distachyongydF4y2BaKQJ85452)。类似地，最后两个外显子可能已经融合(gydF4y2Bat . aestivumgydF4y2BaTraesCS2A02G574400.1;gydF4y2Bat . urartugydF4y2BaTRIUR3_03591-P1)或者所有三个外显子都可以融合，从而合并成一个单外显子结构(gydF4y2BaAe。tauschii,gydF4y2BaAta_AET2Gv21275100.1;gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2BaTdi_TRIDC2AG080470.2 Tdi_TRIDC2BG088710.2;gydF4y2Bat . aestivumgydF4y2BaTraesCS2A02G573900.1。cds1, Tae_TraesCS2B02G613900.1.cds1). The alignments of these PRXs within the breakpoints of exon fusion events supported our proposed evolutionary model (Fig.2gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

确认这些PRX序列gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba在进化模型中，我们从7种植物的rna -测序(RNA-seq)数据中确定了cdna水平的证据(gydF4y2Bap .金属盘gydF4y2Ba，gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba，gydF4y2Ba诉酿酒用葡萄gydF4y2Ba，gydF4y2Bab . distachyongydF4y2Ba，gydF4y2BaAe。tauschiigydF4y2Ba，gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2Ba而且gydF4y2Bat . aestivumgydF4y2Ba)(额外的文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S4)。我们没有确定这些证据gydF4y2Ba美国moellendorffiigydF4y2Ba而且gydF4y2Bat . urartugydF4y2Ba因为他们的GFF3注释文件只是在支架中，而不是在染色体中。结果表明，大多数PRX序列(除了VIT_18s0072g00160。来自7个植物的t01和traescs2a02g57440.1)在RNA-seq数据(附加文件“信息”列中的FPKM和覆盖率值)中检测到gydF4y2Ba6gydF4y2Ba表S4)，表明植物进化过程中发生了外显子融合事件。gydF4y2Ba

我们还检测到PRX结构域序列的阳性选择gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba和其他12个同源PRXs使用PAML 4.9(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．根据站点特定模型的似然比检验，M2a(选择)模型显著高于M1a(中立)(自由度(df) = 2, 2ΔlnL = 68.4，gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.005)，说明部分氨基酸位点在进化过程中发生了正向选择。M7-M8比较(df = 2, 2ΔlnL = 7.47，gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.025)也支持正选择假说。使用朴素经验贝叶斯和贝叶斯经验贝叶斯分析确定了这些积极选择的位点gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S3a, b)。M2a和M8模型中分别发现2个(95 E和185 K，参考序列:Smo_EFJ32905)和6个阳性选择位点(95 E、110 S、117 Q、135 E、185 K和212 R)。进化节点的祖先序列也通过PAML 4.9和MEGAX(附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S3)。gydF4y2Ba

的表达模式gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba在各种组织和压力治疗中gydF4y2Ba

的表达模式gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba这是对压力相关信号的反应gydF4y2Ba，gydF4y2Ba我们在不同的组织(叶、茎和根)和不同的胁迫处理(PEG6000, NaCl, HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， SA, MeJA, IAA，和ABA)。结果表明gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba在根、茎、叶中均有差异表达，其在根组织中的表达量显著高于在叶和茎组织中的表达量(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).然后，我们检查表达模式gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba用qRT-PCR法对PEG 6000、NaCl和H进行处理gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2.gydF4y2Ba结果表明gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba在PEG 6000、NaCl和HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在处理后6 h，表达量达到峰值(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab, c，和d)。我们还检测了四种植物激素的表达模式。如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bae,gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2BaSA处理1小时后，表达约2.5倍的上调(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bae).同样，的表达水平gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba在JA和ABA处理后6 h达到峰值(图5)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baf, h)。然而，gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba在IAA处理后0-6小时内保持相对不变，但在12小时内表现出约1.5倍的上调(图5)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bag).这些结果表明gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba在各种非生物应激反应中。gydF4y2Ba

亚细胞定位gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba蛋白质gydF4y2Ba

描述:描述…的功能gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba的ORFgydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba在CaMV 35S启动子的控制下融合到pBIN35S-eGFP载体上(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:图S4a)。pBIN35S:eGFP空矢量控制和pBIN35S:gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba:将eGFP重组载体转入烟草叶片细胞gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba渗透。观察注射后表皮细胞的变化gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba用共聚焦显微镜观察叶片，发现gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2BaeGFP主要定位于细胞核中gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:无花果。S4bgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba- dgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)．此外，pBIN35S-gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba-eGFP和pBINgydF4y2Ba35个年代gydF4y2Ba-eGFP载体转化洋葱表皮细胞。与在烟草表皮细胞中观察到的定位结果一致gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2BaeGFP也主要定位于洋葱表皮细胞的细胞核中gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:无花果。S4bgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba- dgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba)．此外，web服务器cNLS的预测表明，在核定位信号(NLS)序列中存在5个序列gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba:图S5)。gydF4y2Ba

TaPRX-2AgydF4y2Ba转基因小麦耐盐性增强gydF4y2Ba

进一步确认的功能gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba在植物抗盐胁迫方面，对小麦品种KN199进行了改良gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba构建了3个独立的转基因株系(TaOE1, TaOE2和TaOE3)。表达谱gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba分析了在gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2BaqRT-PCR转基因株系。结果表明，转基因株系的表达水平高于野生型(WT)植株gydF4y2Ba10gydF4y2Ba:无花果S6a)。我们随后测量了三个独立的转基因系和WT的PRX活性，发现转基因系的活性高于WT(附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba:图S6b)。综上所述，我们得出的结论是gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba过表达导致转基因系中PRX活性升高。gydF4y2Ba

然后，我们测量了在盐胁迫条件下转基因品系(三个独立品系(TaOE1, TaOE2和TaOE3)与WT之间的表型差异。在非胁迫条件下，TaOE1-3和WT之间没有明显的表型差异。在盐胁迫条件下，转基因品系比WT生长更强。此外，WT的叶片在盐胁迫下变黄萎蔫，而TaOE的叶片仍保持绿色(图5)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).我们还发现，WT植株经盐处理后的存活率仅为40%，而TaOE1、TaOE2和TaOE3植株的存活率分别为63.6、57.6和63%(图4)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).然后我们比较了盐处理下WT和TaOE植株的茎长、相对含水量(RWC)和根长(图5)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac, d, e)。结果表明，转基因株系的茎长和RWC均高于WT株系。然而，WT和转基因株系之间的根长没有显著差异。综合来看，这些结果表明gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba过表达显著增强了小麦的耐盐性。gydF4y2Ba

进一步探讨其内在机制gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba我们测定了TaOE和WT在非胁迫和盐胁迫条件下的生理生化指标(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba模拟)。盐处理下，TaOE品系丙二醛(MDA)含量显著低于WT;它们还含有较高的可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白质含量。此外，转基因株系的脯氨酸含量大约是WT株系的2倍(图5)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac).这些结果表明gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba增加小麦品种“KN199”耐渗透和抗氧化胁迫所必需的代谢物含量，从而提高耐盐性。gydF4y2Ba

TaPRX-2AgydF4y2Ba调控转基因小麦ROS的清除和胁迫相关基因的表达gydF4y2Ba

已有研究表明，植物对氧化胁迫的耐受性与植物对非生物胁迫的生理反应有关[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．因此，我们考察了的功能gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba降低盐胁迫下转基因系ROS水平的作用。作为ROS水平的主要指标，我们测定了O的积累gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba和HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba用硝基蓝四唑(NBT)和3-二氨基联苯胺(DAB)染色比较TaOE和WT系。在盐处理下，我们发现OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba(被NBT染成蓝色)和HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(DAB染成棕色)在转基因株系中显著低于WT株系(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba模拟)。此外，转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)抗氧化酶活性均高于WT植株(图5)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baeg)。gydF4y2Ba

以确定胁迫反应基因是否与增强盐耐受性有关gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba，我们利用qRT-PCR方法测定了TaOE植物中各种胁迫相关基因的表达模式(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．这些与压力相关的基因(编码脱水反应蛋白，gydF4y2BaRD22gydF4y2Ba；thaumatin-like蛋白质,gydF4y2BaTLP4gydF4y2Ba；ABA-inducing蛋白质,gydF4y2BaABAIgydF4y2Ba；germin-like蛋白质,gydF4y2BaGLP4gydF4y2Ba；谷胱甘肽S-transferase,gydF4y2BaGST22gydF4y2Ba；以及编码ros清除酶的基因gydF4y2BaFeSODgydF4y2Ba，gydF4y2BaCuSODgydF4y2Ba,gydF4y2Ba猫gydF4y2Ba)被报道参与了对各种非生物胁迫的反应。我们的研究结果表明，这些胁迫相关基因在盐胁迫下的TaOE品系中表达高于WT品系gydF4y2BaCuSODgydF4y2BaWT与转基因株系间无显著差异。我们还发现一些与压力相关的基因的表达，包括gydF4y2BaRD22gydF4y2Ba，gydF4y2BaABAIgydF4y2Ba,gydF4y2Ba猫gydF4y2Ba，在非胁迫条件下，WT植株比转基因植株低gydF4y2Ba．gydF4y2Ba综合来看，这些结果表明gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba过表达可能通过提高胁迫响应基因的转录水平来提高小麦的耐盐性。gydF4y2Ba

TaPRX-2A在gydF4y2Bat . aestivumgydF4y2Ba

本研究的目的是确定小麦PRX基因的作用gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba在植物对盐胁迫的反应中，鉴于与这种形式的非生物胁迫相关的作物产量严重下降[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．基于NJ系统发育树的分类和HMM扫描，建立了trescs2a02g57390.1。cds1属于VI PRXs亚家族，可在gydF4y2Ba美国moellendorffiigydF4y2Ba但不是在gydF4y2Bap .金属盘gydF4y2Ba，这表明VI PRXs亚家族出现在类似蕨类的祖先中。亚科VI PRXs在两个调查的优生子中只包含一个成员gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba诉酿酒用葡萄gydF4y2Ba，而VI PRXs亚科包含所研究的单子鼠的各种成员(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S2)，表明VI亚族在单株-双株分离后经历了单株特异性复制事件。gydF4y2Ba

在分析12种植物的外显子-内含子结构的基础上，我们提出了一个包含两轮外显子融合事件的进化模型来推断起源gydF4y2BaTaPRXgydF4y2Ba2 (TraesCS2A02G573900.1.cds1)(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．在这些外显子融合事件中，我们重点研究了第二轮外显子融合事件中的一个，即三外显子结构在发生前转变为一外显子结构gydF4y2BaTriticum-AegilopsgydF4y2Basplit(形成gydF4y2BaTaPRXgydF4y2Ba2一个祖先)。这种单外显子结构出现的可能机制可能是“逆转录”(由于逆转录转位的结果，新复制的残序缺乏内含子)，这在基因起源中有报道gydF4y2Ba精卫gydF4y2Ba在gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba物种(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]和ATP合酶PGAM3 [gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．例如，PGAM1包含三个内含子，而PGAM3一个也没有。在植物中，鉴定出69个逆转录子和1235个初级逆转录基因gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba而且gydF4y2Bao .漂白亚麻纤维卷gydF4y2Ba分别为(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．通过PAML4.9检测进化模型中13个prx的正向选择，发现2 ~ 6个正向选择位点。在24个逆转录基因中有7个基因对被发现gydF4y2Ba选用gydF4y2Ba被鉴定为正选择的物种[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

TaPRX-2AgydF4y2Ba增强了小麦抗氧化能力和耐盐性gydF4y2Ba

在高等植物中，III类PRXs包含一个庞大的基因家族，据报道，该家族的成员参与植物对非生物胁迫的反应[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．例如，III类PRX基因gydF4y2BaOsPRX38gydF4y2Ba在gydF4y2Bao .漂白亚麻纤维卷gydF4y2Ba据报道,改进gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba通过激活抗氧化系统(SOD、PRX和GST)和清除HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．在烟草中，III类PRX基因的过表达已被证明gydF4y2BaAtPrx64gydF4y2Ba在gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba通过增加根系生长和清除Al和ROS积累，提高植物对铝(Al)的耐受性[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba答:芥,gydF4y2Ba过度的gydF4y2BaAtPRX3gydF4y2Ba被证明可以缓解脱水和增加耐盐性。然而,抑制gydF4y2BaAtPRX3gydF4y2Ba表达降低了对脱水和盐的耐受性[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．此外，III类PRX基因gydF4y2BaCrPrx1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCrPrxgydF4y2Ba在gydF4y2BaCatharanthus roseus也叫gydF4y2Ba在盐胁迫条件下，有研究表明gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba［gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．与这些报告的结果一致，我们的结果也证明了小麦耐盐性的正向调节因子gydF4y2BaTaPRX-2A。gydF4y2Ba

在伴随植物非生物胁迫的生理问题中，ROS(特别是OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba和HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)和高浓度的活性氧会破坏细胞膜的通透性和完整性，以及细胞分隔[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．植物中的III类PRXs可以催化HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过转移来自不同供体的电子来减少过氧化循环[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．已有研究表明，III类PRXs可以通过调节植物的ROS平衡来提高植物的抗逆性。例如,gydF4y2BaOsPRX38gydF4y2Ba提高了gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba通过激活抗氧化系统和清除HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］gydF4y2Ba_．gydF4y2BaAtPrx64gydF4y2Ba通过清除ROS积累提高植物对铝的耐受性[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．为了通过清除自由基来维持ROS的平衡，植物进化出了一套复杂的抗氧化系统来保护细胞免受伤害[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．值得注意的是，据报道，SOD、CAT和PRX的表达有助于增强耐盐性[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．在研究中，我们发现gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba过表达通过CAT和PRX提高抗氧化活性，从而降低ROS水平。此外，抗氧化基因(gydF4y2BaFeSODgydF4y2Ba，gydF4y2BaCuSODgydF4y2Ba,gydF4y2Ba猫gydF4y2Ba)在gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba-过表达的转基因植株与在WT植株中观察到的相比，表明gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba调节这些基因的表达，从而影响耐盐性。未来的研究将探索其中的机制gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba调节其他抗氧化剂编码基因。gydF4y2Ba

有趣的是，我们发现gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba以NLSs定位于细胞核。一些报告显示，PRX基因如gydF4y2BaTaPRXsgydF4y2Ba，gydF4y2BaAtGPX8gydF4y2Ba和GPX在哺乳动物和gydF4y2BaLjGpx1gydF4y2Ba位于细胞核中[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．据报道，一个勉强的PRX具有假定的核定位信号，位于核[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．先前的研究表明，ROS可通过激活内切酶和破坏重要的生物大分子(如核酸)引起DNA损伤[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba拟南芥,AtGPX8gydF4y2Ba定位于细胞核，可通过维持细胞氧化还原稳态，保护核DNA免受ROS损伤[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．基于上述证据，我们提出了可能的监管机制:一种解释是gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba在细胞核中抑制ROS介导的基因组DNA损伤，其他酶负责清除细胞器内或邻近的ROS。我们的第二个解释是gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba与其他ROS清除酶共表达，在暴露于盐度胁迫期间，其转录上调导致细胞核外调节ROS水平的酶的上调(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

TaPRX-2A的gydF4y2Ba通过aba依赖性途径对耐盐性的影响gydF4y2Ba

在植物中，ABA信号通路调节各种非生物胁迫响应[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．例如，脱氢蛋白和类索马丁蛋白(gydF4y2Ba张力腿平台gydF4y2Ba)对非生物胁迫的耐受性至关重要的基因，可能在胁迫期间被ABA诱导[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba据报道，ABA介导脱水反应基因的转录上调gydF4y2BaRD22gydF4y2Ba［gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．类似于gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba据报道，一些III类PRX基因通过ABA信号通路介导对非生物胁迫的耐受性[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．例如，的表达式gydF4y2BaAtPRX3gydF4y2Ba在gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba是由盐度胁迫和外源ABA处理共同诱导的[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．7个III类PRXs基因gydF4y2Ba甘蒙柽柳hispidagydF4y2Ba是由ABA信号通路控制的[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．在我们的研究中，表达gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba在NaCl和外源ABA处理下均显著上调。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．此外，我们观察到gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba在转基因小麦中导致胁迫相关基因的转录上调gydF4y2BaRD22gydF4y2Ba，gydF4y2BaTLP4gydF4y2Ba，gydF4y2BaABAIgydF4y2Ba，gydF4y2BaGLP4gydF4y2Ba,gydF4y2BaGST2gydF4y2Ba2在盐度胁迫下(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．我们的研究表明gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba通过激活下游胁迫相关基因和ABA信号通路，增强小麦的耐盐性。有必要进一步研究其调控机制gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba调节与压力相关的基因。gydF4y2Ba

在这项研究中，我们确定并表征了PRX基因的作用gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba对小麦盐胁迫的响应。系统发育分析显示，在此过程中发生了一些外显子融合事件和正向选择gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba进化。过度的gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba通过激活ABA途径和抗氧化酶增强转基因小麦的耐盐性，从而降低ROS积累和提高渗透代谢产物水平。这项工作及其发现在培育耐盐小麦品种方面具有很强的未来应用价值，考虑到未来气候变化的影响所带来的预期作物损失，这一点尤其重要。gydF4y2Ba

分离和克隆gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba及其转换gydF4y2Ba

以收获小麦品种“苏麦3号”叶片为材料，用TRIzol试剂(Transgen)提取总RNA。合成cDNA进行扩增gydF4y2BaTaPRX-2A。gydF4y2Ba完整的gydF4y2Ba-gydF4y2Ba长cDNA序列gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba(基因库。AJ878510.1)来自NCBI (gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/gydF4y2Ba)，连接到PC186载体上，利用粒子枪介导的基因转化为“KN199”[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

植物材料和非生物处理gydF4y2Ba

面包小麦(gydF4y2Bat . aestivumgydF4y2Ba品种“KN199”和“苏麦3号”)幼苗来源于我实验室(山东农业大学农学院作物生物学国家重点实验室)。的gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba-过表达转基因小麦品系和WT“KN199”在20°C - 25°C条件下生长，光周期16/8 h。当植株生长到一叶一颗心期时，用200 mM NaCl处理转基因植株和“KN199”。盐处理时，对照苗和转基因苗在200 mM NaCl溶液中培养10 d。gydF4y2Ba

小麦ⅲ类PRXs的鉴定与分类，gydF4y2BaAe。tauschiigydF4y2Ba，以及其他植物gydF4y2Ba

12种植物的基因组和蛋白质组(gydF4y2Ba美国moellendorffiigydF4y2Ba，gydF4y2Baz梅斯gydF4y2Ba，gydF4y2Bab . distachyongydF4y2Ba，gydF4y2Bat . aestivum Ae。tauschiigydF4y2Ba，gydF4y2Ba小麦、小麦、小麦、小麦、小麦、小麦、小麦gydF4y2Ba，gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba，gydF4y2Bap .金属盘gydF4y2Ba而且gydF4y2Bac . reinhardtiigydF4y2Ba)从综合植物42 (gydF4y2Bahttp://plants.ensembl.org/gydF4y2Ba)和分析。为了识别PRXs，我们使用本地服务器Hmmer 3.1 (pfam配置文件PF00141.23，过氧化物酶)批量扫描了12种植物的所有蛋白质组。嗯,插件可以域)。然后是pfam 32.0网站(gydF4y2Bahttp://pfam.xfam.org/gydF4y2Ba)， E值为0.01。保留和分析典型的PRX区域覆盖> 50%对齐的PRX。那些覆盖小于50%的PRX结构域排列的被认为是非典型PRX，并被排除在进一步的分析之外。使用ClustalW v2.0对PRX域中截断序列进行PRX比对[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．我们使用MEGA-CC 7.0软件在本地服务器上构建了NJ系统发育树[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．利用HMMER 3.1对PRX亚族进行分类，基于玉米PRX比对生成模型[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

的RNA-seq数据gydF4y2Bap .金属盘gydF4y2Ba(SRR11434644, SRR11434645，和SRR11434646)，gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba(SRR11308184, SRR11308187和SRR11308188)，gydF4y2Ba诉酿酒用葡萄gydF4y2Ba(SRR11249050, SRR11249059，和SRR11249060)，gydF4y2Bab . distachyongydF4y2Ba(SRR10380965, SRR10380966, SRR10380967和SRR10380968)，gydF4y2BaAe。tauschiigydF4y2Ba(SRR9657462和SRR9657463)，以及gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2Ba(SRR9657450和SRR9657451)从NCBI SRA转录组数据库(gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/gydF4y2Ba)．的RNA-seq数据gydF4y2Bat . aestivumgydF4y2Ba(ERR1201797, ERR1201798, ERR1201799)从EBI ArrayExpress (gydF4y2Bahttps://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/gydF4y2Ba)．利用Hisat2(2.2.0版本，gydF4y2Bahttps://daehwankimlab.github.io/hisat2/download/#version-hisat2-220gydF4y2Ba)．转换(sam to bam)和排序使用Samtools(版本1.10，gydF4y2Bahttps://github.com/samtools/samtools/releases/gydF4y2Ba)．这些文本是使用Stringtie(版本2.1.1，gydF4y2Bahttps://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtmlgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

prx的结构域和内含子-外显子结构图gydF4y2Ba

我们使用Perl和R脚本为本研究中包含的12种植物生成PRXs内含子-外显子结构和域图，基于来自synbl plants 42 (gydF4y2Bahttp://plants.ensembl.org/gydF4y2Ba)．prx的域信息是从Pfam 32.0 (gydF4y2Bahttp://pfam.xfam.org/gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

选择压力分析gydF4y2Ba

截断的氨基酸PRX结构域序列gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba其余12个同源prx用Clustal X2进行比对。根据Pfam 32的信息，用我们的Perl脚本生成相应的PRX域截断cDNA。密码子对齐由web服务器PAL2NAL生成[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．Paml 4.9 (codeml) [gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]及图形界面PAMLX [gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]用于检测选择压力。生成了位点特异性模型M0(单比)、M1a(中性)、M2a(选择)、M7 (beta)和M8 (beta & ω)。利用CODEML计算各模型的对数似然(lnL)值。采用2 Δ lnL = 2(lnL1−ln0)根据χ2与df的分布进行模型比较。通过CODEML(第一个结果文件)和MEGAX(使用ML方法和基于JTT矩阵的模型)推断祖先序列[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

的表达模式gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba在不同的非生物胁迫处理中gydF4y2Ba

在20% (w/v) PEG 6000处理和200 mM NaCl处理后，分别于0、6、12、24、48和72 h收获小麦三叶期幼苗叶片组织。小麦叶片组织在10 mM h后0、2、6、12、24、48和72 h收割gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba治疗。在2 mM SA、100 μM MeJA、100 μM IAA和100 mM ABA处理后0、1、3、6、12、24和48 h收获小麦叶片组织。收集的所有样本用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA。使用Roche LightCycler®480系统(Roche, Germany)进行第一链cDNA合成和qRT-PCR。小麦基因gydF4y2Ba18 srrnagydF4y2Ba作为内源性对照。相对mRNA表达量用2gydF4y2Ba^{-ΔΔCTgydF4y2Ba}方法。所有的qRT-PCR引物在附加文件中总结gydF4y2Ba11gydF4y2Ba:表S5。gydF4y2Ba

TaPRX-2A蛋白的亚细胞定位gydF4y2Ba

根据ORF的gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba我们克隆了这个没有停止密码子的基因，并将其构建成一个pBINgydF4y2Ba35个年代gydF4y2Ba-gydF4y2BaeGFPgydF4y2Ba载体使用CaMV 35S启动子。随后,pBINgydF4y2Ba35个年代gydF4y2Ba-gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba-gydF4y2BaeGFPgydF4y2Ba和pBINgydF4y2Ba35个年代gydF4y2Ba-gydF4y2BaeGFPgydF4y2Ba(对照)被转化为gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2BaEHA105。的gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2BaEHA105重悬于悬浮液(10 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 10 mM 4- morpholineethone -磺酸水合物pH值5.6,200 mM乙酰丁香酮)。的gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba将悬浮液调整到光密度600值0.6，注射到烟叶中培养3天。用共聚焦显微镜(蔡司LSM880元共聚焦显微镜)观察注射烟草叶片的表皮细胞。此外，我们还对pBIN进行了转换gydF4y2Ba35个年代gydF4y2Ba-gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba-gydF4y2BaeGFPgydF4y2Ba和pBINgydF4y2Ba35个年代gydF4y2Ba-gydF4y2BaeGFPgydF4y2Ba载体通过基因枪介导转化进入洋葱表皮细胞[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba］．将转化后的表皮细胞在28°C暗处培养8-12 h，用共聚焦显微镜观察。的NLS序列gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba使用web服务器cNLS (gydF4y2Bahttp://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgigydF4y2Ba)[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

生理生化参数测定gydF4y2Ba

我们收集了……的叶子gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba-过表达和“KN199”植株在盐处理后10 d。我们用公式计算叶片RWC: RWC = (FW−DW)/(TW−DW) × 100%，其中RWC为相对含水量，FW为鲜重，TW为肥厚鲜重，DW为干重[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba］．采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba］．采用茚三酮反应法测定脯氨酸含量[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba］．可溶性总糖测定采用蒽酮法[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba］．我们用NBT和DAB染色来可视化OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba和HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba水平，如以前所述[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba，gydF4y2Ba80gydF4y2Ba］．采用上述方法检测SOD、CAT和PRX活性[gydF4y2Ba81gydF4y2Ba，gydF4y2Ba82gydF4y2Ba，gydF4y2Ba83gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

研究植物的基因组和蛋白质组刊载于《植物学杂志》(gydF4y2Bahttp://plants.ensembl.org/gydF4y2Ba)．被调查植物的加入数为gydF4y2Bat . aestivumgydF4y2Ba(IWGSC),gydF4y2BaAe。tauschiigydF4y2Ba(Aet_v4.0),gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba(TAIR10),gydF4y2Bab . distachyongydF4y2Ba(v3.0),gydF4y2Bac . reinhardtiigydF4y2Ba(v5.5),gydF4y2Bao .漂白亚麻纤维卷gydF4y2Ba(irgsp - 1.0),gydF4y2Bap .金属盘gydF4y2Ba(Phypa_V3),gydF4y2Ba美国moellendorffiigydF4y2Ba(v1.0),gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2Ba(WEWSeq_v.1.0),gydF4y2Bat . urartugydF4y2Ba(ASM34745v1),gydF4y2Ba诉酿酒用葡萄gydF4y2Ba(12 x)gydF4y2Baz梅斯gydF4y2Ba(B73_RefGen_v4)。TgydF4y2BaaPRX-2AgydF4y2Ba可在NCBI下载，登录编号为AJ878510.1 (gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/gydF4y2Ba)．使用NCBI SRA和EBI ArrayExpress的RNA-seq数据的登录号见方法部分。所研究植物prx的鉴定和外显子-内含子结构在补充文献中有介绍。在当前研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

WT:gydF4y2Ba

野生型gydF4y2Ba

插件可以:gydF4y2Ba

氧化物酶gydF4y2Ba

SOD:gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶gydF4y2Ba

圆荚体:gydF4y2Ba

过氧化物酶gydF4y2Ba

猫:gydF4y2Ba

过氧化氢酶gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

GPX:gydF4y2Ba

谷胱甘肽过氧化物酶gydF4y2Ba

APX型:gydF4y2Ba

抗坏血酸盐过氧化物酶gydF4y2Ba

山:gydF4y2Ba

水杨酸gydF4y2Ba

惩罚:gydF4y2Ba

Methyljasmonic酸gydF4y2Ba

国际宇航科学院:gydF4y2Ba

Indole-3-acetic酸gydF4y2Ba

阿坝:gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

RWC:gydF4y2Ba

相对含水量gydF4y2Ba

电视台:gydF4y2Ba

氮蓝四唑gydF4y2Ba

轻拍:gydF4y2Ba

3-DiaminobenzidinegydF4y2Ba

绿色荧光蛋白:gydF4y2Ba

绿色荧光蛋白gydF4y2Ba

存在:gydF4y2Ba

定量实时聚合酶链反应gydF4y2Ba

PEG6000:gydF4y2Ba

聚乙二醇6000gydF4y2Ba

感谢周淑梅教授(山东农业大学，中国)对生理数据测量的帮助。gydF4y2Ba

国家自然科学基金项目(3315203911、31471488)、转基因专项项目(2016ZX08002003-002、2016ZX08009-003)、国家重点研发计划项目(2016YFD0100602)资助。资助机构在设计研究、收集、分析和解释数据以及撰写手稿方面没有任何作用。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 苏培森和颜俊对这项工作贡献相同。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 山东农业大学农学院，作物生物学国家重点实验室，山东省作物生物学重点实验室，泰安271018gydF4y2Ba

   苏佩森，闫军，李文，王亮，赵金晓，马欣，李安飞，王宏伟，孔令朗gydF4y2Ba

2. 山东农业大学信息科学与工程学院，山东泰安271018gydF4y2Ba

   小君颜gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

PSS、HWW和LRK对实验进行构思和设计;PSS完成了大部分的实验;JY进行了识别和进化分析gydF4y2BaTaPRX-2AgydF4y2Ba，并对手稿进行修改;LW、JXZ和WL进行亚细胞定位和植株转化;AFL提供了植物材料;PSS撰写并修改了手稿。所有作者已阅读并认可最终稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba王:gydF4y2Ba或gydF4y2BaLingrang香港gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

本研究所用小麦品种“KN199”和“苏麦3号”来自山东泰安山东农业大学农学院作物生物学国家重点实验室。它们是公开的，用于非商业目的。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循创作共用署名4.0国际许可协议(Creative Commons Attribution 4.0 International License)，该协议允许在任何媒体或格式中使用、分享、改编、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的署名，提供创作共用许可协议的链接，并说明是否有更改。本文中的图片或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料不包含在文章的创作共用许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超出了允许的用途，您将需要直接从版权所有者那里获得许可。欲查看此许可证的副本，请访问gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献放弃书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba