大米gydF4y2Ba早期衰老2gydF4y2Ba编码肌醇多磷酸激酶，参与叶片衰老gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

叶片早衰通过影响植物的生长发育来影响产量和产量品质。一系列与水稻叶片衰老相关的分子机制已被报道。然而，控制叶片衰老的复杂遗传调控网络还有待阐明。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在这项研究中，一个gydF4y2Ba早期衰老2gydF4y2Ba（gydF4y2Baes2gydF4y2Ba)突变体是从甲基磺酸乙酯诱变(EMS)诱变文库中获得的gydF4y2Ba粳稻gydF4y2Ba水稻品种武育庚7号(WYG7)的叶子gydF4y2Baes2gydF4y2Ba幼苗期衰老早，分蘖期衰老严重。活性氧(ROS)含量显著升高，叶绿素含量、光合速率、过氧化氢酶(CAT)活性显著降低gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体。与衰老、活性氧和叶绿素降解相关的基因上调，而与光合作用和叶绿素合成相关的基因下调gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体与WYG7相比。的gydF4y2BaES2gydF4y2Ba编码肌醇多磷酸激酶(OsIPK2)的基因被精确定位到2号染色体上116.73 kb的区域。DNA测序gydF4y2BaES2gydF4y2Ba在发生错义突变的突变体中，ES2定位于细胞核和细胞质膜，并在水稻各组织中表达。补体实验和过表达实验证实gydF4y2BaES2gydF4y2Ba完全恢复正常表型，叶绿素含量和光合速率与野生型相当。这些结果揭示了新的作用gydF4y2BaOsIPK2gydF4y2Ba因此将为研究水稻叶片早衰的分子机制提供额外的遗传证据。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

的gydF4y2BaES2gydF4y2Ba基因编码的肌醇多磷酸激酶定位于细胞核和细胞质膜，是水稻叶片衰老的必需基因。的进一步研究gydF4y2BaES2gydF4y2Ba将有助于剖析叶片早期衰老和植物生长的遗传机制。gydF4y2Ba

叶片衰老是叶片生命周期中一个内部程序化的退化阶段。在生长发育过程中，植物既有应激性衰老，也有与年龄相关的衰老。从幼苗到成熟，叶片是光合作用的主要来源。成熟阶段，叶细胞有序地发生剧烈的生理代谢变化，如叶绿素降解、蛋白质、脂质和核酸的氧化水解等[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。这些水解的代谢物在多年生植物中重新形成新的芽、茎或根，或在一年生植物中重新形成种子[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。在叶片早期衰老的情况下，叶绿体是第一个被降解的细胞器。因此，叶绿素色素被破坏，叶片颜色逐渐由绿色变为黄色、棕色，最后枯萎[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]。同时，光合作用的减少和生殖器官中同化物积累的减少受遗传因素的调节，并常常由环境胁迫引发，从而导致产量损失[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。在一些杂交水稻品种中，过早衰老导致叶片功能受损和光合产物积累减少，最终影响水稻产量[qh]gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。随着延迟衰老的叶片保持光合活性和花期延长，植物比野生型结籽更多，生物量积累更多[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。因此，了解水稻叶片早衰的机理对水稻育种具有重要意义。gydF4y2Ba

早期衰老过程中最常见的生理变化包括叶绿素降解、活性氧清除、碳氮失衡以及细胞、组织、器官和生物体水平上协调一致的激素反应[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。在过去的几十年里，一系列与水稻叶片衰老相关的基因被分离出来并进行了鉴定，包括转录因子、激素或应激反应的受体和信号成分、代谢调节因子[j]。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。根据所涉及的代谢途径，衰老基因可分为五类。第一种类型也涉及叶绿素降解，如突变gydF4y2BaRLS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsh69gydF4y2Ba导致叶绿素降解，加速叶片衰老[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。此外，在生长后期阻碍叶绿素降解的功能性和非功能性滞绿型基因包括gydF4y2Ba非黄色着色1gydF4y2Ba（gydF4y2BaNYC1gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba非黄色着色3gydF4y2Ba（gydF4y2BaNYC3)gydF4y2Ba，gydF4y2BaNYC1-LIKEgydF4y2Ba（gydF4y2BaNOLgydF4y2Ba),gydF4y2Ba留青稻gydF4y2Ba（gydF4y2Ba岩石gydF4y2Ba） [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。第二类衰老相关基因与调节叶片衰老的植物激素和转录因子有关。例如，脱落酸(ABA)诱导OsNAP调节叶绿素降解，从而影响营养转运和衰老相关基因的表达[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。gydF4y2BaOsFBK12gydF4y2Ba据报道参与了促进叶片衰老的乙烯(ETH)信号通路[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。gydF4y2BaZOG1gydF4y2Ba该基因编码与细胞分裂素(CTK)合成有关的玉米素葡萄糖基转移酶，并介导水稻旗叶衰老[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。在gydF4y2Ba拟南芥,阿富汗二月gydF4y2Ba为吲哚-3-乙酸(IAA)响应因子。为了研究植物的细胞功能gydF4y2Ba阿富汗二月gydF4y2Ba利用敲除基因产生不表达的突变体gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，导致叶片衰老表型延迟[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。第三类与衰老有关的基因，涉及能量代谢途径，包括gydF4y2BaOsNaPRT1gydF4y2Ba/gydF4y2BaLTS1gydF4y2Ba基因。突变的gydF4y2BaLTS1gydF4y2Ba导致NAD含量降低，抑制ossrt的去乙酰化能力gydF4y2Ba。gydF4y2Ba这通过增加H3K9的乙酰化来激活衰老相关基因，最终导致水稻叶片衰老[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。第四种类型是与氮再活化有关的，如gydF4y2BaOsl2gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsFd-GOGATgydF4y2Ba［gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。其他基因，如gydF4y2Ba斑点叶29gydF4y2Ba（gydF4y2BaSPL29gydF4y2Ba)，gydF4y2BaOsSWEET5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba衰老1gydF4y2Ba（gydF4y2BaES1 / TUTOU1gydF4y2Ba)，gydF4y2BaOsGDCHgydF4y2Ba和gydF4y2Ba侏儒和早衰gydF4y2Ba（gydF4y2BaDEL1gydF4y2Ba） [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。多数早衰突变体表现出植株生长发育缺陷，如矮化或半矮化、叶尖枯萎、抽穗提前等[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。因此，鉴定早衰基因对探索早衰机制、提高水稻产量具有重要意义。gydF4y2Ba

肌醇多磷酸盐是一类重要的有机磷化合物和信号分子，广泛分布于各种生物中[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。肌醇多磷酸激酶(IPMK/IPK2)是肌醇磷酸代谢的关键酶，可将肌醇1,4,5-三磷酸(IP3)转化为肌醇四磷酸(IP4)和肌醇五磷酸(IP5) [gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。在真核细胞中，ipk2介导IP4和IP5的产生以促进细胞生长，携带ScIPK2缺失的酵母菌株表现出温度敏感的生长缺陷[j]。gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。ScIPK2也是ArgR-Mcm1转录复合体中不可缺少的组成部分，它调节精氨酸代谢[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。在真核生物中，它们参与多种生物功能，如细胞程序性死亡、激素信号转导、离子通道调节和对氧化应激的敏感性[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。例如，生长素的生物合成、运输和腋芽分枝的介导也受肌醇多磷酸激酶基因(gydF4y2BaAtIPK2αgydF4y2Ba和gydF4y2BaAtIpk2βgydF4y2Ba） [gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。的过度表达gydF4y2BaAtIPK2αgydF4y2Ba通过调节肌醇三磷酸(IP3)介导的钙积累和过表达gydF4y2BaAtIpk2βgydF4y2Ba导致多腋芽分枝在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。gydF4y2BaAtIPK2βgydF4y2Ba参与肌醇1,2,3,4,5,6-己基磷酸(IP6，植酸盐)的合成。gydF4y2BaAtIPK2bgydF4y2Ba与蔗糖非发酵1相关蛋白激酶(SnRK1.1)相互作用，参与葡萄糖抑制种子萌发、营养生长、开花和衰老[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。肌醇多磷酸激酶基因(gydF4y2BaOsIPK2gydF4y2Ba)先前已被分离并鉴定为水稻植酸生物合成候选基因。上调的gydF4y2BaOsIPK2gydF4y2Ba表明在花药中，除了脂质不依赖的途径外，磷脂酶C (PLC)介导的途径也是活跃的[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。肌醇多磷酸多激酶(IPMK)作为一种转录激活因子，在哺乳动物中与肿瘤抑制因子P53结合，从而促进P53介导的细胞死亡[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。的功能gydF4y2BaIPK2gydF4y2Ba在哺乳动物和植物中已有报道，但在水稻叶片早期衰老中的作用尚未有遗传学研究发表。gydF4y2Ba

为研究水稻叶片衰老的分子机制，研究一个新的叶片衰老突变体。gydF4y2Ba早期衰老2gydF4y2Ba（gydF4y2Baes2gydF4y2Ba)，从甲基磺酸乙酯(EMS)中分离得到gydF4y2Ba粳稻(Oryza sativa japonicagydF4y2Ba。Wuyugeng 7 (WYG7)。从苗期开始，叶片出现黄斑，并逐渐枯萎，直至分蘖期。的gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体的叶绿素含量、光合速率和活性氧含量均低于WYG7。基于图谱的克隆及序列分析gydF4y2BaES2gydF4y2Ba基因显示它编码肌醇多磷酸激酶(OsIPK2)。互补实验和过表达分析表明gydF4y2BaES2gydF4y2Ba/gydF4y2BaOsIPK2gydF4y2Ba突变导致水稻叶片早衰，影响水稻产量相关性状。gydF4y2Ba

叶片早衰，农艺性状下降gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体gydF4y2Ba

我们发现了一个突变体，gydF4y2Baes2gydF4y2Ba，具有早叶衰老表型，来自于EMS诱变突变群体gydF4y2Ba粳稻gydF4y2Ba品种、WYG7。的gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体从苗期到成熟期(授粉后45天)均表现出叶片衰老。苗期叶片呈黄斑分布，老化叶片逐渐枯萎(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baf)。为了更准确地分析叶片衰老表型，将WYG7的离体叶片与gydF4y2Baes2gydF4y2Ba2叶期突变体在28°C的暗处保存。与WYG7相比，叶片的gydF4y2Baes2gydF4y2Ba在黑暗中呆了5天后，几乎变得更黄了。这表明基因突变gydF4y2BaES2gydF4y2Ba加速黑暗诱导的叶片衰老(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S1)。gydF4y2Ba

此外，gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体的株高、节间长、穗长、一次枝数、二次枝数、粒宽、千粒重等农艺性状显著低于野生型。此外，分蘖数较野生型植株显著增加(附加文件)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S2)。这些结果表明，早期衰老的叶片gydF4y2Baes2gydF4y2Ba对产量有负面影响。gydF4y2Ba

叶绿素含量下降，光合能力下降，叶绿体超微结构异常gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体gydF4y2Ba

与WYG7相比，叶绿素gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba类胡萝卜素(Car)含量显著降低gydF4y2Baes2gydF4y2Ba苗期、分蘖期和抽穗期突变体(图2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba胃肠道gydF4y2Ba）gydF4y2Ba。在分蘖期测定了WYG7和冬小麦的光合参数gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体。净光合速率(gydF4y2BaPgydF4y2Ba_ngydF4y2Ba)、蒸腾速率(gydF4y2BaTgydF4y2Ba_rgydF4y2Ba)及气孔导度(gydF4y2BaGgydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba})均显著下降gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体与野生型相比(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baj-l)。透射电子显微镜(TEM)分析表明，叶绿体数量显著减少gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体与WYG7相比。叶片的类囊体和间质层结构排列混乱gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体。同时，发现了更多的亲锇颗粒(OG)gydF4y2Baes2gydF4y2Ba与WYG7相比。因此，基因突变gydF4y2BaES2gydF4y2Ba导致叶绿体发育异常(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba模拟)。gydF4y2Ba

的gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体表现为细胞死亡，叶片中ROS积累增多gydF4y2Ba

以确定是否在早期衰老gydF4y2Baes2gydF4y2Ba由于超氧自由基的累积，进行了硝基蓝四氮唑(NBT)染色，发现了更多的蓝色甲醛沉淀gydF4y2Baes2gydF4y2Ba分蘖期叶片比WYG7多(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bae)。我们还检测了过氧化氢(HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(3, 3-二氨基联苯胺(DAB)染色)在WYG7和gydF4y2Baes2gydF4y2Ba。形成的红褐色的甲酸盐岩沉淀在gydF4y2Baes2gydF4y2Ba分蘖期叶片表明H的积累gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Baf)。此外，HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在分蘖期测定了WYG7和WYG7的丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性gydF4y2Baes2gydF4y2Ba,分别。结果表明，HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和丙二醛含量显著升高gydF4y2Baes2gydF4y2Ba比WYG7(图1)gydF4y2Ba2gydF4y2Bag, i). POD、SOD和APX活性升高，CAT活性降低gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体。因此,gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体表现出比野生型更多的ROS积累(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bah, j-l)。为了检验细胞死亡gydF4y2Baes2gydF4y2Ba，树叶gydF4y2Baes2gydF4y2Ba对分蘖期突变体和WYG7进行TUNEL试验。观察到较强的绿色荧光gydF4y2Baes2gydF4y2Ba叶肉细胞数量明显高于WYG7，说明大量DNA片段积累，细胞发生凋亡gydF4y2Baes2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba模拟)。gydF4y2Ba

衰老、活性氧、叶绿素合成与降解、光合作用和叶绿体发育相关基因的表达变化gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体gydF4y2Ba

了解早期衰老的分子基础gydF4y2Baes2gydF4y2Ba我们选择了与衰老、活性氧、叶绿素合成和降解、光合作用和叶绿体发育相关的基因进行qRT-PCR分析。一致地，几个与衰老相关的基因的表达水平，如gydF4y2BaOsh36gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsl57gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsl85gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsWRKY23gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsWRKY72gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsNAC2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba岩石gydF4y2Ba［gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]显著上调gydF4y2Baes2gydF4y2Ba分蘖期与WYG7相比(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa). ROS相关基因的转录量，包括gydF4y2BaAOX1agydF4y2Ba，gydF4y2BaAOX1bgydF4y2Ba，gydF4y2BaAPX1gydF4y2Ba，gydF4y2BaAPX2gydF4y2Ba，gydF4y2BaSODBgydF4y2Ba，gydF4y2BaSODA1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba渺位gydF4y2Ba和gydF4y2BaCATBgydF4y2Ba［gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba的显著上调gydF4y2Baes2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).叶绿素合成和降解相关基因的qRT-PCR结果显示，除gydF4y2BaHEME1gydF4y2Ba的表达水平gydF4y2Ba丙烯酸-gydF4y2Ba，gydF4y2BaGSAgydF4y2Ba，gydF4y2BaCHLDgydF4y2Ba，gydF4y2BaDVRgydF4y2Ba，gydF4y2BaCHLHgydF4y2Ba，gydF4y2BaPORAgydF4y2Ba，gydF4y2BaPORBgydF4y2Ba和gydF4y2BaCAO1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65gydF4y2Ba，gydF4y2Ba66gydF4y2Ba，gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]显著下调，而gydF4y2BaNYC1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNYC3gydF4y2Ba，gydF4y2BaNOLgydF4y2Ba，gydF4y2BaRccr1gydF4y2Ba和gydF4y2BaPCCRgydF4y2Ba［gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba]显著上调gydF4y2Baes2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).除了两个基因gydF4y2Ba红细胞表面gydF4y2Ba和gydF4y2BaRpoC2gydF4y2Ba，所有被试光合作用和叶绿体发育相关基因的表达水平，涉及gydF4y2Ba:gydF4y2Ba，gydF4y2BapsaAgydF4y2Ba，gydF4y2BapsbAgydF4y2Ba，gydF4y2BaCAB1RgydF4y2Ba，gydF4y2BaCAB2RgydF4y2Ba，gydF4y2BaLchP2gydF4y2Ba，gydF4y2BaV2gydF4y2Ba，gydF4y2BaRpoC1gydF4y2Ba，gydF4y2BaRps15gydF4y2Ba，gydF4y2BaLhcb1gydF4y2Ba和gydF4y2BaLhcb4gydF4y2Ba［gydF4y2Ba69gydF4y2Ba，gydF4y2Ba70gydF4y2Ba，gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]的显著下调gydF4y2Baes2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad).这些结果与活性氧积累、光合能力下降和叶绿素含量下降有关gydF4y2Baes2gydF4y2Ba在转录水平上的突变。gydF4y2Ba

遗传分析与精细定位gydF4y2BaES2gydF4y2Ba基因gydF4y2Ba

用于基因分析gydF4y2Baes2gydF4y2Ba变种人，我们让变种人gydF4y2Ba粳稻gydF4y2Ba各种WYG7。所有FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba植株表现出野生型表型，表明该突变是隐性的。在784个随机抽取的FgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba株数、野生型株数和突变型株数分别为604株和180株，比例为3:1gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 1.7361)。因此，该突变体由一个隐性核基因控制，命名为gydF4y2BaES2gydF4y2Ba基因(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表1)。gydF4y2Ba

为了精细地映射gydF4y2BaES2gydF4y2Ba基因，FgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba分离种群是由种群间的杂交产生的gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体,gydF4y2Ba籼稻gydF4y2Ba93 - 11。利用分布在12条染色体上的225个多态性SSR标记对94个突变株进行染色体连锁分析。2号染色体、B2-9、B2-10和B2-11上的3个SSR/STS标记被连锁gydF4y2BaES2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa).利用这3个标记共检测了94个突变株，初步定位于B2-10和B2-11之间。到精细地图gydF4y2BaES2gydF4y2Ba，作图种群扩大到521 FgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba变异个体。通过对日本裸和93-11基因组序列的比较，发现B2-10和B2-11之间存在7个多态Indel标记。使用这些标记，gydF4y2BaES2gydF4y2Ba基因在ID2-3和ID2-4之间116.73 kb的区域内被精细定位(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).根据该地区的Nipponbare基因组序列(gydF4y2Bahttps://rapdb.dna.affrc.go.jp/gydF4y2Ba)，有18个带注释的orf，其中基因外显子有G到a的替换gydF4y2BaLOC_Os02g32370gydF4y2Ba在gydF4y2Baes2gydF4y2Ba导致甘氨酸被谷氨酸取代(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一部)。gydF4y2Ba

基因序列与系统发育分析gydF4y2BaOsIPK2gydF4y2Ba基因gydF4y2Ba

的gydF4y2BaES2gydF4y2Ba基因编码肌醇多磷酸激酶(gydF4y2BaOsIPK2gydF4y2Ba）.蛋白序列比对显示GlygydF4y2Ba_42gydF4y2BaOsES2在植物中高度保守(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).利用不同物种的OsES2蛋白同源序列构建系统发育树，将其分为单子叶和双子叶两类。其中，水稻ES2的同源性最高(76.57%)gydF4y2BaBrachypodium distachyongydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

OsIPK2 / ES2gydF4y2Ba基因与水稻叶片早衰有关gydF4y2Ba

为了确认gydF4y2BaOsIPK2gydF4y2Ba的gydF4y2BaES2gydF4y2Ba进行互补试验，13株转基因植株均恢复了野生型表型(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa, b)。正如预期的那样，基因表达水平、叶绿素含量和光合参数恢复到野生型(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac、e;额外的文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S3)。此外，过表达实验显示，9株转基因植株均恢复了野生型表型(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa, b).随着gydF4y2BaOsIPK2gydF4y2Ba，叶绿素含量和光合参数也升高(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bad, e，附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S3)。gydF4y2Ba

ES2定位于细胞核和质膜，并在水稻各组织中表达gydF4y2Ba

为了确定ES2蛋白的亚细胞定位，将p35S::ES2::GFP载体转移到水稻原生质体和烟草(gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba)，分别以p35S::GFP空矢量为控制(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:图4a-c, g-i)。将p35S::ES2::GFP载体转移到水稻原生质体中，荧光共聚焦观察发现ES2定位于细胞核和质膜(另附文件)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba图S4d-f)。烟草叶表皮细胞的细胞核和质膜上也观察到荧光信号(gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba)转换为p35S::ES2::GFP矢量(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:图s4j - 1)。此外，将p35S::ES2::YFP载体转移到水稻原生质体中，荧光共聚焦观察发现，ES2也定位在细胞核和质膜上(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba:图5)。gydF4y2Ba

β-葡萄糖醛酸酶(GUS)染色观察gydF4y2BaES2gydF4y2Ba在各种组织中表达，包括根、茎、叶、鞘和穗，其中叶中最强gydF4y2Ba10gydF4y2Ba:图S6a-e)。qRT-PCR结果一致显示gydF4y2BaES2gydF4y2Ba在根、茎、叶、鞘和穗中表达，其中叶中表达量最高，其次是茎、穗、根和鞘(附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba图S6f)。gydF4y2Ba

叶片衰老是程序化过程中必不可少的发育阶段，伴随着植物叶片颜色变化、叶绿体降解、叶绿素含量和光合效率降低等特征的出现。最终，叶片过早衰老可能导致植物生长发育迟缓，产量下降[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba]。近年来，一系列水稻叶片衰老相关基因被克隆和鉴定[j]。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]。下叶gydF4y2Ba叶过早衰老3gydF4y2Ba突变体(gydF4y2Bapls3gydF4y2Ba)在分蘖期先变黄，成熟期衰老严重。的gydF4y2Bapls3gydF4y2Ba突变体的叶绿素和褪黑素含量降低，株高降低，千粒重降低[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。的顶端和边缘gydF4y2Baes4gydF4y2Ba突变体分蘖期变黄，灌浆期衰老。的gydF4y2Baes4gydF4y2Ba突变体还表现出叶绿素含量和光合速率降低，株高和千粒重降低[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]。在这项研究中gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体也表现出快速的叶片衰老，这与以前报道的突变体不同。首先，植物的早期衰老伴随着叶绿素含量的变化。幼苗期叶片颜色由绿色变为黄斑，分蘖期至成熟期叶片干枯变化(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa-f)，而叶绿素含量下降，光合速率降低(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bag-l)。二是植株高度、节间长、穗长和千粒重显著降低gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体(附加文件)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S2)。这些结果表明，衰老过程中gydF4y2Baes2gydF4y2Ba因此，突变比先前报道的突变更早发生，gydF4y2Baes2gydF4y2Ba是剖析叶片衰老机制的新突变体。gydF4y2Ba

在高等植物中，有关肌醇多磷酸激酶参与多种生物学功能的报道较多。有两个gydF4y2BaIPK2gydF4y2Ba拟南芥中的基因gydF4y2BaAtIPK2αgydF4y2Ba和gydF4y2BaAtIpk2βgydF4y2Ba，只有一个是大米[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。在拟南芥中,gydF4y2BaIPK2gydF4y2Ba在腋芽分枝、腋芽分枝、根系生长、植酸合成、非生物胁迫响应、生长素响应、种子萌发、营养生长、开花和衰老等过程中发挥重要作用[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba，gydF4y2Ba75gydF4y2Ba]。gydF4y2BaOsIPK2gydF4y2Ba已被分离并鉴定为水稻植酸的候选生物合成基因[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。但其生理功能尚未见报道。最近，有报道称肌醇多磷酸激酶直接与gydF4y2BaOsIAA11gydF4y2Ba调控侧根形成，参与赤霉素信号调节，影响茎伸长和育性[j]。gydF4y2Ba76gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba]。在这项研究中，与先前报道的基因不同，早期衰老表型是由基因突变引起的gydF4y2BaES2gydF4y2Ba/gydF4y2BaOsIPK2gydF4y2Ba肌醇多磷酸激酶基因。gydF4y2BaES2gydF4y2Ba在所有组织中均有表达，但主要在叶肉细胞中表达。qRT-PCR结果显示gydF4y2BaOsIPK2gydF4y2Ba在gydF4y2Baes2gydF4y2Ba在苗期显著上调，在分蘖和抽穗期显著下调gydF4y2Ba11gydF4y2Ba:图S7)。此外，变异的gydF4y2BaES2gydF4y2Ba吉恩变成了gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变株和突变株均不能恢复野生型表型，但该基因的表达量与野生型相比显著增加gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体(附加文件gydF4y2Ba12gydF4y2Ba:图S8)。考虑到叶片衰老的发生gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体从苗期到成熟期，表型变化由单核苷酸突变引起gydF4y2BaES2gydF4y2Ba/gydF4y2BaOsIPK2gydF4y2Ba可能与基因表达水平无关。为了发现突变是否会损害激酶活性对植酸产生水平的影响，我们测量了野生型WYG7和egydF4y2Bas2gydF4y2Ba突变体。植酸含量显著降低gydF4y2Bas2gydF4y2Ba表明基因突变gydF4y2BaIPK2gydF4y2Ba阻碍植酸生物合成(附加文件)gydF4y2Ba13gydF4y2Ba:图S9)。gydF4y2Ba

前期研究表明，叶片早期衰老与活性氧积累有关[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba78gydF4y2Ba，尤其是HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba积累(gydF4y2Ba79gydF4y2Ba，gydF4y2Ba80gydF4y2Ba，gydF4y2Ba81gydF4y2Ba]。ROS积累导致类囊体膜和其他细胞成分的氧化损伤[gydF4y2Ba82gydF4y2Ba]。这里，NBT和DAB染色显示OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba和HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba积累于…gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体与野生型WYG7相比(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bae, f).我们推测叶绿素含量降低和叶绿体超微结构异常gydF4y2Baes2gydF4y2Ba是由于活性氧引起的氧化损伤。qRT-PCR分析显示，衰老相关基因的表达水平上调gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa). TUNEL实验也显示，细胞中出现了大量的DNA片段gydF4y2Baes2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.此外,gydF4y2BaES2gydF4y2Ba定位于细胞核和质膜的蛋白(图5)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，其中产生大量活性氧。这些结果表明，叶片衰老可能是由活性氧积累引起的。gydF4y2Ba

在植物早期衰老过程中，叶片发生一系列生理变化，如HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和MDA, CAT、SOD、POD和APX活性，以及细胞死亡[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba，gydF4y2Ba83gydF4y2Ba，gydF4y2Ba84gydF4y2Ba，gydF4y2Ba85gydF4y2Ba]。在衰老早期，SOD和CAT可以清除ROS [gydF4y2Ba86gydF4y2Ba，gydF4y2Ba87gydF4y2Ba]。SOD催化OgydF4y2Ba^{2−gydF4y2Ba}歧化酶产生氢gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2.gydF4y2BaCAT是主要的HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba清除酶。APX在H的控制中也起着重要作用gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba细胞内水平[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba，gydF4y2Ba85gydF4y2Ba，gydF4y2Ba88gydF4y2Ba]。在我们的研究中，SOD、POD和APX的活性gydF4y2Baes2gydF4y2Ba显著高于WYG7，而CAT活性显著低于WYG7(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bah, j-l)。这与先前关于水稻早衰突变体的报道一致[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba73gydF4y2Ba，gydF4y2Ba89gydF4y2Ba，gydF4y2Ba90gydF4y2Ba，gydF4y2Ba91gydF4y2Ba]。因此，表明SOD活性升高gydF4y2Baes2gydF4y2Ba是由于高OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba产生和降低cat活性加速了H的积累gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。叶片中MDA含量的增加进一步证明了叶片中脂质过氧化和ROS积累gydF4y2Baes2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Bai).叶片衰老是由大量ROS相关基因介导的，如gydF4y2BaAOX1agydF4y2Ba，gydF4y2BaAOX1bgydF4y2Ba，gydF4y2BaAPX1gydF4y2Ba，gydF4y2BaAPX2gydF4y2Ba，gydF4y2BaSODBgydF4y2Ba，gydF4y2BaSODA1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba渺位gydF4y2Ba和gydF4y2BaCATBgydF4y2Ba。qRT-PCR结果显示，它们的表达水平在gydF4y2Baes2gydF4y2Ba与WYG7相比(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

综上所述，gydF4y2BaES2gydF4y2Ba/gydF4y2BaOsIPK2gydF4y2Ba基因导致HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2BaMDA含量、CAT、SOD、POD和APX活性、还原性和叶绿素含量gydF4y2BaPgydF4y2Ba_ngydF4y2Ba含量，最终导致叶片衰老，降低水稻产量。gydF4y2Ba

植物材料、生长条件和暗处理gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba粳稻gydF4y2Ba品种武耕7号(WYG7)和gydF4y2Ba籼稻gydF4y2Ba品种93-11，在中国传统栽培。这些种子由位于中国浙江省杭州的中国水稻研究所(CNRRI)提供。早衰叶突变体gydF4y2Baes2gydF4y2Ba通过EMS诱变获得WYG7。这个突变体被杂交了gydF4y2Ba籼稻gydF4y2Ba品种93-11，用于构建FgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba人口的映射。的gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体和子代遗传稳定，衰老早。所有的水稻都是在中国浙江省杭州CNRRI的田地里种植的。在暗处理中，将培养箱中生长的2叶期植物(出现黄色斑点之前)的离体叶片放在ddH上孵育gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba0在28°C下完全黑暗中保存5天。gydF4y2Ba

叶绿素含量检测gydF4y2Ba

野生植物的新鲜叶子和gydF4y2Baes2gydF4y2Ba在田间条件下对不同生育期的突变体进行取样。新鲜叶片去主叶脉后切成长约0.5 cm、重0.05 g的小片，置于5.0 ml 80%丙酮中黑暗浸泡24 h，每8 ~ 10 h摇晃一次，直至光合色素完全溶解。使用美国BACKMAN COULTER DU800可见分光光度计在470 nm、645 nm和663 nm处测量1 ml样品溶液。试验每组设3个生物重复gydF4y2BatgydF4y2Ba统计分析中采用-检验。用于计算叶绿素的公式gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba(排名gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba),叶绿素gydF4y2BabgydF4y2Ba(排名gydF4y2BabgydF4y2Ba)和类胡萝卜素(Car)的含量如下[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]：gydF4y2Ba

光合速率测定gydF4y2Ba

在日照时间为9:00的情况下，净光合速率(gydF4y2BaPgydF4y2Ba_ngydF4y2Ba)、蒸腾速率(gydF4y2BaTgydF4y2Ba_rgydF4y2Ba)、气孔导度(gydF4y2BaGgydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba})的完全展开的叶片从WYG7和gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体采用LI-6400便携式光合作用测量仪(Li-Cor, Lincoln, NE, usa)，温度28°C, 1200 μmol光子mgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}辐照度和400 μmol molgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba分蘖期田间条件下浓度。采用3个生物重复gydF4y2BatgydF4y2Ba-检验进行统计分析。gydF4y2Ba

叶绿体超微结构的透射电镜分析gydF4y2Ba

野生型WYG7的新鲜叶子和gydF4y2Baes2gydF4y2Ba田间取样幼苗期和分蘖期植株，去除主脉。将一小段切成约0.5-1 cm的小段，立即放入含有2.5%戊二醛固定剂的2ml中，真空抽除空气约2h，使其完全浸入管底，在4℃下保存16h以上。片段在磷酸缓冲液(0.1 M, PH 7.0)中洗涤3次，每步洗涤15分钟，并用1% (w/v) OsO处理gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba在磷酸盐缓冲液中浸泡1-2小时。在磷酸盐缓冲液中洗涤3次，每步洗涤15分钟后，使用从30%到100%的乙醇溶液梯度脱水，每步洗涤15分钟。将样品置于酒精和90%丙酮的1:1混合物中，室温下放置20分钟。然后，将样品转移到90%丙酮中20 min，再转移到100%丙酮中脱水处理3次，每步15 min。脱水处理后，将样品转移到最终的Spurr树脂混合物中过夜。然后将标本放入包埋介质的胶囊中，在70℃下加热9 h。标本切片分别用醋酸铀酰和碱性柠檬酸铅染色15 min，然后用电子显微镜观察(日立HgydF4y2Ba^{−7650gydF4y2Ba}(日本东京)。gydF4y2Ba

硝基蓝四氮唑(NBT)和3,3 ' -二氨基联苯胺(DAB)染色gydF4y2Ba

超氧阴离子(O)的定性分析gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)和过氧化氢(HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba硝基蓝四氮唑(NBT)和3,3′-二氨基联苯胺(DAB)染色[gydF4y2Ba92gydF4y2Ba，gydF4y2Ba93gydF4y2Ba]。WYG7的新鲜叶子和gydF4y2Baes2gydF4y2Ba分别在0.05% (w/v) NBT或0.1% (w/v) DAB (pH 5.8)中培养12 h，温度28°C，黑暗条件下轻摇。gydF4y2Ba

衰老相关生理指标及植酸测定gydF4y2Ba

过氧化氢(HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)和丙二醛(MDA)，过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性测定试剂盒(苏州克明生物科技有限公司)。在)。WYG7的叶子和gydF4y2Baes2gydF4y2Ba从分蘖期稻田植株中取样。植酸含量采用苏州科明生物技术有限公司的测定试剂盒进行测定。在)。WYG7的叶子和gydF4y2Baes2gydF4y2Ba从水稻幼苗、分蘖期和抽穗期的植株中取样。采用3个生物重复gydF4y2BatgydF4y2Ba进行-test。gydF4y2Ba

TUNEL法检测细胞凋亡gydF4y2Ba

分蘖期叶片用FAA固定液固定，石蜡包埋。切片在显微镜下检查，选择合适的载玻片，用梯度酒精脱蜡。TUNEL染色参照Huang et al. (2001) [gydF4y2Ba94gydF4y2Ba]，用DeadEnd™荧光TUNEL系统试剂盒(Promega, Wisconsin, USA)检测细胞凋亡。用激光扫描共聚焦显微镜(蔡司LSM700, Carl Zeiss, Inc.， Thornwood, NY, USA)检测凋亡细胞(荧光素-12- dutp)在红色(620 nm)背景(碘化丙啶，PI)下的局部绿色荧光(520 nm)。gydF4y2Ba

遗传分析和精细定位gydF4y2Ba

相互交叉gydF4y2Baes2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba粳稻gydF4y2Ba采用WYG7进行遗传分析。FgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba用分离种群进行χgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba测试。使用的遗传分析信息在附加文件中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S1。对于精细映射，FgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba分离性种群是由杂交产生的gydF4y2Baes2gydF4y2Ba《变种人》gydF4y2Ba籼稻gydF4y2Ba93 - 11。FgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在杭州的水田中种植植物，用于分离分析。华氏94度gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba表型为突变体的单株植物被用于初始定位gydF4y2Baes2gydF4y2Ba。华氏521度gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba利用突变株进行精细定位。采用十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法提取叶片总DNA样本。利用225个SSR和Indel标记进行初步定位，这些标记分布在水稻(gydF4y2Bahttp://www.Gramene.orggydF4y2Ba）.的精细映射gydF4y2BaES2gydF4y2Ba通过比较Gramene网站上Nipponbare与93-11的序列，利用Primer Premier 5.0软件设计新的Indel标记。所使用的标记信息在附加文件中列出gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表S2。gydF4y2Ba

序列与系统发育分析gydF4y2Ba

由295个氨基酸组成的ES2蛋白序列从Gramene网站(gydF4y2Bahttp://www.gramene.org/gydF4y2Ba）.利用美国国家生物技术信息中心网站(NCBI)的BLASTP程序对ES2进行同源分析。gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/gydF4y2Ba）.DNAMAN用于序列比对。采用MEGA 7.0软件，采用自举法和1000个重复，构建了菌株的系统发育树gydF4y2BaES2gydF4y2Ba和同源蛋白。gydF4y2Ba

质粒构建和植物转化gydF4y2Ba

来验证是否gydF4y2BaLOC_Os02g32370gydF4y2Ba是gydF4y2BaES2gydF4y2Ba基因，一个6030 bp的基因组序列，包括gydF4y2BaES2gydF4y2Ba利用ES2-COM引物从野生型WYG7中扩增出编码区及上下游序列，并插入pCAMBIA1300载体中。为了构建过表达载体，将888 bp的CDS插入pCAMIA1300s载体中。所有向量都变换成gydF4y2Baes2gydF4y2Ba突变体的gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba(EHA105)介导的转换。所使用的引物序列在附加文件中列出gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表S3。gydF4y2Ba

亚细胞定位和GUS实验gydF4y2Ba

带Sal的引物gydF4y2Ba我gydF4y2Ba设计连接器扩增WYG7的CDS序列，通过重组方法将其连接到GFP载体pCAMBIA1301-35S-S65T-GFP上，转化为水稻原生质体[gydF4y2Ba95gydF4y2Ba]，并转化为烟草(gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba)用阮等人(2019)描述的方案[gydF4y2Ba96gydF4y2Ba]。此外，通过重组方法将YFP载体pCAMBIA1300-35S-YFP转化到水稻原生质体中。的瞬态表达式gydF4y2Baes2gydF4y2Ba进行了分析。分别用激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss LSM700, Carl Zeiss, Inc.， Thornwood, NY, USA)观察GFP和YFP信号。gydF4y2Ba

验证的组织特异性表达gydF4y2BaES2gydF4y2Ba的发起人gydF4y2BaES2gydF4y2Ba从WYG7基因组DNA中扩增出(ATG上游2103 bp)，插入GUS报告基因双载体pCAMBIA1305中。将重组载体导入到WYG7愈伤组织中，获得转基因植株。GUS实验在转基因植物的不同组织上进行，包括根、茎、叶、鞘和穗。gydF4y2Ba

RNA提取及实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析gydF4y2Ba

从野生型WYG7和野生型WYG7的根、茎、叶、鞘和穗中提取总RNA样本gydF4y2Baes2gydF4y2Ba在分蘖阶段使用AxyPrep™总RNA迷你试剂盒(Axygen)。然后使用ReverTra Ace®定量PCR RT Master Mix gDNA remover Kit (Toyobo Co. Ltd.;gydF4y2Bahttp://www.toyobo.cn/gydF4y2Ba）.采用CFX96 Touch™Real-Time PCR (Bio-Rad)进行qRT-PCR分析。利用水稻内参基因检测所有靶基因的表达水平gydF4y2Ba组蛋白gydF4y2Ba（gydF4y2BaLOC_Os06g04030gydF4y2Ba)作为标准。试验共进行3次生物重复gydF4y2BatgydF4y2Ba采用-检验进行统计分析。用于qRT-PCR的引物在附加文件中列出gydF4y2Ba4gydF4y2Ba表S4。gydF4y2Ba

所有相关数据均以图表形式在文中提供。gydF4y2Ba

EMS:gydF4y2Ba

甲磺酸乙酯诱变gydF4y2Ba

排名:gydF4y2Ba

叶绿素gydF4y2Ba

的背影gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

叶绿素gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba

的背影gydF4y2BabgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

叶绿素gydF4y2BabgydF4y2Ba

汽车:gydF4y2Ba

类胡萝卜素gydF4y2Ba

透射电镜:gydF4y2Ba

透射电子显微镜gydF4y2Ba

电视台:gydF4y2Ba

硝基蓝四氮唑gydF4y2Ba

轻拍:gydF4y2Ba

3, 3 ' -diaminobenzidinegydF4y2Ba

存在:gydF4y2Ba

实时定量PCRgydF4y2Ba

PgydF4y2Ba_ngydF4y2Ba：gydF4y2Ba

净光合速率gydF4y2Ba

TgydF4y2Ba_rgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

蒸腾速率gydF4y2Ba

GgydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba}：gydF4y2Ba

气孔导度gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

超氧化物阴离子gydF4y2Ba

HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

过氧化氢gydF4y2Ba

MDA:gydF4y2Ba

丙二醛gydF4y2Ba

猫:gydF4y2Ba

过氧化氢酶gydF4y2Ba

SOD:gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶gydF4y2Ba

圆荚体:gydF4y2Ba

过氧化物酶gydF4y2Ba

APX型:gydF4y2Ba

抗坏血酸盐过氧化物酶gydF4y2Ba

TUNEL:gydF4y2Ba

末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP镍端标记gydF4y2Ba

PI:gydF4y2Ba

Propidium碘化gydF4y2Ba

cd:gydF4y2Ba

编码序列gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

分子实验、基因分析及出版费用由国家自然科学基金(批准号:31901481)资助。实验材料的培养和生理测定由国家重点研发计划(2016YFD0100400)资助。资助机构没有在研究设计、数据收集、分析和解释以及撰写论文中发挥作用。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 沈阳农业大学水稻研究所/农业部东北水稻生物学与育种重点实验室，沈阳110866gydF4y2Ba

   杨胜龙，张安鹏，张宇，徐正进，王家玉gydF4y2Ba

2. 中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室，浙江杭州310006gydF4y2Ba

   杨胜龙，方国南，张安鹏，阮半普，姜宏振，丁士林，刘朝磊，张宇，贾诺信，胡鹏，高振宇，钱倩gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

S Y, Z G和Q Q设计了实验。孙勇，郭峰，阿忠，张建军，孙德东，王瑞平，陈立林，潘辉进行了实验。zg, jw和Q Q监督了这项研究。S Y写了手稿。B R, Y Z, N J, Z X, Z G对原稿进行了修改。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba(高gydF4y2Ba，gydF4y2Ba嘉王gydF4y2Ba或gydF4y2Ba茜茜gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和来源，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可协议中，除非在材料的署名中另有说明。如果材料未包含在文章的知识共享许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超过允许的用途，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba。创作共用公共领域免责声明(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba