异三聚体g蛋白α亚基(GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba)赋予加工番茄植株耐寒性(GydF4y2BaLycopersicon esculentumGydF4y2Ba磨机)GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

番茄 （GydF4y2BaLycopersicon esculentumGydF4y2Ba密尔)是关键的食物，它们的分子生物学和进化已经得到很好的描述。番茄原产于热带地区，因此对寒冷很敏感。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在这里,我们生成的GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba过度表达和RNA干扰（RNAi）转基因番茄植株，然后我们将其用于研究GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba响应冷应激。在血浆膜中检测到功能性Legpa1，内源性GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba在根和叶子中高度表达。冷治疗积极诱导表达GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba. 过表达GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba赋予耐寒条件的耐受性，并调节与番茄植物中CBF表达-C重复结合因子（冰CBF）途径（冰CBF）途径有关的基因的表达。在里面GydF4y2BaLeGPA1 -GydF4y2Ba过表达转基因植株在低温胁迫下，超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性升高，可溶性糖和脯氨酸含量升高，活性氧和膜脂过氧化降低。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们的研究结果表明，抗氧化系统的改进可以帮助植物应对由冷应激引起的氧化损伤，从而稳定细胞膜结构并增加光合作用速率。这里提出的数据提供了关键作用的证据GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba在植物细胞中介导冷信号转导。这些发现扩展了我们对g蛋白在植物中的作用的认识，并有助于阐明在番茄加工过程中调控生长发育的机制。GydF4y2Ba

干旱、高温、冷害、盐害和重金属毒性等非生物胁迫严重影响作物生长和粮食生产，每年给农业生产造成的损失超过1000亿美元[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]．为了抵抗损伤，植物在自然地理环境中长期变化期间，植物具有感测和传递转录调节的生理途径，并对低温应激的反应。这些包括跨膜信号转导途径，其中细胞质膜上的信号传导组分，例如异映上型G-蛋白，起到至关重要的作用[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

异三聚体g蛋白是由三个亚基组成的复合物，包括Gα， Gβ和Gγ。g蛋白的功能在动物中很好理解[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba[哺乳动物中已鉴定出20多种Gα。Gα亚基具有以下功能位点：ADP-核糖基化，GTP / GDP结合，血浆膜受体识别和结合，GTP酶活性和细胞内效应结合位点。这些位点与异映上的G蛋白功能密切相关，因此，Gα通常被认为是函数亚基[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]．马等人。基于哺乳动物G蛋白α-亚基序列同源物的使用现代分子生物学技术分离第一GydF4y2BaGPA1GydF4y2Ba基因GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba．由基因编码的蛋白质与哺乳动物Gα亚基相似，含有保守的GTP结合区域[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．随后，在水稻中分离了G蛋白α亚基的cDNA序列[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba，野生燕麦[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba]， 番茄 [GydF4y2Ba11GydF4y2Ba,大豆GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13GydF4y2Ba],豌豆[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]， 菠菜 [GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]，莲花[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]．由这些CDNA编码的所有蛋白质的预测氨基酸序列类似于哺乳动物α亚基上鉴定的功能域，表明这一点GydF4y2BaGPA1GydF4y2Ba是一个普遍存在的开花植物的保守基因。此外，单一的副本GydF4y2BaGPA1GydF4y2Ba发生在植物中，表明该基因可能在植物细胞中具有非冗余功能。GydF4y2Ba

异质三聚体g蛋白参与了植物的多种生长发育过程。例如，过度表达GydF4y2BaGPA1GydF4y2Ba可以提高拟南芥对赤霉素的敏感性，导致在种子萌发过程中对赤霉素的反应增加[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]，进一步影响萌芽。Gα可以影响根部发展，积极调节侧根的生长和发展[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．同时，Gα可以通过调节细胞分化来控制幼苗的幼粒的生长和发展[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]．和....相比GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba， g α编码基因缺失突变体的水稻叶片颜色更宽更深，植株尺寸更短[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24GydF4y2Ba].研究表明GydF4y2BaDL-L.GydF4y2Ba突变体减少[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba]．因此，Gα在水稻细胞分化中起着正调节作用。GydF4y2Ba

异络G-蛋白也是植物中的关键信号转导调节剂，控制与非生物应激相关的途径[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]．在拟南芥中,GydF4y2BaGPA1GydF4y2Ba参与氧化应激信号转导，可以积极调节反应性氧物质（ROS）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）上游的非生物应力因子[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]．拟南芥Gα亚基突变将植物的敏感性降低给臭氧应激[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]．在豌豆（GydF4y2BaPisum一GydF4y2BaGα亚基的结构性过表达增强了转基因豌豆对盐胁迫的抗性[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]．Ferrero-Serrano和Assmann的研究表明，在干旱压力下，GydF4y2BaD1GydF4y2Ba突变体Gα亚基叶片温度较野生型低，抗旱能力较强[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．Chakraborty等人。在他们对一群拟南芥Gα亚基突变体的工作中，据报道，有生物应激相关的基因表达被改变，表明这一点GydF4y2BaGAP1.GydF4y2Ba参与其中GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba响应热和冷应激[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32GydF4y2Ba]．水稻Gα，Gβ和Gγ亚基的表达也被冷应激强烈诱导，这表明这些亚基对水稻冷应激抗性的主动调节作用[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]Ma等人的研究表明，在低温胁迫下，水稻Gα亚基RGA1（水稻G蛋白α亚基1）与质膜和内质网上的耐冷分化1（COLD1）相互作用，激活CaGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}通道及增强抗低温能力[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

加工番茄（GydF4y2BaLycopersicon esculentumGydF4y2Ba起初在亚热带和热带地区种植，但现在全世界都在种植。这些番茄植株对冷胁迫非常敏感，因此有可能造成巨大的经济损失[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba]．因此，确定关键基因低温耐受性具有重大的理论意义和现实意义。GydF4y2Ba

揭示番茄植物中低温耐受性的分子调节后的机制，培养新的低温耐受品种，GydF4y2BaGPA1GydF4y2Ba基因从加工西红柿中克隆。使用转基因方法，我们构建过表达和RNA干扰向量GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba并研究了基因的作用GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba在植物生长发育和低温反应中。这项研究导致了一系列新的耐低温番茄植株的基因工程。这些耐低温植株为揭示番茄加工植株耐低温的分子调控机制提供了宝贵的资源。GydF4y2Ba

生物信息学分析GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba

使用CDNA加工番茄作为模板和基因特异性引物，我们扩增了GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba基因(1176 bp)。的GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba基因编码392个氨基酸。利用DNAMAN软件比较LeGPA1与其他植物GPA1蛋白氨基酸序列。结果表明，加工番茄的LeGPA1蛋白与普通番茄的氨基酸序列相似性最高(98.72%)。GydF4y2BaSolanum lycopersicum.GydF4y2Ba） （无花果。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa).仅检测到单个氨基酸点突变，无插入或缺失。利用ClustalX 2和MEGA 4.1软件建立了13个物种的LeGPA1序列系统发育树。我们发现加工番茄的LeGPA1与普通番茄的SlGPA1在同一系统发育分支上，因此关系密切(图2)。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab）。NCBI的保守域工具用于分析由此编码的序列的保守域。GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba基因。该基因编码的蛋白质具有鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基α结构域，其属于G-α家族（图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaC）。GydF4y2Ba

LeGPA1的亚细胞定位GydF4y2Ba

为了确定LeGPA1在细胞中的位置GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba将基因克隆到35s启动子下游的PCAMBIA2300-35S-GFP（绿色荧光蛋白）载体和GFP基因的上游。融合蛋白表达载体p35s-GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba-GFP组成型表达LeGPA1-GFP（图GydF4y2Ba2GydF4y2Baa).提取质粒，p35S-GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba-GFP和PM-RK（细胞膜标记）转化为GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba原生质体。通过这种方法，发现LEGPA1定位于细胞膜（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab）。GydF4y2Ba

表达式的分析GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba加工番茄GydF4y2Ba

通过定量逆转录PCR（定量RT-PCR），我们分析了GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba野生型加工番茄的各种器官中的表达模式。可检测的GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba在所有检查的器官中发现了表达，根部的最大表达，然后在叶片和水果中，以及茎中最低的表达（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba一种）。进一步验证是否表达GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba由压力引起的，我们还测量了GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba不同胁迫处理下的表达。如图所示。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaB，低温处理迅速引起的上调GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba3 h内基因扩增8.01倍。随后3 h，基因表达量缓慢下降至处理前的7.69倍，在处理9 h达到峰值(增加9.63倍)。说明低温处理可上调表达GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba基因表达。When treated with 20% PEG-6000, the alteration of gene expression during the first 6 h was very slow. Whereas, at 9 and 12 h, the expressions oflegpa1.GydF4y2Ba分别在治疗前4.14和4.38（最大）次，然后在24小时的缓慢降低，然后之后快速减少（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bac). 200 mm NaCl处理上调表达量GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba在9 h时达到最大效果(提高4.84倍)，12 h后迅速下降并趋于稳定(图4)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba根据这些结果，我们得出结论GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba可以通过各种压力诱导。GydF4y2Ba

转基因加工番茄的鉴定GydF4y2Ba

评价…的重要性GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba在加工番茄的低温胁迫反应中，我们采用农杆菌介导的方法获得转基因植株(GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba-过表达和基因沉默)(图SGydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.获得再生植株并进行PCR检测。三个GydF4y2BaLeGPA1 -GydF4y2Ba选择阳性植株过表达转基因株系(OE-1/2/3)和3个rna干扰转基因株系(RI-1/2/3)进行qRT-PCR检测(图1)。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.相对GydF4y2Balegpa.GydF4y2Ba在OE-1，OE-2，和mRNA水平OE-3植物增加4.12，6.13，和7.69倍，分别与野生型植物相比较，并且GydF4y2Balegpa.GydF4y2BaR 1 -1，Ri-2和Ri-3的mRNA水平分别下降0.90-，0.78-和0.74倍。因此，基于基因表达分析的结果，我们选择了两条过表达线（OE-2，OE-3）和两个RNA干扰线（RI-1，RI-2），用于进一步研究冷抗性功能。GydF4y2Ba

转基因番茄的生物学特征分析GydF4y2Ba

我们测试了80日龄植株的生物学指标(株高、茎粗、根长和根鲜重)，并比较了野生型和转基因番茄。如图所示。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba，我们发现GydF4y2BaLeGPA1 -GydF4y2Ba过表达转基因番茄植物与野生型对照相比，较高，较高，较高4-11.6％。然而，RNA干扰线的植物生长低于野生型西红柿的植物生长，28.9-36.9％。根长或鲜重量在野生型和转基因植物中可相当。相反，茎厚度GydF4y2BaLeGPA1 -GydF4y2Ba与野生型植物相比，过表达转基因植物增加了13.5-18.3％，而RNA干扰转基因植物的茎厚度明显增加（34.1-37.4％）与野生型对照相比（GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.01)。GydF4y2Ba

过度的GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba该基因增强了转基因番茄幼苗对低温的抗性GydF4y2Ba

为了测试转基因番茄植物的冷胁迫耐受性，的T2代的种子GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba- 转基因植物，RNA干扰转基因植物和野生型加工厂均匀地播种成矩形罐。将植物在正常条件下（25℃）长3周，然后转移至4℃培养箱7天。观察到表型，在低温下在0,3,5和7天中测量幼苗鲜重和存活。如图所示。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaA，野生型和转基因植物通常在4℃下繁殖。在4°C治疗3天后，RNA干涉番茄幼苗开始显示萎缩的迹象（看到植物零件的轻微弯曲）。野生型番茄幼苗略微枯萎，但不像RNA干涉线一样多，而且GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba- 大规处的番茄植物幼苗表现出比RNA干扰幼苗更好的生长。在低温下5天后，大多数RNA干涉番茄幼苗弯曲和下降，野生型加工厂开始具有抑制增长的弯曲的顶部，以及一些GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba过表达的株系也表现出萎蔫。处理7 d后，rna干扰幼苗几乎全部死亡，只有少数存活;存活的野生型加工苗少，但存活的rna干扰株多GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba转基因苗仅发生部分萎蔫。低温处理7 d后，将番茄幼苗置于4 ~ 25°C培养箱中正常孵育3 d恢复。结果表明，rna干扰的番茄幼苗几乎全部死亡，少数野生型存活，少数存活GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba- 大规处植物死亡。还进行了新的重量测量和存活统计，获得了类似的结果。经过7天的冷治疗，新鲜重量GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba-6.4％（OE-2）和39.6％（OE-3）下降，野生型植物的抑制线减少了68.5％，RNA干扰线的植物的减少了70.7％（RI）-1）和70.1％（RI-2），相对于治疗前取出的值（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab).经过7天的低温处理后，转基因和野生型幼苗存活率均显著降低。然而，成活率GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba- 与RNA干扰植物和野生型对照相比，抑制植物显着增加，与RNA干扰植物相比，野生型对照具有更高的存活率（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba这些数据表明，过度表达GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba增加转基因番茄幼苗抗低温。GydF4y2Ba

转基因番茄芽在低温胁迫下的生长分析GydF4y2Ba

为了进一步评估转基因番茄的低温抗性，转基因和野生型植株在标准条件下生长6周，然后转移5天至4°C。在室温下观察野生型和转基因植株的正常生长。野生型番茄在4℃生长后，叶片均有不同程度的萎蔫，而RNAi番茄叶片全部萎蔫下垂，表面呈深褐色，有水渍，部分叶片死亡。然而，几乎没有什么变化GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba过表达番茄，正常生长(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.这表明了GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba是在这些加工西红柿内的低温阻力的重要介体。GydF4y2Ba

过度表达GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba在低温胁迫下减轻细胞膜损伤GydF4y2Ba

丙二醛(MDA)是ros相关的脂质过氧化副产物。通过MDA水平和相对电解质渗漏(REL)可以测定细胞膜的通透性。在低温胁迫下，野生型和转基因植株的MDA和REL水平均迅速升高(图2)。GydF4y2Ba8.GydF4y2Baa，b）。与野生型对照相比，MDA和RNA干扰植物的rel水平升高。然而，野生型植物表现出明显升高的MDA和相对于GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba-过表达转基因植物(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.01)。GydF4y2Ba

植物的相对含水量(RWC)反映了植物的保水能力，是衡量植物水分状况和渗透调节的指标。转基因和野生型叶片的RWCs与低温胁迫前相当(图2)。GydF4y2Ba8.GydF4y2BaC）。相比之下，植物类型的RWC在压力后减少，但野生型控制的RWC的下降相对于GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba-过表达转基因植物(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.01)。rna干扰植株的RWC值明显高于野生型(P < 0.01)。GydF4y2Ba

计算光系统II (PSII)的最大光化学效率为Fv/Fm。在正常条件下，我们检测到野生型和转基因植物的光化学效率没有显著差异(图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Bad）。然而，在低温下，野生型和转基因系的光化学效率显着不同（P <0.01）。在所有植物中，该价值稳步下降，但野生型植物的下降相对于该植物GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba- 在RNA干扰线中仍然抑制转基因植物，仍然更大。GydF4y2Ba

在低温应激（与正常环境生长温度）下，所有植物都增加了可溶性糖和脯氨酸含量。与野生型植物相比GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba-Overexpressing转基因植物具有更高水平的可溶性糖和脯氨酸，RNA干扰转基因植物具有低可溶性糖和脯氨酸水平（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Bae，f）。这些发现表明过度表达GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba在加工番茄植物中，防止低温应力造成的损坏。GydF4y2Ba

过度表达GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba缓解低温胁迫下活性氧的积累GydF4y2Ba

在施加低温处理之前，HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和o.GydF4y2Ba_2-GydF4y2Ba野生型和转基因植株的含量较低，且几乎相同。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba）.然而，在暴露于低温胁迫后，所有测试植物中的ROS水平增加。与野生型植物相比，RNAI植物中的这种增加明显更大，而且GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba-GydF4y2Baoverexpressing植物。我们发现过度表达GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba降低H的累积GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和o.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba在低温下压力。GydF4y2Ba

研究过度表达和沉默的影响GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba在野生型和转基因植物中测量低温应力相关的氧清除，超氧化物歧化酶（SOD），过氧化物酶（POD）和过氧化酶（猫）酶活性。我们发现，在低温暴露后，所有植物都会增加这三项活动。但是，相对于野生型植物，猫，豆荚和SOD活动显着高。GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba过表达转基因植物（GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.01)。野生型植株的SOD、CAT和POD活性显著高于rna干扰植株(图2)。GydF4y2Ba10GydF4y2Baa-c）。我们发现GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba该基因提高了低温胁迫下氧清除酶的活性，提高了植物的活性氧清除能力，降低了活性氧毒性。这表明转基因番茄可以降解更多的活性氧。为了确定转基因番茄中CAT、SOD和POD活性高的原因，我们测量了GydF4y2Ba莱索德GydF4y2Ba那GydF4y2BaLepod，GydF4y2Ba和GydF4y2BaLeCATGydF4y2Ba转录水平。在标准的生长条件下GydF4y2Ba莱索德GydF4y2Ba那GydF4y2BaLePODGydF4y2Ba， 和GydF4y2BaLeCATGydF4y2Ba所有细胞株的表达水平相似。在低温暴露后，我们记录了GydF4y2Ba莱索德GydF4y2Ba那GydF4y2BaLePODGydF4y2Ba， 和GydF4y2BaLeCATGydF4y2Ba和在所有植物中的表达水平GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba过表达株系比野生型株系高。然而，在rna干扰转基因番茄中水平较低(图。GydF4y2Ba10GydF4y2BaE-F）。因此，我们得出结论，高水平GydF4y2Ba莱索德GydF4y2Ba那GydF4y2BaLePODGydF4y2Ba， 和GydF4y2BaLeCATGydF4y2Ba表达增加了相应的酶活性并清除了更多H.GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和o.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba罗斯在GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba过表达转基因西红柿。GydF4y2Ba

legpa1.GydF4y2Ba对加工西红柿冷应激基因表达具有正调节效果GydF4y2Ba

我们测定了CBF表达诱导子(ICE)和C-REPEAT-BINDING FACTOR (CBF)编码基因(GydF4y2BaLeICE1GydF4y2Ba和GydF4y2BaLeCBF1GydF4y2Ba）及其下游靶基因（GydF4y2BaLeTPS1GydF4y2Ba那GydF4y2BaLECOR413PM2.GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaLeDRCi7GydF4y2Ba）在加工番茄线。我们发现在低温胁迫之前，与野生型植物相比，RNAi线表现出降低的基因表达，表达水平的差异GydF4y2BaLECOR413PM2.GydF4y2Ba和GydF4y2BaLeDRCi7GydF4y2Ba非常重要。然而，在野生型中，基因的表达水平显着低于过表达线。低温应激后，所有植物的基因表达水平显示出总体上升的趋势;但是，野生型和野生型表达的差异GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba过度抑制线进一步增加并显示出极明显差异（图。GydF4y2Ba11GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

植物GydF4y2Ba

野生型GydF4y2BaL. Esculentum.GydF4y2Ba（'yaxin 87-5'）种子是从yaxin种子有限公司（新疆石河子市）获得的。植物首次在25°C组织培养室（16/8H光/暗循环），在60-70％的相对湿度和200μmolm中生长GydF4y2Ba^{−2GydF4y2Ba} sGydF4y2Ba^{−1GydF4y2Ba}光强度。接下来将幼苗移植到含有土壤，泥炭和蛭石的相同混合物的罐中，并用自然照明和相同的湿度和光循环条件转移到22-28°C温室中。在这个温室中，每周两次用500毫升Hoagland的营养液灌溉植物。GydF4y2Ba

评估压力的影响GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba基因表达GydF4y2Ba

野生型番茄种子播种在塑料盆中。然后，在14-H光/ 10-H深色光周期下在25±3℃的温度下和60-70％的相对湿度在受控温室中生长幼苗。通过QRT-PCR，我们评估了GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba80天野生型番茄植株一系列器官(果实、花朵、茎、叶和根)的基因表达。同时,GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba在冷，盐或干旱胁迫下在野生型西红柿中评估表达，在与上述相同的条件下进行。所有应力处理都是使用盆栽植物在6-7阶段的植物，6周龄，基于其均匀性选择的6周龄野生型番茄幼苗。对于冷应激，野生型番茄幼苗浇水，然后在4℃下随机置于冷室中48小时;在相同条件下置于相同条件下但在25℃下进行控制幼苗。对于干旱条件，从土壤中除去野生型番茄幼苗，然后分为两组：干旱治疗组和对照组。干旱处理组中的幼苗根部浸没在20％PEG 6000中5厘米，48小时。对照组幼苗的根部浸没在水中5厘米的水中48小时。通过从其土壤中除去野生型番茄幼苗并将根部浸入200mM NaCl 48小时，诱导盐胁迫。将对照组幼苗根浸没在水中48小时。在开始胁迫条件后，在0,1,3,6,9,12,24和48小时内收集来自相同位置的叶片。 Plants were grown in three separate growth chambers for replicate samples. Collected leaves were snap-frozen before storage at − 80 °C.

使用RNAprep Pure Plant Kit(天根，中国)分离样品RNA进行qRT-PCR，然后用SYBR Green I Master Mix合成cDNA，并使用LightCycler 480II平台(Roche Biochemicals, Indianapolis, IN, USA)进行分析。作为冷胁迫相关基因表达的规范化对照，番茄GydF4y2BaEF1GydF4y2Ba利用基因（GenBank ID：X53043）[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba]．Thermoccycler设置是：30秒的两个循环为95°C;50个循环为95℃，5s，60℃，10 s，68°C为10 s。2GydF4y2Ba^{-ΔΔctGydF4y2Ba}方法(GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]，用来测定胁迫处理植株与对照植株的相对基因表达量。本实验所用引物见补充表SGydF4y2Ba1GydF4y2Ba．在实时PCR分析期间使用了三种生物学和技术复制。为了确保扩增单个离散物种，在实时PCR的末端进行熔融曲线分析。GydF4y2Ba

legpa1.GydF4y2Ba序列评估GydF4y2Ba

DNAMAN(8.0)用于对齐GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba序列。TMHMM算法(GydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/tmmm/GydF4y2Ba)用于预测跨膜结构域。大型5.1 (GydF4y2Bahttp://www.megasoftware.net/GydF4y2Ba)用于基于Neighbor-Joining方法的系统发育分析，共1000次bootstrap重复，bootstrap评分的缺失< 50%。GydF4y2Ba

legpa1.GydF4y2Ba克隆GydF4y2Ba

RNAISOPLUS套件（Takara，Dian，中国）用于从番茄植物的叶子中提取RNA，具有基于提供的指令进行的DNase I柱消化。原血仪RTASE（TAKARA，大连，中国）用于第一链CDNA合成，之后使用PCR来扩增全长GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba使用GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba（GydF4y2BaKpnGydF4y2Ba我)cf和GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba（GydF4y2Ba萨尔GydF4y2Ba我知道了GydF4y2BaR.GydF4y2Ba（表1）使用GydF4y2BaSolanum lycopersicum.GydF4y2Ba基因序列(GenBank ID: NM_001306055.1)。采用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(TaKaRa，中国大连)进行PCR，热循环器设置如下:95℃5 min;35个循环，95°C for 30 s, 56°C for 30 s;72°C 10分钟。该方法获得了1176 bp的PCR片段，克隆到pMD19-T载体(TaKaRa，中国大连)中。通过DNA测序确认了该片段的身份。GydF4y2Ba

过表达和RNA干扰质粒的构建GydF4y2Ba

扩增片段的菌进行GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba的克隆到pCAMBIA2300GydF4y2BaKpnGydF4y2Ba我和GydF4y2Ba萨尔GydF4y2Ba我限制网站GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba过度表达，为其转录GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba由35s启动子驱动。通过插入PCR生成的220-BP段来构建RNAI构造GydF4y2Balegpa1.GydF4y2BacDNA(片段340 - 560bp) (RNAi靶点)转化成pGM-T质粒，然后转化为GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaDH5α。正确的阳性克隆命名为pGM-S(补充表S)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.这个pGM-S结构随后被限制性内切酶消化(GydF4y2BaXhoGydF4y2Ba我和GydF4y2BaBGL.GydF4y2Baii），并将较小的片段回收并用线性化连接（GydF4y2BaXhoGydF4y2Ba我和GydF4y2BaBGL.GydF4y2BaII消化）pUCCRNAi。重组pUCS1载体从收集GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaDH5α用连接产品转化。然后通过限制酶消化PGM-S（GydF4y2BaXhoGydF4y2Ba我和GydF4y2BaBGL.GydF4y2Baii）用于随后的小片段恢复。通过限制酶消化PUCS1（GydF4y2Ba萨尔GydF4y2Ba我和GydF4y2BaBamh.GydF4y2Bai）用于随后的大片段恢复。通过使用PUCCRNAI内含子产生中间载体PUCS1S2的反复重复序列。然后，PUCS1S2被消化GydF4y2Ba太平洋标准时间GydF4y2Ba我，随后恢复小片段，克隆到线性化的pCAM2300载体(消化GydF4y2Ba太平洋标准时间GydF4y2Ba一世）。类似地，还获得了植物RNAi表达载体PCA的反复重复序列。最后，通过冷冻解冻转移到GV3101中转移到GV3101中。GydF4y2Ba

LeGPA1的亚细胞定位分析GydF4y2Ba

的完整开放阅读框架(ORF)GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba除了含有含有底漆的PCR扩增密码子排除GydF4y2BaXBA.GydF4y2Ba我和GydF4y2BaBamh.GydF4y2Ba我限制站点序列，列于表1中.P35S-GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba将扩增子克隆到pCAMBIA2300-GFP载体中，转染至GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba叶肉原生质体使用聚乙二醇。类似地，为了检查质膜定位，PM-RK质粒转导的下面的相同的方法[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba那GydF4y2Ba40GydF4y2Ba那GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba]．将原生质体在23℃下培养16小时，然后使用共聚焦显微镜（Leica Microsystems，德国）来在488,561和633nm激发波长下可视化荧光。GydF4y2Ba

转基因植物制备GydF4y2Ba

过度表达的转基因植物GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba或RNAi构建物为本研究准备。简单地说，在无菌条件下，将野生型番茄种子均匀地播撒在½-MS培养基上，培养约10 d后采集番茄幼苗。将子叶两端剪断，切下胚轴约0.5 cm，置于分化培养基上暗培养2 d。将合适的结构转化为下胚轴GydF4y2Ba根癌土壤杆菌GydF4y2Ba应变GV3101。然后利用含60 mg/L卡那霉素的½强度MS培养基筛选转基因植株。20 d后，愈伤组织从外植体上生长，2个月后发芽，从外植体上分离，插入生根培养基中。育苗生根后，移栽到含养分土壤的盆栽中，培养7 d，适应性强时再移栽到田间。孤立kanamycin-resistant TGydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba植物使用通过半定量逆转录PCR评估GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba引物（补充表SGydF4y2Ba1GydF4y2Ba)利用qRT-PCR技术对不同转基因植株进行鉴定。热带植物GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba- 在补充有60mg / L kanamycin的MS培养基上保留其生长能力的生成在下游测定中被用作转基因植物。GydF4y2Ba

评估应激响应诱导的植物变化GydF4y2Ba

植物（野生型或转基因）GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba-代在25°C孵育箱中培养3-6周(16/8 h光照/黑暗循环;湿度70%;200μ摩尔GydF4y2Ba^{−2GydF4y2Ba} sGydF4y2Ba^{−1GydF4y2Ba}光子通量密度）。3或6周后，具有均匀尺寸的植物进行5天冷应激暴露（4°C）。植物在三个单独的生长室中生长以进行复制样品。然后目视评估植物表型的变化，使用佳能80D相机进行图像。另外收集来自这些植物的顶部的第二和第三叶，并且使用QRT-PCR评估这些叶片中的应激相关和抗氧化酶基因表达。这些样品还用于抗氧化活性测定和植物生理学评估。GydF4y2Ba

生理参数分析GydF4y2Ba

相对含水量(RWC)是由Lara等人进行的一项研究中评估的。[GydF4y2Ba42.GydF4y2BaRWC = (FW−DW)/(TW−DW) × 100%。其中FW为叶片鲜重，TW为叶片膨体重(叶片在dH中培养后)GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.For 24 h in the presence of light), and DW corresponds to dry weight (after leaves were dried at 70 °C to a constant weight).

MDA的水平用硫代巴比土酸反应之后都等人评估。[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]的处理方法:将离体叶片用dH预冲洗GydF4y2Ba_2GydF4y2Bao，收集的光盘通过使用分光光度计（UV-160A; Shimadzu Scientific Instruments，Japan）来用于测量MDA水平。GydF4y2Ba

使用电导率计（EC 215; Markson Scienc Inc.，USA）评估相对电解质泄漏（Rel）[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba] by REL = (C1-CW)/(C2-CW) × 100, in which formula the C1 and C2 correspond to pre- and post-boiled conductivity, respectively, and the CW corresponds to dH_2GydF4y2BaO导电性。GydF4y2Ba

使用便携式荧光分析仪（双PAM-100;德国沃尔兹）评估照相系统II（PSII）的最大效率。将叶子预处理30分钟放置在黑暗中，然后进行1次闪光灯曝光。可变荧光（fGydF4y2Ba_V.GydF4y2Ba）由f评估GydF4y2Ba_V.GydF4y2Ba= FGydF4y2Ba_mGydF4y2Ba- FGydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba]，式中FGydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba(最小荧光)对应于PSII反应所有中心开放的暗适应状态;FGydF4y2Ba_mGydF4y2Ba（最大荧光）对应于闭合PSII反应的所有中心的光饱和状态。GydF4y2Ba

在Bates等人的研究中评估了游离脯氨酸。[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba]．简而言之，使用4ml 3％硫磺酸酸在100℃下提取叶样品（200mg）10分钟，之后将匀浆在12,000×以12,000×中旋转2分钟GydF4y2BaGGydF4y2Ba．接下来，将2ml上清液体积与等同的酸 - 茚三酮试剂和冰醋酸混合。然后将该溶液煮沸30分钟，然后转移到冰浴中。然后在甲苯（4mL）介导的有机相提取后评估520nm处的吸光度。相对于脯氨酸标准曲线测定脯氨酸浓度。GydF4y2Ba

蒽酮方法用于分析可溶性糖，用葡萄糖作为标准[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba]．简而言之，研磨初始叶片样品（200mg），均质在1ml DH中均化GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO体积，蒸煮20分钟，13000 ×离心10分钟GydF4y2BaGGydF4y2Ba然后将2ml上清液体积与1.8ml DH合并GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO和2.0 mL的0.14% (w/v)蒽酮溶液在100% HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba所以GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba．将该溶液在沸水中静置20分钟，然后冷却它，和aGydF4y2Ba_620GydF4y2Ba被评估。总可溶性糖水平通过比较这些AGydF4y2Ba_620GydF4y2Ba用葡萄糖标准曲线得到的值。实验在三个重复的样品中进行。GydF4y2Ba

ROS和抗氧化活性测定GydF4y2Ba

从转基因收集大约0.5g新鲜叶子（tGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba)或野生型植物受到的胁迫。切碎的叶子样品在4 ml添加了10 mM β-ME和1%聚乙烯吡啶酮的50 mM磷酸钠缓冲液(pH 7.8)中均质，然后在4°C和17,426×g下离心15分钟。用上述方法测定CAT和SOD的活性[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba),分别。用酶标仪(Infinite M200 Pro;Tecan Group Ltd.， Männedorf, Switzerland) [GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

H水平GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和o.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba用上述UV-160A分光光度计(日本岛津科学仪器公司)测定吸光度来评价[GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

数据采用SPSS v13.0和GraphPad Prism 7.0进行评估。相对GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba表达数据以平均值±标准差表示，来自三个重复样本，每个幼苗有三片叶子作为一个重复。表达水平归一化至基线(0 h)水平。Dunnett多重比较试验被用来比较植物。＊GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05和**GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.01 correspond to significant and very significant, respectively.

Gα亚基是异质三聚体g蛋白复合物的重要组成部分;它不仅在植物的各种生长发育过程中发挥重要作用，而且还参与对干旱、高温和低温等非生物胁迫的响应[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba那GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba]．Gα亚基在模式植物中得到了很好的研究，但在加工番茄中尚未发现。本研究从加工番茄中鉴定了一个g蛋白Gα亚基，并对其生长发育及其对低温的抗性进行了研究。GydF4y2Ba

我们找到了GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba加工番茄的基因与该基因同源GydF4y2BaGPA1GydF4y2Ba其他茄科物种的基因。以前的研究已经发现，GydF4y2BaGPA1GydF4y2Ba仅在成熟种子[表达GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba]， 和GydF4y2BaGPA1GydF4y2Ba在发育的所有阶段和所有器官中都能检测到表达。GydF4y2BaGPA1GydF4y2Ba在根中表达是最高的，其次是茎尖，缺口，子叶和叶片[GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba]，未成熟器官的水平高于成熟器官[GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba]．我们分析了的表达式GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba在加工番茄植物的各种器官中发现GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba（：根>叶>果实>茎相对表达丰度）在所有测试的器官中表达。这样的表达模式表明GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba参与加工番茄的生长和发育的调节。我们还进行了亚细胞定位实验发现，GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba也定位于细胞膜。这与植物中G蛋白的文献一致[GydF4y2Ba55.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba56.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba57.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

g蛋白Gα亚基已在拟南芥、水稻和玉米中被鉴定，并在所有三个物种中作为细胞增殖和生长的正调控因子[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba那GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba]．通过黄瓜的G蛋白α亚基GPA1的功能分析，Yan等人。发现过表达的GydF4y2BaCsGPA1GydF4y2Ba促进种子发芽和早期幼苗生长，而GydF4y2BaCsGPA1GydF4y2Ba干扰抑制幼苗生长。通过测试转基因素和野生型加工番茄植物的生物学特性[GydF4y2Ba60.GydF4y2Ba]，我们在这里发现了GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba- 大规处番茄植物明显高于野生型植物，而RNA干扰植物较短。这表明了GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba在番茄株高的加工过程中起着重要的调节作用，这与拟南芥、水稻和玉米的描述一致。GydF4y2Ba

g蛋白α亚基在植物非生物胁迫的信号转导途径中也发挥着重要作用[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]．水稻的全转录组微阵列分析表明GydF4y2BaRGA1GydF4y2Ba调控低温、盐胁迫和干旱胁迫，并将胁迫信号传递给小磷酸化酶GTPase和相应的效应蛋白或分子，如离子通道[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]．在豌豆，表达的GydF4y2BaPsGPA1GydF4y2BaNaCl和高温显著改变[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]．的研究GydF4y2Ba芸苔属植物显著GydF4y2Ba发现表达了GydF4y2BaBnGA1GydF4y2Ba20% PEG6000、200 mm NaCl、低温(4°C)和高温(40°C) 4种非生物胁迫诱导的GydF4y2BaBnGA1GydF4y2Ba在抵抗非生物压力方面发挥着重要作用[GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba]．与引用的文献一致，我们在这里报道，在加工番茄的过程中，GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba由干旱，高盐和低温诱导。GydF4y2Ba

GPA1GydF4y2Ba拟南芥参与氧化应激信号转导。例如，GydF4y2BaGPA1GydF4y2Ba可以积极调节ROS生产上游的非生物应激因子[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]．ROS在冷应力下产生并积聚;他们破坏细胞并产生MDA [GydF4y2Ba61.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba62.GydF4y2Ba]．抗氧化酶是植物细胞中清除ROS系统的重要组成部分，因此在植物抗寒中发挥重要作用[GydF4y2Ba63.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba64.GydF4y2Ba]．例如，GydF4y2Ba松果体koraiensisGydF4y2Ba是一种具有耐寒性强的常绿树种。鉴定了大量的DEGGydF4y2BaP. Koraiensis.GydF4y2Ba在冷应激下，特别是在抗氧化机制中去除ROS的次数[GydF4y2Ba65.GydF4y2Ba]．据报道，植物在低温胁迫下抗氧化酶活性增加，这可能是由于相应基因的上调[GydF4y2Ba60.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba66.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba67.GydF4y2Ba]．符合文献，在这里我们报告说表达了GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba在加工过程中，番茄在低温胁迫下表达上调。此外,过度的GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba在转基因番茄中，在低温胁迫下改善抗氧化能力并降低膜脂质过氧化，表明GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba积极调节加工西红柿对低温的反应。GydF4y2Ba

多个基因已牵涉植物响应于低温胁迫，包括CBF途径的ICE1活化[GydF4y2Ba68.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba69.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba70GydF4y2Ba那GydF4y2Ba71.GydF4y2Ba]，海藻糖-6-磷酸酶（TPS）（在海藻糖合成的关键酶）和TPS-相关基因[GydF4y2Ba72.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba73.GydF4y2Ba]，和拟南芥耐寒性基因413（GydF4y2BaATCOR413GydF4y2Ba)(对抗冻性很重要)[GydF4y2Ba74.GydF4y2Ba]．冰-CBF-COR信号传导途径激活下游基因的适当表达，编码OSMoreGulation物质[GydF4y2Ba75.GydF4y2Ba]本研究分析了加工番茄过程中低温胁迫相关基因的表达水平。GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba增加GydF4y2BaLeICE1GydF4y2Ba基因在加工番茄中的表达，从而调节番茄的转录GydF4y2BaLeCBF1GydF4y2Ba基因。因此，表达了GydF4y2BaLECOR413PM2.GydF4y2Ba和GydF4y2BaLeTPS1GydF4y2Ba及其下游调节基因，GydF4y2BaLeDRCi7GydF4y2Ba这些发现确定了可能涉及的分子机制GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba介导的低温耐受性在加工番茄。然而，调节LeGPA1激活和失活，以及下游效应循环的分子机制，还是一个未知数。的refore, to elucidate how plant G proteins interact with environmental signals to maintain stable growth and development in a varied environment, in the future, molecular biological technologies (e.g., immunoco-precipitation and bilateral fluorescence complementary) should be further utilized to verify, isolate, and identify the proteins interacting with LeGPA1, and determine the downstream effector molecules and signal transduction mechanism of LeGPA1.

总之，这些研究结果表明，GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba过表达是提高番茄抗寒性的可行途径。我们发现GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba过表达与提高细胞膜的完整性和稳定性有关，以应对冷胁迫，同时也减少膜脂过氧化产物的积累，降低离子泄漏率，并增加抗氧化酶活性。这些变化与光化学电子传递效率和抗氧化酶活性的提高有关。例如,GydF4y2Balegpa1.GydF4y2Ba-和野生型对照相比，过度表达的植物表现出降低的ROS水平。这些植物通过维持较高的渗透脯氨酸和可溶性糖水平来防止细胞损伤，从而提高了耐低温性。GydF4y2Ba

在当前的研究中使用和/或分析的数据集可从通信作者在合理的要求。GydF4y2Ba

我们要感谢TopEdit (GydF4y2Bawww.topeditsci.comGydF4y2Ba)以供英文编辑。GydF4y2Ba

宣言GydF4y2Ba

提交人声明他们没有知道可能似乎影响本文报告的工作的竞争竞争金融利益或个人关系。GydF4y2Ba

国家自然科学基金项目(no . 31360053);国家转基因重大专项(no . 2016ZX080005004-009);转基因生物新品种培育重点科技项目(no . 2018ZX0800501B-005)。关键词:土力学，土力学，抗剪强度GydF4y2Ba

作者指出GydF4y2Ba

1. 新通郭，枣李和李章这些作者平等贡献，是一首第一作者。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 石河大学生命科学学院，西河，832000GydF4y2Ba

   郭新勇，李菊菊，张丽，张占文，何平，王文文，王梅，王爱英，朱建波GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

XYG和JJL方法学、数据整理、可视化、LZ概念化、写作-原稿准备、ZWZ监督、PH软件、WWW Validation.MW investment、AYW作品设计、JBZ写作-审查和编辑。所有作者阅读并批准了手稿。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

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