面包小麦盐胁迫响应的渗透期和离子期转录组分析揭示了性状特异性候选基因

背景

面包小麦是人类饮食中最重要的作物之一，但日益严重的土壤盐碱化正在导致世界范围内的产量下降。提高小麦的耐盐性需要阐明植物对这一非生物胁迫因子响应的机制基础。尽管已经开展了一些研究来分析小麦对盐胁迫的适应性，但要全面了解从初始信号感知到响应性耐受途径的分子机制，仍有一些空白。本研究的主要目的是利用潜在QTL区域的动态盐胁迫转录组来发现控制面包小麦耐盐性的候选基因。采用大量3′端测序方法对渗透相和离子相的样品进行分析。随后，在两个定位群体中鉴定了盐胁迫相关性状的胁迫应答基因重叠QTL。

结果

在盐反应基因中，耐盐基因型中钙结合和细胞壁合成基因的早期上调可能是应对盐相关渗透胁迫的策略。另一方面，在敏感基因型中，光合作用相关基因和钙结合基因的下调以及氧化应激反应的增加与渗透期更大的光合作用抑制有关。一些ABC转运蛋白和Na的特异性上调⁺/ Ca^{2 +}离子阶段耐受基因型中的交换子表明它们参与钠排斥和体内平衡的机制。此外，在两个胁迫阶段都鉴定出了与蛋白质合成和分解相关的基因。基于连锁不平衡区，QTL区间内的盐响应基因被确定为盐胁迫耐受途径的潜在组分。此外，本研究还为面包小麦的新转录区提供了证据。

结论

动态转录组分析可以比较盐胁迫响应的渗透相和离子相，并深入了解不同面包小麦基因型盐胁迫适应的关键分子机制。利用高度连续的染色体水平参考基因组序列组装，通过靶向新的耐盐候选基因，促进了QTL解剖。

面包小麦(小麦)是维持全球粮食安全的主要粮食作物，其产量须增加60%，才能在2050年前养活世界人口[1，2]。因此，育种计划应强调复杂性状的遗传改良，以提高生长限制条件下的产量潜力[3.]。小麦是一种含有三个亚基因组(AABBDD)的异源六倍体物种，具有高度重复的DNA序列(85%)，总基因组大小为16 Gb，因此对小麦复杂性状的遗传研究具有挑战性。4，5]。国际小麦基因组测序联盟(International Wheat Genome Sequencing Consortium, IWGSC)的努力已经发布了中国春季小麦品种的全注释和高度连续的染色体水平组装序列草图，该品种占整个基因组的94% [5，6，7]。

全世界每天有2000公顷的可耕地因盐而退化，这对全球粮食安全构成严重威胁[8]。在所有非生物胁迫因子中，土壤盐渍化会导致小麦减产和品质下降[j]。9]。盐胁迫适应反应是一种复杂的性状，因为它影响几种代谢途径中基因网络的协调作用，导致关键生理过程的变化[10，11]。因此，胁迫相关性状的候选基因定位可以在育种计划中利用，培育出耐盐性更高的品种[12]。

高盐度导致生理性干旱，引起离子毒性和细胞氧化损伤，影响植物生长[10，11]。植物生长对盐度的响应分为两个阶段。第一个阶段对应于渗透期，它与钠在组织中的积累无关。在这一阶段对植物生长的迅速而往往是短暂的影响归因于根际盐的渗透作用，因为水势降低了[13，14，15]。因此，抗渗透胁迫植物可以通过维持气孔导度和叶片膨胀来适应干旱胁迫。16]。渗透期的早期信号事件发生在盐胁迫暴露后的几秒到几小时内，对植物的适应反应至关重要[15]。一个模型提出，在渗透阶段，根感知盐胁迫和第二信使活性氧(ROS)和钙^{2 +}作为信号传播到空中部分。这些信号触发适应性反应来应对Na⁺在接下来的胁迫阶段到达光合组织并引起毒性作用的离子[17]。其次，由于叶片中盐的积累，离子相继续存在，需要几天或几周的时间才能显现出来。在这个阶段，老叶子的衰老是由于植物无法忍受组织中有毒浓度的盐而引起的[13，18]。为了减少毒性作用，耐盐植物可以排出钠⁺由根积累在芽中或分区化的钠⁺和Cl⁻在液泡中以避免细胞质中的毒性浓度[19，20.]。在两个胁迫阶段，盐度对作物生产力的限制作用主要是由于其对光合过程的影响，导致生物量积累大幅减少[21，22]。

遗传作图研究允许检测分子标记与数量性状表型值的统计关联，从而找到特定物种基因组中数量性状位点(QTL)的位置[23，24]。对面包小麦进行了多次定位分析，发现了影响盐胁迫相关性状的QTL [j]。25，26，27，28，29]。由于大多数研究的定位分辨率有限，每个QTL区间都包含许多影响性状变异的潜在数量性状基因(qtg)。结合遗传作图和转录组学分析的研究可以显著减少这些基因的数量，并根据自然遗传变异可以通过调节基因表达机制来支持复杂性状的假设，为已确定的QTL提供强有力的候选qtg [24，30.，31，32]。

新一代测序平台包括快速发展的高通量方法，用于对植物的基因组、转录组和表观基因组产生新的见解，以帮助育种者了解基因的生物学功能[33]。转录组学研究允许识别在渗透和离子相调节的途径。可以利用时间过程转录组学分析来确定盐胁迫反应中发生的关键生理变化期间的转录变化[34，35，36]。MACE (Massive Analysis of cDNA 3 ' -ends)测序方案是常规rna测序的替代方案，其中单个序列片段代表一个转录物[37]。因此，该方案的输出是数字化的和链特异性的，方便并提高了表达量化的准确性。此外，该方法可以提供高分辨率检测低或中等表达水平和短转录本的基因[37，38]。MACE的这些特征有助于在测序数据较少的情况下探索复杂的小麦转录组，并朝着3 '端完善基因模型[39]。

我们研究的主要目标是利用最近来自面包小麦的注释和高度连续的染色体水平基因组序列组装来确定在盐胁迫反应途径中运作的候选基因[5]。为此，MACE方法被用于渗透相和离子相的动态转录组分析。跨不同遗传背景和胁迫阶段的比较转录组学分析允许鉴定核心和差异盐响应基因类别。其中一些分类与渗透期和K值的光合作用测量有关⁺和钠⁺在离子阶段进行的积累研究。将盐胁迫相关性状QTL内的胁迫应答基因作为控制性状变异的候选基因。本研究为进一步的功能分析提供候选基因，以验证其作为育种靶点，从而有助于QTL解剖。

在盐胁迫的渗透期和离子期留下转录组测序

采用MACE方案比较了渗透期Zentos(耐盐)和Syn86(盐敏感)基因型和离子期Altay2000(耐盐)和Bobur(盐敏感)基因型的基因表达水平。在渗透期胁迫暴露后8、15、30 min和4 h以及离子期胁迫暴露后11和24 d分别鉴定出盐响应基因。测序文库来自每个对照和胁迫时间点的4个汇集的植物，并且与参考基因组对齐。来自Altay2000和Bobur的文库比来自渗透期研究的基因型文库含有更多的总读长和重复读长(表2)1）.与渗透胁迫实验相比，离子胁迫文库在质量控制过滤后的读数较少，作图效率更高(表1)1）.每个库的读取处理和参考基因组图谱的详细信息包含在附加文件中1．在所有的唯一映射reads中，86%的人用参考注释打分，91%的人用扩展基因模型打分。因此，通过扩展注释，在additional文件中列出的12,019个基因中检测到大约60万个额外的reads2．这些基因占RefSeq v1.1基因组注释中预测的基因模型的4.5% [5]。无花果。1例证了基因延长的3 '端TraesCS7D02G051200与读取映射超出定义的基因模型。

盐反应基因的鉴定

为了比较盐胁迫下基因的表达水平，考虑GFOLD(广义折叠变化)值> 1或<−1，参数c = 0.01，用于鉴定渗透相和离子相时间点的盐响应基因[40]。比较了四种基因型文库的表达密度，并在附加文件中显示3.．Syn86和Zentos的库具有可比性，它们的重叠表达密度证明了这一点。不同的是，与其他时间点的平均值相比，在ASE 24天观察到的表达值平均值更高(附加文件)3.）.这种类型的表达分布是高水平PCR重复reads的一个指标。因此，在离子相的差异表达分析中使用了重复数据的比对文件。重复数据删除后，密度图显示Altay2000和Bobur样本的均匀性更好(附加文件)3.）.

差异表达分析显示，基因型之间的差异(平均值±标准差)在鉴定的新转录本百分比(4.5±0.4%)，低置信度(LC)(5.0±0.8%)和高置信度(HC)(90.5±1.1%)基因模型方面有所降低。D亚基因组中盐响应基因的比例最高(35.8±1.7%)，其次是B(31.4±1.1%)、A(31.3±1.5%)和未放置的超支架(1.5±0.3%)。新转录本的基因组坐标显示在附加文件中4，所有盐反应基因的表达水平在附加文件中列出5．

渗透胁迫反应的比较分析

在渗透胁迫阶段进行转录组分析，以研究植物对盐暴露的早期反应。本分析的时间点选择基于盐胁迫下光合作用响应的时间过程(图2)。2) ［27]。在Syn86和Zentos中，盐反应基因在30分钟和15分钟时最多，而在8分钟时，两种基因型中盐反应基因的数量最少(图2)。3.a, b)。在Syn86和Zentos的所有时间点上，分别有38个和14个基因同时存在差异表达(图2)。3.a, b)。上调和下调基因的分布显示，Zentos分别在ASE 15 min和ASE 4 h时的上调和下调基因数量最多(图2)。4a).相比之下，Syn86在4 h时上调基因数量最多，在30 min时下调基因数量最多。总的来说，Zentos显示了75%的上调基因，而Syn86显示了60%。

通过基因本体(GO)富集分析，揭示了应激各时间点过度代表的基因类别。在热图中突出显示(图2)。5A、b)分别是24和18个过度代表的本体术语，它们分别是完全向上和向下调节的。在上调的基因类型中，涉及伤害反应和色氨酸合成酶活性的基因在易感基因型中过多，而在Zentos中则是钙结合结构域的基因。在两种基因型中，对真菌和细菌的防御反应、转录因子活性和蛋白激酶编码基因都被过度表达和上调(图2)。5a).在Syn86的下调类别中发现精胺和亚精胺生物合成和抗氧化活性基因的过度表达(图6)。5b).附加文件6每个过度代表类别的详细信息，背景中基因的总数，分配给该术语的盐反应基因的数量(GA)，预期基因的数量(GE)和折叠变化。后者由GA除以GE得出，并表示每个显著富集的高度。

具有特定表达谱的5个簇包括来自每种基因型的96%的盐反应基因，并显示在附加文件中7．从表达趋势来看，Zentos的主要基因簇中包含15 min上调的基因簇，其次是30 min上调的基因簇，而30 min下调和上调的基因簇对应于Syn86的两个主要基因簇。这些集群分别包含了Zentos和Syn86盐响应基因总数的54.5%和57.3%。额外的文件8列出了在集群中被过度表示的GO术语。这些术语大多与在表达谱中显示出更大幅度的时间点上过度代表的类别相吻合(图2)。5a、b)。

渗透期基因表达与光合速率的时间进程

与渗透期相关的一些代表性过高的基因类别的表达谱在两种基因型中显示出关键差异。因此，我们比较了光合作用相关基因、钙结合基因、氧化应激反应基因和木葡聚糖:木糖基转移酶活性基因的表达谱(图2)。6）.在有101个基因的敏感基因型中，观察到光合作用类别的过度代表性，而在Zentos中，该术语只有11个转录本对盐敏感(更正)p-value > 0.001)。6a).在Syn86光合速率开始下降的8 min ASE时，观察到光系统II (PSII)中与电子传递相关的8个基因的上调(图6)。2）.30min时，光合速率有所恢复，但仍受到抑制(图2)。2)，来自光系统I和II类别的91个转录本下调，相对表达值在−1.1至−3.4之间(图2)。6a).以Zentos为例，在ASE 4 h时观察到受盐胁迫影响的少数光合作用基因(图2)。6a)，这与该基因型在前分钟ASE中检测到的更大的光合稳定性一致(图2)。2）.

对耐盐基因型的50个盐响应钙结合基因进行局部估计的黄土曲线分析，结果显示耐盐基因型在15 min时有基因上调的趋势。在该时间点鉴定出34个转录本，相对表达值在1.0 ~ 3.4之间(图2)。6b).在这些基因中，32个含有EF-hand钙结合结构域。该术语在Syn86中没有被过多地表示(已更正)p-value > 0.001)，尽管与Zentos相比，更多的基因表现出差异表达。因此，Syn86在129个钙结合基因中表现出不同的表达模式。其中大部分基因(40个)在30 min时下调，GFOLD值在−1.0 ~−3.1之间(图3)。6b).其中大部分(29个基因)是来自PSII的氧进化复合体的组分[39]。这一结果也与Syn86在该时间点光合速率受到抑制的情况相一致(图2)。2）.这类基因的其他基因在该基因型中上调，在ASE 30分钟上调35个，在ASE 15分钟上调21个。

从氧化应激反应类别中，在Zentos中鉴定出33个盐反应基因。其中8个和10个在ASE 15和30 min时表达上调，相对表达值分别低于2.5。在4 h时观察到8个基因的下调，表达值在−1.0 ~−2.4之间(图2)。6c)。相比之下，Syn86中的59个基因表现出不同的表达模式，相对表达值高于Zentos(图2)。6c).下调转录本的表达值在−1.0 ~−3.5之间波动，上调转录本的GFOLD值在1.0 ~ 4.2之间波动。盐响应性氧化应激基因在30 min时最多(38个转录本)，包括上调和下调转录本。这些在易感基因型中较大的转录变异与在这个时间点观察到的抑制光合活性是一致的。2）.

最后，所有的盐反应细胞壁基因都对应于木葡聚糖:木糖基转移酶活性类别。在Zentos中鉴定出18个基因，其中14个基因在8和15 min出现上调，GFOLD值在1.1到4.0之间(图2)。6d).在Syn86中，这类基因中有24个对盐敏感。黄土曲线突出显示了16个转录本在30 min时的下调，相对表达值在−1.0至−4.3之间(图2)。6d)。

离子应力响应的对比分析

为了更好地了解植物对盐暴露的后期反应，在离子胁迫阶段进行了比较转录谱分析。该分析显示，Altay2000在第11天的转录变化最小(图2)。3.c).跨基因型和时间点鉴定了9个基因的同时差异表达(图2)。3.c).在ASE第24天，上调的基因多于下调的基因，而在ASE第11天，两种基因型中都发现了相反的模式，下调的基因更多(图2)。4b). Altay2000和Bobur总共分别含有54%和50%的下调基因。

鉴定出这一应激阶段特有的3个氧化石墨烯术语，23个类别中的11个在两种基因型中具有相同的应激效应(图2)。5c)。例如，两种基因型的几丁质酶活性和对氧化应激的反应都下调，而对水和跨膜运输的反应则上调(图2)。5c).跨膜转运类转录本上调，可能对Na起作用⁺在ASE第24天确定体内平衡(图2)。7）.该分析显示ABC转运蛋白和Na的数量较多⁺/ Ca^{2 +}交换子在耐受性基因型中表达，而在易感基因型中表达的基因相对表达值更高。另一方面，与翻译相关的基因在耐受性基因型中下调，而金属离子结合类基因则上调。在易感基因型中观察到对生长素类别的反应上调(图2)。5c).附加文件9详细说明离子阶段过度代表的基因类别，类似于附加文件6对于渗透相。

渗透和离子胁迫反应的比较分析

比较了4种基因型的转录组动力学，以确定在盐胁迫反应的渗透期和离子期改变其表达水平的基因。Syn86是盐响应基因数量最多的基因型，是3个品种盐响应基因数量的3 ~ 5倍。在所有差异表达基因中，4个基因型中有86个是应激反应基因，而耐受性基因型和敏感性基因型中分别有50个和232个转录本(图2)。3.d)。

在渗透相和离子相中，共有20个氧化石墨烯项被过度表示(图2)。5）.盐敏感型Syn86在渗透期和耐盐型Altay2000在离子期的翻译类别下调。丝氨酸型内多肽酶抑制剂活性在两个盐胁迫阶段的耐盐基因型中呈现相反的相对表达值。这些基因在耐盐基因型中下调，在盐敏感基因型中上调。相反，耐盐基因型在离子胁迫阶段表现出上调。在渗透胁迫阶段，对比基因型对氧化应激类别的响应均上调和下调，而在离子阶段，两种基因型均下调。

候选qtg的鉴定

为了揭示可能包含控制盐胁迫相关性状的等位基因的候选qtg，在QTL区间内鉴定了盐响应转录本。Syn86和Zentos是一项先进的回交qtl (AB-QTL)研究的对照亲本[27]，而Altay2000和Bobur是在一个关联小组中鉴定出的对比基因型[28]。数字8和表2从这些研究中发现的2A染色体上的两个QTL中获得候选qtg。一个36 Mbp的连锁不平衡(LD)区包括单核苷酸多态性(SNP)标记RAC875_c38018_278，该标记在关联面板中与盐胁迫后茎鲜重相关。在该区域发现了3个差异表达基因，敏感基因型中有1个盐响应基因，耐盐基因型中有2个(表2)2,无花果。8）.TraesCS2A02G395000盐敏感基因型表现出最强烈的胁迫反应，编码氧戊二酸/铁依赖性双加氧酶的基因在盐敏感基因型中被抑制，表达值为−2.4。在AB-QTL定位研究中，一个9 Mbp的LD块包含标记BS00041707_51，该标记被鉴定为影响胁迫下籽粒重的变异。该区域包括Syn86中两个表达水平相似的上调基因，分别编码氨基酸转运蛋白和铜胺氧化酶。在其他研究中，5个候选qtg具有应激反应(表2)2）.

实时定量PCR分析

通过实时定量PCR (RT-qPCR)分析两个钙结合类基因的表达，验证MACE测序确定的转录物丰度。额外的文件10显示了目标基因和两个内参基因的扩增效率比较。根据这些结果，为每个靶基因选择不同的内参基因(图2)。9）.PCR产物的熔化曲线包含在附加文件中11显示单峰，表明特异性扩增和缺乏引物二聚体。的表达式TraesCS2D02G173600在所有研究的时间点上，Zentos都比Syn86高。在AB-QTL研究中，该盐响应基因从SNP标记Kukri_rep_c72254_186中分离了9 kb，对盐胁迫下植物生物量的影响[j]。27]。与之前的基因不同，TraesCS5D02G238700在两种基因型中均表现出较高的相对表达值，在这种情况下，Syn86中的基因表达量高于Zentos(图2)。9）.在附加文件中比较了转录组和RT-qPCR分析的相对表达值12．RT-qPCR分析TraesCS5D02G238700在8和15分钟的转录组学分析中证实了Syn86更大的上调。在…的情况下TraesCS2D02G173600， RT-qPCR与转录组相对表达值相关性较低。

本研究揭示了盐胁迫在渗透期和离子期所导致的基因型转录变化的多样性。渗透胁迫实验揭示了一些快速的转录变化，这些变化可能与盐胁迫早期反应有关，从而引发不同基因型的差异胁迫驯化反应。易感基因型光合相关转录物的初始上调和后向下调与观察到的光合响应一致。PSII类电子输运在8 min时的上调可能与该系统的过度激发有关，从而导致ROS的产生增加[14，48]。光合作用相关基因在30 min ASE时的下调可能是由于过度的ROS积累在转录和翻译水平上抑制了光损伤PSII的修复[49，50，51，52]。尽管如此，结果表明植物可以恢复光合作用相关基因的表达水平，因为在ASE 4 h时没有观察到光合作用的转录抑制(图2)。6一个)。

Zentos氧化应激反应的降低可归因于抑制ROS的产生，这可能会刺激应激条件下的生长[52]。因此，该基因型的光合作用抑制减弱可能与光合机构的氧化损伤降低有关。另一方面，易感基因型显示与氧化损伤保护相关的基因下调和上调，相对表达值高于耐受基因型(图2)。6b).这些结果表明，盐胁迫在转录水平上对Syn86的氧化损伤保护系统有更强的影响，支持其更大的光合抑制作用[52]。对胁迫下ROS含量的进一步研究将有助于将其与所观察到的对比基因型的转录变化联系起来。

在Zentos中，钙结合蛋白编码基因在15分钟内的过度表达与耐盐基因型中钙和ROS信号传导的早期时间一致[13]。这些分子在信号通路中相互作用，调节盐胁迫反应并引发全身反应[13，14，17，53]。延迟的Ca^{2 +}/ROS信号在Syn86中观察到30分钟，可导致茉莉酸信号通路的激活，最终导致细胞死亡。不同的是，耐受基因型中钙依赖性和ros依赖性信号的早期激活可以通过激活脱落酸信号通路诱导茉莉酸信号的约束[13]。除了延迟钙结合上调外，还观察到盐驱动对光合作用相关钙结合基因的抑制。这一结果也与在Syn86中观察到的光合作用抑制有关。

本研究还揭示了不同基因型对木葡聚糖:木糖基转移酶活性项的差异反应。在耐受性基因型中观察到的转录增加可能使植物在逆境下生长，并可能有利于细胞壁的强化，防止过度的水分流失和维持细胞壁中木葡聚糖的生物合成所造成的膨胀压力[54，55]。所描述的转录事件的协同作用和特定时间可能对在早期胁迫阶段研究的基因型的差异应激反应至关重要。在Zentos中发生的快速信号事件可能与激活胁迫适应和更高的光合稳定性的有益机制有关。

在离子胁迫阶段，对比基因型中观察到的一些氧化石墨烯项的相似胁迫反应表明，一些早期的转录反应可能存在更大的差异，并可能显著影响基因型对长期盐胁迫的驯化反应[j]。15]。然而，也有可能相似的种类在两种基因型中都对盐有反应，差异可能在于特定的基因及其表达水平，从而影响不同的应激反应。例如，跨膜运输类别在两种基因型中均上调。这一类包含ABC转运蛋白和Na转运蛋白⁺/ Ca^{2 +}仅在耐受基因型中表达的交换子可能与Na相关⁺排除机制[56，57，58]。需要进一步的实验来证实这些基因在应激诱导下的表达与Na的减少之间的联系⁺在离子期耐受性基因型中发现的积累[59]。

结果表明，盐反应基因中过度表达的氧化石墨烯类别及其抑制或过度表达与两个胁迫阶段对比基因型的生理测量结果一致。大多数在离子相中过度表达的氧化石墨烯在渗透相中也被发现，这表明在这些胁迫相中存在一组共同的转录反应。翻译和丝氨酸型内肽酶抑制剂类别在两个应激阶段都有相反的调控，表明这些机制的控制是应激阶段特异性的。与应激相关的ROS损伤可导致异常蛋白在细胞内的积累，从而导致蛋白质从头合成和蛋白酶在细胞内降解的短暂抑制[60，61，62]。

RT-qPCR证明了转录组学结果的准确性，因为在样品制备、RNA提取和测序过程中可能出现多种偏差，以及分析文库所需的复杂管道[63，64，65]。RT-qPCR证实treescs5d02g238700在渗透期上调，而trescs5d02g238700在渗透期上调TraesCS1B02G144500（ZIP7)在离子相中得到了Oyiga等人的证实[28]。的表达不协调TraesCS2D02G173600在这两个平台中，可能是由于在一些基因组区域中多个对齐reads的高频率导致转录组学分析中的表达量化偏差[66]。

从关联图谱分析的QTL区间观察到的3个盐响应基因中，氧戊二酸/铁依赖性双加氧酶在易感基因型中下调最强。这个基因超家族可能参与了几种特殊的次生代谢物的生物合成，以响应生物和非生物胁迫[67，68]。因此，该基因是一个强有力的候选基因，可以优先进行进一步的验证分析。

AB-QTL定位区间包含两个盐响应基因，包括一个铜胺氧化酶和一个氨基酸转运蛋白，它们的相对表达量相似。敏感基因型中这两个基因的上调可能与来自Syn86的等位基因在盐胁迫下籽粒重变异中的正表型作用有关[27]。研究拟南芥铜胺氧化酶参与一氧化氮的生物合成，一氧化氮是一种信号分子，参与对生物或非生物胁迫的适应性反应[69，70，71]。另一方面，盐胁迫上调的氨基酸转运蛋白可参与氨基酸的运输，如脯氨酸，脯氨酸在胁迫下积累，充当渗透调节的渗透渗透物[72，73]。基因在间隔内的差异表达可能是伴随表型变异的原因[30.]。RT-qPCR验证TraesCS2D02G173600是D亚基因组AB-QTL研究中QTL内候选基因的另一个例子[27]。在这种情况下，由于该亚基因组的遗传变异性降低，导致snp标记密度较低，因此无法划分LD区间[27，74，75]。

由于面包小麦基因组的高度复杂性和定位研究的低分辨率，必须实施策略来确定QTL区间的潜在功能候选物，以深入了解复杂性状的机制基础。本研究中开发的方法强调了最近完全注释和高度连续的染色体水平参考基因组序列组装的有用性，以促进基因组和转录组资源的整合，以解决面包小麦的QTL问题[5，76]。当其他组织在盐胁迫下的表达数据和额外的时间点也可以包括在内时，这种策略可能更加稳健。进一步确认所选候选基因对感兴趣性状的因果关系的步骤是鉴定编码和启动子区域的多态性，以及将更高分辨率的定位方法与功能研究相结合。

除了揭示盐胁迫响应期间的动态转录组和QTL区间的qtg外，mace衍生的序列分析还为面包小麦提供了两种新型转录区域的证据。首先，发现了参与盐胁迫反应的新转录本。根据对18个品种全基因组的分析，这些转录本可能丰富了占总泛基因组39%的小麦变量泛基因组[77]。其次，在基因模型预测的3 '端之外检测到的reads表明转录时间延长，有助于改进RefSeq v1.1注释[5]。这些reads的发现表明，目前的一些基因模型预测是基于在3 '端具有不完整读取覆盖的转录本。通过扩展转录鉴定的基因可以包含在计算预测方法中，以改进基因结构[39，78]。考虑这些额外的reads与更好地定量表达水平有关，因为在当前的参考基因组注释中，这些reads被忽略了。对新转录本和3 '端进行RT-qPCR验证对于确认这些区域的转录是必要的。

本研究强调了在盐胁迫反应的渗透和离子阶段受转录水平影响的关键基因类别。我们推测，细胞壁合成和钙结合基因在耐受性基因型的渗透期早期激活，可能与触发该基因型更大的光合稳定性和总体上增加的盐胁迫适应性的机制有关。一些ABC转运蛋白和Na的特异性上调⁺/ Ca^{2 +}离子阶段耐受基因型的交换分子表明它们参与钠排斥机制。我们期望我们的研究结果将鼓励小麦研究界在QTL区间内对一些优先基因进行功能分析，以遵循等位基因特异性引物的开发步骤，用于标记辅助选择方法。这些结果将有助于更好地进行QTL解剖，最终揭示盐胁迫相关性状调控途径的新基因，从而进一步应用于小麦育种计划。

从定位群体和组织取样对比基因型

利用AB-QTL分析渗透胁迫响应过程中叶片转录组的差异，德国冬小麦优良品种Zentos(耐盐)和合成基因型Syn86(盐敏感)为对照亲本[j]。27，79]。Zentos的种子由Syngenta Seeds GmbH (Bad Salzuflen, Germany)提供，而Syn86的种子由Lange和Jochemsen生产和供应[80]。土耳其品种Altay2000(耐盐)和乌兹别克斯坦品种Bobur(耐盐)是早期研究中鉴定的冬小麦基因型，用于对比茎部钾积累⁺和钠⁺其他应激相关性状[59]。这些基因型包括在关联制图研究中使用的一个小组中[28，29]，分析离子胁迫响应过程中的叶片转录组。该研究的种子由国际冬小麦改良计划提供，如Oyiga等人所述。[28，29，59]。

对照基因型在20±2°C、50±5%湿度、光周期12 h、4盏灯、200 μmol m光强的生长室内水培系统中生长⁻²年代⁻¹100 mM NaCl盐胁迫处理。水培系统的详细步骤见Dadshani等人。[81]和Oyiga等人。[59]分别用于渗透相和离子相实验。简单地说，对于渗透胁迫取样，种子在培养皿(29.0 × 22.5 × 3.0 cm;Licefa GmbH & Co KG, Bad Salzuflen, Germany)滤纸(C160;Munktell & Filtrak GmbH;Bärenstein，德国)和蒸馏水。8天后，54株健康幼苗转移到聚苯乙烯板(styrodur 3035 CS;巴斯夫，路德维希港，德国)放置在深色聚丙烯箱上，装满170升营养液，通过四个空气扩散器不断充气(Eheim 4,002,650, Eheim GmbH & Co. KG, Deizisau，德国)。根据Dadshani[]分析的光合作用响应，采用适应水培条件10天的均匀大小幼苗在时间点取样叶片。27]。利用LI-6400XT气体交换系统测定光合速率的时间过程，揭示了不同基因型在胁迫阶段的不同胁迫响应。利科环保公司，林肯，美国)。这个分析是在水培系统中进行的，使用5个50天的植物，然后转移到NaCl溶液中。从第三片完全展开的叶片开始，每隔30 s记录一次数据，直到ASE 45 min。这项研究使我们能够确定光合作用速率的转折点。拐点是指曲线斜率方向变化所显示的响应变化最大的时间点，如图所示。2［82]。因此，在8、15和30分钟确定的光合作用转向时间点采样渗透胁迫条件(图2)。2对照条件分别为0、30 min和4 h，在无NaCl的水培箱中生长。

离子相水培系统考虑使用容量为170 L的深色聚丙烯箱，箱内装有156根PVC管(直径4.5 cm × 45 cm深)和164 L营养液。在这种情况下，种子在含有Aquagran过滤器石英2-3.15 mm (euroquartz GmbH, Dorsten, Germany)的管中原位发芽。种植后3天，在3天内逐渐施盐，直至达到最终浓度[59]。离子胁迫条件下的样品分别在盐胁迫和对照植株的第11天和第24天采集。从四株植物中收获等量的叶片组织，在液氮中均质，形成一个RNA池，用于每个对照和胁迫时间点。

MACE读取加工和映射到参考基因组

采用Chang等人开发的方法分离合并样本的总RNA。83]， 5 μg用于cDNA合成。MACE库构建协议按照Zawada等人的描述执行。[84]使用Illumina NextSeq 500系统，对生物素化的3 '端片段进行了16至200 bp的测序。使用Cutadapt工具从读取中移除适配器[85]。这些程序在GenXPro GmbH (Frankfurt, Germany)进行，分别从渗透和离子应力实验中生成14个和8个文库。使用FastQC对图书馆进行质量控制[86]，用Trimmomatic [87]。保留的reads与参考基因组组装版本“RefSeq v1.0”比对[5]使用Tophat [88]。使用Cufflinks预测工具生成新的转录本组装[89，90]。使用SAMtools的标记工具生成重复数据删除的对齐文件并估计读重复的数量[91]。

为了更好地估计基因表达水平，从而有助于基因模型的改进，我们创建了一个新的注释文件，用于计数HC和LC基因模型预测的3 '端以外的reads [5]。因此，RefSeq v1.1基因组注释中的基因模型[5]在大于1000 bp但小于基因大小的3倍的基因间区域中，向预测的3 '端下游延伸40%。当基因间距离较大时，延长的靶序列与基因的大小相对应。然后，Subread包的featurets工具中的搁浅选项[92，93]用于计算分配给细长HC和LC基因模型的唯一映射reads，以及新的预测转录本。

读取计数数据被归一化为每百万次的计数。在每个基因型中定义转录组背景，以减少可能导致采样噪声的低表达转录物的数量[94，95]。因此，在相同基因型的文库中，选择2.5计数/百万的平均归一化值作为阈值，过滤掉每个文库中少于5%的读取(参见附加文件)1）.

盐反应基因鉴定及基因本体富集分析

在过滤了很少读取的转录本后，使用片段的原始计数数据作为GFOLD软件的输入来鉴定盐应答基因[40]。GFOLD值是为合并实验分析而开发的相对基因表达的可靠估计[40]。测井密度图₁₀使用规范化表达式值来比较它们的分布。重叠的表达分布表明测序深度具有适当的均匀性，计数归一化适合比较不同文库的表达水平[96]。假设在正常条件下，在这短时间内几乎没有发生生理变化，将0分钟的样品作为8和15分钟ASE的对照。GFOLD绝对值越高，表明基因的上调或下调程度越高。当c = 0.01时，GFOLD值> 1或< - 1的基因被考虑进行进一步分析，因为它们代表了应激条件下表达水平的相关变化。定义的c值是一个参数，表示在99%的情况下，基因的折叠变化大于该基因计算的绝对GFOLD(0.01)值[40]。

使用来自STEM软件的GO富集工具来区分对比基因型中被时间点过度代表的基因类别[97，98]。分析中只保留每个基因型转录组背景中的基因类别[99]。采用Bonferroni多元假设校正检验，因此GO项具有校正项p-value < 0.001被认为是过度代表。使用STEM算法对渗透期的表达谱进行聚类，并定义聚类中过度代表的GO类别[97，98]。选择在渗透期代表性过高的关键类别，创建相应基因的时间过程表达图。拟合黄土模型来表示基因簇的表达趋势。比较了离子期不同基因型中与离子稳态相关的跨膜转运类转录本的表达水平。

qtg的鉴定

通过对强LD (R)中snp的鉴定确定QTL区间²≥0.8)，标记对性状变异有显著影响[One hundred.]。通过转录组学分析在跨越QTL的LD块内检测到的盐响应基因，可以定位qtg [27，28]。参考基因组序列RefSeq v1.0中LD块的位置根据snp -侧翼序列IWGSC RefSeq v1.0 BLAST结果确定[45]。利用小麦RNA-seq图谱expVIP将QTGs的表达与其他非生物胁迫实验中测定的QTGs的表达进行比较[46]。

实时定量PCR分析

以Syn86和Zentos为材料，采用150 mM NaCl进行水培试验。在确定的渗透相时间点取样应激条件和对照条件。每种条件下收集3株幼苗，在液氮中冷冻。人工研磨叶片，用RNeasy植物迷你试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)从每株植物中提取200 mg组织进行总RNA分离。cDNA合成采用First Strand cDNA synthesis Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)，每个样品的总RNA为5 μg。RT-qPCR使用SDS-7500序列检测系统(Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)，循环条件为95°C/7 min，依次在95°C/10 s、60°C/30 s、72°C/30 s、82°C/30 s(荧光采集)循环40次。盐反应基因的亚基因组特异性引物TraesCS2D02G173600和TraesCS5D02G238700使用基于web的工具GSP [101]，并在附加文件中提供10．内控引物的扩增效率TaEf-1.1和TaEf-1.2［28，29]，并对各靶基因进行比较。20 μl RT-qPCR反应为:每个引物0.25 μl，与ROX (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)混合的DyNamo Color Flash SYBR Green 2X-master混合物10.12 μl, 1:20稀释的cDNA模板2.5 μl。PCR产物分别在95°C 10 s、60°C 30 s和95°C 15 s的循环中熔化曲线分析。

计算三个技术重复的平均Ct值，并将其作为输入，采用∆∆Ct法定量所选基因的相对表达[47]。单样本单尾t检验(p< 0.05)^−∆∆Ct每个基因型在每个时间点的值，评估平均值是> 2.0还是< 1.0，以确定转录本在胁迫下分别是上调还是下调。采用双样本双尾t检验(p < 0.05)^−∆∆Ct测定两个基因型的平均相对表达值在每个时间点是否有显著差异。比较转录组学分析所得的平均∆∆Ct值和GFOLD值。

支持本文结果的主要数据包含在本文和提供的附加文件中。每个文库的序列比对文件存入国家生物技术信息中心的序列读取档案(SRA)，检索号为PRJNA549411。

AB-QTL:

先进backcross-QTL

日月光半导体:

应激暴露后

遗传算法:

属于这一类的基因

通用电气:

这一类别中预期的基因

GFOLD:

广义褶皱变化

走:

基因本体论

HC:

高的信心

IWGSC:

国际小麦基因组测序联盟

LC:

信心不足

LD:

连锁不平衡

黄土说:

局部估计散点图平滑

梅斯:

cDNA 3 '端大量分析

PSII:

光系统II

QTG:

数量性状基因

QTL:

数量性状位点

ROS:

活性氧

RT-qPCR:

实时定量PCR

作者要感谢Asis Shrestha、Teresa Mosquera和Felipe sammiento对本文的批判性阅读，并感谢Inci Vogt对RT-qPCR分析的支持。

本研究由德国联邦政府经济与经济合作委员会(German Agency for International Cooperation)通过“德国国际合作署”(Project 09.7860.1-001.00)资助。DDD由哥伦比亚科学、技术和创新部679号博士奖学金资助。资助机构仅为研究项目提供资金支持，不参与研究设计、数据收集、分析或手稿准备。由Projekt DEAL提供的开放获取资金。

从属关系

1. 植物育种研究所，波恩大学，波恩，德国

   Diana Duarte-Delgado, Said Dadshani, Benedict C. Oyiga, Michael Schneider, bobby Mathew, Jens lsamon和Agim Ballvora

2. inres -作物生物信息学，波恩大学，德国波恩

   海科Schoof

贡献

DDD进行了实验室和生物信息学分析，解释了数据并起草了手稿。SD和BCO设计并进行了水培试验，并参与了数据解释。HS监督生物信息学分析并对数据解释作出贡献。MS和BM支持生物信息学分析。AB和JL对研究进行了概念化。AB监督了整个研究，参与了实验的设计和数据的解释。所有作者都参与了稿件的撰写，并审定了定稿。

相应的作者

对应到Agim Ballvora．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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