基因组调查，表征和BZIP转录因子的表达分析藜藜麦

背景

藜藜麦Willd。藜麦(quinoa)是苋科的一种伪谷类作物，是一种很有前途的作物，营养含量高，对应激环境(如受高盐影响的土壤)具有很高的耐受性。碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子仅在真核生物中存在，与许多生物过程有关。到目前为止，藜麦和其他3种苋科作物(Spinacia oleracea那Beta寻常魅力， 和Amaranthus hepochondriacus.）已经完全测序。然而，有关的bZIPs在这些苋菜科的物种是有限的，全基因组分析bZIP结构这个家族缺乏藜麦。

结果

我们确认94bZIPs在奎奴亚藜中（命名为CqbZIP1-CQBZIP94）.一切CqbZIPs在系统发育上被分成12个不同的亚科。比例CqbZIPs在每个亚家族中是不同的，同一亚群的成员都具有保守的外显子-内含子结构和蛋白质基序。此外,32个重复cqbzip.研究基因对，重复CqbZIPs主要经历了净化选择压力，这表明重复的功能CqbZIPs可能没有太大的分歧。此外，我们确定了bZIP结构藜麦和41,32和16种氨基克科特物种的成员和41,32和16个直字基因对S. Oleracea.那刺檗， 和A.次沉晶杆菌,分别。其中，大多数是一个单一的副本出现在S. Oleracea.那刺檗， 和A.次沉晶杆菌和两种副本存在于同种异体一体化奎奴亚藜中。功能分歧bZIP结构同源基因可能是有限的。此外，11中选择CqbZIPs有特定的空间表达式模式，共有6个CqbZIPs响应于盐胁迫而上调。在选定中间CqbZIPs，4个重复基因对共有类似的表达模式，表明这些重复的基因可能在随后的进化期间保留一些基本功能。

结论

本研究提供了系统发育分类，基因序和基因结构，膨胀模式和表达剖面的第一种系统分析bZIP结构奎奴亚藜的家庭。我们的结果将为CQ的功能和进化分析奠定重要基础bZIPs，并为进一步研究组织特异性及其在藜麦抗盐胁迫中的功能提供了有前景的候选基因。

藜麦(藜藜麦Willd。）是一种嗜睡症，源于南美安第斯仙安第安马省地区[1]它是一种异源四倍体（2n = 四倍 = 奎奴亚藜属苋科植物，也包括其他重要的经济作物，如Spinacia oleracea（菠菜，2n = 2x = 12），Beta寻常魅力（甜菜，2n = 2x = 18） ，及Amaranthus hepochondriacus.（苋菜红，2n = 2x = 32) [2]．藜麦生产的谷物比其他主要谷物更有营养[3.那4.]并表现出对不良气候和土壤条件的高耐受性，如干旱，土壤盐度和霜，这使其成为农艺膨胀到边缘土地的有利候选者，并鉴定促进胁迫耐受性的候选基因[1那5.那6.那7.]．2013年宣布国际藜亚的年度，联合国承认了这一新兴作物的潜力[6.那7.]为了在世界范围内扩大奎奴亚藜的生产并加速奎奴亚藜的改良，越来越多的研究人员致力于奎奴亚藜的研究，并起草了藜麦最近报道了基因组序列[7.这为加速世界粮食作物的遗传改良和提高全球粮食安全提供了基础。

转录因子（TFS）在几乎所有植物生物过程中起重要作用。它们是许多信号网络的关键调节因子，响应于植物生长和发展以及通过结合对应基因的启动子和/或增强子区域来激活或抑制下游靶基因的转录[8.那9.那10.]在几个只存在于真核生物中的TF家族中，碱性亮氨酸拉链（bZIP）家族是最大和最多样化的家族之一[10.那11.那12.]．bZIP TFs包含一个高度保守的bZIP域，该域由两个结构特征组成，一个高度保守的基本区域和一个不太保守的亮氨酸拉链。基本区由16个氨基酸残基组成，具有不变的N-× 7-R/K基序，专门负责DNA结合和细胞核定位。亮氨酸拉链包括亮氨酸或其他大型疏水氨基酸的七核苷酸重复序列，用于特定的识别和二聚[10.那11.那12.那13.那14.]．

在植物中，有大量证据表明bZIP TFs在胚胎发生等生物过程的各个方面发挥着关键作用[15.]，种子成熟[16.那17.[花和血管发展[18.那19.]．另一方面，bZIP蛋白也参与调控信号和对非生物/生物刺激的反应，包括高盐度、干旱、渗透、冷胁迫和病原体防御[10.那11.那12.那20.]．因此，bZIP结构转录因子是重要的植物抵御各种环境压力，如盐渍化土壤。土壤盐渍化是一个日益严重的问题，在农业生产造成全球巨大的经济损失。由于藜可在苛刻的土壤条件下生长，并表现出高耐盐[6.那21.那22.[庄稼可以用作其他作物的耐盐基因的有价值的捐赠者[6.]．

Bzip TF家族的成员在许多真核基因组中全面地识别或预测了[10.那20.那23.那24.那25.那26.]．然而，据我们所知，没有bZIP结构到目前为止已经在奎奴亚藜中鉴定并孤立基因。通过藜麦基因组测序完成，基因组概述bZIP结构迫切需要奎奴亚藜科植物。在本研究中，假设bZIPs在奎奴亚藜中鉴定出来。我们对系统发育，基因结构，蛋白质基序，基因组定位，膨胀模式和表达谱进行了相对详细的研究，以评估分子演化和生物学功能bZIP结构奎奴亚藜的家庭。

推定基因的基因组鉴定和特征bZIPs

总共94bZIP结构基因被证实和藜（附加文件中标识1)，我们将这些基因命名为CqbZIPs， 从CqbZIP1来CQBZIP9494个CQBZIP的一级和二级蛋白质结构由其蛋白质序列推断（附加文件1）.蛋白质结构在所有鉴定的CQbzips中高度多样化，蛋白质的氨基酸数由92（CQBZIP31）至821（CQBZIP86）变化，预测分子量范围为10.8kDa（CQbzip31）至91.6kDa（CQbzip86）。等电点从4.38（CQBZIP81）到10.37（CQBZIP42）。此外，我们确定了54,48和49bZIP结构基因甘蓝，普通甘蓝， 和A.次沉晶杆菌，表示为sobzips.那BvbZIPs， 和AhbZIPs，分别（附加文件2）.

系统发育分析

确定进化关系bZIPs在藜麦中，用来自拟南芥的94个Cqbzip蛋白和已知的Bzips构建系统发育树（图。1和2a、 附加文件3.）.

根据以前的分类系统[14.),cqbzip.家系分为12个亚科（亚科A至K和S），每个亚科的成员比例不同（附加文件）4.一个)。亚家族S（17％）具有最多的基因，其次是亚家族A（14％），亚家族D（13％）和亚家族I（13％）。亚家族B（2％），亚家族J（2％）和亚家族K（2％）含有最小成员。此外，这bZIPs在菠菜中，甜菜和苋菜被系统发育分类（附加文件）5.），每个植物中发现每个亚家族中的类似成分分布（附加文件4.B-D）。

基因结构和蛋白质基序CqbZIPs

对基因结构和内含子相进行了研究cqbzip.家庭（图。2b）。结果表明大多数CqbZIPs（72 of 94CqbZIPs)含有内含子，内含子数量从1个到11个不等。亚家族A、B、C、E、F、H、I、J、K、S含有0-5个内含子，而亚家族D、G含有7-11个内含子，但不含CQBZIP90.．一般来说，大多数cqbzip.同一亚组中的基因显示出类似的外显子结构，并且通过相对位置和相形成的内含子模式在每个系统发育亚组内高度保守。

总共，在CqbZIP蛋白质中鉴定出20个保守的基序，包括bZIP结构域，它们的多水平一致氨基酸基序序列在附加文件中列出6.．对应的系统发育树的图案分布cqbzip.基因家族如图所示。2c.所有的cqbzip都有Motif 1，代表bZIP域的基本区域和铰链，Motif 4和9对应于bZIP家族中亮氨酸拉链区域的可变Motif。例如，motif 9只出现在D亚族中，而motif 4几乎出现在其他亚族中。此外，还发现了一些亚家族特有的基序。例如，Motif 16仅存在于G亚家族中，Motif 15仅存在于A亚家族中，Motif 11和20仅存在于I亚家族中，Motif 2、7和9仅存在于D亚家族中。

基因组位置和基因复制CqbZIPs

94的基因组位置CqbZIPs显示在其他文件中7.。此外，为了说明CqbZIPs，基因复制事件在本研究探讨。如图1所示。3.32岁的复制cqbzip.重复事件主要集中在S、D、A、G和I亚群。此外，计算了所有32个重复样本的Ka/Ks比值cqbzip.基因对小于11）.的同源关系bZIPs分析藜麦和3种其他苋菜植物之间，分别鉴定41,32和16个直晶基因对，分别在藜麦和菠菜，甜菜和苋菜之间鉴定出来（图。4.，附加文件8.）.其中,17sobzips., 13BvbZIPs，及7AhbZIPs有2bZIP结构奎奴亚藜的直觉。在原始基因对中，大多数分布在亚家族D，S和I中。除此之外，所有KA / KS比例cqbzip72/Bvbzip13.和CQBZIP73./Bvbzip13.少于1人。

表达式模式CqbZIPs

以前的研究报告说，有些bZIP结构基因，如BZIP17.[27.那28.],bZIP49[14.],BZIP28[29.],BZIP60[28.那30.],ABF1-4[14.那31.那32.],GBF1[33.],矫正性大动脉转位[34.那35.那36.],Abi5.[37.]， 和HY5[38.]在植物对盐胁迫和其他非生物胁迫的反应中发挥作用。在本研究中，我们调查了11个选定的基因的表达模式CqbZIPs(无花果。5.)，表现出较高的同源性bZIPs在拟南芥中（图。1，附加文件9.)结果表明，这些基因具有组织特异性表达谱（图。5.一个)。CqbZIP3主要表达于叶，而CqbZIP17在幼茎中表现出较高的转录本丰度。其他基因，如cqbzip92那CQBZIP44那cqbzip81那cqbzip72， 和cqbzip61主要在根中表达。此外，11CqbZIPs对盐处理下的幼苗根系进行了研究(图。5.b).结果表明，11CqbZIPs被诱导或抑制。如图所示。5.B，6 11CqbZIPs（CqbZIP3那CqbZIP8那CqbZIP24那CQBZIP67.那CQBZIP44， 和CQBZIP73.）对盐胁迫响应肯定，而其他基因如CqbZIP17那cqbzip72那cqbzip92， 和cqbzip61在盐胁迫后表达水平下降。此外，4个重复的表达式配置文件cqbzip.基因对进行了比较（附加文件10.）.其中，3对基因(CQBZIP44/CQBZIP67.那CqbZIP8/CqbZIP24， 和cqbzip81/cqbzip92）共享相似的表达模式（附加文件10.A-C和E-G），虽然这不是如此cqbzip72/CQBZIP73.．复制的基因对在盐胁迫下表现出反表达模式(附加文件)10.H)，这可能是由基因调控的变异引起的。

奎奴亚藜基因组是两个不同的多倍体亲本物种基因组融合的结果土荆芥（c . pallidicaule和C. Suecicum.)，每一个贡献约一半的基因组大小[7.]．在这项研究中，一套完整的94bZIP结构在藜麦中鉴定基因，基因的大小与拟南芥（78）相似[14.]和大米(89)[23.，但明显低于大豆(160)[39.]最近的全部基因组重复（WGD）事件由于古代多百倍而发生，这表明除了大约430万年前发生的基因组融合事件，没有其他谱系最近的WGD参与奎奴亚藜基因组进化[40].此外，基因的编码蛋白CqbZIPs表现出物理和化学性质的显着差异（附加文件1)bZIPs其他植物的基因[23.那24.那25.]．

这bZIP结构成员也被鉴定在其他3种苋科物种和数量bZIPs异源四倍体中的藜麦几乎是多倍体中的一倍S. Oleracea.（54），刺檗(48),A.次沉晶杆菌(49)(附加文件2）.其中,12bZIP结构亚科是通过系统发生分析（图聚类。1和2a、 附加文件2那3，和5.）），在4次苋科植物中发现了每种亚家族的类似成分分布（附加文件4.）.亚家族含有最多的基因，而亚家族B，J和K具有最少bZIPs．然而，并非每株植物都存在所有亚组。与拟南芥中的成员相比，没有亚家族bZIPs存在于4种苋科植物中，无J亚科bZIPs存在于A.次沉晶杆菌，表明植物的进化不仅涉及基因保留，而且还伴随着基因丢失和突变[41]．

内外图案携带基因家族的演变的印记[42那43那44那45]．在本研究中，内含子的数量CqbZIPs从0变化到11（图2b，附加文件3.）.大多数CqbZIPs（72 of 94CqbZIPs)包含内含子，仅占总数的22cqbzip.基因是无元的。外显子和内含子拼接的不同状态可能是有意义的cqbzip.基因进化。此外，结果表明，基因的外显子/内含子结构CqbZIPs各亚群内高度保守，聚在一起的基因在外显子序列中的内含子区域分布普遍相似。此外，D亚家族和G亚家族包含的内含子明显多于其他亚家族，S亚家族(16个成员中有14个)和F亚家族(8个成员中有6个)的大部分都不存在内含子。CqbZIPs表现出相似的基因结构多样性bZIP结构S在其他物种中，例如木薯[20.]和六个豆类[26.]．

在本研究中，我们还根据保守motif的序列相似性对20个不同的保守motif进行了识别和分类(图2)。2c).结果表明，所有的cqbzip都包含典型的bZIP域(Motif 1)，每个亚族都有一些共同的Motif，但也有一些亚族包含特殊的Motif。bZIP结构域是bZIP家族的核心，优先与下游靶基因的启动子结合CIS.-元素(如ABREs)。不同的母题组成可能有助于CqbZIP成员的功能多样性[25.]．总体而言，各系统发育类群的基因结构和基序分布高度保守，支持其密切的进化关系和亚科分类。

人们已经认识到，基因复制在进化新颖性和复杂性的起源中起着重要作用[46那47]．在这项研究中，研究了基因重复事件以阐明扩大机制bZIP结构奎奴亚藜的基因家族（图。3.桌子1）.我们确定了32重复cqbzip.基因对（图3.），以及嘉/ Ks的比率对所有的复制cqbzip.基因对小于11），表明这一点CqbZIPs主要经验丰富的净化选择压力，有限的功能分歧[41那48那49]．同时，成绩单水平的一些重复CqbZIPs不同组织和根在盐胁迫后也有相似之处(附加文件10.)，这可能与它们高度相似的蛋白质结构有关CIS.-regulatory元素，结果表明，这些重复基因可能后续演进过程中保留了一些基本功能[50那51那52]．

在苋菜科家庭，属土荆芥和Spinacia.属藜科β属于贝叶科，属苋菜属苋科[2]．在这项研究中，41,32和16CqbZIPs分别与菠菜、甜菜和苋菜同源(图。4.，附加文件8.)，取进化树(附加文件11.）考虑到奎奴亚藜和菠菜bZIPs与甜菜和苋菜在系统发育上是否密切相关bZIPs，这符合预期[2]．除此之外,在bZIP结构同源基因中，大多数是一个拷贝存在于多倍体菠菜、甜菜和苋菜中，两个拷贝存在于异源四倍体藜麦中（图。4.，附加文件8.）.嘉/ Ks的比来计算建议内的功能有限发散bZIP结构本研究鉴定的同源基因。

对于多基因家族，基因表达分析常常为功能预测提供有用的线索。结果表明，11个样本中大部分被选中CqbZIPs具有特定的空间表达模式(图。5.A)，表明它们在藜麦中发挥不同的发育和生理功能的重要作用。此外，藜麦作为植物耐盐性的一个模型也被研究bZIP结构已被证明在各种植物物种中鉴定的基因在盐应激反应中发挥关键作用[53那54那55那56]．在目前的研究中，11人中有6人CqbZIPs那CqbZIP3（直观到ABF1-4），CqbZIP8（直观到GBF1），CqbZIP24（直观到GBF1），CQBZIP67.（直观到BZIP17.那bZIP49， 和BZIP28），CQBZIP44（直观到BZIP17.那bZIP49， 和BZIP28),CQBZIP73.（直观到矫正性大动脉转位）响应于盐应激而正面调节（图。5.b） 我们的结果为筛选候选基因提供了证据，以进一步鉴定它们在植物抗盐胁迫中的功能参与CqbZIPs对盐胁迫产生负面影响，表明它们可能是对其他强调或参与其他生物过程的反应。

在本报告中，共94岁bZIPs在藜中分离得到。综合研究CqbZIPs所提供的基因家族的一些重要的功能，如系统发生的分类，扩展图案，和表达谱。本研究的结果可以扩大上的分子进化和功能我们的理解bZIP结构奎奴亚藜的家庭，并提供了进一步调查的好机会bZIP结构植物科。

的的bZIP转录因子基因鉴定

藜麦(藜藜麦V1.0）和苋菜（Amaranthus hepochondriacus.从Phytozome v12 (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）.菠菜(登录号:PRJNA325593)和甜菜(登录号:PRJNA268352)基因组数据库从美国国家生物技术信息中心(NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）.Arabidopsis Bzip序列[14.]取自拟南芥信息资源(TAIR) (http://www.arabidopsis.org)，并使用带有默认参数的BLASTP程序对藜麦、菠菜、甜菜和苋菜基因组数据库进行搜索[57]之后，bZIP域由保守域数据库（CDD）程序确认(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)和简单模块化架构研究工具(SMART) (http://smart.embl-heidelberg.de）.最后，收集了自信的基因并分配为bZIP结构基因如下分析。利用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)及SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/npsa/npsa_sopma.html.） 工具。

系统发育分类和结构分析

本研究中识别的所有bZIP序列使用ClustalX version 2.1进行比对[58]．然后，利用MEGA7 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis)构建邻居连接系统发育树[59]．Bootstrap分析进行1000次重复，以评估每个节点的统计支持度。利用在线Multiple Em for Motif Elicitation (MEME)程序扫描藜麦中bZIP蛋白的保守基序(http://meme-suite.org/tools/meme.），参数是基于先前的研究上设置[41]．为了说明藜麦的外显子-内含子结构bZIPs，基因结构显示服务器(GSDS)工具(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)通过将预测的编码序列与其对应的基因组序列进行比较来使用。

染色体定位和基因复制

藜麦和苋菜的特定染色体位置bZIPs从植物血统数据库下载，以及染色体位置信息bZIPs在NCBI中搜索菠菜和甜菜。通过BLASTP和系统发育分析搜索重复的基因对[49]，并配以马戏团节目[60]用DnaSP v5.0软件估算进化率、Ka（非同义替代率）和Ks（同义替代率）[61，计算Ka/Ks比值来评估每个重复基因对的选择压力。

植物材料、RNA提取和定量实时PCR

白藜种子（YMSBLM-2）由山西省农业科学院玉米研究所提供。在受控条件下在生长室中培养灭菌的种子（24℃/ 22°C夜晚，16小时光/ 8小时）。从4-5叶阶段幼苗收集RNA样品。收获根，茎，叶子，并收获300mM NaCl（盐胁迫）的根，1小时和3小时。之后，使用RNeasy植物迷你试剂盒（QIAGEN）提取总RNA，使用Superscript TM III逆转录酶试剂盒（Invitrogen）进行cDNA的制备。设计了基因特异性引物（附加文件12.)，然后进行商业合成(华大基因，北京，中国)。采用2× Quantitative SYBR Green PCR mix (QIAGEN)和ABI ViiA 7 real-time PCR系统(Applied Biosystems, USA)进行实时定量PCR (qRT-PCR)，严格按照制造商说明进行。qRT-PCR机设置40个循环，退火温度为60℃。相对基因转录水平测定为2^−⊿⊿CT.[62]，和归一化对延伸因子1α（EF1α.)基因转录水平。每个实验使用独立的RNA样本重复三次bZIPs在奎奴亚藜中，使用Cluster 3.0软件进行聚类[63]．

拟南芥bZIP蛋白序列来源于拟南芥信息源(TAIR)数据库(http://www.arabidopsis.org)藜属植物的基因组序列(藜藜麦V1.0）和苋菜（Amaranthus hepochondriacus.下载自Phytozome v12 (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）.菠菜(登录号:PRJNA325593)和甜菜(登录号:PRJNA268352)的基因组序列从国家生物技术信息中心(NCBI)下载http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）.目前研究中使用的所有数据都包含在本发布的文章中及其附加文件中，或者可以从相应的作者提供合理的请求。

bZIP:

基本亮氨酸拉链

TF:

转录因子

NCBI：

国家生物技术信息中心

TAIR:

拟南芥信息资源

客户尽职调查：

保守域数据库

聪明的：

简单的模块化建筑研究工具

兆：

分子进化遗传学分析

MEME：

多重Em用于基序诱导

GSDS：

基因结构显示服务器

Ka / Ks:

非同义替换率/同义替换率

EF1α.：

伸长因子1α基因

qRT PCR：

定量实时PCR

我们感谢凯凡博士（福建农业和中国林业大学）以获得优秀的技术援助。

这项研究是由来自山西大同大学（2017年-B-18）的博士后科研基金，重点研究和农业科技大同科技，山西（2018042）和山西省计划的开发项目，重点基础研究发展计划资助项目（201603D221004-5）。供资机构必须在研究和收集，分析和解释数据的设计没有任何作用，并以书面稿件。

从属关系

1. 山西大同大学生命科学学院，大同，037009，中华人民共和国

   冯丽，江西刘，徐湖郭，丽丽尹＆洪利张

2. 山西大同大学农业设施技术研发中心，大同，037009，中华人民共和国

   冯丽，莉莉尹＆洪利张

3. 山西农业科学院玉米研究所，鑫州，中华人民共和国034000

   日语温

贡献

FL和RW构思和设计了研究。FL和RW提供了新的试剂或分析工具。FL、JL、XG和HZ分析了数据。FL、JL和LY进行了实验。FL、XG、HZ和RW为撰写手稿做出了贡献。所有作者都阅读并批准了手稿。

通讯作者

通信日语温．

道德认可和参与同意

不适用。

同意出版

不适用。

竞争利益

两位作者宣称没有相互竞争的经济利益。

出版商的注意事项

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