全基因组分析WRKY黄瓜基因组中的基因家族和应答生物和非生物胁迫的WRKY转录因子的转录组范围鉴定

背景

黄瓜(Cucumis巨大成功L.)是一种重要的经济蔬菜作物品种。然而，它容易受到各种非生物和生物压力的影响。WRKY转录因子在植物生长发育中起着重要作用，特别是在植物对生物和非生物胁迫的响应中。然而，对的表达模式知之甚少WRKY黄瓜不同胁迫下的基因。

结果

在本研究中，对黄瓜基因组的新组装(v3.0)的分析允许对61个黄瓜进行鉴定WRKY基因。利用相关种进行了系统发育和同系性分析，研究了黄瓜的进化过程WRKY基因。61年CsWRKYs分为三大类，其中基因结构和基序组成较为保守。组织表达谱WRKY基因表明CsWRKY在所有样本中，FPKM > 1基因均呈本构表达WRKY基因显示器官特异性表达，表明这些WRKYs可能对黄瓜的植物生长和器官发育很重要。重要的是，分析CsWRKY基因表达模式揭示了五种CsWRKY基因对盐胁迫和热胁迫都有强烈反应，观察到有12个基因对霜霉病和白粉病的感染有反应，3个基因对盐胁迫和热胁迫有强烈反应CsWRKY基因同时对所分析的所有处理作出反应。一些CsWRKY在非生物或生物胁迫处理后，观察到基因在不同时间被诱导/抑制，表明黄瓜WRKY基因可能在不同的应激反应中发挥不同的作用，其表达模式也因应激反应而异。

结论

六十一年WRKY本研究对黄瓜中的基因进行了鉴定，并对其分类、进化和表达模式进行了研究。研究了黄瓜对不同生物胁迫和非生物胁迫的响应。我们的结果提供了一个更好的理解的功能CsWRKY提高黄瓜非生物和生物抗逆性的基因研究。

在植物的整个生命周期中，它们经常遇到许多不同类型的胁迫，这些胁迫严重阻碍了它们达到最佳生长，并可能对产量产生重大影响[1，2，3.，4］．其中一些压力是非生物胁迫因素，如温度、干旱、盐和重金属胁迫。相比之下，生物胁迫因素涉及植物与以植物为食物来源的昆虫、线虫、病毒、细菌、真菌或卵菌的相互作用[2，5］．为了承受或应对这些不同的胁迫，植物进化出了一系列的调节机制，其中包括对大量基因的广泛调节，以调节植物的生理和生化过程[6，7］．因此，研究参与这些机制的基因对于开发生物技术工具以增强理想的农艺性状(如植物生长和生产力)非常重要。转录因子(TFs)，包括AP2/ERF、NAC、MYB和WRKY家族成员，通过调节防御相关基因的表达参与植物对非生物和生物胁迫的耐受[8，9，10，11，12，13，14］．

的WRKY基因家族是高等植物中最大、研究最广泛的TF家族之一[15］．自从第一次WRKY基因在甘薯中克隆，鉴定WRKY基因已经在各种植物物种中进行了，包括拟南芥(72) (16),栽培稻(103) (17),玉米(120) (18),而茄属植物lycopersicum(81) (19］．WRKY tf共享一个保守的dna结合结构域，该结构域包含高度保守的WRKYGQK七肽，随后是C2H2-或c2hc -型锌指基序[15，20.］．WRKY tf的功能是识别和绑定W-box独联体-元件(TTGACC/T)，以及庚肽序列和锌指基序都是这种高结合活性所必需的[15，21，22］．根据WRKY结构域的数量和锌指类型，WRKY tf可分为三个系统发育上不同的组:组I WRKY，有两个WRKY结构域;II类WRKY具有一个WRKY结构域，I类和II类WRKY均含有一个c2h2型锌指基序(C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H);III族成员，具有一个WRKY结构域和一个c2hc型基序(C-X7-C-X23-H-X1-C)。此外，根据系统发育分析，第II组进一步分为五个亚组(IIa-IIe) [23，24，25］．

WRKY tf已被报道参与植物发育的许多方面[25，26]，包括衰老[27，28]，毛状体发育[29]，次生代谢产物的生物合成[21，30.，31，32]，开花[33，34]，以及种子的发育和萌发[35，36，37］．大量证据表明，许多WRKY基因也参与各种应激反应。例如，18的表达式WRKY在拟南芥的根中，这些基因被证明是由暴露于盐胁迫诱导的[38］．WRKY6而且WRKY42被鉴定为通过调节PHO1表达式[39］．来自拟南芥的WRKY tf也显示出积极和/或消极地调节对抗细菌病原体的防御反应[16，40]、真菌病原体[41，42，43]和线虫[44，45］．13的表达水平OsWRKY研究了水稻基因对不同处理的反应，包括盐、聚乙二醇(PEG)和冷或热胁迫WRKY基因对这些非生物胁迫的反应是下调或上调的。此外，番茄WRKY蛋白(美国lycopersicum) ［19，46),芸苔属植物显著［47]，大豆(大豆) ［48]，大米(o .漂白亚麻纤维卷) ［49，50]，小麦(小麦l .) [51]和其他植物物种被证明在应对各种生物和非生物压力方面发挥着关键作用。

根据上述讨论，WRKY tf可能参与多种途径，导致一系列生理反应。的演化和重复展开的说明WRKY基因似乎与其功能的多样性有关[20.，24］．的进化研究WRKY基因家族和大规模全基因组分析WRKY基因表明，由最少成员组成的IIa组基因是最后进化的，似乎起源于IIb组基因。此外，IIa组转录因子在生物和非生物应激反应的调节中发挥着许多重要作用[20.］．

黄瓜(Cucumis巨大成功)是最具经济价值的蔬菜作物之一，其果实鲜嫩，可作食用器官[52，53］．此外，黄瓜被广泛用作性别决定、血管生物学和诱导防御反应研究的模型系统[54］．在黄瓜栽培中，产量和质量经常受到不同类型的生物和非生物胁迫的影响，导致黄瓜产量下降。因此，新的抗胁迫功能基因的鉴定得到了相当大的兴趣。基于黄瓜基因组(v1.0)， 57WRKY已鉴定出基因，其中23个基因在至少一种非生物胁迫下表现出差异表达[55］．利用低盖度Sanger序列和短盖度高盖度Illumina序列对黄瓜进行基因组组装(v1.0和v2.0);因此，这些基因组是不完整和低质量的。一个高质量和完整的黄瓜基因组集(v3.0)目前可用于比较基因组学和遗传研究[56］．本文利用黄瓜(Chinese Long, 9930)基因组(v3.0)对黄瓜WRKYs进行了新的全基因组鉴定。我们确定了61个WRKY基因，并将它们分为三组。进一步进行基因结构、染色体位置、保守蛋白结构域和系统发育分析等综合分析。全基因组表达谱CsWRKY研究了不同胁迫条件下黄瓜植株的基因。我们的研究结果将为今后研究WRKYs在黄瓜中的功能提供有价值的线索。

黄瓜基因组包含61个WRKY基因

在之前的研究中，57WRKY在黄瓜(中国长，9930)基因组(v1.0)中鉴定了基因[55］．最近，CuGenDB中发布了更新版本(v3.0) (http://cucurbitgenomics.org/)，并取消了1.0版本。因此，我们鉴定出了黄瓜WRKY黄瓜基因组中的基因(v3.0)和61WRKY基因通过WRKY结构域(PF03106)的隐马尔可夫模型(HMM)搜索进行识别。根据Pfam和SMART分析，这些基因均含有WRKY结构域。前57名中WRKY基因，五个(CsWRKY53-CsWRKY57)并没有在黄瓜基因组的基础上最终定位到任何染色体(v1.0) [55];然而，所有的61WRKY在本研究中鉴定的基因可以在当前版本的黄瓜基因组(v3.0)的基础上映射到染色体上(附加文件)1:图S1)。黄瓜基因组中有7条染色体;的WRKY基因并不均匀地分布在所有染色体上。染色体3的染色体数量最多CsWRKY5号染色体上有15个(24.59%)基因，5个(8.20%)基因。除1号和4号染色体外，染色体的数目WRKY我们发现的映射到每条染色体上的基因至少比之前的研究多一个(附加文件)2:图S2)。根据它们在染色体上的顺序WRKY在这项研究中发现的基因被重新命名CsWRKY1来CsWRKY61(附加文件1:图S1)，该命名方法与先前研究中使用的命名方法相同。黄瓜基因组中已知WRKY tf的比较(Gy14, v1.0;9930, v2.0和v3.0)列在附加文件中3.:表S1。

这61人WRKY对基因、编码DNA序列(CDS)和蛋白质序列的长度、蛋白质分子量(MW)和等电点(pI)进行分析(表1和附加文件3.:表S1)。最大的蛋白质为CsWRKY8，由1118个氨基酸(aa)组成，最小的蛋白质为CsWRKY47 (119 aa)，对应的分子量范围为13.95 (CsWRKY47)至124.59 (CsWRKY8) kDa。WKRYs的pi范围为5.11 (CsWRKY10) ~ 10.08 (CsWRKY54)。根据亚细胞定位的预测结果，这些CsWRKY蛋白都可能定位于细胞核。CsWRKY50亚细胞定位(本文命名为CsWRKY47) [53可以支持这一说法。

CsWRKY蛋白的多序列比对、系统发育关系和分类

首先对新鉴定的cswrky的WRKY结构域(约60个aa)进行比对，并从每个组或亚组中随机选择7个AtWRKY结构域(AtWRKY58、56、21、35、46、40和6)作为代表进行分析。高度保守的序列WRKYGQK在总共58个CsWRKY蛋白中被发现，而其他的(CsWRKY10、CsWRKY47和CsWRKY50)只有一个氨基酸取代:K取代Q(图2)。1和表1)．

以黄瓜和拟南芥为研究对象，采用MEGA 5.0软件，通过1000次自举试验，采用邻域连接(NJ)方法构建了系统发育树[16WRKY域aa序列(附加文件4:表S2)。如图所示。2，在拟南芥WRKY蛋白分类的基础上，黄瓜WRKY蛋白可分为三大类(Group I-III) [25］．在61个CsWRKY蛋白序列中，11个序列归属于I组，43个序列归属于II组，7个序列归属于III组。在组I中，10个成员包含两个WRKY域(一个n端WRKY域和一个c端WRKY域)，而CsWRKY42失去了c端wrkygqk样拉伸;这11个成员都含有c2h2型锌指基元(C-X4-C-X22-24-H-X-H)。第二组的成员包含一个WRKY域，并可进一步分为五个亚组(IIa-IIe)。此外，有三名成员属于IIa，这是成员人数最少的一组;5, IIb;20日,IIc;7, IId;第八，撒谎。 Although most of the members of Group II had integral C2H2-type zinc finger motifs, partial absence of the zinc finger motif sequence was present in CsWRKY14 and CsWRKY47. Except for CsWRKY40, whose zinc finger motif was almost entirely absent, the CsWRKYs classed in Group III harboured a WRKY domain and contained a C2HC-type zinc finger motif. The ‘leucine-rich repeat’ (LRR) motif, which is a typical domain of resistance (R) proteins and is found in WRKY proteins of some species, such as Arabidopsis and rice, was not observed in the WRKY proteins of cucumber.

IIa组WRKY基因被发现是最后进化的，因为这些基因组成了长刺苔藓中唯一不存在的群体卷柏moellendorffii［20.］．的WRKY已鉴定出许多物种的基因家族成员，其详细数目列于表中2．因此，我们研究了IIa群的复制和多样化WRKYs在进化过程中基于可用的WRKYIIa基因存在于不同物种中，包括8种双子叶植物(拟南芥、蓖麻、黄瓜、葡萄、番茄、梨、马铃薯和杨树)和6种单子叶植物(大麦、水稻、玉米、面包小麦)。Brachypodium和小米)。这些的WRKY域序列WRKY利用IIa基因通过MEGA 5.0软件构建系统发育树(附加文件5:表S3)。

正如我们构建的系统进化树所示，WRKY IIa蛋白被分为7个进化支(图2)。3.)．来自系统发育较近的物种的wrky聚集在同一进化枝中。例如，进化枝1和2的成员都来自双子叶，而进化枝4-7只含有来自单子叶的蛋白质;分支3根据双子叶和单子叶的成员进一步划分为两个不同的亚分支(分支3a和分支3b)，这表明双子叶和单子叶中IIa类群WRKYs的不同进化模式可能是在它们分化后发生的。来自同一个物种的WRKY蛋白在三个进化支中最多聚集在一起，并且所有分成三个进化支的WRKY蛋白都来自单子叶。为WRKYs在双子叶植物中，黄瓜、葡萄、梨和杨树分别向分枝1和分枝2贡献了至少一个基因;然而，这三个物种(蓖麻豆、番茄和土豆)专门聚集在分支1或分支2中。这些结果表明了大量的进化分裂和多样化WRKYs发生在不同的物种之间。

基因结构和基序组成CsWRKYs

基因结构多样性可以反映多基因家族的演化[68］．因此，我们分析了每个基因的ORF (open reading fame)序列中的外显子-内含子组织CsWRKY基因(CsWRKY40该基因缺乏锌指基序)，以获得更多关于黄瓜中WRKY家族进化的见解。以往研究表明，大多数杨树和大豆WRKY成员含有2 ~ 4个内含子[48，62］．一直以来，超过80%的成员CsWRKY基因包含2 ~ 4个内含子(7个含1个内含子，29个含2个内含子，10个含3个内含子，12个含4个内含子，2个含5个内含子，1个含6个内含子)(图)。4和表1)．如图所示。4， I组观察到较多的内含子，数量从3个到6个不等。所有WRKY结构域通常都包含一个内含子，而且这个内含子的位置是高度保守的[57］．我们发现CsWRKYs在它们的WRKY结构域中含有内含子。该内含子位于I组(c端WRKY结构域)，IIc, IId, IIe和IIIWRKY基因具有相同的位置，位于不变PR氨基酸序列(PR内含子)的密码子之后(图。1)．在IIa组和IIb组基因中观察到VQR内含子出现在不变的VQR氨基酸序列之前。

以更好地了解保护和多样化CsWRKYs，通过模因基序分析预测所有CsWRKY蛋白的推测基序。正如预期的那样，被分类到同一组的cswrky具有高度相似的motif组成(图。4和附加文件6:表S4)。例如，motif 9是IId和IIe组特有的，而motif 10是IIb和IIc组特有的;IIe和IIc组只有2 - 3个母题，而IIb组有5个母题。这些母题的功能大多尚待阐明。

总的来说，系统发育树中亲缘关系密切的cswrky具有相似的基因结构和共同的基序组成，表明同一类群内的cswrky可能具有相似的功能作用。

的同步性分析CsWRKY基因

对黄瓜WRKY家族中发生的片段复制事件进行了分析CsWRKY基因使用BLASTP和MCScanX。如图所示。5， 14个片段复制事件，涉及25个WRKY观察基因(附加文件7:表S5)。相比之下，串联复制事件，由200 kb内包含两个或多个基因的染色体区域定义，在黄瓜中没有被鉴定出来WRKY基因。这些结果表明一些CsWRKYs是否可能是由节段复制事件而产生的呢CsWRKY基因至少在一定程度上是由片段复制事件驱动的。

通过构建与5个代表性物种(包括3个双子叶(拟南芥、番茄和西瓜)和2个单子叶(水稻和玉米)相关的黄瓜WRKY家族的系统发育机制，进一步探索了黄瓜WRKY家族的系统发育机制(图2)。6)．52 29 27 9 5CsWRKY这些基因分别与西瓜、番茄、拟南芥、水稻和玉米5个物种的基因呈共线关系。总共52个WRKY在黄瓜和西瓜之间鉴定出共线基因对，其次是黄瓜和拟南芥(41)，黄瓜和番茄(37)，黄瓜和水稻(9)，黄瓜和玉米(7)(附加文件)8:表S6)。黄瓜和西瓜都属于葫芦科，并且有85%以上CsWRKY基因表现为同向关系WRKYS代表西瓜，还有一个CsWRKY基因只与一个同位基因对相关，说明WRKY黄瓜和西瓜的基因来自同一远古时期WRKY基因。CsWRKY21而且CsWRKY28发现黄瓜与番茄/水稻/玉米之间存在2对同程基因;一些CsWRKY基因与3对共线基因(黄瓜和番茄/拟南芥)相关WRKY基因)，推测这些CsWRKYs可能在进化中发挥重要作用WRKY基因家族。重要的是,共线CsWRKY21结果表明，黄瓜与其他5种植物间均存在同源基因对，这一同源基因对可能在双子叶植物和单子叶植物分化之前就已形成。

CsWRKYs不同器官的表达谱

所有61个的表达模式CsWRKYs基于黄瓜根、茎、叶、雌花、雄花、子房、扩张的未受精房、扩张的受精房和卷须等不同组织的公开转录组数据，采用标准的转录组分析程序进行研究[69］．61人中CsWRKY基因,41CsWRKYs在所有检测样本中均有表达(FPKM> 0)， 24个基因呈本构表达(FPKM> 1在所有样本中均有表达)(补充文件9:表S7)。一些CsWRKY基因在所有测试的组织中都表现出优先表达。根有19个基因，卷须有2个基因(CsWRKY50/59)，以及雌花中的两个基因(CsWRKY48/12)的转录水平最高。不同果实发育阶段的表达分析表明，几种基因(CsWRKY9/40/54)在卵巢中的表达量高于扩张的卵巢(受精和未受精)。此外，抄本水平也有所提高CsWRKYs(如CsWRKY19/27/41/57)在受精卵膨胀的卵巢中减少(图;7)．这些结果表明，这些基因可能在黄瓜植株发育的许多方面发挥作用，包括子房发育和果实受精。

表达模式CsWRKYs以应对非生物和生物压力

确认是否CsWRKYs都参与了对各种应激的反应，我们分析了CsWRKY在不同的非生物和生物胁迫下，包括盐、热、霜霉病(DM，Pseudoperonospora cubensis)和白粉病(PM，Podosphaera fusca)，根据公开的转录组资料[54，70，71和我们生成的转录组数据。

研究…的潜在功能CsWRKYs在抗盐胁迫方面，我们进行了CsWRKYs基于公开转录组数据的盐处理后表达分析[70](附加文件10:表S8)。我们观察到的表达水平CsWRKY27, CsWRKY41而且CsWRKY50对盐胁迫的反应大大增加。此外，7个基因在盐胁迫下表现出相反的趋势。8a).先前的研究表明，施用硅(Si)可以促进盐胁迫下植物的生长[72］．盐胁迫下调的7个基因中，有6个基因的表达水平恢复正常，差异表达基因(DEGs)均在外源Si处理下表达上调，这可能是这些基因的潜在作用WRKY基因在硅基缓解盐胁迫中的作用(图;8a).此外，所有61个的表达模式CsWRKY本研究对转录组数据中的基因进行了研究，这些基因来自于受到不同热处理时间的叶片(附加文件10:表S8)。用相关分析和聚类分析来探讨转录组之间的相似性。两个样品(HT3h_2和HT6h_2)由于均匀性差而被去除，其余7个样品用于以下分析(附加文件11:图S3)。如图所示。8b, 21CsWRKY热胁迫显著诱导/抑制基因表达。表达的变化趋势最为明显WRKY基因对热应激3 h (h)的反应与6 h (h)一致。总体来看，成绩单水平为5级CsWRKY基因(CsWRKY27/41/50/52/57)受到盐胁迫和热胁迫处理的显著影响。

的潜在功能CsWRKYs在抵抗生物压力方面，我们进行了CsWRKYs基于已发表的RNA-seq数据，PM接种48 h后黄瓜敏感和抗性株系的表达分析[71(图。9a和附加文件10:表S8)。11和12CsWRKY与对照相比，在敏感和抗性黄瓜品系中分别鉴定出差异表达的基因。这些结果表明WRKYs可能受到PM压力的影响。的表达模式CsWRKY10而且CsWRKY50在接种PM的黄瓜敏感品系和抗性品系中表现相反，说明这两者的重要作用WRKY基因对PM感染的反应。的表达式CsWRKY基于Adhikari等发表的RNA-seq数据，通过转录组分析获得DM感染应答基因。[54](附加文件10:表S8)。25CsWRKY黄瓜中的基因参与了对DM感染的反应，表明它们被诱导在响应DM感染中发挥作用(图2)。9b).我们确定了12个CsWRKY基因(CsWRKY10/14/19/27/28/32/35/46/50/52/59/61)在接种PM和DM后表达差异显著(图2)。9)，表明这些基因可能在生物应激反应中发挥关键作用。一些CsWRKY基因仅受接种PM和/或DM的影响，而不受非生物(热和盐)胁迫的影响(图2)。8而且9)．例如,CsWRKY46对接种PM和DM有显著表达，对盐胁迫和热胁迫无显著表达;此外,CsWRKY15除接种PM外，其他处理均未诱导/抑制。此外，表达水平有几种CsWRKY基因受到非生物胁迫和生物胁迫的显著影响(图2)。8而且9)．例如,CsWRKY27，CsWRKY50而且CsWRKY52同时对所有处理均有反应，且表达CsWRKY59除盐处理外，所有试验处理均有影响。

虽然WRKY在黄瓜(9930)基因组(v1.0)中已鉴定出基因[55]，有必要重新识别它们。因为信息WRKY由于从CuGenDB中删除了1.0版本的基因，在1.0版本中鉴定的基因不再可用(http://cucurbitgenomics.org/)，而程序集(v2.0和v3.0)是可用的。因此，我们在黄瓜(9930)基因组(v3.0)中鉴定并鉴定了WRKY家族。它由61个成员组成，根据其染色体位置命名为CsWRKY1到CsWRKY61;这一数字高于之前的一项研究(57WRKY基因)[55］．与之前报道的相比CsWRKY九种新基因CsWRKY基因被映射到染色体上，之前的五个CsWRKY根据当前版本的黄瓜基因组(v3.0)，不能最终映射到任何染色体的基因被认为是过时的1:图S1和附加文件2:图S2)。

根据基因结构，氨基酸序列，保守结构域和系统发育关系答:芥61个CsWRKY蛋白与其他物种中典型的WRKY家族蛋白相似，分为I、IIa、IIb、IIc、IId、IIe和III组1,无花果。1而且2)．Rinerson等人[20.]提出开花植物WRKY TF谱系主要有类群I + IIc、类群IIa + IIb、类群IId + IIe和类群III，准确反映了WRKY家族的演化过程。这在黄瓜中也得到了验证;例如，IIa和IIb类群(或IId和IIe类群)的成员被分为两个分支，它们涉及同一个分支;一些来自IIc组的WRKY tf与I组的成员被归为一个亚分支(图2)。2)．IIc组中3个CsWRKY蛋白(CsWRKY10/47/50)的WRKY结构域存在序列变异。畴的丢失，似乎在单子叶植物中很常见，是植物扩展的发散力之一WRKY基因家族[73，74];然而，这些失域事件在双子叶植物中发生的要比单子叶植物少。例如，在拟南芥中，I族含有一个只有一个WRKY结构域的蛋白质(AtWRKY10) [74］．在黄瓜中，除CsWRKY42外，I族WRKY蛋白均有2个WRKY结构域，锌指motif缺失事件也在3个WRKY tf中被发现(CsWRKY14/40/47)(图。1和表1)．根据以往的研究，WRKY tf与同源物的高结合亲和力都需要七肽基序WRKYGQK和锌指基序独联体-作用w盒元件(TTGACC/T)。因此，七肽基序的变异和锌指基序的缺失可能会影响CsWRKY与靶基因的正常相互作用，这5种CsWRKY蛋白的结合特异性和功能值得进一步研究。

串联复制和染色体/节段复制都有助于细胞的扩增WRKY基因家族[24］．数量的比较WRKY黄瓜基因组与其他双子叶植物基因组的基因测序结果表明，黄瓜具有更少的基因2)．25个内14个片段复制事件WRKY观察基因(图;5和附加文件7:表S5)，而没有串联复制事件。因此，串联复制的缺乏可能是数量较少的一个可能原因CsWRKY基因和片段复制是主要的驱动因素WRKY黄瓜进化过程中的基因扩增。此外，我们发现超过85%(52 / 61)的CsWRKY基因表现为同源关系ClWRKY基因(附加文件)8:表S6)，表示的段复制WRKY基因可能在黄瓜和西瓜分化之前就在二倍体祖细胞中发生了。

2015年，Rinerson等人利用一种苔藓的基因组序列提出了III族基因不是最后进化的假设;IIa组基因是[20.］．在WRKY在基因家族中，IIa组基因组成了成员最少的亚支，在不同胁迫下的反应中发挥着许多重要作用[20.］．植物基因组中IIa族成员数量的增加可能为WRKY TF家族的进化提供更多线索。在本研究中，我们发现来自近缘种的WRKY Group IIa的成员倾向于聚集在一起，并且存在单子叶(枝1、2和3a)和双子叶(枝3b和4-7)特异性枝(图。3.)．这些结果表明WRKYIIa基因可能是在单子叶和双子叶分化后独立进化的。

众所周知，基因表达与基因功能相关[75］．在本研究中，所有61CsWRKY研究人员分析了黄瓜根、茎、叶、花、子房和卷须等9种不同组织的基因。我们发现19CsWRKY基因在根中特异表达(图;7)．如前所述，AtWRKY23，AtWRKY75而且AtWRKY6都能调节根的发育[76，77]，以及它们在黄瓜中的密切同源基因，CsWRKY25，CsWRKY32而且CsWRKY52，分别在根中特异表达。根据这些结果，所有在根系中特异表达的基因都被认为是根系发育的关键调节因子，并可能在应对首先影响地下植物的各种胁迫中发挥作用。此外,CsWRKY50而且CsWRKY59卷须被认为是黄瓜的异常叶片，在卷须中大量表达，提示它们可能调控黄瓜叶片形态发生。值得注意的是，黄瓜的表达谱WRKY本研究中的基因与Ling等的研究结果不一致。[55］．例如,WRKY18而且WRKY56在这两项研究中有极其不同的表达谱模式(图。7) ［55］．原因可能是，虽然它们有相同的名字，但它们实际上是不同的基因。这一预测可以得到支持WRKY56在之前的研究中无法最终映射到任何染色体[55]，但在我们的研究中是7号染色体(附加文件1:图S1)，以及WRKY18位于染色体3的不同位置(附加文件1:图S1) [55］．但是，由于目前还没有黄瓜基因组序列的v1.0版本，Ling等人在论文中也没有提供WRKYs的基因或蛋白序列，目前很难明确其原因[55］．

WRKY蛋白是最重要的TF家族之一，参与对生物和非生物胁迫的响应[25］．至少26个和54个WRKY在拟南芥和水稻中分别鉴定出响应非生物胁迫的基因[38，78］．在本研究中，我们进一步探讨了61的表达CsWRKY多重压力下的基因。它们大多受到我们所测试的至少一种胁迫(热、盐和接种DM和PM)的诱导/抑制，这表明CsWRKYs在黄瓜胁迫反应中起着至关重要的作用。四个CsWRKY的基因,CsWRKY9，CsWRKY18，CsWRKY48而且CsWRKY57，对热胁迫和/或盐胁迫有反应，但对接种DM和PM无反应(图2)。8而且9)．之前的研究已经揭示了这一点WRKY基因可以对几种压力做出反应。例如，过度表达AtWRKY30种子萌发过程中对氧化和盐度胁迫的耐受性提高[79］．在这四个基因中，的转录水平CsWRKY57盐胁迫和热胁迫处理均显著影响(图2)。8)，表明该基因是调控黄瓜对非生物胁迫易感性的最重要基因。相应地,10CsWRKY基因(CsWRKY1/3/4/15/21/22/30/46/53/58)只受接种PM和/或DM的影响，不受非生物胁迫(热胁迫和盐胁迫)的影响(图2)。8而且9)，只有CsWRKY46在PM和DM的胁迫诱导下，各基因在胁迫诱导下表达差异显著WRKYs以应对非生物和生物压力。此外，22CsWRKY基因受到非生物胁迫和生物胁迫的显著影响(图2)。8而且9)，表明一些CsWRKY基因在应对非生物和生物压力时具有相似的功能。例如，的表达式CsWRKY59除盐处理外，所有试验处理均有影响;CsWRKY27，CsWRKY50而且CsWRKY52同时对我们分析的所有治疗都有反应。的表达式OsWRKY67稻瘟病接种活化;过度的OsWRKY67增强水稻对叶枯病、穗枯病和白叶枯病的抗性[80];和黄瓜的同源物，CsWRKY50，也是由生物胁迫引起的，这表明CsWRKY27，CsWRKY50而且CsWRKY52黄瓜非生物和生物胁迫耐受性的改善。此外，12CsWRKY基因(CsWRKY6/16/17/24/29/31/38/39/42/43/55/60)对我们在本研究中分析的生物压力或非生物压力都没有反应。

如图所示。9，表示CsWRKY19在PM感染时表达下调，而在DM感染时表达上调WRKY在不同的应激反应下，基因可能发挥不同的作用。进一步的分析表明，对应力的响应发生在不同的时间点。CsWRKY10而且CsWRKY47热胁迫3 h后，细胞对热胁迫反应明显CsWRKY28而且CsWRKY35热应激开始后6 h影响;CsWRKY56仅在2 dpi处高表达，而DM感染可上调CsWRKY12而且CsWRKY50dpi在2到8之间，这表明CsWRKY基因可能在黄瓜抗生物胁迫和非生物胁迫的不同阶段发挥重要的调控作用。

总的来说，上述研究结果为研究黄瓜的潜在功能提供了新的思路WRKY基因。不同胁迫下的表达差异表明其功能多样化。一些CsWRKY基因可能对生物或非生物胁迫有特异性反应，而一些基因可能对生物和非生物胁迫都有反应。此外，一些CsWRKY基因可能与应激反应无关。这些结果有助于未来的功能表征CsWRKY研究了黄瓜抗生物和非生物胁迫的遗传改良基因。

在本研究中，61个黄瓜WRKY基因鉴定，并对其进行全面分析CsWRKY进行基因测试。首先介绍了黄瓜的染色体位置、保守基序、进化关系和基因结构WRKY研究人员检查了基因。的表达式模式CsWRKY结果表明，这些基因在黄瓜品种9930的9个不同组织中以及对不同胁迫的响应中可能发挥重要作用。此外，我们的结果揭示了应激诱导表达的差异和相似性CsWRKYs以应对非生物和生物压力。综上所述，我们的研究为今后的功能研究提供了基础WRKY在应对非生物和生物胁迫以及为育种计划确定新的抗性来源方面具有重要意义的基因。

基因鉴定和染色体定位

WRKY结构域(PF03106)的隐马尔科夫模型(HMM)文件，下载自Pfam蛋白家族数据库(http://pfam.sanger.ac.uk/)，用以识别WRKY基因从黄瓜基因组数据库(v3.0)的hmmer3.0。采用默认参数，截止值为0.01。所有CsWRKY根据HMMER结果从黄瓜基因组数据中查询的基因被进一步检查，通过Pfam (http://pfam.xfam.org/search#tabview=tab1)及SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)数据库。然后，我们手动检查每个候选基因，以确保保守的七肽序列在预测的WRKY结构域内，并使用PCR扩增和测序进一步验证选择CsWRKY基因。六十一年WRKY根据黄瓜基因组数据库中的物理位置信息，最终鉴定出基因并将其映射到黄瓜染色体上。利用CELLO预测CsWRKY蛋白的亚细胞定位(http://cello.life.nctu.edu.tw/)．

CsWRKY基因结构分析、分类及系统发育分析

利用基因结构显示服务器(gene Structure Display Server, GSDS)对所有鉴定的黄瓜WRKY基因进行基因结构鉴定。http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)．黄瓜WRKY按照拟南芥的分类方案将基因分为不同的类群WRKYCsWRKY和AtWRKY蛋白的WRKY结构域排列。在默认设置下，使用ClustalX对以下氨基酸序列进行比对:黄瓜和拟南芥的WRKY结构域(不包括I组c端结构域);61个全长cswrky;拟南芥中IIa族WRKY结构域[16]、蓖麻[64]，黄瓜，葡萄[67]，西红柿[19]，梨[63]，土豆[66]，杨树[62]，大麦[59]，大米[17]，玉米[18]，面包，小麦[51),Brachypodium［57]和小米[81］．然后利用MEGA 5.0的邻域连接(NJ)方法构建系统发育树。这些树通过Evolview (http://www.evolgenius.info/evolview)．

CsWRKY蛋白基序组成分析

61个黄瓜WRKY蛋白序列中的基序是通过MEME在线程序(http://meme.nbcr.net/meme/intro.html)，输入如下参数:重复次数，any;最大图案数量，10个;每个基序的最佳宽度在6到300个残基之间。

基因重复分析

多重共线性扫描工具包(MCScanX)用于检测基因复制事件，使用默认参数[82］．的同音关系WRKY利用MCScanX软件构建了黄瓜和其他精选品种的共程分析图谱。

的启动子区域中的调控元件CsWRKY基因

该基因的1.5 kb启动子片段(cswrky编码序列的上游序列)中的元件CsWRKY使用PlantCARE在线数据库(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)．

转录组分析WRKY黄瓜中的基因

的表达式模式CsWRKYs基于已发表的RNA-seq数据进行分析(SRA046916) [69］．清洁标签被重新映射到黄瓜基因组序列(http://cucurbitgenomics.org/Biomarker Technologies (Beijing, China)， v3.0)，并重新计算FPKM值。这些分析是对9种不同的黄瓜组织进行的:根、茎、叶、雌花、雄花、子房、扩张的未受精房、扩张的受精房和卷须。每个组织样本只使用一个生物复制[69］．全基因组表达CsWRKY使用MeV (Multiple Experiment Viewer)软件在热图上显示基因，表达水平由绿色变为红色的色条显示。

转录组分析CsWRKYs以应对非生物和生物压力

表达规范CsWRKY从公开的转录组数据中获得对不同胁迫反应的基因，这些数据从Gene Expression Omnibus下载，并分析以揭示盐处理后的全基因组差异表达基因(GSE116265) [70]和接种DM (SRP009350) [54]及PM (GSE81234) [71］．每个处理有三个或两个生物重复。罗斯福总统(或罗斯福总统P用原始文献中发表的log2的绝对值(fold-change)来鉴定DEGs [54，70，71］．由于显示的基因ID是根据黄瓜基因组v2.0，我们交叉引用的基因IDCsWRKYs黄瓜基因组v3.0版本。的表达式CsWRKY然后用MeV软件用热图显示基因。

“中国长”自交系9930幼苗来自中国农业科学院蔬菜花卉研究所顾晓明研究室，用于黄瓜基因组测序，在42°C下处理，并在处理后0、3和6 h取幼苗叶片，在Novogene(中国北京)进行转录组测序。进行3个生物重复。转录丰富CsWRKY基因以每千碱基外显子模型每百万映射reads (FPKM)的片段数计算。测序reads数据提交给国家生物技术信息中心(NCBI) GEO Sequence Read Archive，登录号为GSE151055。

用于转录组分析CsWRKYs对非生物和生物压力的反应，FDR(或P用绝对值log2 (fold-change)≥1来定义deg。

支持本文结论的数据集包含在文章及其附加文件中;本文中的黄瓜序列可以从CuGenDB (http://cucurbitgenomics.org/）;的拟南芥本文中的序列是从TAIR (https://www.arabidopsis.org/index.jsp)．公开转录组数据可在Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)．测序读取黄瓜对高温胁迫的响应数据，保存在GEO上，登录号为GSE151055 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE151055)．所有植物材料均选自山东农业大学任正仁实验室提供的黄瓜。

TFs:

转录因子

嗯:

隐马尔可夫模型

cd:

编码DNA序列

兆瓦:

分子量

pI:

等电点

aa:

氨基酸

NJ:

Neighbor-joining

R蛋白:

抗性蛋白

子:

开式阅读架

度:

差异表达基因

h:

小时

如果:

硅

糖尿病:

霜霉病

下午:

白粉病

我们衷心感谢尹帅博士对稿件的审核。

国家自然科学基金(31872950、31672170、31701923)、山东省“双顶尖”计划(SYL2017YSTD06)和山东省人民政府“泰山学者”基金(ts20130932)资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、数据解释或手稿写作中没有任何作用。

从属关系

1. 作物生物学国家重点实验室，山东省果蔬优质高效生产协同创新中心，泰安

   陈春华，陈学倩，韩晶，吕雯丽，任中海

2. 山东农业大学园艺科学与工程学院，农业部黄淮地区园艺作物生物学与遗传改良重点实验室，山东泰安271018

   陈春华，陈学倩，韩晶，吕雯丽，任中海

贡献

ZR和CC构想并设计了实验。XC和JH提供了转录组数据。CC分析了数据并撰写了手稿。所有作者均已阅读并批准最终稿。

相应的作者

对应到Chunhua陈或中海任．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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