一种重要海岸灌木的从头转录组组装和种群遗传分析apocynum venetum.L.

背景

apocynum venetum.L.是一家重要的药用植物，主要​​分布在中国沿海地区和中国西北部。除了其高医学和经济价值外，还对盐碱和沿海盐水土地的适应答:venetum用于植被恢复的理想候选者。迄今为止，研究答:venetum在中国西北地区受到限制，遗传多样性和人口结构的关注很少答:venetum沿海地区的人口。在这里，我们进行了总RNA的转录组测序答:venetum开发高效表达序列标记-简单序列重复(EST-SSR)标记，用于分析水稻的遗传多样性和群体结构答:venetum在沿海地区。

结果

经过从头组装，共得到86,890个unigenes，其中68,751个通过7个蛋白数据库的搜索成功注释。共检测到14072个EST-SSR位点，成功设计引物10243对。随机选择100对引物进行合成，鉴定出12对高多态性引物，用于群体遗传分析。群体遗传分析表明答:venetum表现出低水平的遗传多样性(每个位点的平均等位基因数，N_一种= 3.3;意思是预期的杂合性,H_E. = 0.342) and moderate level of genetic differentiation among the populations (genetic differentiation index,F_英石 = 0.032–0.220) in the coastal region. Although the contemporary (meanm_C = 0.056) and historical (meanm_H= 0.106)答:venetum种群数量适中，近几代呈下降趋势。贝叶斯结构分析将6个居群聚为2个主要居群，发现2个居群存在遗传瓶颈。

结论

利用新的EST-SSR标记，对该品种的遗传变异进行了评价答:venetum在沿海地区和基于这些调查结果的保守优先事项。我们研究中确定的unigenes和SSR的大型数据集，将样本与更广泛的范围相结合，将支持进一步研究这个重要的沿海植物及其相关物种的保护和演变。

沿海生境位于陆地生态系统与海洋生态系统之间的过渡地带，其生态系统独特而复杂，具有较高的生态价值[1]．它们独特的环境特征，包括土壤结构差、入渗和排水差、含盐量高、PH值高，导致了独特的植物多样性和许多特殊物种[2]．然而，由于快速的城市化进程，滨海生境受到土地改造和大众旅游的双重影响，导致自然生境受到严重干扰和丧失[3.]．许多沿海植​​物适应特定的肋骨环境条件，因此非常容易受到栖息地破坏的影响[4.那5.那6.]．因此，迫切需要评估和保护沿海地区不可替代的、脆弱的生物多样性，特别是在持续的人为压力下。

江苏省沿海地区占中国沿海地区总区的四分之一，主要落在盐城市[7.]．盐城市海岸线长582公里，海滩区占地683万小时²，年增长率10000 hm²[7.]．盐城沿海地区不仅提供珍贵的土地资源，而且还提供重要的湿地自然保护区。根据植物调查，有688种血管厂属于391属，114个家庭，在盐城潮湿地湿地[8.]．盐城市自1949年以来一直在盐城市进行多种大规模的海滩填海工程，该地区的自然栖息地已被显着修改[7.]．许多研究表明，人为的生境改变会影响全球生物多样性和遗传多样性，危及物种的长期生存，增加物种灭绝的风险[9.那10那11那12那13]．有许多有价值的植物资源，如Limonium sinense（Girard）Kuntze，apocynum venetum.那甘蒙柽柳对不悦之色。Tournefortia sibirica， 和Salicornia Europaea盐城滩涂中的L.等，不仅耐盐胁迫，而且具有较高的医学和经济价值[8.]．沿海植物种群的遗传多样性和遗传结构是否受到沿海生境变化的影响，目前尚无相关研究。

apocynum venetum.L.．是一支常年灌木，专门分布在江苏省沿海地区。它也被称为“洛博玛”，因为它于20世纪50年代在新疆罗国平原上发现了[14]．答:venetum提供宝贵的纤维和花蜜资源，是治疗高血压和高脂血症的重要药用植物。对高含盐量和瘠薄土壤的抗逆性也使其具有巨大的生态价值。到目前为止，关于答:venetum主要研究其药效和光合作用、吸水等生理特性[15那16那17]．然而，对天然植物的遗传多样性和遗传结构的研究很少答:venetum人群。为了更好地保护和利用盐城沿海地区的这一重要植物物种，迫切需要对其自然遗传多样性和种群结构进行评估答:venetum人群。

由于它们的高多态性，可重复性和Codominant遗传，简单的序列重复（SSR）标记已被广泛用于人群遗传分析和分子标记辅助育种[18那19]．已经进行了许多转录组分析答:venetum[20.那21那22]，而SSR标记尚未开发并用于评估自然的遗传多样性答:venetum人口。利用RAPD(随机扩增多态性DNA)和AFLP(扩增片段长度多态性)标记，研究人员检测到了中高水平的遗传多样性答:venetum来自新疆和内蒙古地区的人口[23那24]．除了在干旱地区，还没有评估遗传多样性的研究答:venetum沿海地区的人口。因此，在本研究中，我们进行了全面的转录组测序答:venetum利用Illumina测序平台对江苏省沿海地区进行测序。经过数据汇编和注释，我们开发了一套新的EST-SSR标记。利用这些信息标记，我们成功地评估了6个自然分布的居群的遗传多样性、居群结构和人口统计学变化答:venetum在盐城沿海地区我们期望这项研究中确定的遗传信息将有助于管理和保护自然答:venetum未来的人口。

组装的答:venetumIllumina测序的转录组数据

转录组测序产生46,408,308条reads，总计约6.96 Gb答:venetum在这个研究中。经过严格的质量滤波，获得45,760,331（98.6％）获得高质量读数，表现出98.31％的Q20碱基和GC值为46.93％（表1)．使用Trinity软件成功地组装了86,890个unigenes，平均长度为1767 bp和2580bp的N50。在所有组装的unigenes中，其中3119个（约3.58％）小于300 bp，14,657个unigenes（16.85％）长于3000 bp，而大多数unigenes（69,204）（79.56％）范围为300至3000 bp (Additional file1：图。S1A）。映射到每个Unigene分析的读数的数量揭示了13,065个unigenes（约47.90％）和5506个ungenes（约20.19％）分别组成，每分别包括少数unigenes（3.3％）较少超过10读（附加文件1:图印地)。

功能注释

使用NCBI Blast工具，搜索所有组装的Unigenes针对NR，NT，Swissprot，PFAM，Go，Ko和Kog数据库进行功能注释。在86,980个unigenes中，最多的比赛是在NR数据库中注释（63,975个未成年人，73.55％的所有ungenes），其次是瑞士科（53,436,61.43％），GO（51,733,59.47％）和PFAM（51,451,59.15％）数据库（表1)．总计68,751条(79.04%)unigenes在至少一个数据库中进行了同源匹配，13,207条(15.18%)unigenes在所有7个数据库中被注释(Table1)．

通过Go和Kog的功能分类

为了进一步评估这些unigenes的功能，我们使用了DES分配来注释和分析每个UNIGENE。共分配了51,733个unigenes至54个功能子组。在三个本体类别中，最大的是生物过程（47.6％），其次是细胞组分（29.5％）和分子功能（22.9％）（图。1)．在生物过程中，最常见的类别是细胞过程（22.04％），其次是代谢过程（20.99％）。细胞（19.40％）和细胞部分（19.40％）是细胞组分类别中最高度代表的基团。对于分子函数类别，结合（45.49％）和催化活性（38.16％）占最大的比例。然后，我们将所有组装的unigenes提交给Kog数据库以获取进一步的功能预测和分类。在25个Kog类别中，蛋白质周转和伴侣组成了最大的群体（13.36％），只有（12.71％）和翻译，核糖体结构和生物发生（10.60％）也显示出高百分比（附加档案2：图。S2）。

KEGG的功能分类

共28,505个unigenes被分配到130个KEGG通路中，分为5类，分别是代谢通路(44.08%)、遗传信息加工(22.55%)、细胞过程(4.5%)、环境信息加工(3.25%)和生物系统(2.89%)(图1)。2)．大多数unigene途径与翻译(2847个unigene)、碳水化合物代谢(2553个unigene)、折叠、分类和降解(1941个unigene)有关。

SSR标记的开发和特征

本研究从86,980个unigenes中共鉴定出14,072个双核苷酸到六核苷酸的ssr。在所有SSR类型中，二核苷酸重复序列占主要比例(9399,66.8%)，其次是三核苷酸重复序列(4328,30.76%)。四核苷酸重复序列(210,1.49%)、六核苷酸重复序列(93,0.66%)和五核苷酸重复序列(42,0.30%)是非常低频率的类型。这些ssr的串联重复序列数量为5 ~ 36个，最多的重复单元为6个(3571个，25.38%)，其次是5个串联重复序列(2670个，18.97%)和7个串联重复序列(1950个，13.86%)(见表1)2)．在二核苷酸重复中，最丰富的基序类型是Ag / Ct（34.50％），然后在（23.39％）和Ac / gt（8.66％）中。在雷核苷酸重复中，AAG / CTT（8.99％）是最常见的基序类型，其次是AAT / ATT（6.07％）。剩余的图案类型占这些重复的18.4％（表2)．

在14,072个SSR中，成功设计了10,243个底漆对。我们从这些引物对中随机选择了100对进行扩增，并且35在预期的尺寸下成功扩增。使用来自四个的十二个答:venetum应用这35对引物进行多态性筛选，其中12对显示等位基因多态性(表1)3.)．使用这12种多晶型EST-SSR标记，在六个沿海的103个样本中检测到总共有39个等位基因答:venetum人群，每个基因座2到5个等位基因。使用Micro-Checker程序，我们发现没有证据表明数据集中的缺点和评分错误。在每种群体中的每对基因座之间进行连接不平衡分析。结果表明，396个比较中的6个（AV39.和Av88在人口ld;Av02和Av88在人口xy;Av08和AV39.那Av08和Av63那AV39.和Av63那AV39.和Av75)在Bonferroni校正(P. = 0.00013). Given that there is no overlap between these six pairs of loci, we treated these 12 EST-SSR markers as independent loci in the following analyses. For all loci, the expected (H_E.）和观察到的杂合子（H_O.)的变化范围分别为0.030 ~ 0.651和0.030 ~ 0.653。多态信息含量(PIC)在0.029 (AV55.）和0.575（AV39.)，平均为0.297(表3.)．在72例按基因座进行的人群检测中，在基因座观察到偏离HWEAv02在LD人口，基因座Av08和AV39.经连续Bonferroni校正(P.< 0.004)。由于重要的P.这3个位点只存在于单个种群中，它们与HWE的偏离很可能反映了种群特异性问题，而不是位点特异性问题。

分析人口遗传多样性与结构

为答:venetum，遗传多样性的平均估计通常在人口水平下较低（AR = 2.34，H_E. = 0.314,H_O. = 0.350). Population SY showed the lowest level of genetic diversity (AR = 1.96,H_E. = 0.244, andH_O.= 0.264)， XY群体最高(AR = 2.52，H_E.= 0.363,H_O. = 0.410). The values of inbreeding (F_是)的变化范围为−0.012 ~−0.138，平均为−0.08(见表4.)．的F_英石人口对的值范围为0.032至0.220（表5.)，总体值为0.101，表明所有居群的遗传分化水平为低至中等水平。在连续Bonferroni校正后，15个两两比较中的13个有显著性(见表15.)．

在结构分析中，我们使用LnP(D.)和ΔK.统计以确定群体遗传群集的最可能值K.．因为lnp（D.）逐步增加K.= 1至6时，很难确定基因群的真实数目(K.)．然而,ΔK.Evanno et al.(2005)的统计检测到峰值在K.= 2(图。3 a, b)．数字3C显示个体分配到每个簇(“红色”和“蓝色”分别代表簇I和簇II)时K. = 2. The individuals that contain both colors represent the mixed origin of two gene pools. Cluster I and II were present at a high frequency (78 and 88%) (Q > 0.80) in the DF and SY populations. For the QG and XY populations, nearly half of the individuals were assigned to each cluster respectively. For the LD and BH populations, 10 to 50% of all local samples were assigned to each cluster, and the remaining 30% consisted of mixed individuals. With increased values ofK.（K.= 3)，我们观察到SY群体被分配到一个独立的群III(“黄色”)(图。3C），暗示来自盐城地区其他人口的潜在遗传分化。

历史和当代的基因流动

他们igrate-N结果表明，六个突变缩放的有效种群大小（θ）答:venetum种群分布范围为0.0342 ~ 0.0438。历史基因流动(m_H)，从突变规模迁移率(M)推断，从种群LD到QG (m_H = 0.169), and lowest from population LD to DF (m_H = 0.041), with an average value of 0.106 across all the populations (Additional file3.：表S1）。在两对群体中观察到不对称基因流，从群体DF到LD和XY发生的基因流动的主要方向。使用B.是的一种SS.在软件中，我们发现这6个群体很大程度上由来自同一个网站的个体组成(平均72%)，而大约6%的个体与其他网站交换(附加文件3.：表S1）。虽然六个中检测到中等程度的基因流动答:venetumWilcoxon符号秩检验表明，当代估计(均值m_C = 0.056) were significantly lower than the historical estimates of migration rates (meanm_H= 0.106,P. < 0.001), suggesting a decrease in gene flow over the last few generations. The Mantel test for isolation by distance did not detect a significant correlation between genetic and geographical distance (r = 0.164,P. = 0.251) (Additional file4.:图S3)。

有效种群规模的变化

在逐步突变模型(SMM)和两阶段突变模型(TPM)下，我们的Wilcoxon检验均未检测到大多数种群存在显著的杂合子过剩(表1)6.)．对于BH人口，我们检测到历史瓶颈的证据（P.< 0.05;表格6.)．同样，模式转换测试显示，大多数种群的等位基因呈l型分布，这表明没有最近的瓶颈。在两个种群(QG, BH)中观察到的一个移动模式表明在过去几代中发生了瓶颈事件(表6.)．

表征答:venetum转录组及其在种质资源评价中的应用潜力

随着测序成本的降低，基于下一代测序技术的分子标记的开发已成为非模式植物分子研究最有效的方法[25那26]．利用Illumina测序平台，获得了完整的转录组测序数据，并开发了一套新的EST-SSR标记答:venetum．作为一种重要的药用植物和纤维来源，答:venetum一直是广泛的遗传学和药理学研究的主题。到目前为止，已经开发了ISSR（简单序列重复），AFLP和RAPD分子标记答:venetum[23那24那27]．近年来，许多转录组分析已经进行答:venetum[20.那21那22]．使用叶片材料，我们获得了由Chen等人获得的类似转录组数据（6.96 GB）。[20.] (6.57 Gb)，但unigenes(86,890比52,983)和SSRs(14,072比7579)的数量更多。李等人[22]在整个基因组中确定了101,918个SSRA. venetum。他们的研究表明，AT / TA和AAT / TTA分别占最高比例的二核苷酸和三核苷酸重复。在我们的研究中，我们发现AG / CT（34.50％）是二核苷酸重复中最常见的基序，并且AAG / CTT（8.99％）是最常见的三核苷酸重复。在55个双子象状物种中的EST-SSR研究中，Kumpatla和Mukhopadhyay [28)和AAG/AGA/GAA/CTT/TTC/TCT(2.7 ~ 15.5%)为主要的二核苷酸和三核苷酸ssr。EST-SSR重复序列的组成与大多数其他植物相同，核ssr序列存在差异答:venetum可能提示这些SSR主题在植物基因组中的转录偏好和保守功能。例如，研究表明，5'UTR中的CT微卫星在基因调节中发挥作用，并且参与反义转录，并且CTT重复在5'UTR中发生并在高频上转录的区域[29那30.]．答:venetum广泛分布于西北地区到中国黄海的海岸;但是，遗传学研究答:venetum发布到目前为止仅关注中国的干旱地区。我们的转录组数据丰富了可用的遗传信息答:venetum来自郊区水域，将促进种质资源的筛查，特别是在沿海地区。

答:venetum在中国长期被用作降血压、降血脂的传统药物答:venetum已作为镇静和抗衰老的补充产品被商业化。答:venetum富含类黄酮化合物，具有广泛的药理活性[31那32]．黄酮类化合物通过长期复杂的途径合成[33.]．鉴定类黄酮生物合成的调节机制对于了解Apocynum的化学成分或药理学活性至关重要。以前的研究表明答:venetum具有比其相关物种更高的黄酮含量罗布麻属。hendersonii，一些类黄酮成分，如金丝桃苷，已被鉴定为合适的化学标记，以区分这两个物种[34.]．Gao等人最近对Apocynum的代谢组和转录组进行了分析[21]发现类黄酮生物合成途径是造成两者多样性相当大比例的原因答:venetum和答:hendersonii，并将花青素确定为决定水稻茎叶颜色表型多样性的关键成分答:venetum和答:hendersonii．在我们的Kegg分析中，将28,505个unigenes聚集到130条途径中，包括黄酮和黄酮生物合成（KO00944），类黄酮生物合成（KO00941），异黄酮生物合成（KO00943）和花青素生物合成（KO00942）途径。在与这些途径有关的88个unigenes中，84个unigenes的平均FPKM（每百万片段的外显子片段的碎片映射）大于50的价值。此外，这88个unigenes中的23个含有SSR基因座（附加文件5.：表S2）。例如，作为黄酮合成酶（NR ID：BAD34463.1）和黄酮类3-O-半乳糖基转移酶（NR ID：BAF49284.1）的unigenes，包括SSR的平均FPKM值分别为50.38和22.16。虽然它和CpDNA序列已被用于识别答:venetum这些序列在属内是保守的，只能提供有限的遗传信息[35.]．本研究发现的含有SSRs的类黄酮生物合成相关转录本将为开发新的分子标记提供参考，为罗经属植物的物种鉴定和选择提供参考答:venetum韧皮纤维和类黄酮含量高的种质资源。

低水平的遗传多样性答:venetum沿海人口

自然栖息地的干扰对全球生物多样性构成了重大威胁[36.]．持续的生境变化过程一般会对物种组成和遗传多样性产生强烈的负面影响[37.那38.那39.]．自然种群的遗传评价是保护和利用植物资源，特别是脆弱和受威胁物种的重要步骤。利用RAPD和AFLP标记，研究人员在自然中检测到中度到高水平的遗传多样性答:venetum新疆和内蒙古地区的种群[23那24]．他们也发现遗传多样性答:venetum与降水、海拔、纬度等环境因子显著相关。利用EST-SSR标记，发现该植物的遗传多样性水平较低答:venetum来自沿海栖息地的人群（H_E.= 0.342)(表4.)．虽然预计EST-SSRS将更加保守并表现出比基因组SSR的多态性较低速度[40那41.那42.那43.[还有研究表明，这两种类型的标记之间没有显着差异[44.那45.那46.]．考虑到人口大小答:venetum沿海地区的人口，结合基因组SSR标记或基因组SNP的分析的未来研究可以更好地代表遗传多样性的实际水平答:venetum从这个地区。

由于沿海植物对沿海环境的高度专门化，它们很容易受到生境改变的影响[6.]．通过核SSR分析，在沿海草本植物，灌木和树种物种中观察到低水平的遗传多样性[47.那48.那49.]．彭等人。[50.]调查了9种野生动物的遗传多样性答:venetum来自中国八个省利用RAPD标记的人口，他们的研究表明，江苏和吉林等沿海地区的人口表现出较低的遗传多样性，比来自新疆，内蒙古和宁夏等干旱的西北地区的遗传多样性。在一个比较研究中Fraxinus angustifolia大陆地区和地中海地区的瓦哈尔人，Temunović等[51.[后者]检测到显着降低的遗传多样性和较高的人口分歧，揭示了环境异质性在塑造了发散栖息地之间的遗传变异方面的影响。因此，沿海答:venetum群体可能代表不同的生态型，环境因素可能导致干旱和半湿润地区遗传多样性的差异。通过在未来的分析中纳入环境数据，我们可以进一步检验这些差异是否与不同的自然条件(半湿润地区和干旱地区)有关。对这种低水平的基因多样性的另一个合理解释是答:venetum沿海地区的种群数量严重减少，导致了遗传多样性的丧失和易感性的增加。使用瓶颈软件，我们发现两个种群(QG和BH)的等位基因频率分布出现了畸变(模态转移)，表明了最近的瓶颈事件，Wilcoxon的测试也显示了BH种群中显著的杂合子过剩(P.< 0.05;表格6.)．根据我们的实地观察，像BH和SY这样的种群，位于公路沿线，其自然栖息地受到了严重的干扰。此外，大多数人口的人口规模相当小(N < 30). Based on scaled effective population sizes Θ (4N_E.μ),估计N_E.的答:venetum在盐城地区约有10-11个个体。根据预测每一代初始杂合度保留比例的遗传模型[1-(1/2N_E.)] [52.]，答:venetum预计种群每一代将失去4.5%的杂合度。因此，随着遗传多样性的减少和人口结构的持续变化，答:venetum盐城沿海地区的群体对个体健康和人口的可行性降低以及未来灭绝的风险增加。

中等水平的基因关联呈下降趋势答:venetum沿海人口

基因流动对于栖息地干扰和环境变化后种群的恢复力和持久性至关重要。这一过程可能提供一个补充的来源，并通过引入其他种群的适应性等位基因来维持遗传多样性[53.那54.那55.]．在这项研究中，我们发现了很少的证据表明在强的基因结构答:venetum盐城沿海地区的人口遗传结构分析将所有的样本居群分为两类，在大多数居群中存在一些混合植物(图1)。3C)．负多点F_是找到值（平均值 - 0.08）答:venetum，表明该物种沿海种群没有近交繁殖(表4.)．据此，当代的移民率在答:venetum沿海地区的人口是中等(平均)m_C = 0.056) (Additional file3.：表S1）。这些结果在一起表明人口连接答:venetum沿海人口尚未受到极大的干扰。一般来说，植物物种如花粉和种子分散模式的生命历史特征，通常影响人口之间的遗传联系[55.那56.]．传粉生物学的研究表明的蜜蜂和ichneumon sp。是主要的粉刷者答:venetum[57.]．由于这些传粉者的觅食距离有限，仅通过花粉进行基因传播似乎不足以维持物种在沿海地区的种群连通性。的种子答:venetum小于1毫米的大小，覆盖着papuppas样的毛发，使之能像风一样分散[58.那59.]．种子传播能力强答:venetum可能在维持沿海地区适度水平的持续基因流动和种群连通性方面发挥了关键作用。虽然有研究表明，依靠风传粉或散播种子的植物，可能受到生境改变对其遗传多样性或种群联系的负面影响较小[55.那56.[与迁移率的历史水平相比，我们仍然检测到过去几代基因流量的减少（平均值m_H= 0.106)。在持续的人为压力和气候干扰下，无论是自然的答:venetum群体，特别是那些具有低遗传多样性和小人口大小的人，在干扰或适应未来的环境变革之后具有足够的能力，仍需要长期监测。

在这项研究中，我们获得了一种高质量的转录组答:venetum利用Illumina测序平台成功开发了12个多态EST-SSR标记答:venetum．利用这些信息制造者，我们检测到低水平的遗传多样性和瓶颈事件答:venetum江苏盐城沿海地区的跨州沿海地区的种群。虽然人口之间的连接答:venetum由于其较高的种子传播能力，应采取长期监测和保护策略，以更好地保护这些小种群。为了使这种具有重要经济价值的植物继续得到利用，现有遗传多样性的保护是至关重要的。基于本研究结果，我们建议优先保护那些经历瓶颈的群体(如BH和QG群体)和具有较高遗传多样性的群体(如XY群体)。此外，目前还没有足够的比较数据来说明黄花的遗传多样性程度答:venetum在其全球生物地理范围内，结合干旱地区的样本和更多的标记进行进一步的研究，以更准确地了解该重要植物的遗传多样性、种群结构和进化历史。

样品收集和DNA和RNA提取

共有103个叶样品答:venetum共采集了6个野生种群的10 ~ 24个个体，代表了该种在江苏省的大部分分布区域(图1)。4.)．所有人口的详细信息列于表中4.．答:venetum主要分布在河边或路边，采集这些样本不需要经过许可。植物材料的收集符合国家规定。所有取样的叶子立即用硅胶干燥。材料经江苏省和中国科学院鉴定。我们使用QIAGEN植物DNA试剂盒(Gaithersburg, MD)根据制造商的协议提取总基因组DNA。此外，将LD群体中的3个个体的新鲜叶片立即冷冻于液氮中，保存在−70°C中提取总RNA。使用QIAGEN RNeasy植物迷你试剂盒按照制造商的程序(查茨沃斯，CA)从这些个体中提取总RNA。然后将定量的总rna送至Novogene生物信息学研究所(中国北京)进行进一步处理。

cDNA文库构建和转录组测序

首先，使用Qubit 2.0荧光计中的Qubit RNA分析试剂盒(Life Technologies, carl lsbad, CA, USA)和RNA Nano 6000分析试剂盒与安捷伦生物分析仪2100系统(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)测量样本的RNA浓度和完整性。然后，根据Novogene Bioinformatics Institute(北京，中国)的标准程序，使用等量合格的RNA构建每个样本的cDNA文库并测序。使用NEBNext®Ultra™RNA文库制备试剂盒用于Illumina®(NEB, USA)生成测序文库。经纯化和质量评价后，在Illumina HiSeq平台(Illumina, USA)上对三种文库制剂进行测序。

转录组合组件和功能注释

使用内部Perl脚本处理原始的RNA-SEQ读取，以删除包含适配器和PLOY-N序列（大于5％）的读数，并且具有超过20％的低质量基础（质量评分<10）。然后，我们使用Trinity软件[60.[默认参数是否要组装高质量的清洁数据。针对NCBI NR（非冗余蛋白）和NT（非冗余核苷酸）数据库询问所有unigenes;Swissprot蛋白质数据库（http://www.expasy.ch/sprot）;PFAM（蛋白质数据库）;Kog（蛋白质群组簇）数据库和KO（Kegg orthology）数据库。基因本体（GO）注释[61.]使用BLAST2GO进行unigenes [62.]．基因和基因组（Kegg）途径的京都百科全书（https://www.genome.jp/kegg/用1E-5的E值截止测定）测定。Wego [63.]来绘制具有功能分类的二级氧化石墨烯术语的分布。

识别EST-SSRs

微型卫星(MISA)计划[64.]用于检测含有est - ssr的转录本。二核苷酸基序的最小重复数为6，三、四、五、六核苷酸基序的最小重复数为5。含有ssr的序列提交给Primer premier 5.0软件(premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA)设计引物。参数设置如下:产品尺寸范围为100 ~ 300bp;引物长度18 ~ 25 bp;GC含量在40 ~ 60%之间，退火温度在55 ~ 65℃之间[65.]．

PCR扩增在含有20-40ng基因组DNA的15μl总反应体积中进行，7.5μl2×Taq PCR Mastermix（天根，北京，中国）和0.3μm的每个引物。PCR程序包括在94℃下3分钟的初始变性，然后在94℃下为35个循环，在94℃，30秒，每个基因座的最佳退火温度，并且在72℃下为15 s，然后是最终延伸72°C的5分钟。使用银染色的Nondenaturing聚丙烯酰胺凝胶检查PCR产物。然后用6-FAM或六角麦芽糖素染料（Sangon Biotech，中国）进一步标记优化的SSR引物。在PCR扩增后，使用Genemarker版本2.2.0（软版，州立学院，宾夕法尼亚州，美国）进行等位基因鉴定和基因分型。

遗传多样性分析

等位基因的数目(N_一种），多态性信息内容（PIC），预期的杂合性（H_E.）观察到杂合子（H_O.）每个EST-SSR基因座估计ervus2.0 [66.]．用Genepop版本4.2具有Bonferroni校正[67.]．使用M检测NULL等位基因频率，口吃和大等位基因丢失icro-C赫克佩2.2.3版本(68.)程序。每一人口一种．venetum，等位基因数量（N_一种)、等位基因丰富度(AR)、期望杂合度(H_E.)，观察杂合度(H_O.)、近交系数(F_是）种群的差异化（F_英石)用F统计2.9.3.2版[69.]．

人口遗传结构，基因流量和人口分析

采用S生成2.3.4程序(70]实现基于模型的贝叶斯方法。遗传簇的价值（K.)设为1 ~ 6，假设为混合模型，等位基因频率独立。每组分别进行了10次独立试验K.用10,000个和100,000个马尔科夫链蒙特卡罗重复。最可能的K.通过计算δ选择值K.[71.]在S.tructureHarvester[72.]．

当代人口之间的迁移答:venetum使用B是的一种SS.版本1.3 [73.]．相应地调整等位基因频率，迁移率和近距离繁殖系数的三角形值，以确保接受率下降40％至60％[73.]．我们执行了10个软件^7.老化为10的迭代^6.几代人。用不同的初始种子进行十个复制运行。我们通过比较这十个运行的参数估计的后验概率密度来评估模型融合。提出的结果来自最佳运行。我们还使用在程序中实施的基于聚合的贝叶斯方法估计历史基因流程igrate-N3.6版(74.]．该过程使用褐色运动近似作为10以下的突变模型^7.老化为10的迭代^5.．静态加热方案采用不同温度下(1.0,1.5,3.0,100,000.0)的四个链[75.]．两个参数，规模有效种群规模Θ (4N_E.μ,N_E.有效种群大小，μ是微卫星的平均突变率为10吗⁻³每代）和缩放的移民率M（m_H/μ,m_H两对人口之间的历史迁移率是否超过4N_E.几代人同时被估计。每一代Nm的移民数量由公式Nm = ΘM/4估计。采用Wilcoxon符号秩检验比较历史和当代基因流估计答:venetum人群。

要测试逐距离（IBD），对成对地理距离的相关性（LOG地理距离为KM）和遗传距离（F_英石/ 1-F_英石)值进行评估。Mantel检验的1000种排列通过R包Vegan进行统计学显著性检验[76.]．Wilcoxon的签名等级测试和B中的模式换档测试ottleneck版本1.2.02 [77.用来确定是否答:venetum盐城沿海地区的人口经历了有效的人口大小的重大减少（N_E.)．第一方法比较预期的杂合子（H_E.）在Hardy-Weinberg平衡与突变漂移平衡预期的杂合子（H_情商)[78.]，适用于检测最近2-4次出现的瓶颈N_E.几代人。第二种方法基于等位基因频率分布，这更适合于最近发生的人口下降（大约几十几代）[79.那80]．在未经历瓶颈事件的群体中，等位基因的低频率分布比例较大，而中频率分布比例较小(l型分布)。而在瓶颈种群中，等位基因频率分布模式会发生变化。我们在逐步突变模型(SMM)和两阶段模型(TPM)下进行了10,000次模拟，每种模型有95%的单步突变和5%的多步突变答:venetum人口。P.- 评估值为0.05级的统计显着性。

用于EST-SSR标记开发的原始测序数据可在NCBI SRA: PRJNA614557 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA614557)．支持本文结论的其他数据集包含在本文及其附加文件中。

基于“增大化现实”技术:

等位基因丰富

EST-SSR：

表达序列标记衍生的简单序列重复标记

F_是：

近交系数

F_英石：

群体之间的分化

走:

基因本体论

H_E.：

预期的杂合性

H_O.：

观察到的杂合性

HWE:

哈迪温伯格平衡

柯:

kegg ortholog数据库

KOG:

蛋白质的同源基团簇

N_E.：

有效的人口规模

Nr:

NCBI非冗余蛋白质数据库

Nt:

NCBI非冗余核苷酸数据库

包含了:

蛋白质家族数据库

我们非常感谢三个匿名评论员在本文的先前版本上的有用评论。

国家自然科学基金资助项目(No. 31800312)。资助机构没有参与研究的设计、数据的收集、分析和解释，也没有参与手稿的撰写。

从属关系

1. 江苏农业科学院农业学省会作物种质与生物技术研究所，江苏农业科学院，南京南京

   Na元

2. 江苏省中国科学院植物研究所，江苏南京

   咪咪李

3. 山东省农业科学院农业与可持续发展研究所，山东济南

   聚会贾

贡献

NY, ML, CJ构思和设计了研究，NY进行了研究，分析了数据并撰写了论文。所有作者都阅读并批准了原稿。

通讯作者

对应到Na元．

伦理批准并同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

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提交人声明他们没有竞争利益。

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