整合转录组学和代谢组学分析激素通路宏碁石在发育的叶片衰老期间

背景

为了充分阐明植物激素在叶片衰老中的作用和机制，我们利用转录组和代谢组数据对红枫非衰老和衰老叶片进行了综合分析。

结果

转录谱和代谢物谱分别通过深度测序、第三代测序数据分析和超高效液相色谱Q萃取质谱(UHPLC-QE-MS)合成。我们研究了八种激素的化合物积累以及生物合成和信号基因的表达。结果表明，乙烯和脱落酸浓度在叶片衰老过程中呈上升趋势，细胞分裂素、生长素、茉莉酸和水杨酸含量持续下降。分析了激素含量与转录变化的相关性，在6条通路中鉴定出与叶片衰老密切相关的基因。

结论

这些结果将丰富我们对红枫叶片衰老的调控机制的认识，同时为红枫的基因改造奠定基础宏碁在未来。

植物叶片的衰老是一个主动的、基因上精确的过程，受一系列内外因素的调控[1]。许多环境压力，如极端温度、干旱、营养缺乏、光照/阴影不足或完全黑暗，以及生物压力(如细菌感染)都可诱发衰老[2，3.]。在叶片衰老的诱导和繁殖过程中，植物激素水平是由植物年龄和胁迫决定的[4]。这些内部和外部因素可能单独或共同起作用。其中，植物激素是一类在植物某些部位产生的有机物，可以调节植物生长发育的几乎所有方面，在低浓度下可诱导生理反应[5]。目前，植物激素在植物衰老中的调控作用及其机制的研究已取得明显进展[6]。

根据植物衰老的作用，以往的研究表明，一般来说，植物激素可分为两类:衰老促进剂和衰老延缓剂[7]。前者包括乙烯(ET)、脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)和油菜素内酯(BR)，后者包括细胞分裂素(CK)、生长素(IAA)和赤霉素(GA)。一系列研究证实，当树叶达到一定年龄或足够成熟时，乙烯会促进衰老[8]。研究还表明，脱落酸抑制叶片衰老过程中的气孔关闭，导致叶片大量水分流失和随后的死亡。同时，它确保叶片中有足够的氧气，以增加老化过程中的呼吸[9]。关于茉莉酸和水杨酸在叶片衰老中的作用的研究已经取得了相当大的进展[10，11]。油菜素内酯在叶片衰老中的作用主要在生理学和遗传学研究中得到解决。用油菜素内酯(24-表油菜素内酯;EBR)，植物丙二醛含量增加，活性氧被抑制，导致叶片衰老[12]。然而，其在衰老中的独特作用有待深入研究。相反，细胞分裂素已被证实对叶片衰老有抑制作用[13]。赤霉素对叶片衰老的抑制作用不如细胞分裂素那么明显[14]。传统上，生长素被认为能抑制植物衰老[15]。值得一提的是，这些植物激素不是单独起作用的，它们经常以可变组合的方式使用，以实现对衰老的调节[16，17]。

叶片衰老是叶片从成熟到死亡的最后阶段，因为它们逐渐变黄。这伴随着养分从老叶向新叶和种子的转移[18]。叶片衰老是植物长期进化的结果，有助于植物适应环境变化和保持有效的能量利用[19]。然而，叶片过早衰老严重影响了植物的光合作用时间和养分运输，从而降低了作物的产量和品质[20.]。属宏碁L红枫，也被称为红枫，是北半球最重要的乔灌木属之一[21，22，23，24，25]。枫树具有很高的观赏价值，是园林绿化中极具吸引力的树种。除了它们杰出的景观应用外，许多物种宏碁也作为枫糖、枫糖浆、家具和木材的主要原料[26]。此外，大量的枫树植物化学物质被发现具有潜在的抗氧化、抗肿瘤和抗炎活性[27，28，29，30.，31]。因此，研究红枫叶片衰老不仅对探索红枫的生命周期和功能现象具有重要的科学意义，而且对红枫的生产也具有重要的指导意义。

植物的新陈代谢是一个网络关系。植物对环境因子响应的调控不仅影响个体代谢途径，也影响整个代谢网络的平衡[32]。与传统的生理研究和遗传表型分析相比，高通量组学研究技术可以更系统地观察植物的生理变化，并且可能具有更大的发现新基因的潜力[33，34]。近年来，不同组学平台(转录组学和代谢组学)的关联分析逐渐成为植物代谢研究领域的新趋势[35，36，37，38，39，40，41]。在这项研究中，我们将转录组学和代谢组学结合起来，研究了八种常见的激素宏碁石(乙烯、脱落酸、细胞分裂素、生长素、茉莉酸、水杨酸、油菜素类固醇和赤霉素)。叶片衰老过程中代谢物水平和通路基因表达水平的变化，揭示了不同激素调控植物叶片衰老过程的机制。这包括有史以来第一次完整的转录组学和代谢组学分析的植物激素参与叶片衰老的调节宏碁石．本研究结果可以丰富我们对植物激素在植物体内的作用机制的认识宏碁。

植物材料和样品制备

我们在中国合肥安徽省农业科学院的试验田种植植物(图2)。1a)(北纬31.86，东经117.27)。加拿大林业局的植物种子，李世友博士赠送。11月中下旬采集非衰老叶片(完全展开的绿叶)和衰老叶片(叶片表面100%泛黄，叶绿素损失~ 95%)。样品(20片)宏碁石将非衰老叶片和衰老叶片进行冷冻干燥，然后在- 80°C的深度冷冻室中保存。代金券标本存放于安徽省农业科学院农业工程研究所。朱谦博士对样品进行了正式鉴定。这项研究考察了一种不需要任何特别许可的本地植物物种。

代谢分析

代谢物提取

我们使用了40%甲醇(LC-MS级，CNW Technologies): 40%乙腈(LC-MS级，CNW Technologies): 20%水(v: v: v)作为提取溶剂的混合物。取0.05 g叶片(每组样品由6个生物重复组成)与1 mL溶剂，溶液涡流30 s。样品均质(45 Hz, 4 min, JXFSTPRP-24;静心科技)，并在冰水浴中超声(5分钟)。此步骤重复三次，之后将样品置于- 20°C静置1小时，离心(Heraeus Fresco17;Thermo Fisher Scientific)在4°C下12000转15分钟。将上清液引入LC-MS小瓶中进行UHPLC-QE Orbitrap/MS检测。将所有样品中等量的上清液混合作为质量控制(QC)样品进行检测。

质/ MS分析

LC-MS/MS分析采用UHPLC系统(1290;安捷伦科技公司)和Q Exactive Orbitrap(赛默飞世尔科技公司)。采用UPLC HSS T3柱(2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm)进行色谱分离[42]。

流动阶段由以下部分组成:

• 正模式:流动相A:甲酸(0.1%)水溶液;流动相B:乙腈。

• 负模式:流动相A:醋酸铵(5 mmol/L)水溶液;流动相B:乙腈。

流速维持在500 μL/min。t洗脱梯度参数设置为:0 min, 99% A, 1% B;1分钟，99% A, 1% B;8分钟，1% A, 99% B;10分钟，1% A, 99% B;10.1 min, 99% A, 1% B;12 min, 99% A, 1% b。对于LC/MS实验，QE质谱仪能够使用信息依赖采集(information-dependent acquisition, IDA)进行MS/MS采集。在这种模式下，采集软件(Xcalibur 4.0.27, Thermo)在获取全扫描测量MS数据时，根据预先选择的标准连续评估并触发MS/MS光谱的采集。通过两种方式实现了大量的数据采集:使用ESI⁺(电喷雾电离-正离子模式)和ESI⁻(电喷雾电离-负离子模式)。使用以下设置(护套气流量:45 Arb，辅助气流量:15 Arb，毛细管温度:320℃，全ms分辨率:70,000,ms / ms分辨率:17500，碰撞能量:20/40/60 eV，喷雾电压:3.8kv(正)或- 3.1kv(负)。

数据预处理与标注

使用ProteoWizard软件将MS原始数据(.raw)转换为mzML格式，然后使用R包XCMS(版本3.2)进行保留时间校正、峰识别、峰提取、峰整合和峰对准[43]。采用OSI-SMMS(1.0版，大连大硕信息技术有限公司)软件，结合内部MS/MS数据库进行物质鉴定。采用归一化数据矩阵进行多元统计分析(PCA分析、PLS-DA分析、opls-da分析)。通过多元统计分析opls-da和单变量统计分析(学生t检验)相结合筛选差异代谢物，代谢途径KEGG富集分析使用非商业数据库(补充表)S1）.

组合测序分析

RNA测序实验

转录组测序分析的评估方法如前所述[44]。本研究采用新一代测序(NGS)和单分子实时测序(SMRT)相结合的方法。实验包括总RNA的分离(使用RNAprep试剂盒DP441;Tiangen，)，然后根据Isoform Sequencing protocol (Iso-Seq)使用Clontech SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit将短cDNA片段转换为Iso-Seq文库。测序使用Pacific Biosciences (PN 100-092-800-03)描述的BluePippin大小选择系统协议。

KEGG富集及差异表达分析

为了捕获植物激素相关基因，我们利用KEGG (http://www.genome.jp/kegg/)在线数据库，用于定位目标基因的通路。其中包括色氨酸代谢(生长素合成途径;途径ID 00380)，玉米素生物合成(细胞分裂素合成途径;途径ID 00908)，二萜类生物合成(赤霉素合成途径;途径ID 00904)，类胡萝卜素生物合成(脱落酸合成途径;途径ID 00906)，半胱氨酸和蛋氨酸代谢(乙烯合成途径;途径ID 00270)，油菜素内酯生物合成(油菜素内酯合成途径;途径ID 00905)， α -亚麻酸代谢(茉莉酸合成途径;途径ID 00592)，苯丙氨酸代谢(水杨酸合成途径;途径ID 00360)，植物激素信号转导(植物激素信号转导; pathway ID 04075). By comparing the values (|log2(FoldChange)| > 1 &P值< 0.01)，则选择差异表达基因(deg)。使用Rpackage (Supplementary Table)生成这些deg的热图S2）.

相关分析

利用GraphPad Prism(8.0)软件计算代谢组和转录组数据的相关系数(Spearman’s rank correlation test， |R| > 0.8)。使用Cytoscape(版本3.6.1)可视化了红枫的代谢组和转录组关系(补充表)S3）.

叶片衰老

叶片衰老是红枫叶片生命历程中从成熟到衰老的最后阶段，最明显的外部变化是变黄。我们之前的研究表明，红枫衰老叶片的变黄主要归因于叶绿素的降解，而不是类胡萝卜素等黄色植物色素的出现[44]。采用超高效液相色谱Q萃取质谱法(UHPLC-QE-MS)对未衰老叶片(完全展开的未衰老叶片)和衰老叶片(叶片表面100%泛黄;~ 95%叶绿素损失)(图2)1b).测试结果表明，与衰老叶片相比，非衰老叶片的氨基酸、脂质等生物大分子代谢途径中存在许多不同的代谢物(图2)。1c、补充表S4）.

叶片衰老是植物生命周期中功能器官从光合作用到降解阶段的遗传调控循环过程。目的:评价紫花苜蓿叶片的衰老过程宏碁石进行了非衰老叶片和衰老叶片的组合测序。基于测序结果，我们比较了非衰老和衰老叶片中氨基酸代谢、脂质代谢、碳水化合物代谢、能量代谢、辅助因子和维生素代谢、核苷酸代谢等相关通路中差异表达基因的数量。在未衰老与衰老叶片的比较中，碳水化合物代谢中的deg数量最多(上调1623个，下调1530个)。相反，辅助因子和维生素的代谢代表了最小的组，有269个上调和163个下调的unigenes(图2)。1d、补充表S5）.

乙烯

植物激素乙烯广泛参与许多植物过程，先前的研究发现乙烯水平与叶片衰老有关。在许多物种中，乙烯处理可以引发衰老特征的改变，包括促进叶绿素、叶绿素-蛋白质复合物和其他大分子物质的减少，同时增加蛋白酶和其他代谢酶的活性[45，46]。大量研究将乙烯的合成途径概括为蛋氨酸转化为s -腺苷甲硫氨酸(SAM)、SAM转化为1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)和ACC转化为乙烯[47]。由于植物体内的蛋氨酸数量有限，甲基硫基被循环利用以补充蛋氨酸水平并维持乙烯的生物合成。在代谢途径中检测到的乙烯及相关化合物排列在相应的位置(图2)。2）.结果表明，s -腺苷- l-蛋氨酸、s -甲基-5-硫- d -核糖1-磷酸、2,3-二酮-5-甲基硫- d -磷酸和乙烯在衰老叶片中含量最多，而s -腺苷-蛋氨酸胺、5 ' -甲基硫-腺苷、5-甲基硫- d -核糖、1,2-二羟基-5-(甲基硫)戊-1-烯-3-酮、4-甲基硫-2-氧丁酸和1-氨基环丙烷-1-羧酸在非衰老叶片中含量最多。

在43个参与乙烯生物合成的差异表达基因(DEGs)中，有39个在衰老叶片中高表达(图2)。3.）.ACC合成酶(ACS)和ACC氧化酶(ACO)是乙烯生物合成途径中的限速酶。在我们的研究中，没有检测到ACS的deg。七度角ArACOs，其中大部分(5/7)在衰老叶片中表达量较高。27个et信号基因均在未衰老叶片中表达上调。

脱落酸

脱落酸(ABA)曾被认为是除乙烯外促进叶片衰老最有效的激素。我们研究了与ABA合成有关的代谢物和基因的富集，以及ABA信号通路(图2)。3.）.结果表明，脱落酸在衰老叶片中含量较高，在非衰老叶片中含量高于衰老叶片。在ABA合成阶段，三个基因表现出差异表达。其中,ArZEP在衰老叶片中表达量较高，而ArNCED和ArABA2在未衰老叶片中高度表达。在23个aba信号基因中，12个基因在衰老叶片中表达上调(ArPYL2, ArPP2C4/5/6/7, ArSNRK2-3/4/5/7/8/9, ArABF3)和11个下调(ArPYL1, ArPP2C1/2/3, ArSNRK2-1/2/6, ArABF1/2/4/5)(图。3.）.

细胞分裂素

细胞分裂素(Cytokinins, ck)是植物激素，在植物生长发育过程中起着重要作用。在离体和活叶上施用外源细胞分裂素可防止叶片衰老[48]。通过对衰老前后叶片细胞分裂素水平的分析，发现细胞分裂素水平与植物各组织和衰老过程呈负相关[7，49，50]。此外，在转基因植物中对细胞分裂素产生的基因操作为细胞分裂素在叶片衰老中的抑制作用提供了非常确凿的证据[7，51，52，53]。

在本研究中，衰老叶片中细胞分裂素的含量远高于非衰老叶片，并收集了与CK稳态各方面相关的基因(图2)。4）.细胞分裂素信号是基于双组分系统(TCS)，它是通过磷酸盐基团在主要组分之间的连续转移来实现的。我们的研究结果表明，该信号转导通路中的所有差异表达基因在衰老叶片中都被下调(图2)。4）.

生长素

早期研究发现，外源生长素的施用与叶片衰老呈负相关，许多植物的内源生长素水平随着年龄的增长而下降[54]。植物通过三种途径实现色氨酸合成生长素，以中间产物命名，包括吲哚-3-丙酮酸途径、色胺途径和吲哚-3-乙腈途径[55]。目前，三种合成途径中的两种尚未得到充分的研究，控制相关合成步骤的关键基因尚未发现。其中许多步骤仍然是基于现有实验的潜在模型。

红枫衰老叶片中色氨酸含量高于未衰老叶片。吲哚-3-乙醛(IAAld)、吲哚-3-乙腈(IAN)和吲哚-3-乙酸(IAA)在未衰老叶片中的含量较高(图2)。5）.在生长素合成途径中共获得22个关键差异表达基因，包括YUCCA、ALDH和TAA1家族基因。衰老叶片中有7个YUCCA基因表达水平显著下调(吲哚-3-丙酮酸途径)。吲哚-3-丙酮酸途径是第一个被完全阐明的生长素生物合成途径，也是植物中最基本、最重要的生长素合成途径[j]。56，57]。

许多研究表明，该通路中的YUCCA失活会减少植物生长素的合成，而YUCCA基因的过度表达会导致生长素的过量产生，从而导致发育缺陷[58]。因此，YUCCA是生长素合成的限速因子，其基因表达模式对生长素合成起着至关重要的作用。在本研究中，表达ArYUCCA衰老叶片基因下调，提示其在生长素合成中起关键作用。通过差异基因筛选，在生长素信号转导通路中发现35个差异表达基因，包括TIR1、IAA、ARF、SAUR家族基因。各家族基因表达谱分析显示，TIR1、IAA和ARF基因家族在非衰老叶片中均有上调，而SAUR基因家族在非衰老叶片中均有上调/下调基因(图2)。5）.

茉莉酸

茉莉酸及其衍生物是一类重要的植物激素，是植物生长发育所必需的，并有助于植物承受压力和完成生命周期。茉莉酸的第一个记录功能是促进离体燕麦叶片的衰老[59，60]。因此，我们研究了赤枫茉莉酸生物合成和信号转导相关通路中DEGs的代谢物含量和表达模式(图2)。6）.未衰老叶片α-亚麻酸和茉莉酸甲酯含量高于衰老叶片，后者的磷脂酰胆碱和茉莉酸含量高于衰老叶片。

相关基因表达模式清晰，除环氧丙烯环化酶(AOC)外，同一基因家族的基因表达谱一致。其中有一位ArAOC基因和5个脂氧合酶(LOX)基因在衰老叶片中下调。衰老叶片中，氧化烯合成酶(AOS)、氧化烯环化酶(AOC)、氧化二烯酸还原酶(OPR)和茉莉酸o -甲基转移酶(JAT)等7个生物合成基因上调，催化了茉莉酸生物合成途径中的一系列反应。jasmonate -resistant 1 (JAR1)、coronatine insensitive 1 (COI1)、jasmonate ZIM (JAZ)蛋白和转录因子MYC2是ja信号通路的重要组成部分。前两个基因在衰老叶片中下调，后两个基因在衰老叶片中上调。

水杨酸

水杨酸(Salicylic acid, SA)是一种酚类植物激素，可调节各种植物的种子萌发、细胞生长、呼吸、气孔关闭、胁迫响应、固氮和结实率[j]。61]。近年来，水杨酸在叶片衰老中的作用也得到了认识[62]。因此，我们研究了红枫水杨酸SA合成中代谢物含量和相关基因的表达，以及SA信号通路(图2)。7）.苯丙氨酸途径是最早发现的水杨酸合成途径。结果表明，衰老叶片和非衰老叶片的苯丙氨酸含量基本相等。而红枫未衰老叶片中水杨酸的含量较高，但其核心酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因在衰老叶片中的表达量远高于未衰老叶片。有趣的是，这一结果与其他研究的结果不同。在拟南芥中，内源水杨酸含量随着叶片衰老而增加[63]。

研究表明水杨酸信号转导通路主要是npr1依赖性通路[64]。NPR1解聚成反应性单体并转移到细胞核后，可直接与转录因子TAG家族的一些成员相互作用，诱导下游抗病基因的表达。的表达水平ArNPR1衰老叶片和非衰老叶片的基因相似;16个TGA基因中有15个成员在衰老过程中上调。因此，我们假设SA在红枫叶片衰老中的作用依赖于信号转导通路中相关基因的有效表达。

Brassinosteroid

植物激素油菜素内酯(brassinosteroids, BR)在包括叶片衰老在内的多种发育过程中发挥作用。一些拟南芥BR生物合成突变体(如det2), (65]，或者信号转导途径的丧失(例如，BRI1)延缓了叶片衰老表型和相关的衰老特征[66，67，68，69]。然而，在我们的代谢组测试结果中没有检测到这种植物激素。以往的研究表明，植物组织中油菜素内酯的含量变化很大[70]。花粉、未成熟种子和果实的BR含量最高。年轻的生长组织含有较高的BR水平;然而，成熟叶片的BR浓度较低[71]。

BR信号从位于膜上的BRI1传递到细胞核内的转录因子BZR1，是通过一系列蛋白磷酸化和去磷酸化反应完成的。这一系列磷酸酶或磷酸激酶，包括BAK1、BSK、BIN2和BZR1/2，在衰老的叶片中下调(图2)。8）.

赤霉素

赤霉素(giberellin, GAs)是一类双胍类植物激素，在植物的整个生命周期中起着重要作用。高等植物中GA生物合成的前体是由焦磷酸异戊烯基合成的香叶酰二磷酸(GGPP)。以前的许多研究已经讨论了赤霉素对叶片衰老的阻碍作用[72]。衰老叶片的GGPP含量是未衰老叶片的两倍(GL/YL = 0.5;无花果。9）.在所有参与赤霉素信号传导的基因中，只有两个差异表达的基因(ArDELLA1和ArDELLA2)，均在未衰老叶片中高表达。

红枫叶片衰老的促进作用

乙烯是植物生长和生理的主要调节剂。从种子萌发到器官衰老，从性别决定到细胞伸长，乙烯起着至关重要的作用[73]。在某些物种中，乙烯已被证明在调节叶片衰老方面是有效的[74]。在这项研究中，我们观察到三种ACC氧化酶(ArACO3，ArACO6,ArACO7)和乙烯在红枫(图。10）.表达水平为三ArACOs衰老叶片中乙烯含量高于未衰老叶片，且与乙烯含量一致。早期研究表明，ACC氧化酶催化了乙烯生物合成的最后一步，在乙烯产量高的条件下，ACO往往是生物合成的限速步骤[75，76]。一项研究表明，与野生型相比，转基因ACC氧化酶反义番茄植株的叶片衰老时间明显推迟了10-14天，从颜色由绿色变为黄色。77]。ET信号转导是根据“线性”方法进行的。它以受体开始，以转录因子(tf)结束。ETR(乙烯反应)和CTR1 (Raf-like CONSTITUTIVE TRIPLE-RESPONSE1)是该通路的负调控因子。在这项研究中，两个CTR1基因(ArCTR1-1和ArCTR1-2)和6个ETR基因(ArETR1和ArETR3/4/5/6/7)与红枫乙烯呈负相关。分析etr拟南芥和水稻的突变确实表明了这一点etr叶片(乙烯不敏感)比野生型叶片寿命更长[78，79]。同样,在拟南芥的ctr1对该突变进行了详细分析，结果表明该突变延缓了叶片的功能性衰老[80]。这些结果表明ArACOs，ArETRs,ArCTRs参与了乙烯对红枫叶片衰老的影响。

ABA在促进叶片衰老方面的作用已被广泛证实[81]。内源ABA水平可以诱导不同植物中多种基因的表达。这些基因的产物除了转录因子和其他信号分子外，还有功能基因，如LEA蛋白、解毒酶、渗透保护剂合成酶等[82]。在拟南芥衰老时，大部分参与脱落酸合成的基因被上调[83，84，85，86]。在许多情况下，产物积累的变化与基因表达一致。有趣的是，这与我们的研究结果相反。ABA反应已被证明严格受细胞内信号转导途径控制，许多可能与ABA反应相关的信号中间体也已被分子和生化研究确定。最近在了解ABA早期信号转导方面的进展导致了PYL-PP2C-SnRK2信号转导模型的构建[87]。红枫ABA代谢途径的共调控网络显示，3个基因家族中的7个成员与ABA相关(图2)。10）.的表达水平呈负相关ArPP2C1/2/3和ABA。ArPYL2和ArSnRK2-7/8/9与ABA水平呈正相关。大量遗传证据表明，磷酸酶2C (PP2C)是ABA信号的负调控因子。Zhang等人注意到拟南芥中SAG113基因编码一种蛋白磷酸酶2C，而SAG113蛋白磷酸酶2C的作用是在叶片衰老过程中抑制气孔关闭。这使得更多的氧气进入叶片，加快叶肉细胞的呼吸速率，衰老细胞的呼吸速率趋于加快，同时促进叶片水分的快速蒸发，直至耗尽[81，88]。我们的结果表明，四个ArPP2C这些基因在红枫衰老叶片中高度表达，表明这些基因在红枫叶片衰老中起重要作用。先前的研究表明，PYR/ pyl是ABA受体，在负调控途径的顶端发挥作用，通过抑制pp2c来控制ABA信号传导。因此，我们推测在红枫的衰老叶片中，ArPYL2可能会与ArPP2C1/2/3并抑制磷酸酶活性，使ArSnRK2-7/8/9激活和磷酸化目标蛋白，从而调节叶片衰老。

红枫叶片衰老的抑制作用

以往的研究表明，细胞分裂素是调控植物生长发育的最重要的植物激素之一[89，90]。细胞分裂素可能是最常被研究的调节叶片衰老的激素。外源细胞分裂素在离体植物叶片上的应用，可以延缓叶片衰老[j]89，91]。细胞分裂素信号通路成分的过度表达也可能延缓植物叶片衰老[92]。红枫未衰老叶片中细胞分裂素含量较高。细胞分裂素有抑制红枫叶片衰老的作用。相关分析表明，红枫细胞分裂素含量与ArARR-A1/3/4呈正相关(图2)。10）.已知a型ARR基因的表达可被细胞分裂素快速特异性诱导[93，94]。这种类型的基因被认为是细胞分裂素信号通路中的标记基因。a型ARR基因的过表达会导致转基因植株开花时间提前、根系变长、侧根增多、衰老提前、细胞分裂素敏感性降低。拟南芥中的ARR16可能参与调节其叶片的衰老过程[95]。综上所述，红枫中ArARR-A1/3/4可能通过细胞分裂素信号通路参与调节叶片衰老过程。

生长素在植物生长发育的各个部位和阶段都起着重要的作用[96]。早期研究表明，外用生长素与叶片衰老呈负相关，提示生长素具有延缓叶片衰老的作用[97]。在大多数情况下，生长素的应用可以延缓许多植物叶片中叶绿素和蛋白质的降解，而在开始或处于衰老过程的叶片中，内源生长素的水平降低[j]。54]。在本研究中，与衰老叶片相比，未衰老的红枫叶含有较高的生长素水平。相关分析表明，红枫的生长素含量与红枫的生长素含量呈显著正相关ArYUCCA2/3/5/8(无花果。10）.先前的研究表明，YUCCA6激活突变体yuc6-1d具有高水平的游离IAA，并表现出典型的高生长素表型。转基因植株表现出明显的生命周期延长，并对黑暗和激素诱导的衰老表现出明显的抑制作用[98]。此外，的表达ArSAUR14在红枫衰老过程中，生长素含量呈负调控关系。近年来，一些分子遗传学研究发现，生长素应答基因家族中的SAUR (small auxin-up RNA)基因通过调控植物激素生长素的积累，在植物生长中起着至关重要的作用[R]。过表达SAUR39的转基因水稻植株表明，与生长素的生物合成不同，该基因在衰老叶片中的表达水平更高。转基因植株生长素水平降低，生长素极性转运减少，一些推测的生长素合成和转运基因下调[j]。99]。综上所述，红枫中的ArYUCCA2/3/5/8和ArSAUR14可能通过生长素代谢和信号传导调控叶片衰老。

红枫中的两种植物激素与以往的研究相反

茉莉酸盐(JAs)及其氧脂素衍生物是公认的调节植物生长和植物适应生物胁迫和非生物胁迫的植物激素[j]。One hundred.]。首次证实JA的生物学功能是作为一种促进衰老的物质，促进离体燕麦叶片的衰老[60]。他等人(2002)的研究表明，衰老叶片中的JA含量是未衰老叶片的4倍[101]。然而，我们的试验结果表明，红枫未衰老叶片中的JA含量高于衰老叶片。JA下游产物检测结果显示，MeJA在衰老叶片中的含量略高于非衰老叶片(GL/YL = 0.9)。可能JA产生额外的MeJA参与抗应激反应。相关分析结果表明ArJAZ1/4/6/9/11/12，ArMYC1，与JA含量呈负相关(图2)。10）.先前的研究表明，JAZs可以通过与一系列转录因子或信号转导蛋白(如MYC2)相互作用来抑制ja诱导的叶片衰老[102，103，104，105]。因此，红枫衰老叶片中ArJAZs转录本的高表达可能抑制了JA诱导的叶片衰老。

虽然SA作为一种信号分子在植物病害防御反应中已经得到了很好的研究，但直到最近才认识到它在叶片衰老中的作用。在拟南芥中，内源SA含量随叶片衰老过程而增加[106]，拟南芥突变体叶片随SA含量的增加或减少而呈现早或晚衰老[107，108，109，110，111，112),分别。结果表明，虽然衰老叶片中苯丙氨酸脱氢酶含量较高，但未衰老叶片中水杨酸含量高于衰老叶片。在许多植物中，水杨酸是通过苯丙氨酸途径合成的[113]。在苯丙氨酸脱氢酶的作用下，苯丙氨酸生成肉桂酸，然后生成苯甲酸，最后生成水杨酸。然而，肉桂酸是许多多酚的前体，如类黄酮[114]。因此，我们推测红枫中的肉桂酸更多的是作为这类物质的前体参与植物代谢。相关分析显示，ArNPR1含量与SA呈正相关(图2)。10）.已有研究证实，NPR1在叶片衰老过程中起重要作用。npr1是拟南芥中SA信号受体缺失的突变体，表现出延缓叶片衰老的现象，并改变了一些衰老相关基因(SAGs)的表达[106]。因此，我们推测衰老叶片中SA积累较低可能与叶片中SA的表达较低有关ArNPR1基因。当然，这一猜想还需要进一步的实验来验证。

油菜素内酯和GA在红枫叶片衰老中的作用

油菜素内酯是一类独特的植物激素，对植物的正常生长至关重要[115，116]。然而，迄今为止，这些物质在植物叶片衰老中的作用还没有深入研究。目前，我们知道绿豆的幼苗叶[117]和黄瓜子叶[118用表油菜素内酯治疗会出现过早衰老(epiBR）.在拟南芥中，不同的BR突变体(例如，det2，bri1)表现出加速或延缓叶片衰老的表型[67，68，69]。在我们的研究结果中，没有检测到红枫中BRs的含量，这可能是由于不同生物之间BRs的含量差异很大。前人研究表明，花粉、未成熟种子和果实中BRs含量最高，幼龄生长组织中次之，而成熟叶片中BRs含量最低[119，120]。红枫BRs合成途径中未发现差异表达基因，信号转导途径的基因在未衰老叶片中也有高表达，这说明衰老过程中油菜素内酯可能没有显著积累。

赤霉素是一种植物激素，属于二萜类，在植物的整个生命周期中起着至关重要的作用[121]。基于对赤霉素的处理和相关研究成果，报道了赤霉素维持叶绿素水平和RNA合成;从而延缓有丝分裂后叶片衰老[R]。外源GA(3)喷施多叶莲可明显抑制多叶莲地上成分的衰老[j]。122]， GA(4)可延缓衰老Alstroemeria矮牵牛叶子(123，124]。根据我们的结果，在红枫中没有检测到赤霉素，赤霉素合成途径中也没有观察到差异表达的基因。虽然衰老叶片中GGPP初始代谢物含量较高，但红枫衰老过程中GA含量的变化无法预测。这是因为植物中的GGPP可以形成GA, ent- karen [125]、Chl-phytol (Chl (Phy)) [126，127，128，129]，植物烯和类胡萝卜素[130根据不同的分支路径。以GGPP为前体的任何分支通路的操作也会显著影响其他分支通路。例如，植物烯合成酶的上调或下调会导致类胡萝卜素合成的增加或减少以及GA水平的变化[131]。因此，GA对红枫叶片衰老的影响有待进一步研究。

乙烯和ABA可能在叶面衰老中起积极作用宏碁石．参与乙烯调控叶片衰老的关键因子可能包括ArACO，ArETR,ArCTR基因家族。在ABA信号通路中，PYL-PP2C-SnRK2组分在调控ABA的产生中起关键作用。细胞分裂素和生长素可能在红枫叶片衰老的调控中起负向作用。a型核反应调节因子很可能是红枫细胞分裂素延缓叶片衰老的关键调节因子。建议今后对植物生长素延缓叶片衰老机制的研究应集中在YUCCA等基因上。红枫非衰老叶片中JA和SA的积累量较高，这与其他树种内源JA和SA含量随叶片衰老而增加的研究结果相反。

根据对JA合成途径相关代谢物含量变化的分析结果，我们推测红枫衰老叶片中JA经历了一个快速积累期。我们进一步推测，在衰老过程中，SA的前体肉桂酸更多地参与其他次生代谢产物，如黄酮类化合物，这可能是SA没有进一步积累的原因。我们在红枫中未检测到BRs和GAs。通过对BRs信号通路中差异基因的表达分析，我们推测该物质的含量不太可能在红枫叶片衰老过程中增加。由于GA代谢途径的初始代谢物GGPP下游分支通路的复杂性，我们仍然无法推测GAs可能的蓄积。在未来，我们将通过额外的实验证据进一步阐明上述激素在红枫衰老调控中的作用模式和机制。

所有测序数据提交至NCBI Sequence Read Archive数据库，登录号为PRJNA531583。

UHPLC-QE-MS:

液相色谱仪Q萃取质谱法

等:

乙烯

阿坝:

脱落酸

是:

茉莉酸

山:

水杨酸

BR:

Brassinosteroid

CK:

细胞分裂素

国际宇航科学院:

生长素

遗传算法:

赤霉素

Non-senescing叶子:

完全展开的绿叶

开始衰老的叶子:

叶片表面100%泛黄，叶绿素损失约95%

艾达:

Information-dependent收购

esi +:

电喷雾电离-正离子模式

ESI -:

电喷雾电离-负离子模式

门店:

新一代测序

SMRT:

单分子实时测序

Iso-Seq:

Isoform测序方案

FPKM:

每千个碱基转录物的片段数每一百万次映射读取

度:

差异表达基因

NCBI:

国家生物技术信息中心

GL:

叶片不衰老，完全展开的绿叶

YL型:

叶片衰老，叶面100%泛黄;~ 95%叶绿素损失

mtnK:

5-methylthioribose激酶

mtnA:

Methylthioribose-1-phosphate异构酶

MTN:

5 ' -methylthioadenosine核苷酶

mtnB:

Methylthioribulose-1-phosphate脱水酶

滚筒:

亚精胺合成酶

mtnC:

2, 3-diketo-5-methylthiopentyl-1-phosphate enolase-phosphatase

加速:

s -腺苷甲硫氨酸脱羧酶前酶

mtnD:

1, 2-dihydroxy-3-keto-5-methylthiopentene加双氧酶

metK:

S-adenosylmethionine合成酶

答:

酪氨酸转氨酶

ACS:

1-aminocyclopropane-1-carboxylate合酶

华:

Aminocyclopropanecarboxylate氧化酶

ETR:

乙烯受体

CTR:

本构

EIN2:

乙烯不敏感2

EIN3:

乙烯不敏感3

ERF1/2:

乙烯反应转录因子1/2

TF:

转录因子

齐柏林飞艇:

玉米黄质环氧酶

NSY:

Neoxanthin合酶

VDE:

黄质de-epoxidase

阿坝:

黄氧素脱氢酶

nc:

9-cis-epoxycarotenoid加双氧酶

阳极氧化铝:

Abscisic-aldehyde氧化酶

所有:

Pyrabactin-resistance 1

PP2C:

蛋白磷酸酶2C型

SnRK:

丝氨酸/ threonine-protein激酶

沛富:

脱落酸响应元件结合因子

DMAPP:

Dimethylallyl二磷酸

ATP:

三磷酸腺苷

ADP:

二磷酸腺苷

AMP:

腺苷酸

IPT:

Isopentenyl转移酶

iPRTP:

”Isopentenyl腺苷三磷酸

iPRDP:

”Isopentenyl腺苷二磷酸

iPRMP:

”Isopentenyl腺苷一磷酸

CYP735A:

细胞分裂素trans-hydroxylase

tZRTP:

反式玉米蛋白核苷三磷酸

tZRDP:

反式玉米核苷二磷酸

tZRMP:

反式玉米核苷单磷酸

日志:

细胞分裂素激活酶孤独的家伙

知识产权:

Isopentenyl腺苷

tZR:

Trans-zeatin核苷

知识产权:

Isopentenyl腺嘌呤

tZT:

Trans-zeatin

层次分析法:

含组氨酸的磷酸转移蛋白

a型血人加勒比海盗:

a型响应调节器

b型arr:

b型反应调节器

trpB:

色氨酸合成酶链

Trp:

色氨酸

监护系统:

色氨酸脱羧酶

TAA:

色氨酸转氨酶

TAM:

色胺

异丙醇:

Indole-3-pyruvate

CYP71A13:

Indoleacetaldoxime脱水酶

IAOx:

吲哚3-acetaldoxime

丝兰:

Indole-3-pyruvate单氧酶

IAAld:

Indole-3-acetaldehyde

伊恩:

Indole-3-acetonitrile

ALDH:

醛脱氢酶

没用的人:

腈水解酶

国际宇航科学院:

Indole-3-acetate

辅助/ IAA:

生长素反应蛋白

东盟地区论坛:

生长素反应因子

TIR1:

转运抑制剂反应1

阿富汗二月:

小生长素上调RNA

拉:

磷脂酶A1

αlea:

亚麻酸

液态氧:

脂氧合酶

12日,13-HPOT:

12日,13-hydroperoxylinoleic酸

代谢:

氧化丙烯合成酶

12日,13-EOT:

12日,13-epoxyoctadecatrienoic酸

AOC:

烯氧化物环化酶

OPDA:

Oxophytodienoic酸

超载比:

氧植物二烯酸还原酶

JMT:

茉莉酸羧甲基转移酶

JAR1:

茉莉酸抗性1

惩罚:

甲基jasmonate

JA-Ile:

Jasmonoyl-L-isoleucine

COI1:

冠状蛋白不敏感蛋白

JAZ:

茉莉酸ZIM结构域蛋白

朋友:

苯丙氨酸ammonia-lyase

BA2H:

安息香酸盐

NADPH:

氧氧化还原酶(2-羟基化)

美国国家公共电台:

Nonexpressorofpathogenesis-relatedgenes1

TGA:

转录因子TGA

90 b / 724 b:

类固醇22-alpha-hydroxylase

6-DeoxoCT:

6-Deoxocathasterone

6-OHCN:

6 alpha-hydroxycampestanol

6-DeoxoTE:

6-Deoxoteasterone

6-OxoCN:

6-Oxocampestanol

6-Deoxo3DT:

3-Dehydro-6-deoxoteasterone

CT:

Cathasterone

6-DeoxoTY:

6-Deoxotyphasterol

TE:

Teasterone

6-DeoxoCS:

6-Deoxocastasterone

3-DT:

3-Dehydroteasterone

6-OHCS:

6 alpha-hydroxy-castasterone

泰:

Typhasterol

85 a1/2:

Brassinosteroid-6-oxidase 1

92 a6:

Typhasterol / 6-deoxotyphasterol 2α-羟化酶

85 a2:

Brassinosteroid-6-oxidase 2

BRI1:

油菜素内酯不敏感蛋白

BAK1:

油菜素内酯不敏感1相关受体激酶1

BSK:

BR-signaling激酶

BSU1:

丝氨酸/ threonine-protein磷酸酶

BIN2:

油菜素内酯不敏感

BZR1/2:

抗油菜素类固醇1/2

PP2A:

蛋白磷酸酶2A型

GGPP:

Geranylgeranyldiphosphate

CPS:

对-共聚二磷酸合成酶

ent-CDP:

Ent-Copalyl二磷酸

KS:

Ent-kaurene合酶

柯:

Ent-Kaurene氧化酶

花王:

Ent-Kaurenoicacid氧化酶

遗传算法:

赤霉素

GA20ox:

GA20-oxidase

GA30ox:

GA30-oxidase

GID1:

赤霉素不敏感矮秆1

感谢园林植物与景观工程团队所有成员的贡献。

安徽省自然科学基金资助项目[批准号:1908085QC113];安徽省自然科学基金[批准号1708085mc57];国家自然科学基金[批准号31600543]。所有这些资金都在研究和收集、分析和写作的设计中发挥作用。

从属关系

1. 安徽省农业科学院农业工程研究所，安徽合肥农科南路40号，安徽合肥230031

   陈竹，高俊兰，宣云，任杰

2. 安徽农业大学林业与园林学院，安徽合肥长江西路130号，安徽合肥230036

   路小雨

贡献

CZ:概念化，写作-原稿准备，写作-审查和编辑。《方法论、写作——审查与编辑》。GJL:验证。XY:调查。RJ:监管，资金获取。所有作者已阅读并同意稿件。

相应的作者

对应到任杰．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者声明，他们没有已知的竞争经济利益或个人关系，可能会影响本文所报道的工作。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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