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转录组Cunninghamia lanceolata.雄性/雌性球果揭示了MIKC MADS-box基因与生殖器官发育的关系

抽象的

背景

Cunninghamia lanceolata.(中国FIR)是针叶树家族山脉的成员,是中国木材生产最受欢迎的栽培树之一。正在持续研究进行改进c .生长状况育种价值。鉴于种子流产率高(胚珠和花粉发育失败的原因之一)c .生长状况,女性/男性锥体的正确形成可以理论上可以增加后代的后代数量。Mikc Mads-Box基因以其在花/锥体开发中的作用而闻名,并包括典型/非典型花卉开发模型,用于AgeniSperms和Gymnosperms。

结果

我们进行了转录组分析,以发现在一个精心确定的单一发育阶段,雌性和雄性球果之间的基因差异表达,重点是MIKC MADS-box基因。最终获得47个独特的MIKC MADS-box基因c .生长状况把这些基因分成不同的分支。47个mic MADS-box基因中有27个在雌球果和雄球果中有差异表达,大部分在叶片中不表达。在这27个基因中,大多数b类基因(AP3 / PI.)在雄球果中表达上调TM8基因在雌性锥体上调节。然后,没有明显的整体偏好AG)(C + D类别)基因在雌性/雄性锥体中,似乎这些基因似乎参与了两个锥体的发展。最后,少数基因如GGM7高级副总裁AGL15,这些基因在雌性/雄性球果中特异表达,使其成为性别特异性球果发育的候选基因。

结论

我们的研究发现了一些MIKC MADS-box基因,这些基因在雄性和雌性球果中表现出不同的表达c .生长状况,阐明了这些基因与c .生长状况锥的发展。在此基础上,我们假设了一种可能的锥发育模型c .生长状况.研究结果表明,雌球果和雄球果的基因表达存在差异,可用于研究与性别特异性球果发育相关的未知调控网络。

背景

Cunninghamia lanceolata.(羔羊。)钩(中国冷杉)是中国南部最具商业中最重要的木材树之一。由于其杰出的木质性质和高增长率,它已经耕种数千年[1],其种植面积占全国总种植面积的24% [2].c .生长状况是一种单一的针叶树种类,具有分布在上冠和中间冠和中下冠和下冠中的阳锥体的雌锥[3.].c .生长状况雌性/雄性锥体从经典的贪眼花很大(图。1一种)。具体地,雌性锥由苞片鳞片组成,其底部产生的胚珠。苞片鳞片将逐渐打开,然后将接受花粉以完成施肥(图。2c) [8].在c .生长状况,雄球果聚集成一个复合结构,由几个球果组成,每个球果被许多小孢子叶包裹,其中包含花粉囊,花粉粒成熟后释放(图。2A和c) [8].由于其较高的商业价值,c .生长状况由育种者不断改进。其中一个重要的繁殖目标是提高其繁殖效率;由于约50-70%的种子可能败育,这是其发芽率低的根本原因[9].为什么种子中止尚未完全理解;两种可能的原因是花粉流产和异常胚珠发育[10].因此,研究花球发育的分子机制是了解种子败育的潜在过程。

图。1
图1

被子植物和裸子植物花的同源性功能及不同物种的MADS-box基因域。一个图解说明了经典的ABCDE花发育模型在被子植物拟南芥.A,B,C,D和E类的不同组合导致不同的器官标识[4].bB(C)模型用于控制裸子植物雌雄球果的发育,(C)表示C + D [456].cMADS-box蛋白有两种类型:type I (SRF-like)和type II (MEF2-like)。刻度表示蛋白质中氨基酸的数量。“?“表示c端还没有明确定义”[7](从图中重绘。1https://www.pnas.org/content/97/10/5328版权所有(2000)美国国家科学院

图2
figure2

c .生长状况女性和男性锥体与他们的垂直部分。一个与大量的男性斯特罗比利的男性锥体。b与鳞片叶子和略微打开的苞片鳞片的女性锥体。树3-15-31,显示为F3,M3;树No.4-9-31,显示为F4,M4。秤栏:A,B = 1厘米。c雄性锥与轴(a),microcophyll(b)。microclophyll熊花粉囊(c)和花粉(d)。与轴(a'),鳞片(h')和宏观孢子的雌锥。宏观孢子基与苞片尺度(d'),排卵量表(c')。用Lobe(E'),Integument(F'),Nucellus(G')的排卵量表[8

花卉发展是一种复杂的生物过程,受到遗传和环境因素的影响[11].在Angiosperms中,经典的Homeicog ABC模型解释了局部基因表达如何能够控制花卉身份(A类基因,SQUA / AP1;B类基因,AP3,PI.;C类基因,AG))[12].在最初的概念之后,ABC模型后来得到了扩展,增加了D类(D类基因,SHP,Stk.)[13]和E (E类基因,Sep1, 2, 3, 4)[14ABCDE模型,因为更多的基因参与其中。该模型的工作原理是,在发育中的花的特定区域中表达的每种同种异体基因(A到E)的独特组合,产生了特定的花组织类型[5].例如,A和E类参与萼片形成,ABE的组合影响了花瓣发育,BCE控制雄蕊形成,CE影响CARPEL发育,DCE参与建立胚珠(图。1) (1516].然而,在裸子植物中,雌性和雄性球果的发育被认为仅受B类和C类蛋白质四聚体的控制[56].然而,关于裸子植物花同种异体模式仍然存在两种不同的观点:B(C)系统(图。1b)和(A) b (C)系统,其中(C)代表C + D类,(A)代表A + E类[5].

除了AP2基因,属于ABCDE模型的基因是MADS-box基因家族的成员,在花器官发育中具有重要的功能[17].所有Mads-Box蛋白质都有一个高度保守的领域,疯狂的域,可以分为两个主要谱系:I型(SRF样)和II型(MEF2类似),基于序列保护[7].这两种MADS谱系都可以在植物、动物和真菌中找到。然而,有一些特殊的结构,如K域,只有在植物的II型MADS-box基因中才发现(图1)。1c;从图重画。1https://www.pnas.org/content/97/10/5328)“版权所有(2000)美国国家科学院,U.A.”)[7].到目前为止,在植物花卉发展中,II型疯子箱基因已经更彻底地研究了它们的功能[18].植物II型MADS-box基因的一个显著特征是,它们比I型MADS基因多包含三个结构域:介入(I)结构域、角蛋白样卷曲卷曲(K)结构域和C端(C)结构域(图1)。1c) (19].高度保守的MADS结构域是该基因家族的主要特征之一,它决定了DNA的结合和二聚[20.].K结构域可能介导蛋白质之间的相互作用,也可能参与与其他蛋白质的直接相互作用[20.].MADS域和K域由一个短的中间I域连接[21].在一些疯子箱中,C末端区域参与转录激活或三元复合物形成[2223].这些基因被归类为mikc型,是植物特有的[7].

以前的研究c .生长状况主要关注形成层活性的调节[24, EST-SSR标记开发[252627],与生长和发展相关的基因[28]纤维素和木质素生物合成[29]和早期种子发育的蛋白质组分析[1].到目前为止,关于其女性/雄性锥发育的分子机制很少。在这里,我们进行了RNA-SEQ转录组方法以鉴定差异表达在未成熟的女性和雄性锥之间的基因c .生长状况.本研究为裸子植物球果发育相关基因的研究提供了有价值的资源,并可能为今后杉木改良项目中增加种子数量的培育提供帮助。

方法

植物材料

本研究于2月下旬在两棵不同的单株活树(3 - 15-31,4 - 9-31)上采集了未成熟的雌球果和雄球果c .生长状况克隆(6421)(24].这些树种位于中国福建省杉木国家种质资源库洋口森林站。该站与南京林业大学有合作关系。为了避免样本差异的影响,雌/雄球果在树中以相似的状态和高度进行采样。雌球果的采集状态是被绿色鳞片覆盖,苞片稍开。2b),而阳锥是由几种斯特罗基(图。2a).此时胚珠已经出现,但尚未完全形成,花粉也是如此。样品的正式鉴定由作者郑仁华负责。然而,据我们所知,没有植物标本馆存放这一特定材料的凭据标本。为了进行转录组学分析,雌性/雄性球果立即在液氮中冷冻,并保存在−80°C,直到RNA提取。为了进行SEM分析,采集新鲜球果,用2.5%戊二醛(0.1 M PBS, pH 7.2)固定。所有材料均经许可获得。

扫描电子显微镜

用0.1M磷酸盐缓冲液冲洗2.5%戊二醛的雌性/雄性锥,使用一系列分级乙醇溶液脱水,使用临界点烘干机(K850,Emitech,England)干燥,在短柱上安装双面胶带,并在溅射涂餐(E-1010,日本,日本)中涂有耳云。在Quanta 200扫描电子显微镜(Fei,America)上观察样品[30.].

RNA提取和mRNA图书馆建设

根据制造商的说明,使用乙醇沉淀方案和CTAB-PBIOZOL试剂纯化总RNA。总RNA由NanoDrop和Agilent 2100生物分析仪(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)进行质量控制和定量。用寡聚物(dT)附着的磁珠纯化mRNA。然后将mRNA片段化,然后使用第一链反应体系生成第一链和第二链cDNA。然后,将纯化的cDNA与特定的适配器序列连接。用PCR扩增cDNA片段,用Ampure XP Beads纯化。采用Agilent 2100生物分析仪和ABI StepOnePlus Real-Time PCR系统对样品库进行定量和质量控制。文库随后使用Illumina HiSeq 4000平台(华大基因深圳)进行测序(reads长度为151 bp)。测序后的reads保存在NCBI Sequence Read Archive (SRA)中,注册号为SRR10161401、SRR10161402、SRR10161403、SRR10161404。

转录组数据组装和功能注释

首先过滤原始数据以获得高质量的清洁数据。适配器序列,低质量读取(我们将低质量读取为具有超过10%的基础的低质量读数,并且从原始读取中删除了超过5%的基地的读数。然后通过FASTQC V0.11.7控制的质量清洁读数[31].通过运行trinity(v2.0.6),通过序列之间的重叠延伸到contigs中的清洁读数[32].然后,根据配对结束序列信息,将CONTIG组装成转录序列。

将装配后的unigenes的编码区域分别标注到多个公共数据库中,使用TransDecoder对其进行注释,然后使用blastp算法[33]对UniProt_sprot进行了运行[34]和HMMER数据库与pf - a。hmm(隐马尔科夫模型)[35]鉴定保守的蛋白质。

通过blast对蛋白质序列进行功能注释拟南芥杨树trichocarpa奥雅萨苜蓿,瑞士Prot [34].最终基因本体论(GO)[36]注释结果合并来自两者的数据答:芥p . trichocarpa.由于我们对转录因子(TFs)特别感兴趣,我们在注释过程中添加了一个基因类型参数。在所有情况下,BLAST算法[33]应用了不大于10的电子值参数−5

差异表达分析

通过使用RSEM将清洁读数映射到Trinity转录程序组件来估计基因表达水平[37]对于每个样本。所有基因的丰富是通过FPKM方法使用唯一映射读数的标准化和计算的[38].软件边缘器[39用于鉴定差异表达基因(DEGS)。所结果的P- 通过多次测试方法调整虚假发现率(FDR)的阈值[40].筛选显著差异表达基因(上调和下调基因)的条件为FDR < 0.01和倍数变化> 2。一个R包用于可视化结果和阅读分散。显著的DEGs也通过TopGO R包进行了GO富集分析[41].为了检测哪些转录因子家族在这个发育阶段显著富集(p值< 0.01),使用卡方检验。

MADS-box转录因子和DEGs的鉴定及系统发育重建

识别c .生长状况MADS-box序列,两个报道的隐马尔科夫模型剖面SRF (PF00319)和K-box (PF01486)均来自Pfam [35].使用hmmer软件[42],并得到了过滤条件E-value≤1.0E-04的候选序列,然后使用SMART对序列进行进一步验证[43].

为了准确地识别不同表达的MADS-box基因的雌/雄锥体c .生长状况,用edgeR分析包将低表达的MADS-box基因从DEG列表中剔除[39],留下27个疯子箱子的unigenes。R包Pheatmap(1.0.12)和Mega 7.0用于分析表达水平并构建系统发育树,其显示为热图簇。一岁的叶子的序列原始数据[44]从NCBI Sequence Read Archive (SRA)数据库(SRX2586190)下载,作为营养器官表达比较。

MADS-box序列答:芥o .漂白亚麻纤维卷葡萄从植物转录因子数据库中获得(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php),而序列日本柳杉粳稻挪威云杉Pinus Taeda.http://congenie.org)分别从Futamura等人的三篇文章中获得[45, Carlsbecker等人[46和Chen等人[47].所有引用序列在附加文件中列出1.随后,使用MAFFT对多个序列的全长进行对齐[48,之后的RAxML v8.2.11 [49]构建了PROTGAMMAAUTO模式和100个bootstrap复制的系统发育树。为了支持系统发育分析,对MADS-box基因M, I, K, C结构域进行比对葡萄球菌,冷杉杆菌P. Taeda.C. japonica.,c .生长状况被Texshade选中并显示[50].

QRT-PCR分析

选择了几个疯狂箱基因以验证我们的DEG检测。使用生物植物总RNA提取试剂盒(RP3301)从未成熟的雌性/阳锥中获得总RNA(RP3301),仅通过CTAB替换裂解缓冲液。通过凝胶电泳(1%凝胶)测定总RNA完整性,使用NanoDrop-2000分光光度计(Thermo,Inc。)测定RNA浓度。使用Vazyme标记第1链CDNA合成试剂盒(R211-02)通过逆转录酶方法合成cDNA,然后使用QUBBit 2.0(Invitrogen)进行定量。使用vazyme aceq QPCR Sybr Green Master混合物(没有Rox)(Q121-02)在Lighcycler 480i(Roche)上一式三份进行定量实时PCR(QRT-PCR)反应。基于三次技术和生物学重复进行基因表达分析,并与参考基因标准化CleIF3.表达数据采用Livak计算方法计算,表示为log (2-ΔΔct)[51].

结果

雌球果和雄球果发育于c .生长状况

种子流产是一个不可忽略的方面c .生长状况繁殖。提高品种的育种价值c .生长状况因此,有必要对球果发育的分子机制进行研究。更糟的是c .生长状况是一个裸子植物,其雌性/雄性锥的结构与高昂的花朵的大大不同(图。1一个和无花果。2)[52].为了更好地了解其形态特征c .生长状况女性/雄性锥体,我们使用扫描电子显微镜(SEM)观察雌性和雄性锥,特别是观察胚珠和花粉。在我们采样的阶段,每种雌性锥体含有大量的苞片鳞片,在苞片尺度的底部处具有排卵,并且位于排卵等级的2-3个胚珠(图。3.b)。裂片,nucellus和整数(图。3.c)已经形成但尚未完全分化,每个胚珠的一个排卵尺度的一个叶子(图。3.c) (30.].雄性锥由大量的微麦基组成,一个在中心位置和周围螺旋布置中的残留物。每个microclecophyll都携带2-3种花粉囊(图。3.d e)。每个花粉(无花果。3.f)含有花粉孔径。

图3.
图3

形态学c .生长状况雌性和雄性球果。一个雌球果具鳞片和大孢子叶(b)。b在苞片鳞片(胚珠鳞片)的基部具胚珠的扩大的大孢子叶。c具有代表性的胚珠有珠心(c)、珠被(d)和裂片(e)。d雄球果小孢子叶(箭头所指)带有花粉囊(a’)。e大的小孢子叶,有两个花粉囊(a’)。f花粉放大,箭头指花粉孔。比例尺:A = 2 mm;B、D = 1 mm;C = 100嗯;E = 400嗯;F = 10嗯

序列组装和注释c .生长状况

接下来,我们进行了整个转录组的方法来鉴定差异调节的成绩单,在雌性和公锥体的发育过程之间进行差异c .生长状况.因此,我们从全雌性/阳锥体中分离出总RNA,并使用Illumina测序技术来确定转录组。我们总共获得了22,188,695(F3女性,从树3-15-31),18,114,397(F3男性,来自树No.3-15-31),18,731,606(F4女性,来自树No.4-9-31)和22,054,735(F4男性,来自树No.4-9-31)的每个图书馆的原始读取(表S1).经过过滤和去除适配器和低质量序列后,22123838 (F3母序),18051760 (F3公序),18299131 (F4母序)和21990476 (F4公序)清除读取(表S1)保留了进一步的大会。总共产生24.14GB RNA-SEQ数据。我们总共组装了97,856名转录物,其葡萄藤N50长度为1925年的BP和63,223个unigenes,具有1721年的折叠N50长度(表S)2).所有转录物和unigenes的中位数斑纹长度为784bp和620bp,所有转录物和unigenes的平均长度分别为1228bp和1066 bp(表S2).所有63,223个组装的unigenes(表S2),共鉴定出2117个转录因子(表S3.).

雌性和雄性球果的差异基因表达

为了鉴定特异性差异表达的转录本c .生长状况雌球果和雄球果处于同一发育阶段。在所有组装的unigenes中,剔除了低表达水平的unigenes,得到18045个unigenes。我们以FDR < 0.01和Fold Change > 2为筛选标准筛选这些单基因。然后,我们进一步用GO术语和功能分类对这些基因进行了表征。我们发现5016个unigenes明显差异表达,其中2506个unigenes下调表达,2510个unigenes上调表达。4).

图4.
装具

差异表达基因的火山曲线图。X轴表示女性和阳锥中基因的表达折叠变化。Y轴表示差异表达中的统计学意义程度。较高的10(FDR)值表示更大的差异。黑点表明基因表达没有显着变化。上调基因(男性>雌性)由红色点,下调(雄性<雌性)基因由蓝色点表示

致富集分析成功地将上调/下调的未经内衣2217/2168分为三个GO子组(图。5).我们分别绘制了每个子组的前20个富集的阶段。下调基因(雄性<雌性,冷调)参与DNA复制(BP),核(CC),蛋白质结合(MF)等,而上调(男性>雌性,温调)基因参与花粉外膨胀形成(BP),细胞壁(CC),氧化还原酶活性(MF)等(图。5).这些结果表明,雌球果在生长旺盛时期细胞分裂活跃,而雄球果则主要参与花粉发育。

图5.
figure5

功能分类c .生长状况可见。列出了三个亚组的前20名富集基因本体论(GO)条款。基因本体论术语(GOS)用于将转录物产品分类为(CC)细胞组分,(MF)分子功能和(BP)生物学过程次宿主的类别。温暖/冷彩条表示-log10(P- 在雄性/雌性锥中显着表达基因的值,而曲线在每个术语中表示基因数

专注于我们之前确定的2117c .生长状况我们发现三个基因家族显著富集(P< 0.01): AP2, myb相关,和MADS-box(表1).MADS-box基因的显著表达c .生长状况在其他植物中,球果发育与花的形成过程是一致的,表明该基因家族在花的形成过程中起着重要的作用c .生长状况

中显著富集的转录因子c .生长状况

mikc mads-box转录因子c .生长状况

使用上面的方法,我们终于获得了47个独特的Mikc Mad-Box基因c .生长状况(表4)基于先前的研究,将这些基因分成几个分支(图。6一、表2和s4)[46475354].同时,MADS-box蛋白结构域的比较结果C. Lanceolata,P. AbiesP. Taeda和V.Vinifera,使系统发育分析可用(图S1).

图6.
figure6

Mikc Mads-Box基因的系统发育树用不同的组织中的疯狂箱拍摄。一个使用最大似然算法进行系统发育分析。47 MIKC MADS-BOX基因分为12个分支。bMIKC MADS-box基因在雌球果(F)、雄球果(M)和叶片(L)中的DEGs热图

表2 MIKC MADS-BOX基因摘要c .生长状况k

中可以找到大多数MADS分支c .生长状况,就像AP3 / PI.(b级),9月(类E),AG)(c级),STK / SHP.(d级),参与花器官身份[16].然而,树枝像FLC,BS.富裕AP1(A类)找不到。这可以通过在所选时期期间这些同源基因的低表达来解释。另一种可能的原因是c .生长状况基因组不含这些基因。由于没有某种典型的花卉结构,花器官身份相关基因,喜欢AP1这有助于在Agiospers中有助于萼片和花瓣形成,在进化时间期间可能会丢失。具体情况下这种潜在的基因损失需要进一步研究来说明。

相反,一些疯子分支,就像TM8基因,不是在拟南芥和赖斯,但可以在c .生长状况C. japonica.45],V. Vinifera.53].这些结果表明TM8基因是在高血管植物和裸子植物的共同祖先中建立的,并且在一些植物谱系的相对近期的演化历史中,它们已经独立丢失了[55].

我们还发现了少量的MIKC MADS-box基因,这些基因可以归类到GGM7分支中,而在被子植物中没有发现[46].相比之下,AGL15AGL12基因在c .生长状况,Pinus Taeda.47],以及服直者等答:芥56),V. Vinifera.53,表明这些基因可能在被子植物和裸子植物的花/球果发育中具有重要的功能保守性。与此同时,有一种基因不能被归入任何分支。我们在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)使用BLASTP并发现它是部分身份AG-like基因。然而,在我们的系统发育树中无法得到分类。因此,我们用它的编号命名它:MADS41,这使其成为一种新的候选基因。

mikc mads-box degsc .生长状况女性和雄性锥体

接下来,我们使用我们的差异基因表达数据来确定哪些MADS-box基因在雌球果和雄球果之间有差异表达,使用来自叶片的表达数据作为非生殖组织的比较。我们推断,参与生殖器官发育的基因应该在这些器官中更具体地表达。47个人中c .生长状况Mikc Mads-Box基因,27个基因在阳性和雌性锥体之间差异表达,其中18(27分)不在叶片中表达,9(27个)在叶子中没有显着表达。(图。6b及表S5).大多数B级基因(AP3 / PI.)(4)在雄性锥上调节,类似于在其他植物物种中进行的先前研究中发现的内容[5758),而TM8基因在雌性锥形的较高水平下显然表达,并且更有可能参与女性锥发育。

因为我们发现了一些AG)(C + D类别)基因在雌锥中的雄性锥和其他基因上上调,似乎这些基因似乎参与了任何锥体的发展。我们确定了三个9月(e)和四AGL6基因c .生长状况.然而,9月基因表现出非常低的表达水平,这是很难确定他们的差异表达在锥。然而,我们确实找到了两个AGL6在女性和雄性锥体中表达的基因。事实上,在我们收集的阶段,AGL6基因在雌锥中显示出更高的表达水平。

GGM7根据系统发育树,基因可以细分为2类:DAL10-likeDAL21-like.它们在雌性和雄性锥体中有不同的表达模式P. Abies.46),以及在c .生长状况.而在答:芥AGL15在叶、花序、花药和花粉中表达[59];高级副总裁表达于幼叶、花原基和早期共花期[60],AGL15高级副总裁的雄性和雌性锥体中都高度表达c .生长状况, 分别。除了,MADS41是一个特别的基因,没有明显分类。但其雌性锥体中的高表达水平,使其成为可能参与女性锥发育的候选基因。

的验证c .生长状况女性/男性锥体转录om

为了验证雄性和雌性球果库的差异,我们选择了有限数量的球果库c .生长状况来自差异表达基因名单的MIKC MADS-BOX基因(表S.5)在整个锥体RNA上进行QRT-PCR分析(图。7).该组包括已知在模型生物中涉及Carpel或雄蕊发育的基因(AG) AP3 /π),以及在某些高昂(如拟南芥和米饭)(TM8).

图7.
figure7

差异表达的相对表达c .生长状况选择的女性和雄性基因验证RNA-SEQ结果。Clmads7,10,16,26,34,47选择验证,CleIF3用作参考基因。y轴表示表达水平(2-ΔΔct),这是用利瓦克的方法计算的[47然后转换为log10刻度(log10 (2-ΔΔct)).错误条表示标准错误(SE)

这些结果与RNA-SEQ数据密切一致,例如,表达水平ClMADS34雄球果的基因表达量约为雌球果的100倍ClMADS10在雌性球果中是雄性球果的近10倍,这与转录组数据的结果一致,提示了我们的转录组分析数据的可靠性(图1)。6b和无花果。7).

讨论

作为一种重要的木材品种,c .生长状况再现一直是通过育种计划提高的特征之一。种子流产是一种常见的发生c .生长状况而不正确形成的胚珠和花粉可引起。在这里,我们研究了分子机制c .生长状况通过转录组分析的球果发育。

基于这些数据,我们进行了顺序分析,以确定女性和男性锥体之间的差异,然后我们专注于疯子箱基因家族c .生长状况揭示可能涉及的特定基因c .生长状况锥形发展与裸子植物中ABC模型的表现。

我们发现B类,C,D和E基因c .生长状况并且对于那些在雄性或雌性锥体中显着上调的那些基因,主要是在叶子中表达。B类基因,AP3 / PI.ClMADS44, 45, 46, 47)主要在雄球果中表达上调,最可能影响雄性器官的发育。类似的结果在被子植物中也有报道Quercus Suber.57和裸子植物C. japonica.61例如,CjMADS1b型MADS-box基因在雄球果中表达C. japonica..在挪威云杉中发现,b型MADS-box基因在雄性器官原基中具有活性[62],与被子植物中的b类基因同源[63].这些结果表明,b型基因在裸子植物和被子植物中都有保存,可能在整个种子植物中都有保存。

C类和d类基因不能被明显分离c .生长状况,并在两个生殖器官中表达。AG)在两个锥体中表达的基因P. Abies.64),Gnetum gnemon65)(裸子植物)。这与Quercus Suber.(被子植物),其中c类基因在雄花和雌花中表达水平相似[57].这些结果表明,这些C型基因可能在裸子植物和高管培养中起着类似的作用,这是女性和男性锥形/花开发的供应[4].不幸的是,我们无法识别E-Class基因的表达,因为它们在雄性或女性锥体上没有显着表达。因此,我们推测在这种发展过程中没有必要的级别基因。

此外,我们确定了表达AGL6基因c .生长状况,在雌球果和雄球果中均有表达,在雌球果中表达量较高,但在叶片中不表达,与它们的同源基因的表达模式相似G. Gnemon.65].GGM7基因引起了我们极大的关注,因为它们只存在于裸子植物中[66].在P. Abies., 这GGM7分支包含2个基因:DAL10DAL21DAL10在球果和花粉球果中特别活跃[66),而DAL21在雄性锥或营养芽中未检测到,但在雌性锥体的排卵量表中。意味着,ClMADS 30,31,32,被分为DAL21在雌球果中表达量明显较高,而在雄球果和叶片中表达量不高,具有相似的表达模式P. Abies..但当涉及到DAL10基因。DAL10基因(ClMADS 39、40)c .生长状况在雌球果和雄球果中均有表达,雌球果中表达更高。这反映了不同物种的基因既有功能保守性,也有功能分化性。

AGL15高级副总裁基因充当花卉过渡的阻遏物答:芥5960),而在c .生长状况AGL15高级副总裁在男性和女性锥体中高度表达。这可能是一个有趣的研究问题,可能意味着中国冷杉中类似的抑制剂,限制了锥体的发展范围。

此外,我们鉴定了几种可能在女性锥发育中发挥重要作用的基因。我们检测到TM8在雌性锥体上全调节的基因,基本上没有用叶子表达。研究人员发现了大肠茅EGTM8在早期和晚期的花蕾[67].在番茄中,TM8可能对子房和果实的形成很重要[68].Gramzow等人[69)表明,TM8基因可以在许多裸子植物中发现,但很少的研究揭示了它在裸子植物的器官开发中的功能。考虑到胚珠和花粉c .生长状况收集时仍处于发育阶段,我们推测这些基因很可能影响胚珠发育,可以进一步研究。

基于我们的研究结果,我们倾向于同意Theißen等人提出的裸子植物球果发育的B(C)模型[5),其中A类和e类基因可能与球果发育无关。为了验证该模型的适用性c .生长状况,需要更多的实验来确认B(c)基因的功能,并排除其他基因(A,E-Class基因)的累积。以一般的方式,我们通过过表达和敲除该物种中的这种基因来研究基因功能。不幸的是,成熟的转基因系统c .生长状况尚未开发出来,并且在这种物种中进行转基因实验将具有额外的缺点,即木质植物的开花需要很长时间。因此,例如,应该考虑其他方法,例如,表达c .生长状况模式生物的b型基因拟南芥,从而研究这些基因的功能保存程度。但必须强调的是,基因功能研究最终将回归物种本身。然而,考虑到转基因裸子植物产生的困难和其漫长的代期,这些研究需要大量的时间和精力。

由于材料选择的限制,我们的结果仅限于一定发育时期的雌、雄球果差异基因。虽然通过我们的研究确实发现了一些值得注意的基因,但可能丢失了一些有关球果发育的信息,无法获得这些MADS-box基因参与整个发育过程。进一步的研究可以监测从球果起始到雌球果受精的整个发育过程,可能发现所有涉及的MADS-box基因,并进行更完整的解释。

结论

综上所述,我们对雌性和雄性锥体进行了RNA-Seq分析c .生长状况并分析了雌性和阳锥之间的基因表达差异。我们确定了47个mikc mads-box基因c .生长状况,并鉴定了一些与球果发育相关的MADS-box基因c .生长状况,可能符合前一个B(c)型裸子植物模型。我们还确定了可能在女性/男性锥形发育中发挥重要作用的额外基因。此外,我们提供了一个基因数据库,其显示了女性和雄性锥之间的差异表达,可以用作在未来发现未知的监管网络的基础。

数据和材料的可用性

本研究中产生或分析的所有数据均包含在文件和NCBI SRA数据库(登录号SRR10161401、SRR10161402、SRR10161403、SRR10161404)中,可通过联系通讯作者(chenjh@njfu.edu.cn).

缩写

FPKM:

每千碱基中的片段每百万次读取

RSEM:

期望最大化的rna测序

磨边机:

数字基因表达数据的实证分析。

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致谢

作者希望感谢编辑和审稿人提供的有用的评论和建议。

资金

该研究得到了江苏林业局(Lykj [2017] 42),江苏省重点研发计划,中国的自然科学基金(31770715),江苏省清兰工程,杰出教授项目(31770715)作者:王莹,江苏省高等教育机构与优先学术课程开发。这些融资机构没有在收集,分析,数据解释以及写作稿件中发挥任何作用。

作者信息

隶属关系

作者

贡献

D.D.w为此工作数据分析,实验表演和写作做出了贡献。J.H.C和JS.S设计了这项工作并提供了修改建议。z.d.h写了分析代码,并使用x.f.l,z.j.w和y提供了编辑建议.P提供了锥结构标识支持。r.h.z,x.y.z和d.q.y执行了实地工作和收集的样本。W.H.W帮助数据执行。x.y.h和g.b.w提供编辑建议。所有作者都读过并批准了稿件。

相应的作者

对应于金汇陈

道德声明

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

利益争夺

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。

附加信息

出版商的注意

《自然》杂志对已出版的地图和附属机构的管辖权主张保持中立。

补充信息

额外的文件1。

所有系统发育树参考序列。

附加文件2表S1。

测序数据的c .生长状况锥RNA-SEQ图书馆。各个文库由四个特定的RNA池产生,来自雌锥(F3和F4)的两个,来自阳锥(M3和M4)。表S2。关于所有样品的组装转录物和未成年人的概述。表S3。注释转录因子(TFS)概述。

附加文件3表S4。

全部c .生长状况MIKC型MADS-box基因。

附加文件4图S1。

所选MADS-BOX基因的对齐域保护域。m(a),i(b),k(b&c),c(d)毛箱蛋白的域V. Vinifera.C. japonica,p. abies,p. taedac .生长状况(不完全长度)

附加文件5表S5。

差分表达的mikc mads-box基因C.兰克拉塔。

附加文件6表S6。

用于QRT-PCR的引物列表。

权利和权限

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王,D.,Hao,Z.,Long,X.等等。转录组Cunninghamia lanceolata.雄性/雌性球果揭示了MIKC MADS-box基因与生殖器官发育的关系。BMC植物杂志20,508(2020)。https://doi.org/10.1186/s12870-020-02634-7

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关键词

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  • c .生长状况,转录组
  • MADS-box基因
  • 花卉的发展模式