复合材料的施用通过调控转录组减轻棉花叶片的生理盐水和碱性胁迫

背景

土壤盐碱化是影响农业生产力的主要因素。评价复合材料在田间土壤中的持久性是调控棉花对盐碱胁迫反应的重要组成部分。

结果

为研究复合材料对棉花盐胁迫和碱胁迫响应的分子效应，在盐渍化土壤(NaCl 8 g kg)中种植棉花⁻¹)和碱化土(Na₂有限公司_3.8 g kg⁻¹)，分析了棉花开花期和成铃期新叶的离子含量、生理特性和转录。结果表明，与盐胁迫相比，碱胁迫使钠含量增加⁺K⁺、SOD和MDA。复合材料的应用降低了Na的含量⁺但增加了K⁺/ Na⁺转录组分析表明，复合材料处理后，Na⁺/小时⁺棉花叶片中交换基因表达下调，而K⁺运输车,K⁺通道，POD基因上调。此外，苯丙氨酸生物合成途径中木质素合成相关基因的下调与叶片离子含量和生理特性密切相关。PCR定量分析证实了RNA测序结果的可靠性。

结论

这些结果表明，该复合材料通过调控关键生物学通路上的候选基因，减轻了棉花叶片的盐胁迫和碱胁迫，加深了我们对该复合材料调控棉花对盐胁迫和碱胁迫反应的分子机制的认识。

土壤盐碱化是限制作物生长和产量的主要环境因素[1]。盐碱化土壤和碱化土壤广泛分布在世界各地的干旱、半干旱地区。2，3.]，盐碱化土壤造成的胁迫直接影响植物细胞的离子平衡[4]，进而影响生理稳态[5，6]。许多研究表明，盐胁迫和碱胁迫是植物的两种不同类型的胁迫[7]，碱胁迫对植物的影响比盐胁迫更严重[8]。盐胁迫主要由中性盐引起，碱胁迫主要由碱性盐引起[9];盐胁迫一般会引起植物的离子损伤和渗透胁迫[10]，碱胁迫不仅会对植物造成上述损害，还会使植物的pH值升高[11]。前人研究发现外源物质的施用是调控作物对盐胁迫和碱胁迫反应的有效途径之一[12，13]。化学修饰可以通过替代Na来调节作物对盐胁迫和碱胁迫的反应⁺在土壤中施用无机盐(如钙、硫酸铝、硫酸亚铁等)或有机化合物(如木质素磺酸盐、聚丙烯酰胺等)，从而降低土壤盐分和碱度，促进植物生长，提高作物品质。龚，等。[12发现褪黑素调节酶活性和多胺的生物合成，提高植物对碱性胁迫的耐受性。Faghih，等。[13结果表明，在草莓叶片上喷施水杨酸和茉莉酸甲酯可以提高草莓在盐胁迫下的防御系统和抗氧化能力。因此，研究外源物质对植物盐胁迫和碱胁迫响应的影响具有重要意义。

棉(Gossypium是世界上最重要的经济作物之一陆地棉L.被广泛种植，其种植面积占全球种植面积的95%以上。棉花虽然耐盐，但其生长受到盐胁迫和碱胁迫的影响[14]。据报道，盐胁迫和碱胁迫影响棉花种子萌发、幼苗生长、根系生长、开花和铃数，造成产量损失[15，16，17]。面对全球棉花需求的不断增长，调节棉花盐胁迫和碱胁迫对棉花的损害的研究也越来越多。18]。已经发现了几个调节棉花对生理盐水和碱性胁迫反应的基因。例如，离子通道和转运体可以减轻Na⁺毒性和K值⁺/ Na⁺棉花中过表达NHX1或SOS1可提高耐盐性[j]。19]。GhSOS3和GhCBL10参与调节对盐胁迫和碱胁迫的反应，以及GhSOS3 / GhCBL10-SOS2网络也起着核心作用g .分子对盐胁迫和碱胁迫的响应[20.]。此外，过度表达的OSCU / Zn-SOD基因可提高活性氧解毒能力，提高耐盐能力[j]。21]。然而，以往的研究大多是通过盆栽试验或室内培养试验进行的，很少有通过田间试验进行的。田间试验使作物的生长非常接近其自然生长，能真实反映作物的生长规律。

本研究利用RNA-seq分析棉花叶片在盐胁迫和碱胁迫下的转录变化，阐明复合材料对提高棉花耐盐碱性的分子作用。我们分析了许多与植物抗氧化防御相关的基因⁺/ Na⁺比例转运和木质素生物合成，这些基因可能参与调控棉花对盐胁迫和碱胁迫的响应。本试验的主要目的是:(1)测定棉花对盐胁迫和碱胁迫的响应差异;(2)确定复合材料对K的影响差异⁺, Na⁺棉花叶片的生理特性;(3)了解复合材料调控棉花对盐胁迫和碱胁迫反应过程中的相关基因。

K⁺, Na⁺棉花叶片的生理特性

K⁺和钠⁺叶片中Na的含量₂有限公司_3.处理(CK-J和P-J处理)高于NaCl处理(CK-Y和P-Y处理)(图2)。1a). K⁺和钠⁺与对照组相比，CK-J处理提高了30.54% (p < 0.05)及21.20% (p < 0.05)，分别与CK-Y处理相比(图2)。1a)⁺/ Na⁺P-Y和P-J处理的比例增加(p < 0.05)和Na⁺含量降低(p > 0.05)，与对照(CK-Y和CK-J处理)比较。P-Y处理的K值无显著差异⁺内容;Na⁺含量降低(p > 0.05)和K⁺/ Na⁺比率增加(p > 0.05)，与CK-Y处理相比(图2)。1a) P-J处理的K值无显著差异⁺内容;Na⁺含量降低18.26% (p > 0.05)和K⁺/ Na⁺比率上升了37.11% (p < 0.05)与CK-J处理相比(图2)。1a)与此同时，K⁺和钠⁺内容和K⁺/ Na⁺P-J处理提高了35.14% (p < 0.05)， 14.11% (p > 0.05)， 18.27% (p < 0.05)，分别与P-Y处理相比(图2)。1一个)。

CK-J处理的SOD活性比CK-J处理的SOD活性高46.29% (p < 0.05)，而POD和CAT活性则下降4.09% (p < 0.05)及27.60% (p < 0.05)，分别与CK-Y处理相比(图2)。1b).与对照(CK-Y和CK-J处理)相比，P-Y和P-J处理的抗氧化酶活性有所增加(图2)。1b). P-Y处理的SOD、POD、CAT活性和REC分别提高了45.24%、44.71%、29.11%和24.02% (p < 0.05)， MDA含量与CK-Y组比较差异无统计学意义。P-J处理的POD和CAT活性提高了15.10% (p < 0.05)及22.66% (p > 0.05)，与CK-J处理相比，SOD活性和REC含量无显著差异(图2)。1b)。同时，P-J处理对SOD活性和REC无显著影响(p > 0.05)， POD和CAT活性降低23.72% (p < 0.05)及31.22% (p < 0.05)，与P-Y处理相比(图2)。1b)。

转录组反应概述

在Illumina配对端测序平台上对每个样本的转录组进行测序。生成的读取数从3900万到4800万不等，每个样本的平均读取数为4400万。这些reads被映射到棉花参考转录组中。作图比例为53.60 ~ 67.40%，平均值为64.11%。在基因水平上总结了定位reads的计数(附加文件)1表S1，附加文件2:图S1)。主成分分析(PCA)是基于基因计数(附加文件3.:图S2)。结果表明，NaCl和Na样品₂有限公司_3.处理后的样品在PC2维度上有明显的分离，而修饰后的样品和未修饰的样品在PC1维度上有明显的分离。为了验证RNA-seq数据的准确性，随机选择6个基因进行定量RT-PCR (qRT-PCR)分析。qRT-PCR和RNA-seq估计的表达丰度呈高度相关(R²= 0.80，附加文件4:图S3)，表明RNA-seq结果适合后续分析。

差异表达基因

为了确定对不同处理的转录反应的差异，差异表达基因(DEGs)通过样本的两两比较被鉴定出来。与CK-Y处理相比，CK-J处理有386个基因上调，275个基因下调(图2)。2a). Na共鉴定出1937和2365个deg₂有限公司_3.分别为CK-J和P-J处理和CK-Y和P-Y处理。2a).这些结果表明，与Na处理相比，NaCl处理改变了更多基因的表达模式₂有限公司_3.治疗方法。与CK-Y处理相比，P-Y处理有1424个基因上调，941个基因下调。与CK-J处理相比，P-J处理有1448个基因上调，489个基因下调(图2)。2a).与P-Y处理相比，P-J处理有1184个基因上调，373个基因下调。绘制维恩图来识别常见和特殊的deg。结果显示，4个处理共有7个差异表达基因(图2)。2b)。

富集分析

对响应复合材料鉴定的deg进行氧化石墨烯富集分析。NaCl处理(图2)3.a)， BP类中最富集的氧化石墨烯术语是金属离子转运(GO:0030001)、信号转导(GO:0035556)和蛋白质泛素化(GO:0016567)， CC类中富集的氧化石墨烯术语是细胞外区域(GO:0005576)、核小体(GO:0000786)和微管(GO:0005874)， MF类中富集的氧化石墨烯术语是铁离子结合(GO:0005506)、氧化还原酶活性(GO:0016705)和水解酶活性(GO:0004553)。对Na₂有限公司_3.治疗(图。3.b)， BP最富集的GO术语是金属DNA复制(GO:0006260)、基于微管的运动(GO:0007018)和金属离子运输(GO:0030001)， CC最富集的GO术语是核小体(GO:0000786)、MCM复合物(GO:0042555)和微管(GO:0005874)， MF最富集的GO术语是蛋白质异二聚化活性(GO:0046982)、铁离子结合(GO:0005506)和微管结合(GO:0008017)。对于控件(图2)。3.c)， BP最富集的氧化石墨烯术语是信号转传导(GO:0007165)、脂质代谢过程(GO:0006629)和细胞壁修饰(GO:0042545)， CC最富集的氧化石墨烯术语是细胞质(GO:0005737)、质膜的组成部分(GO:0005887)和外质体(GO:0048046)， MF最富集的氧化石墨烯术语是铁离子结合(GO:0005506)、氧化还原酶活性、作用于配对供体(GO:0016705)和序列特异性DNA结合(GO:0043565)。复合材料处理(图1)3.d)， BP最富集的GO术语是信号转传导(GO:0007165)、脂质代谢过程(GO:0006629)和金属离子运输(GO:0030001)， CC最富集的GO术语是细胞质(GO:0005737)、外质(GO:0048046)和细胞外区域(GO:0005576)， MF最富集的GO术语是序列特异性DNA结合(GO:0043565)、钙离子结合(GO:0005509)和铁离子结合(GO:0005506)。

为了进一步了解deg之间的分子相互作用，进行了KEGG富集分析。结果显示，在NaCl处理(CK-Y和P-Y处理)下，苯丙素类生物合成途径、百日咳途径和油菜素内酯生物合成途径显著丰富(附加文件)5:图S4A);系统性红斑狼疮和酒精中毒途径的Na显著富集₂有限公司_3.处理(CK-J和P-J处理5:图S4B);对照(CK-J和CK-Y处理)中苯丙类生物合成、甘油脂代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢以及戊糖和葡萄糖醛酸相互转化途径显著丰富(附加文件)5:图S4C);复合材料处理(P-J和P-Y处理)显著增加了苯丙类生物合成和α -亚麻酸代谢途径(附加文件)5:图S4D)。

棉花叶片中盐离子转运体的响应

转运体介导的棉花叶片盐离子平衡是调控棉花对复合材料盐胁迫和碱胁迫响应的重要组成部分。在NaCl处理(CK-Y和P-Y处理)中，K⁺转运体和K⁺通道基因受到复合材料的显著调控，4个通道基因表达量上调⁺鉴定出通道基因GH_A13G1568、GH_D01G0882、GH_D13G1517和GH_A01G0868。此外，一个K⁺转运体基因(GH_D08G2294)表达上调，钠/氢交换基因(GH_A09G0801)表达下调1）.对Na₂有限公司_3.处理(CK-J和P-J处理)，K相关基因的表达量⁺转运蛋白(GH_D05G2808)和K⁺通道(GH_A01G0868、GH_D01G0882、GH_D13G1517)发生显著变化，均上调(表2)1）.对于复合材料处理(P-J和P-Y处理)，1 K⁺通道基因GH_A05G1107下调(表2)1）.

棉花叶片抗氧化防御的调控

棉花叶片中许多deg在氧化还原酶活性方面显著富集。NaCl处理的8个过氧化物酶基因(GH_A06G1119、GH_D11G2319、GH_D10G1060、GH_A12G2651、GH_A05G0628、GH_D10G1977、GH_D06G1268和GH_A06G1247)上调，Na处理的3个过氧化物酶基因(GH_A05G4223、GH_A06G1247和GH_A05G0628)上调₂有限公司_3.治疗上调。复合材料处理的过氧化物酶基因GH_A05G1582下调，5个过氧化物酶基因GH_A03G1283、GH_D03G1634、GH_D04G0154、GH_D03G1633、GH_D08G2611上调。对照的一个过氧化物酶基因(GH_D05G1612)下调，一个过氧化物酶基因(GH_D10G1977)上调2）.

转录基因间相关性分析⁺, Na⁺，生理特征

转录基因间的相关系数(r)⁺, Na⁺，生理特性及显著性检验结果见图。4。GH_A09G0801与Na呈正相关⁺内容(p < 0.05）;GH_A13G1568、GH_D01G0882、GH_D13G1517、GH_A01G0868、GH_D05G2808与K呈正相关⁺/ Na⁺比(p < 0.05)(图。4a). GH_A06G1119、GH_D10G1060、GH_A12G2651、GH_D10G1977、GH_D06G1268、GH_A06G1247与SOD活性呈正相关(p < 0.05）;GH_A06G1119 (p < 0.05)， gh_d10g1060 (p < 0.01)，以及GH_A05G1582 (p < 0.01)与POD活性正相关;GH_D10G1060 (p < 0.05)及GH_A05G1582 (p < 0.01)与CAT活性正相关;GH_A03G1283和GH_D03G1634与MDA含量呈正相关(p < 0.01）;GH_A12G2651 (p < 0.05)， gh_d10g1977 (p < 0.05)， gh_a06g1119 (p < 0.01)， gh_d10g1060 (p < 0.01)，以及GH_A05G1582 (p < 0.01)与REC呈正相关(图2)。4b)。

参与苯丙类生物合成途径的deg

参与类苯丙烷生物合成的基因的表达(https://www.kegg.jp/dbget-bin/www_bget?map00940)对复合材料施用对棉花叶片的响应进行了分析(图2)。5）.生理盐水治疗,度参与beta-glucosidase (EC: 3.2.1.21)、松柏醇葡糖基转移酶(EC: 2.4.1.111)和coniferyl-aldehyde脱氢酶(EC: 1.2.1.68)上调,而度参与东莨菪亭葡糖基转移酶(EC: 2.4.1.128),咖啡酸3-O-methyltransferase (EC: 2.1.1.68) ferulate-5-hydroxylase (EC: 1.14.”),4-coumarate——辅酶a连接酶(EC: 6.2.1.12) shikimate O-hydroxycinnamoyl转移酶(EC: 2.3.1.133),肉桂醇脱氢酶(EC: 1.1.1.195),和过氧化物酶(EC:1.11.1.7)下调(图2)。5a).对于Na₂有限公司_3.处理后，与阿魏酸-5-羟化酶(EC:1.14.-.-)相关的deg上调，而与莽草酸o -羟基肉桂酰转移酶(EC:2.3.1.133)和过氧化物酶(EC:1.11.1.7)相关的deg下调(图2)。5b).对于对照组，涉及苯丙氨酸解氨酶(EC:4.3.1.24)、东scopetin葡萄糖基转移酶(EC:2.4.1.128)和4-香豆酸酯-辅酶a连接酶(EC:6.2.1.12)的deg上调，而涉及莽草酸o -羟基肉桂基转移酶(EC:2.3.1.133)、阿魏酸-5-羟化酶(EC:1.14.-.-)、松木醛脱氢酶(EC:1.2.1.68)和过氧化物酶(EC:1.11.1.7)的deg下调(图2)。5c).复合材料处理下，苯丙氨酸解氨酶(EC:4.3.1.24)、阿铁酰辅酶a 6-羟化酶(EC:1.14.11.61)、东莨菪碱葡萄糖基转移酶(EC:2.4.1.128)、咖啡酸3- o -甲基转移酶(EC:2.1.1.68)、4-香豆酸—辅酶a连接酶(EC:6.2.1.12)、莽草酸o -羟基肉桂基转移酶(EC:2.3.1.133)和咖啡酸3- o -甲基转移酶(EC:2.1.1.68)所涉及的DEGs均上调;而参与阿魏酸-5-羟化酶(EC:1.14.-.-)和过氧化物酶(EC:1.11.1.7)的deg则下调(图2)。5d)。

在盐胁迫和碱胁迫下，Na过量⁺会在植物叶片中积累，抑制K⁺引起K⁺和钠⁺植物细胞中的离子失衡[22]。然而，盐胁迫和碱胁迫下的离子平衡规律不同。王，等。[9表明Na⁺盆栽试验中，碱胁迫下含量高于盐胁迫。在这项研究中，Na⁺和K⁺碱胁迫下棉花叶片中钾离子含量显著高于盐胁迫，钾离子含量差异不显著⁺/ Na⁺比率。为了调节棉花对盐胁迫和碱胁迫的反应，采用复合材料进行田间试验。张，等。[23发现Na⁺/小时⁺通过水培培养，芝麻地上部交换4在盐水胁迫下表达上调。赵，等。[24发现17 Na⁺/小时⁺菊花根部反转运蛋白对盐胁迫的响应。牛，等。[25]发现盐度显著降低Na的表达⁺/小时⁺叶脉中的交换器4。在本研究中，对于复合材料处理，Na⁺含量降低;这可能是因为Na的应激信号⁺可以被Na ?的下调迅速抑制⁺/小时⁺复合材料施用于盐渍化土壤时，交换3基因。此外,钠⁺/小时⁺交换剂减少了Na的积累⁺通过固定Na⁺将其储存在液泡中[26，27]。黄，等。[28]发现大麦地上部钾通道KAT1在盐胁迫下下调。本研究在盐胁迫和碱胁迫下，K⁺含量和K⁺/ Na⁺复合材料处理比例增加;这可能是因为复合材料的应用增加了棉花叶片中编码K转运体和K通道的某些基因的转录水平。特别是在盐胁迫下，双孔K的几个基因⁺通道1和通道K⁺生理盐水处理的转运蛋白1上调，K⁺转运蛋白2和双孔K⁺碱性处理的通道1也上调。其中，GH_A13G1568、GH_D01G0882、GH_D13G1517、GH_A01G0868和GH_D05G2808基因的上调对K值有正向影响⁺/ Na⁺表明复合材料可以通过调节叶片离子平衡来缓解盐胁迫和碱胁迫。此外，a K⁺通道SKOR基因因Na而下调₂有限公司_3.与NaCl处理相比，表明复合材料的施用对钾的恢复效果更好⁺盐胁迫下棉花含量。

K的差异⁺和钠⁺NaCl处理与Na处理之间的差异₂有限公司_3.根据棉花所受生理损害的不同，采取不同的处理措施。本研究发现，碱胁迫对棉花叶片的生理损害大于盐胁迫。龚，等。[12]发现外源物质的应用可以促进抗氧化系统清除多余的自由基，调节生理损伤。在本研究中，我们还发现复合材料的应用可以调节棉花遭受的生理伤害。盐胁迫和碱胁迫对抗氧化酶的调节作用相同，但作用程度不同。例如，无论在盐胁迫还是碱胁迫下，复合材料均能提高棉花叶片SOD、POD和CAT活性。这可能是因为大量的deg与CK-Y、P-Y、CK-J和P-J处理的氧化还原酶活性有关。NaCl处理共调控氧化还原酶活性51℃，Na处理共调控氧化还原酶活性29℃₂有限公司_3.治疗是有规范的;此外，复合材料激活了盐胁迫和碱胁迫下的氧化应激反应。其中，复合材料显著提高了盐胁迫下SOD和CAT的活性。这可能是因为GH_A06G1119、GH_A12G2651、GH_D06G1268和GH_A06G1247上调SOD活性，而GH_D10G1060上调CAT活性;但在碱胁迫下，复合材料并没有显著提高SOD和CAT的活性，说明复合材料对碱胁迫下的SOD和CAT活性影响较小，SOD活性可能对棉花的耐盐性和耐碱性没有作用[j]。29]。研究表明，POD是植物在盐胁迫和碱胁迫下的主要解毒酶[30.]。本研究发现，该复合材料显著提高了盐胁迫和碱胁迫下棉花叶片POD活性。这可能是因为施用复合材料后，CK-Y、P-Y、CK-J和P-J处理的过氧化物酶相关基因表达量上调，抗氧化酶基因表达量也上调，导致棉花对盐胁迫和碱胁迫的耐受性提高;此外，盐胁迫下复合材料的施用上调了大量抗氧化酶基因的表达。罗，等。[31表明SOD1和CAT1基因参与了棉花对盐水胁迫的反应。耿，等。[32发现POD7和SOD (Cu-Zn)甜菜耐盐品种的基因显著上调。然而，在我们的研究中，复合材料的应用只显著调节PODA2/50/5/46/29/12 / P7在棉花叶里。这可能是因为田间土壤的渗透性增强了棉花的根系活力，促进了棉花的耐受性，因此只有过氧化物酶相关基因参与了棉花对盐胁迫和碱胁迫的响应。我们还注意到，在盐胁迫和碱胁迫下，叶片的REC和MDA受到影响。盐胁迫和碱胁迫下的REC差异不显著，但MDA含量在碱胁迫下明显高于盐胁迫。崔，等。[33结果表明，盐胁迫下花生叶片RCE升高。龚，等。[12]发现叶片丙二醛含量马吕斯hupehensisRehd。在碱性胁迫下，褪黑素降低了。本研究发现，在盐胁迫和碱胁迫下，施用复合材料可提高棉花叶片REC含量。其中，盐胁迫下只有棉花REC增加显著。这可能是因为GH_A06G1119、GH_D10G1060、GH_A12G2651和GH_D10G1977上调了REC含量，表明复合材料降低了盐胁迫和碱胁迫对细胞膜稳定性和完整性的影响。此外，盐胁迫下复合材料对棉花细胞膜的影响比碱胁迫下更显著。

木质素生物合成基因在不同水平上受到动态调控，以保护植物细胞代谢免受氧化损伤[34]。在转录数据中，通过KEGG和GO富集分析对DEGs进行功能分析，发现大量基因参与了苯丙类生物合成途径。苯丙素生物合成途径是植物中最重要的次生代谢途径之一，与植物对盐胁迫和碱胁迫的反应有关[j]。35]。该途径产生的木质素代谢产物对植物抵抗非生物胁迫具有重要意义[35，36]。此外，四种木质素(对羟基苯基木质素、愈创木酰木质素、5-羟基愈创木酰木质素和紫丁香基木质素)被四种单体(对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇和新树醇)聚集，四种醇被过氧化物酶催化(EC: 1.11.1.7)形成这些木质素(图1)。5）.沈，等。[37发现了7个与木质素生物合成有关的基因拟南芥在生理盐水胁迫下上调。结果表明，与CK-Y处理相比，P-Y处理的4CL、HCT、COMT、TOGT1、F5H、CAD、POD等酶均下调，表明这些酶可能在减少木质素合成和保护棉花免受复合材料盐胁迫损害方面发挥了作用。此外，已有研究发现4CL酶改变木质素的积累[38]， HCT酶修饰H木质素(对羟基苯基木质素)[39]， COMT酶参与S木质素(丁香基木质素)的生物合成[40]， F5H酶调节S/G木质素(丁香基(S)/愈创木酰基(G)木质素)的组成[41]， CAD酶改变木质素的含量和结构[42]， POD酶参与木质素生物合成，影响植物生长[43]。在本研究中，与CK-J处理相比，P-J处理下HCT和POD酶的表达水平下调，表明5- o -咖啡酰莽草酸和咖啡酰奎宁酸不能转化为咖啡酰辅酶a。然而，咖啡酰辅酶a是木质素生物合成的重要中间体[44]。综上所述，在盐胁迫和碱胁迫下，复合材料的施用均下调过氧化物酶(EC: 1.11.1.7)，这可能是由于复合材料降低了盐胁迫和碱胁迫下木质素的生物合成。

田间试验结果表明，盐胁迫和碱胁迫是两种不同的胁迫。生理盐水胁迫下，钠含量⁺棉花叶片中MDA含量较高，POD和CAT活性较低，且碱胁迫的影响大于盐胁迫。复合材料的施用主要是为了提高棉花K值⁺/ Na⁺比值和POD活性提高棉花耐盐碱性。通过转录组分析，进一步发现K⁺复合材料在调节棉花对盐胁迫和碱胁迫的响应过程中，转运蛋白基因和过氧化物酶相关基因表达上调;参与木质素生物合成的酶被下调，保护棉花免受盐胁迫和碱胁迫的伤害(图2)。6）.其中，在复合材料调控棉花对盐胁迫的响应过程中，这些上调基因和下调酶在棉花叶片中大量存在。此外，田间试验获得的这些差异表达基因具有较高的稳定性，可用于今后的田间育种。

实验地点

棉花(新陆早62)种子来自新疆石河子市棉花作物研究所。本试验在中国新疆省石河子市葡萄研究所试验站(44°20 ' N, 86°03 ' E)进行，土壤为荒漠灰土。土壤基本特征见表3.。

实验材料与实验设计

本实验于2018年4月20日至9月20日进行。以新陆早62号棉花和一种复合材料为试验材料。复合材料为木质素磺酸钙、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铁、硼酸、阴离子聚丙烯酰胺、聚乙烯醇(质量比:4:4:4:4:2:1:0 .5:0.5)的混合物。

本试验采用随机区组设计。共4个处理，每个处理3个重复:(1)P-Y处理(复合材料300 kg hm)⁻²NaCl 8 g kg⁻¹(2) P-J处理(复合材料300kg hm⁻²， Na₂有限公司_3.8克公斤⁻¹(3) CK-Y处理(不施用复合材料，NaCl浓度为8 g kg⁻¹(4) CK-J处理(不施用复合材料，Na₂有限公司_3.8克公斤⁻¹与耕层充分混合)。2018年4月20日，将土壤放入塑料桶(直径0.5 m，高度0.6 m)中，保持土层状态，然后将桶埋回田间。然后是NaCl和Na₂有限公司_3.被应用。盐渍化土壤的pH和EC分别为8.24和1.84 s m⁻¹碱化土壤为9.78和1.03 s m⁻¹,分别。4月29日，所有治疗，0.2克公斤⁻²尿素和0.4 g kg⁻²合成肥料(为滴灌而配制);N: 0.07 g kg⁻²;P: 0.07 g kg⁻²;K: 0.07 g kg⁻²)。5月4日，播种棉花;羽化后，每桶保留6株幼苗。5月6日，用水稀释后应用复合材料。滴灌土壤同时施用肥料和复合材料。6月25日第一次灌水。灌溉周期为3 d。在开花和成铃期(8月19日)采集新叶进行转录组测序(每个处理3个重复)。所有样品立即置于液氮中，保存在- 80°C，待使用。

植物生理分析

用分光光度法测定叶片(0.5 g)中抗氧化酶的活性[46，47，48]。采用NBT光化学还原法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性(560 nm) [46]。根据愈创木酚引起的吸光度测定过氧化物酶(POD)活性(470 nm) [47]。以磷酸钾缓冲液与H反应为基础，测定过氧化氢酶(CAT)活性(240 nm)₂O₂(48]。

丙二醛(MDA)以叶样品中硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)含量(nmol/g;消光系数:155 mM cm⁻¹) ［49]。相对电导率(REC) [50]，将0.1 g新鲜叶片切成1 cm的薄片，放入10 mL去离子水中，在室温下在旋转摇床上摇24 h (QL200H, Shanghai, China)。然后，使用电导率计(EM38, ICT international, Armidale, NSW, Australia)测量溶液(L1)的电导率。将溶液煮沸15分钟后冷却至室温，再次测量电导率(L2)。最后计算REC (REC = L1/L2)。

Na⁺和K⁺叶片样品的含量测定方法为45]。叶片样品浸泡在98%的H中₂所以₄30% H₂O₂采用火焰分光光度计(AP1200型，中国上海)测定。

转录组测序和数据分析

本研究提取了12个样本的总RNA [51]，总RNA中的PolyA mRNA被Oligo (dT)磁珠富集，RNA被离子中断约300 bp的长度。以6个碱基随机引物和逆转录酶为模板合成第一链cDNA，以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA。文库构建完成后，对文库片段进行PCR扩增富集，然后根据片段大小(450bp)选择文库。然后使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies, Palo Alto, california)检测文库的总浓度和有效浓度。然后，根据库的有效集中度和库所需的数据量，将包含不同索引序列的库按比例混合。经RNA提取、纯化和文库构建后，采用基于Illumina测序平台的下一代测序(NGS)进行测序[51]。RNA文库建设由上海个人生物信息有限公司负责。http://www.personalbio.cn/）.

使用FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）.使用Fastp去除读段中的适配器和低质量序列[52]。棉花基因组序列(陆地棉,ZJU)下载自Hu等。[53]并用作参考基因组(https://www.cottongen.org/species/Gossypium_hirsutum/ZJU-AD1_v2.1）.使用Salmon[]将clean reads准映射到所有带注释的转录本上。54]。在基因水平上计算每百万转录本单位(TPM)的表达丰度。采用DESeq2对调整阈值的样本间差异表达基因(DEGs)进行鉴定p-值小于1且log2(折次变化)绝对值大于1 [55]。基于前1000个基因的数量，采用主成分分析(PCA)显示样本间的转录组相似性。基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析使用clusterProfiler [56]。通路分析采用KEGG作图方法。根据途径数据库中的EC分布，将Unigene序列映射到KEGG生化途径[57，58]。

实时定量PCR验证

为了验证RNA-seq数据，从途径富集分析中选择6个deg进行qRT-PCR分析。将RNA-Seq样本反转录为cDNA，使用PrimeScript™第一站cDNA合成试剂盒和SYBR Green Master Mixes (Vazyme Biotech，南京，中国)进行实时qPCR验证。在TIB8600荧光定量系统(Taipu, Biotech, China Xiamen)上进行qRT-PCR。每个样品用3个生物重复和3个技术重复进行测定，用2^-⊿⊿Ct方法。内源性内参基因为GhEF1α。基因特异性引物列于表S2(附加文件)1）.

统计分析

对K进行单因素方差分析(ANOVA)⁺和钠⁺棉花叶片的含量和生理特性(邓肯试验);P< 0.05, SPSS 22.0)。以上分析均在R软件(版本3.2.3，http://www.r-project.org)，使用Vegan和Origin 8.0软件。

原始RNA-seq数据来自NCBI Sequence Read Archive (SRA)数据库，登录号为PRJNA660498 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA660498）.本研究过程中产生或分析的所有数据均可根据通讯作者的合理要求提供。

SOD:

超氧化物歧化酶

圆荚体:

过氧化物酶

猫:

过氧化氢酶

MDA:

丙二醛

矩形:

相对电导率

走:

基因本体论

KEGG:

京都基因与基因组百科全书

度:

差异表达基因(DEGs)

不适用。

国家重点研发计划项目(2016YFC0501406);新疆生产建设兵团重大科技项目(2018AA005)，石河子大学项目(GJHZ201802)。资助者在实验设计、数据收集和分析或撰写手稿方面没有任何作用。

作者指出

1. 安孟杰和王晓丽对这项工作也有同样的贡献。

从属关系

1. 石河子大学农学院，新疆石河子832000

   安梦洁，王晓丽，常豆豆，王帅，洪大双，范华，王开勇

贡献

MJA, XLW和KYW构思和设计实验;MJA和XLW进行实验和数据分析;DDC、SW、DSH协助实验;MJA写了手稿;KYW和HF对稿件进行了修改。所有作者都阅读并认可了稿件。

相应的作者

对应到Kaiyong王。

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

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