百合‘薇薇安’不同花瓣组织色素积累的综合代谢谱和转录组分析

背景

花瓣是许多观赏植物色彩斑斓的区域。花瓣颜色的品质性状直接影响观赏植物的价值。虽然许多植物的花色调控机制已被广泛研究，但百合花色的调控机制仍值得进一步探索。

结果

本研究从组织结构、代谢物生物合成和基因表达等方面分析了百合品种‘Vivian’花瓣不同区域的色素沉着调控网络。我们发现，未着色区花瓣的细胞形态与着色区花瓣的细胞形态不同。未着色区细胞形态趋于扁平，颜色较浅。此外，代谢组学分析发现花青素在色素区含量较高，特别是花青素衍生物。然而，与花青素相比，黄酮在百合花瓣未着色区域积累。为了了解这些不同代谢物与百合花色的关系，我们利用RNA-Seq分析了差异表达基因的代谢物生物合成。在这些基因中，与花青素衍生物生物合成相关的几个基因的表达水平在色素区和非色素区有显著差异，如LvMYB5, LvMYB7, LvF3'H, LvDFR, LvANS和Lv3GT。

结论

这些数据将有助于我们进一步了解百合花瓣色素沉着的调控网络，并创造出不同的独特颜色物种。

在观赏植物中，花瓣是最主要的特征，花色的好坏直接影响到植物的审美价值和商业价值。在植物中，各种各样的色素沉着模式，如条纹或斑点，通常是基因表达空间调控的结果。例如，抗鼻兰和蝴蝶兰的条纹和斑点的形成与MYB［1，2]。在天然双色花表型中，矮牵牛成熟CHS在白色组织中未发现mrna。这表明双色花表型是由两者的转录后沉默的空间调控引起的CHS-A［3.]。在之前的研究中，研究人员研究了百合花瓣中斑点和条纹的色素沉着模式。有人建议LhMYB12调节花青素斑点和条纹的形成[4，5]。在本研究中，我们希望阐明百合花瓣的另一种色素沉着模式，即顶部有色素沉着，基部无色素沉着。

有色化合物在不同区域的分布和积累也可能与组织结构的变化有关[1，6]。从细胞学的角度来看，花青素分布的花瓣表皮细胞不仅在结构上保护花瓣，而且对花色的形成也有很大的影响。光线照射在花瓣上，一部分进入表皮，被花瓣吸收并转化为能量。另一部分被花瓣的不同结构和组织反射回来，并通过色素层产生颜色[7]。因此，不同表皮细胞结构的花瓣，入射光和反射光的比例不同，从而影响花朵的颜色。

研究发现，花瓣的表皮细胞有不同的形状，通常是尖的、圆锥形的或扁平的[8]。这项研究报春花科花青素主要存在于花的表皮细胞中，多数表皮细胞呈圆弧形和尖尖圆锥形。9]。此外，还对黄芪色素分布和表皮细胞形态进行了研究石斛兰物种发现有四种类型的表皮细胞形状确定在石斛兰花:平，圆顶，细长的圆顶和具乳突。植物表皮细胞形状对视觉感知的影响[10]。

此外，植物色素是决定花朵颜色的最重要因素。黄酮类和类胡萝卜素等天然产物色素积累的差异被认为是花色素沉着的主要基础。这些色素的种类和含量是造成花瓣颜色不同的直接原因[11]。花青素的积累通常发生在百合的发育过程中[12]。在高等植物中，花青素(砖红色)、花青素(从红色到粉红色)和飞燕素(从蓝色到紫色)是最常见的花青素，都是类黄酮代谢途径中的次级代谢产物[13]。

类黄酮的生物合成和花青素的生理研究受到了广泛的关注。黄酮类化合物的生物合成来源于苯丙素途径，涉及多种生物合成途径和调控基因。类黄酮生物合成的催化酶基因包括CHS(查耳酮合酶),气(查耳酮异构酶),F3'H(黄酮3′羟化酶);F3’5是什么(黄酮3 ' 5 '羟化酶)，FLS的(黄酮醇合成酶)DFR(dihydroflavonol 4-reductase),答(花青素合成酶)，和UFGT(类黄酮葡萄糖基转移酶)。这些基因协同调节花青素的合成[14，15]。R2R3-MYB［16，17，18]，bHLH(基本螺旋-环-螺旋)[19),而WD40(WD40重复蛋白)[20.]是调节花青素合成的主要转录因子[21]。大量的工作已经证明了这些调控基因的功能。例如，r2r3 - myb在亚群4,5,6和7拟南芥在类黄酮生物合成途径中参与花青素和原花青素的合成和调控[22]，而亚群3中的bHLHs则作为TFs参与调节类黄酮生物合成途径[23，24]。因此，花瓣颜色的形成受到多种因素的影响，包括花瓣的组织结构、次生代谢产物、基因表达调控等。

百合品种具有可变的特征。例如，亚洲杂交百合花颜色丰富，但缺乏香味，而东方杂交百合花大而漂亮，芳香香味浓郁，但颜色相对简单。因此，培育出花色丰富、花香馥郁的百合是花卉育种的目标之一。此外，百合花瓣上的斑点、条纹和色素积累不均匀可以用来形成多样的百合品种。这些形成机制在观赏植物的研究中也引起了广泛的关注。此外，百合花色调控基因的研究表明LhMYB12促进整个花瓣的颜色[25，26];LhMYB12-lat决定卵巢花青素的形成[27];LrMYB15调节花青素在芽中的色素沉着百合［28];和LhMYB18参与大花青素斑点的形成[29]。百合品种“薇薇安”是一种东方杂交百合，香气浓郁，颜色鲜艳，深受消费者的喜爱。在‘薇薇安’的开花阶段，花瓣的顶部和底部区域有不同的颜色。花瓣的顶部是深粉红色，而花瓣的底部是无色素的白色(图1)。1）.

本研究以百合品种“薇薇安”为研究对象，研究了百合花发育过程中不同花瓣区域的色素沉着调控网络。由于百合花瓣不同区域的色素沉着程度不同，我们推测两色区在花瓣细胞形态、花青素代谢产物和色素沉着基因表达水平上存在差异。为此，采用扫描电镜(SEM)技术，对百合品种‘薇薇安’、‘桌舞’和‘科瓦拉’盛开时期不同区域的百合花瓣进行扫描电镜观察，观察不同区域的表皮细胞形态及其与颜色的相关性。接下来，我们将‘Vivian’的花瓣分为上色素区和下未色素区两部分，然后进行高分辨率lc - ms代谢组学分析，分析不同区域花青素生物合成代谢物的积累情况。然后，我们使用相同的样品类型进行RNA-seq，这使我们能够通过大约40天的采样来表征花瓣区域之间以及出现和发育花之间数百个基因的差异表达。从分子水平上筛选与花瓣色素沉着有关的功能基因。

百合花瓣不同颜色区表皮细胞的形态差异

在百合品种' Corvara '(图。2a)“桌舞”(图2)2b)和“Vivian”(图2)。2C)，花瓣呈现出从有色素到无色素的颜色梯度。采用扫描电子显微镜(SEM)对百合花期花瓣不同区域的细胞形态进行观察，以确定表皮细胞对花瓣颜色的影响。我们发现花瓣的细胞形态在色素区和非色素区是不同的。“小红花”花瓣色素区表皮细胞形态呈镶嵌状、凹凸状，未色素区表皮细胞形态呈镶嵌状、平坦状(图2)。2a, d)。“桌舞”花瓣色素区表皮细胞形态不规则，呈凸状，而未色素区表皮细胞形态不规则，呈扁平状(图2)。2b, d)。“维维安”花瓣色素区表皮细胞的形态(顶部和边缘)为圆锥形和凸起，在中心交界处为菱形和平坦，在基部未色素区为平坦(图2)。2c, d)。百合栽培品种' Vestaro '的白色花瓣表皮细胞的形态是扁平的(附加文件1:图S1)。

采用LC-MS分析了百合品种‘薇薇安’次生代谢产物的变化。

除了表皮细胞结构对表观遗传性状的影响外，我们还想确定每个地区积累的花色素类型的差异。以百合品种“薇薇安”为例，我们使用LC-MS分析了三种样品类型中积累的代谢物:芽期花瓣样品(S1)，在芽形成后20天从内花瓣顶部向下1-2 cm的区域;花期花瓣，将花期花瓣样本分为两部分:花期芽形成后40天内花瓣顶部向下2-3 cm的区域(S3)，以及从基部向上1 cm的区域(X)。每个样本都有来自不同三年生植物的3个重复。LC-MS共检测到652个不同的离子峰。

随后对色素化花瓣样品(S3)和未色素化花瓣样品(X)中积累的代谢物进行分析，根据PLS-DA模型和a的VIP > 1阈值，鉴定出204种代谢物的积累存在显著差异P学生的显著性阈值< 0.05t-测试分析(FDR校正后)。KEGG分析显示，X与S3中代谢物差异积累的显著富集途径是类黄酮生物合成(附加文件)2:图S2)。我们选取了这条通路上的23种差异积累代谢物进行分析，包括香豆素、羟基肉桂酰衍生物、黄酮、黄酮醇和花青素代谢物(表1)1）.

我们还对黄酮类化合物的生物合成途径进行了综合分析(图2)。3.a)和差异代谢物(表1）.肉桂酸、对香豆酸和香豆酰辅酶a酸是类黄酮生物合成途径的开端。我们发现，对香豆酸在着色花瓣(S3)中的含量显著高于未着色花瓣(X)，对香豆酸底物可催化生成香豆酰辅酶a和咖啡酸，但在花瓣的不同区域，这两种物质的含量无显著差异。以柚皮素查尔酮和柚皮素为催化剂，制备黄酮和黄酮醇原料。双氢槲皮素(Dihydroquercetin, DHQ)属于黄酮醇类，是合成花青素必需的底物，S3中DHQ的含量高于X。衍生物花青素、花青素3- o -葡萄糖苷(kuromanin)和花青素3- o - rutino苷(keracyanin)在S3中分别比X上调了9.8倍、7.7倍和77倍。同时，与X相比，S3中发现了几种下调的代谢物，包括橙皮苷黄酮、同碘二醇(下调1.94E)⁻⁰⁶-和7.76E⁻⁰⁶与S3相比，X组下调了0.214倍，而X组下调了0.214倍。

结果表明，同一片花瓣中橙皮苷和异戊二醇含量在未着色区(X)显著高于着色区(S3)。未着色区(X)的花青素衍生物含量显著低于着色区(S3)。虽然X中的飞燕草苷含量较高，但X与S3中的飞燕草苷-3-葡聚糖含量差异不显著。总体而言，在花青素合成途径代谢产物的测定中，“薇薇安”中花青素的主要成分是花青素衍生物。

我们还分析了S1和S3中积累的代谢物，根据上述相同的标准，鉴定出179种代谢物积累有显著差异。KEGG分析显示，黄酮类和黄酮醇类代谢物的生物合成途径显著富集3.:图S3)。共有23种代谢物差异积累(表2)2)进行筛选分析。作为初始底物，我们发现S1中‘Vivian’的肉桂酸和对香豆酸含量高于S3，而S1中的橙皮苷含量也高于S3。S3中花青素3- o -葡萄糖苷、花青素3- o -芦丁苷和花青素的含量均高于S1(表1)2）.综上所述，LC-MS分析表明，随着肉桂酸、对香豆酸和橙皮苷含量在早期降低，其他类黄酮和花青素的产物在花色素沉着过程中不断积累。

在本研究中，百合花瓣的代谢产物(附加文件)8使用广泛靶向代谢组学方法检测不同区域或阶段的患者。在百合品种“薇薇”的花瓣中检测到多种花青素。有6种花青素可以被注释到KEGG途径中，包括花青素3- o -葡萄糖苷、飞鸽苷、飞鸽苷3- o -葡萄糖苷、花青素3- o -芦丁苷、牵牛花苷3- o -葡萄糖苷、花青素。根据差异代谢物分析(图2)。3.b)发现牵牛花苷3- o -葡萄糖苷和飞燕草苷3- o -葡萄糖苷在S1、S3和x样品中差异不显著，其中飞燕草苷在S3样品中含量最低，而在x样品中含量上调，说明飞燕草苷和牵牛花苷不是影响花瓣显色的主要代谢物。而花青素衍生物在不同样品中差异显著，代谢物含量变化趋势与花青素积累量呈正相关。不出所料，“薇薇安”的主要色素物质是花青素衍生物。

采用RNA-seq技术对百合色素沉着相关功能基因进行筛选

转录组分析:单基因的功能注释和分类

类黄酮生物合成途径中代谢物的差异积累通常是由于相关基因的差异表达所致。为了筛选与颜色形成相关的基因，我们对四种百合花瓣样本进行了转录组测序。其中三个样本S1、S3和X与代谢组样本相同。在花蕾形成30天后，我们添加了第四个样品，即着色芽花瓣样品(S2)，在着色芽阶段的内花瓣顶部向下2-3 cm的区域。每个样品有3个来自不同三年生植物的重复。

Illumina Hiseq测序从库中生成的干净数据(附加文件)9表2)。共组装了125,535个unigenes，平均长度为563 bp (N50长度为896 bp)10表S3)。基于5个数据库对基因功能进行了注释(附加文件)11:表S4)。这些结果表明，百合品种“薇薇安”花瓣的RNA-Seq数据可用于本研究。

GO分析显示，15520个unigenes可被富集，可分为生物过程、细胞成分、分子功能三类。在分子功能上，结合基团(7686 Unigene, 49.5%)最大，催化活性基团(6895 Unigene, 44.4%)次之。细胞过程(7449 Unigene, 48.0%)和代谢过程(7406 Unigene, 47.7%)是生物过程中最大的两个类别4:图S4)。

开花发育中的差异表达基因

为了寻找与花发育过程中类黄酮生物合成相关的功能基因，我们分析了S1(芽花瓣)、S2(着色芽花瓣)和S3(着色花瓣)样品。三种样品均采自不同发育阶段花瓣无叶脉的区域。利用|log2FoldChange| > 1对不同花发育阶段的差异表达基因(DEGs)进行统计分析;P值< 0.05。S1和S3分别有4622个deg，其中上调基因2455个，下调基因2167个;S2和S3分别有3636个和1445个基因上调和下调;S1和S2分别有1139个上调基因和1462个下调基因，分别为2601个DEGs5:图S5a)。

KEGG分析表明，显著富集的deg通路与植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢有关(附加文件)5:图5b-d)。百合花瓣的着色过程也是花从芽到成熟的发育过程。已有研究表明，植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢与植物生长发育密切相关[30.，31，32]。因此，它可能在百合的花朵发育中起着类似的作用。

类黄酮和花青素生物合成相关功能基因

从花蕾期(S1)到着色期(S2)或花瓣着色期(S3)的差异表达基因(DEGs)来看，在花瓣着色过程中，有559个基因(DEGs)表达上调(图2)。4a)和858度下调(图2)。4b). LC-MS结果显示，百合花瓣不同区域的不同代谢物在黄酮类化合物生物合成途径上存在显著差异，这与花的色素沉着有关。为了分析百合花色的调控网络，从上调和下调的deg中筛选出与类黄酮生物合成相关的基因进行分析。

我们发现早期结构基因的表达水平LvPAL(TRINITY_DN103692_c2_g1)和LvC4H(TRINITY_DN98512_c5_g1)在花发育过程中从S1(芽期)到S3(花期)下调(图2)。5a).肉桂酸和对香豆酸的结果一致(表2)2）.的FPKMLvCHI在所有三个阶段都相对较高(平均FPKM大于1000)，但LvCHS在三个阶段无显著差异。因此，早期结构基因的高表达促进了酶的编码以催化底物，为花青素的形成提供了更多的类黄酮和黄酮醇底物。

晚期调控基因》(TRINITY_DN96206_c2_g6 283.8倍),LvF3'H(TRINITY_DN101310_c2_g1, 226.4 -fold)，LvDFR(TRINITY_DN97466_c0_g1, 79.8 -fold)，和Lv3GT(TRINITY_DN101276_c1_g1, 32倍)在S2中表达上调。的基因LvANS, LvF3'H, LvDFR,Lv3GT与S1相比，S3中表达量分别上调99倍、88倍、32倍和6倍，表达水平差异显著(图2)。5a).所有这些基因都可能在花发育过程中决定色素沉着。

总之，的表达LvANS, LvF3'H, LvDFR和Lv3GT与花发育过程中花青素的形成和积累趋势一致。这些基因在S2和S3的表达量显著高，在S1和x的表达量显著低，这种模式可能协同促进了‘薇薇安’花瓣花青素的合成和积累。

转录因子在类黄酮生物合成途径中具有协同调控基因表达的作用，因此我们进一步分析了转录因子。我们比较了的Pfam模型MYB和bHLH在百合转录组数据中，筛选出含有MYB和HLH基序的基因。我们分析了所有注释为的基因MYB和bHLH，在S1 vs. S2、S2 vs. S3和S1 vs. S3中存在显著差异，构建了独立的进化树拟南芥MYB和bHLH(附加文件6:图S6a, c)，进一步分析TF基因的差异表达(附加文件6:图S6b、d)。

两个MYBs，LvMYB7(TRINITY_DN101863_c2_g1)和LvMYB5(TRINITY_DN103447_c0_g1)，与的子群6聚类拟南芥MYB基因家族(AtMYB75，AtMYB90，AtMYB113和AtMYB114)，可以调节发育后期花青素的生物合成[33]，花发育过程中FPKM较高，基因表达水平差异显著。其表达量在S2和S3较高，S1和X较低，且变化显著。第三组答:芥bHLH基因家族参与调节类黄酮的合成[23]。四种百合的DEGs分析LvbHLH(TRINITY_DN101351_c1_g2, TRINITY_DN101351_c1_g3, TRINITY_DN99942_c5_g1和TRINITY_DN95134_c0_g2)，与拟南芥III组bHLH基因家族在花发育过程中表达差异显著。然而，这四个基因在花发育过程中都被下调(图2)。5一个)。

在屏幕分析WD，采用WD模型进行筛选WD在基因里。然后这些基因被构建到进化树中WD与其他植物中发现的花青素生物合成途径有关(附加文件)7:图S7)。采用MAGA中的ML方法构建进化树。我们发现了两个基因，LvWD1(TRINITY_DN100841_c1_g2)和LvWD2(TRINITY_DN101304_c1_g1)，与WD，与花青素的生物合成途径有关。然而，这些基因的表达水平没有显著差异(图2)。5一个)。

综上所述，S2和S3高表达、S1和X低表达且变化显著的基因包括LvANS, LvF3'H, LvDFR, Lv3GT, LvMYB5和LvMYB7，这与花发育过程中花青素的形成和积累趋势一致。这些基因可能协同促进百合花瓣中花青素的合成。

影响不同地区花瓣色素沉着的类黄酮生物合成基因的鉴定

为了探索花瓣色素沉着在不同区域的调控网络，我们分析了色素沉着花瓣(S3)和未色素沉着花瓣(X)的转录组数据(图5)。4c).共有765个基因组(错误发现率[FDR] < 0.05)，其中上调基因487个，下调基因278个(|log2FoldChange| > 1;P值< 0.05)。

基于开花发育过程中与类黄酮生物合成相关的功能基因，筛选了色素化和未色素化花瓣中影响色素沉着的基因。的表达水平LvF3'H, LvDFR, LvANS, Lv3GT，LvMYB7和LvMYB5在有色素的花瓣中比在没有色素的花瓣中要高(图2)。3.）.

我们选择了7个deg，并使用qRT-PCR(引物见附录)分析了它们在芽花瓣样品(S1)、着色花瓣样品(S2)、着色花瓣样品(S3)和未着色花瓣样品(X)中的表达水平，以验证RNA-Seq结果(图2)。5b).然后我们使用Pearson相关性来识别相关性(附加文件12表5)。qRT-PCR结果与转录组数据一致。这表明我们的转录组结果对进一步的研究是可靠的。我们发现基因的表达，LvF3'H, LvDFR, LvANS, Lv3GT，LvMYB7和LvMYB5在S2和S3中表达量较高，差异不显著，在S1和x中表达量较低，在S3中表达量也显著高于xLvCHS无显著差异表达。

中间代谢物与关键基因表达的相关性

为了检验中间代谢物与基因表达之间的关系，我们采用Pearson相关法进行相关性鉴定，并利用Cytoscape构建相关网络图(图5)。5c)。

相关分析显示LvMYB5和LvMYB7的表达水平与lvf3h, LvDFR, LvANS和Lv3GT(无花果。5c)，它们是花青素生物合成途径中主要的晚期结构基因，在S2和S3中表达量高(图2)。5a).然而，这四个bHLH与早期结构基因高度相关，这些基因与花青素合成途径早期肉桂酸衍生物的合成有关(图2)。5c)，与肉桂酸衍生物的表达趋势相似(图2)。5一个)。

LvMYB5和lvby7的序列分析

为了确定筛选到的TF MYB的特征，我们将推导出的氨基酸序列与其他已发表的花青素相关基因的氨基酸序列进行了系统发育分析和同源序列比对。

花青素相关MYB进化树显示，LvMYB5和LvMYB7氨基酸序列具有高度同源性(图2)。6a)，并且与其他已发表的花青素相关myb密切相关，它们会促进色素沉着[34，35，36，37，38，39，40]。结果表明，百合中LvMYB5和LvMYB7首先与LhMYB12聚集在一起。但是，LvMYB5、LhSorMYB12和LhMYB12氨基酸序列的同源序列比对显示，在n端高度相似，而在c端存在一些差异(图2)。6b). LhMYB12 R2区有明显的氨基酸插入，这与LvMYB5和LhSorMYB12的序列不同。此外，LhSorMYB12和LvMYB5在n端保守区域具有很高的相似性，但在c端氨基酸序列上存在很大差异(图中红线)。6b)。

其次，用MaAN2对两个lvmyb进行聚类葡萄风信子。结果表明，它们具有相似的功能。MaAN2属于MYB家族的AN2亚群。花青素的积累葡萄风信子与MaAN2的表达呈正相关。双荧光素酶实验表明，MaAN2与拟南芥AtTT8强烈激活了MaDFR和MaANS的启动子。MaAN2异位表达在转基因烟草叶片和花瓣中产生明显的红色[41]。

最后，将这些基因与在其他植物中激活花青素生物合成的MYB基因(如植物中的AtMYB90、AtMYB75和AtMYB114)归为一类拟南芥［23]， MdMYB1和MdMBY10 in马吕斯［18，42]和CmMYB6 in菊花［37]。的转录水平差异MdMYB1编码花青素生物合成关键调控因子，控制果皮中花青素的含量和颜色[43]。表达的MdMYB10在苹果中产生了强烈的表现型，具有高度着色的植株[42]。的转录激活PpMYB10烟草中花青素色素沉着[34]。高度同源性表明这些MYB的功能相似。此外，LvMYB5和LvMYB7具有R2R3-MYB基因家族的一般特征[44]，包含R2和R3域(图2)。6因此,b)。LvMYB5和LvMYB7与其他花青素相关基因相似，可能在促进花瓣色素沉着中起重要作用。

本研究发现，不同颜色区域的表皮细胞形态不同。然后，对上色素区和下非色素区进行代谢组学分析。在非色素区，黄酮类生物合成途径的代谢产物主要流向黄酮。而在色素区，主要代谢产物为花青素。这一结果在以往的百合色素沉着研究中尚未得到澄清。最后，我们得到了2MYB的基因,LvMYB5和LvMYB7，在色素沉着区和非色素沉着区表达水平不同。相关分析表明LvMYB5和LvMYB7可能是影响花瓣不同区域着色方式的主要因素。值得进一步研究。

百合花瓣不同区域的颜色与表皮细胞形态和花青素积累呈正相关

许多研究发现，大多数植物花瓣的表皮细胞呈独特的圆锥形。这些锥形花瓣表皮细胞的形态影响光聚焦，在吸引传粉者中起重要作用[j]。45，46，47]。在本研究中，我们发现百合花瓣的不同区域表现出相似的形态差异报春花科和石斛兰［9，10]。百合花瓣不同区域的细胞形态差异显著，顶部较暗的部分呈圆锥形，而底部较浅的部分呈扁平状。花瓣中不同的表皮细胞结构导致入射光和反射光的比例不同，从而影响花朵的颜色。例如，锥形细胞提高了入射光在上皮细胞上的比例，从而增强了色素对光的吸收，从而使花的颜色变暗，提高了颜色饱和度。然而，平面细胞反射更多的入射光，导致花的颜色更浅[7]。类似的结果在金鱼草majus［48，49，50]。

花青素衍生物在百合花瓣未着色区积累较少，而在花瓣着色区积累较少。此外，未着色区域没有可见的颜色。原因有二，一是细胞中色素物质较少，不足以显色，也可能是受表皮细胞扁平化对可见颜色的影响。说明花青素的生物合成可能参与了百合花瓣色素区颜色形成的调控。然而，这种调节可能与色素区细胞形态有关。例如，锥形表皮细胞中花青素和其他类黄酮含量明显高于扁平表皮细胞金鱼草属植物花瓣(51]。在转基因拟南芥植物，过度表达PsMYB114L和PsMYB12L导致花青素积累显著增加，导致叶片呈紫红色[52]。在蝴蝶兰属兰花,PeMYB11-沉默导致花青素含量减少，花色从深紫色褪为粉红色[2]。因此，花青素物质与植物的颜色密切相关。

百合花瓣不同区域的颜色与表皮细胞的形态和花青素的积累密切相关，这可能是影响花瓣颜色的部分原因。但我们不能否认内在的细胞发育影响。细胞形态的差异可能涉及多方面，可能是激素、光照、pH、细胞内物质积累等因素共同作用的结果[53]。在分子水平上，MIXTA基因编码myb相关蛋白，并参与表皮细胞形状的转录控制[48]。研究发现罗普(Plant RhoGTPases)在植物发育过程中涉及多个方面。它是形成锥形细胞的最终形状所必需的[54]。此外,SPK1(SPIKE1),ARP2/3(肌动蛋白相关蛋白2/3)，RIC1/4(rop相互作用CRIB基序含蛋白1/4)，CRP1(发病相关基因组成表达子1)，PID(PINOID),东盟地区论坛(生长素反应因子)等基因很可能通过激素信号通路参与植物细胞的形态发生，进而影响植物细胞圆锥形和扁平形状的形成[55，56，57，58，59]。在此基础上，我们初步筛选了与细胞形态发生相关的相关基因(附加文件)14:图S8)。此外，一些相关基因的表达水平，如Rop, rapc2, CRP和里克，在色素花瓣和非色素花瓣之间差异显著。接下来，我们将对这些基因进行详细的分析和验证，以便用完整的实验数据来描述这一部分。

百合花瓣不同部位的黄酮和花青素含量差异显著

在大多数植物中，花的发育和色素沉着与类黄酮的生物合成密切相关[60，61]。高等植物中的黄酮醇、黄酮和肉桂酸衍生物(CADs)是无色的类黄酮或苯丙基化合物，具有吸收紫外线的特性，并与花青素在花器官中共着色[j]。15，62，63]。花青素、飞燕素和花青素是植物中主要的花青素。花青素衍生物已被确定为红苹果果皮中存在的主要花青素，也存在于紫红色、青铜色和粉红色的菊花花序中[64，65]。百合的花色丰富，但其花色的代谢物组成，以及花瓣不同区域代谢物与花色的关系，还有待进一步研究。

通过对比百合花开花期未着色花瓣(X)和着色花瓣(S3)的代谢物，可以得出结论，除了飞飞蓟苷、橙皮苷和同戊二醇外，与花青素合成相关的次生代谢物大部分上调(表1)1）.与X相比，S3中的Delphinidin下调，表明X中的Delphinidin含量高于S3。但两种药材的最终含量无显著差异。可能是两个地区的矮牵牛花苷3-葡萄糖苷含量相对较低，不足以呈现显著的颜色差异。

在这项研究中，我们检测了许多羟基肉桂基衍生物，包括咖啡酸和肉桂酸，以及黄酮，黄酮醇和花青素(表1，2）.在亚洲杂交百合中检测到大量肉桂酸衍生物(CADs)，包括咖啡酸，但未检测到黄酮或黄酮醇[5，66]。与S3相比，X组hesperetin和homoeriodictyol下调1.94E⁻⁰⁶和7.67 e⁻⁰⁶-折叠，黄酮大量积累，花青素代谢物在非色素区域下调(图2)。3.）.基于花青素生物合成途径(图2)3.)，柚皮素是花青素、橙皮素和异戊二醇的共同底物。这一观察结果表明，对柚皮素的竞争发生在花青素和黄酮生物合成途径的分支点上。类似的发现在佩妮， Saito等。[67发现……佩妮花呈红色边缘和白色中心，黄酮醇产物在中心增加佩妮花瓣抑制了花青素的积累。因此，不同地区百合花瓣中黄烷酮和花青素物质含量的差异，导致了不同地区的花色不同。花青素水平的降低，导致基部花瓣中未着色区域的形成，至少部分归因于黄酮的积累。

LvMYB5和LvMYB7花青素积累在花瓣的不同区域是否有协同调节作用

类黄酮生物合成途径是植物中一个保守的网络，其调控是通过表达结构和调控性生物合成基因来维持的[68]。结构基因可分为早期生物合成基因(EBGs)，如CHS,气,F3H,和晚期生物合成基因(LBGs)，如DFR ANS,和UFGT。这些基因通常由MYB或者是MYB-bHLH-WD40（MBW)复杂的[69，70]。在这里，我们讨论了哪些基因调节了“薇薇安”花瓣不同区域的颜色形成。

EBGs在百合中的表达水平，如CHS，在花发育各阶段均较高，代谢物差异不显著。某些双色花的形成机制不同。矮牵牛花的星形和边缘picotee(白色边缘，色素中心)图案是由PTGS引起的CHS-A在白色花瓣区，而不是花青素生物合成基因表达的变化[3.，71]。CHS已被证明在不同物种的花青素生物合成中起重要作用，许多植物中白花的存在是由于它们缺乏表达[3.，72，73，74]。而在百合中，EBGs的表达量和柚皮素查尔酮的含量没有显著差异。因此，百合不同于佩妮双色花的形成机制。

在‘Vivian’花期，LBGs的表达水平存在显著差异;lvf3h, LvDFR, LvANS和Lv3GT，在有色素和无色素的花瓣区之间，导致两部分花色素含量不同，颜色不同。这说明LBGs表达的变化影响了花不同颜色的形成。植物中一些花色变异的表达模式与‘Vivian’相似。LBG表达差异导致双色牡丹“西岛”的颜色差异[75),粉红色山茶花［76]，黄色/橙色的变化龙胆［77]。因此，LBGs的表达可以影响这些植物的色素沉着。

被子植物花的颜色图案是由受空间和时间限制的色素沉积形成的。转录因子(Transcription factors, TFs)可调控花色相关结构基因的表达[4]。LvMYB5和LvMYB7本研究筛选的两个R2R3-MYB与花青素合成密切相关，从qRT-PCR数据可以看出，这些基因在花瓣不同区域的表达水平存在显著差异。根据代谢物和功能基因的网络分析，LvMYB5和LvMYB7与lbg的表达高度相关，LvF3'H, LvDFR, LvANS和Lv3GT在花青素生物合成途径中。这些lbg与花青素衍生物的积累密切相关。5c).因此，它们可能在百合花瓣的色素沉着中发挥重要的调节作用。

LvMYB5和LvMYB7均聚集在MYB基因家族的第6亚组。这些基因可以调控LBGs的表达和后期花青素的生物合成[33，78]。类似地,MdMYB10的马吕斯,聚集在第6亚组，与花青素积累和LBGs表达呈正相关[42]。番茄果实中myb相关tf的过表达导致类黄酮相关基因的高表达，如F3 ' h, F3 ' 5'h, ANS，和UFGT,导致花青素的大量积累[79]。研究表明LhMYB12通过抑制或增强花青素生物合成基因的表达，调节花青素在花瓣、斑点和卵巢中的色素沉着[4，27]。因此，可能存在多个MYB基因协同调控植物不同组织的花色形成。

花青素的生物合成是一个复杂的过程，在花卉着色中具有重要意义。参与花中花青素生物合成的编码酶基因在花色素沉着过程中具有活性，但花青素积累与花瓣不同区域的关系尚不清楚。东方杂交百合花‘薇薇安’，同一花瓣的顶部(有色)和底部(非有色)呈现不同的颜色;然而，其特殊机制尚不清楚。在本研究中，我们发现百合花瓣不同颜色区域的表皮细胞形态不同。为了了解细胞形态差异是否与代谢物生物合成和基因表达有关，我们使用了代谢组学和转录组学分析。代谢组学分析结果表明，花青素衍生物在百合主要色素中积累，而黄酮在百合花瓣的非色素区积累，花青素含量减少(X)，这表明花青素和黄酮的生物合成可能参与了百合花色的调节。因此，我们利用RNA-Seq和qRT-PCR分析了这些与花青素和黄酮生物合成相关的基因在百合花瓣色素区和非色素区的表达。在这些基因中，LvF3'H, LvDFR, LvANS, Lv3GT, LvMYB5和LvMYB7在花瓣色素区和非色素区差异显著，且与花青素衍生物的积累量呈正相关。这表明这些基因可能调控花青素的生物合成，从而影响百合花瓣色素区和非色素区颜色的形成。这将有助于我们进一步了解百合花瓣色素的调控网络，培育不同的独特颜色品种。

我们鉴定并标注了大量的单基因，为百合基因组研究提供了良好的平台，为百合花发育过程中花色相关基因表达调控机制的研究提供了新的视角。然而，需要在细胞和转录水平上进一步验证，以确定TF MYB基因如何调节促进百合花瓣色素沉着的基因。本研究的结论为花卉颜色的研究提供了一个新的方向，可以进一步研究关键因子的功能。

植物材料和处理

2018年，在中国辽宁省沈阳农业大学实验农场的温室(不加热和自然光周期)中栽培百合品种。采用不同时期、不同地区的花瓣作为植物材料，包括:芽形成后20天的S1花期花瓣;S2 -芽形成后30天为芽瓣着色;花期花瓣，花蕾形成后40 d，分为花期花瓣色素区S3和花期花瓣未色素区X。采集4个花瓣样品，进行3次生物重复，然后立即在液氮中冷冻30 min以上，保存在- 80°C的冰箱中供进一步研究。

扫描电子显微镜

百合品种“Corvara”、“Table dance”、“Vestaro”和“Vivian”是东方杂交百合。这些百合的花瓣由红色/粉红色和白色组成，并显示出从色素到非色素的颜色梯度。因此，我们选择这些品种来探讨细胞形态的差异。然后我们从中选择一个进行进一步的研究和分析。

用蒸馏水冲洗植物材料，快速切除5 mm × 5 mm的正方形样品。处理后的样品真空固定在1 ml 2.5%戊二醛缓冲液中。样品用1.5 ml pH 7.2的磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次10分钟，去除表面残留的固定液。接下来，将固定组织在增加的1ml体积的乙醇水溶液系列(30,50,70,90,100%)中脱水。用乙酸异戊酯替代乙醇，每次2次，每次15min。最后，用临界点干燥法将样品中的溶剂替换为液态二氧化碳[80]。在使用日立Regulus 8100扫描电子显微镜(SEM)检查之前，将干燥的花被片安装在标本存根上，并溅射涂上一层金。用扫描电镜对样品进行了观察和拍照。

代谢物鉴定和定量

采用超高效液相色谱法(Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A;http://www.shimadzu.com.cn/)和串联质谱(Applied Biosystems 6500 QTRAP，http://www.appliedbiosystems.com.cn/(UPLC-MS/MS)系统生物样品被真空冷冻干燥，并使用研磨装置(MM 400, Retsch) (30 Hz, 1.5 min)研磨成粉末。称取100 mg粉末，溶解于1.0 mL提取物中。溶解后的样品在4°C冷藏过夜时进行三次涡流，以提高提取率。离心(10,000×g, 10 min)后，提取上清液。样品用微孔过滤器(孔径0.22 m)过滤，保存在小瓶中进行LC-MS/MS分析。UPLC出水连接到电喷雾电离(ESI)-三重四极线性离子阱-质谱联用系统。将ESI源设置为正电离模式，源温度保持在500℃;毛细管电压为5500 V。设置监测模式为多反应监测(MRM)。

通过对在线KEGG (http://kegg)中显著峰特征的准确质量进行检索，对LC-MS检测到的化合物进行鉴定www.kegg.jp/)及房委会(http://www.hmdb.ca)数据库。当观察到的化合物和理论化合物之间的质量差< 10ppm时，报告代谢物名称。代谢物的鉴定和定量采用Chen等人的方法。[81]。对含量有显著差异的代谢物设置投影(VIP)≥1、倍数变化≥2或≤0.5的可变重要阈值。

RNA提取

花瓣样品S1、S2、S3和X的总RNA由RNA plant plus (TIANGEN, China, Beijing)按照制造商的说明提取。纯化RNA的质量首先在琼脂糖凝胶上进行评估，然后使用NanoDropTM分光光度计(Thermo Fisher Scientific, Inc.)进行定量。

RNA-Seq和注释

选择花瓣样品S1、S2、S3和X，使用Illumina Hiseq (Personal Biotechnology, Shanghai, China)进行转录组测序。总RNA中具有多a结构的mRNA被Oligo (dT)磁珠富集。mRNA被纯化并片段化。然后，将产物分割成200-300 bp的短段。然后，合成双链cDNA。通过cDNA合成构建文库。文库质量评估在Agilent 2100生物分析仪系统上进行，文库在Illumina Hiseq平台上测序，生成末端配对reads。

对测序数据进行处理，去除适配器和低质量读数。所有下游分析均基于高质量的干净数据。使用Trinity软件对转录组进行从头组装以获得转录序列，使用默认参数，没有参考序列[82]。通过层次聚类分析对转录本进行聚类[83]，然后从每个簇中选取最长的转录序列作为单基因。为了保证rna测序数据的准确性和可靠性，我们只使用高质量的reads (clean reads)进行统计分析。

差异表达基因(DEGs)的功能注释信息通过以下数据库获得:NR (NCBI非冗余蛋白序列;ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/)、Pfam (http://pfam.xfam.org/)， KOG/COG/eggNOG(簇状同源蛋白，ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/COG/COGhttp://eggnogdb.embl.de/)、Swiss-Prot (http://www.uniprot.org/)， KEGG(京都基因与基因组百科全书)，http://www.genome.jp/kegg/)和GO(基因本体，http://www.geneontology.org/) [84]。

将花青素生物合成基因的FPKM值进行log2变换(为了避免变换后的负值，我们在log2变换前的每个FPKM值都加“1”)，取平均值居中，然后行标准化。由R软件中的热图包生成的热图。

存在分析

利用HiScript 1st strand cDNA Synthesis Kit (Vazyme，南京，中国)合成第一条cDNA。使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix (without ROX) (Vazyme，南京，中国)将SYBR Green插入扩增产物中。10 μl反应溶液中各含有0.5 μl基因特异性引物和2 μl稀释10倍的第一链cDNA。信号监测使用BIO-RAD CFX 96触摸qRT-PCR系统(Bio-Red Laboratories, Inc.， Hercules, CA, USA)。测定每个样品中肌动蛋白mRNA的量，并用于使靶基因mRNA的量归一化。使用以下循环参数:1次在95°C下保持5分钟，40次在95°C(10秒)和60°C(25秒)下保持，1次在95°C(15秒)，60°C(60秒)，95°C(30秒)，95°C(15秒)收集融合曲线。qRT-PCR产物的熔融曲线分析和琼脂糖凝胶电泳证实了引物特异性。根据2 .计算基因的相对表达量^——ΔΔCt方法，其中ΔCt = Ct(靶基因)-Ct(肌动蛋白)。采用三个生物重复的相对折叠变化值计算平均值和标准误差[85]。转录水平表示为平均值的平均值±标准误差。采用SPSS 16.0 (SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)进行方差和显著性差异的统计分析。不同的字母表示样本之间的统计显著差异。实验中使用的引物列于补充表(附加文件)13表6)。

cDNA经梯度稀释10倍，共5个梯度，0.1 0.01 0.001 0.0001 0.00001。然后将该系列稀释液作为模板，用不同的引物进行qRT-PCR。得到Ct值，绘制单个引物的标准曲线。各引物标准曲线的回归系数均在0.9以上，说明Ct值与模板稀释比相关性较好。引物效率为90% ~ 105%，符合qRT-PCR的要求。

相关分析

通过花青素结构基因与转录因子的相关性分析，获得了与花青素生物合成相关的主要推定基因。利用SPSS 16.0软件中的“相关”函数，对tf与结构基因、基因与代谢物进行Pearson相关分析。然后，我们使用Cytoscape(版本3.6.1,Institute of Systems Biology, Seattle, Washington, USA)构建网络进行可视化[86]。

系统发育分析

基于氨基酸序列的系统发育分析在MEGA(5.0版本，宾夕法尼亚州立大学实验室，St Collie, PA, USA)中进行，并使用最大似然法进行1000次bootstrap重复[87]。

在本研究中生成和分析的数据集可在NCBI项目PRJNA649743中获得。通讯作者可以提出任何合理的要求。

度:

差异表达基因

DHK:

Dihydrokaempferol

DHM:

Dihydromyricetin

DHQ:

Dihydroquercetin

走:

基因本体论

KEGG:

京都基因与基因组百科全书

UPLC-MS /女士:

超高效液相色谱和串联质谱分析

LBG:

晚期生物合成基因

EBG:

早期生物合成基因

TFs:

转录因子

不适用。

国家重点研发计划项目(批准号:2019YFD1001002)和国家自然科学基金项目(批准号:31572150)资助。资助机构在研究的设计、数据的收集、分析和解释以及撰写手稿方面的作用是管理和监督。

作者指出

1. 尹晓娟和林心玥对这项工作也有同样的贡献。

从属关系

1. 沈阳农业大学园艺学院，设施园艺教育部重点实验室，生物科学与技术学院，辽宁沈阳110866

   尹晓娟，林欣悦，刘宇轩，陈丽静，张丽

2. 萨戈达大学生物技术系，巴基斯坦萨戈达

   穆罕默德·艾尔

贡献

LJC概念化了这个项目。XJY和XYL进行了实验工作和数据分析，并撰写了论文初稿。YXL协助审阅和编辑稿件;MI一直参与对重要知识内容的手稿进行批判性修改;LJC和LZ全面负责这个项目，包括项目思路、实验设计指导、数据分析、论文撰写和修改。LJC参与项目管理和资金获取。所有作者都阅读并批准了最终稿件。

相应的作者

对应到丽江陈或李张。

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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