AGPase基因的综合分析揭示了其在莲子淀粉生物合成中的潜在作用gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

莲子淀粉中含有高比例的直链淀粉，这使得莲子在低血糖和低血糖指数功能食品的开发中具有广阔的应用前景。目前，提高淀粉含量是莲子育种的主要目标之一。adp -葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)在调节植物淀粉生物合成中起重要作用，但对其在荷花中的特性知之甚少。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

以淀粉为主要成分，对30个品种的莲子进行营养成分分析。比较转录组分析表明，淀粉含量显著不同的两个品种(CA和JX)的AGPase基因表达存在差异。在荷花基因组中鉴定出7个推测的AGPase基因(gydF4y2Ba莲属椰子gydF4y2BaGaertn.)，可分为两个亚科。选择压力分析表明，纯化选择在AGPase基因的进化中起着至关重要的作用。表达分析表明，荷花AGPase基因具有不同的表达模式gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba主要表现在种子和根茎中。gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba与多个淀粉和蔗糖代谢途径相关基因共表达，其表达伴随着莲子AGPase活性和淀粉含量的增加。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

在荷花中鉴定出7个AGPase基因，其中gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba，是莲子淀粉生物合成的关键基因。这些结果大大扩展了我们对荷花AGPase基因的认识，为选育高淀粉含量荷花新品种提供了理论依据。gydF4y2Ba

莲属gydF4y2Ba是莲科的一个独特属，包括两个现存的物种:gydF4y2Ban .椰子gydF4y2BaGaertn。广泛分布于亚洲和澳大利亚北部gydF4y2Ban luteagydF4y2Ba珀耳斯。分布在美国的[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。作为一种长期种植的作物，荷花用途广泛，部分植物已被用作休闲食品、蔬菜、药物和观赏园艺。根据不同的性状和农业用途，莲品种可分为三大类:种子莲、根茎莲和花莲[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]。与其他两个品种相比，莲子的种子产量更高。目前，莲子产品在亚洲的日常饮食中非常受欢迎，例如，中国每年对莲子的需求量约为5 - 7.5万吨。成熟莲子的子叶中含有40-60%的淀粉，因此被认为是淀粉的丰富来源，被广泛用于低血糖指数食品的生产。此外，莲子还含有丰富的蛋白质、维生素、必需氨基酸和多种生物活性成分，具有重要的营养和药用价值。gydF4y2Ba

淀粉作为一种非结构性碳水化合物，是植物体内最重要的碳水化合物储存形式。它由葡萄糖的两种聚合物直链淀粉和支链淀粉组成，这两种聚合物具有不同的分子结构，前者由无支链的葡萄糖单体组成，而后者是支链的多糖[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。淀粉可以通过一个高度复杂的过程在光合和非光合组织中积累[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。淀粉的生物合成始于叶片，然后以双糖的形式转运到其他储存器官进行淀粉合成。蔗糖经蔗糖合酶(SuSy)、adp -葡萄糖焦磷酸化酶(UDPase)和磷酸葡萄糖糖糖化酶(PGM)催化从叶片转运到贮藏器官，产生葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖-6-磷酸被转运到淀粉质体中进行淀粉合成，淀粉合成由PGM、adp -葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)和淀粉分支酶(SBE)催化[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。此外，其他重要的酶如AGPase [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]， ss [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]及SBE [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]已被鉴定并成功应用于分子育种。目前，淀粉生物合成过程的机理已经被阐明，如gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba、马铃薯、稻米及玉米[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。然而，莲子淀粉生物合成的机制尚不清楚。gydF4y2Ba

已有研究表明，淀粉生物合成过程在莲子发育过程中起着重要作用[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。莲花授粉后9 ~ 20天，淀粉在子叶中迅速积累[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。蛋白质组学分析表明，成熟莲子在25 DAP处AGPase高度富集，淀粉磷酸化酶(StarchP)显著积累[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。比较淀粉含量高的莲子品种JX(“建选17”)和淀粉含量低的CA(“中国古”)的转录组结果表明，在莲子发育过程中，AGPase、可溶性淀粉合成酶(SSS)和SBE等参与淀粉生物合成的编码基因被上调。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

AGPase在细菌和植物中分别调控糖原和淀粉的生物合成中起着至关重要的作用[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。AGPase (EC:2.7.7.27)催化淀粉生物合成途径的初始和主要限制步骤，将葡萄糖-1-磷酸(Glc1P)和ATP转化为adp -葡萄糖和焦磷酸(PPi) [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。AGPase是一种杂四聚体，由两个小/催化亚基和两个大/调节亚基组成[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。根据其细胞定位，AGPases有两种异构体，即胞质异构体和质体异构体。谷物胚乳的禾本科植物,ADP-glucose胞液中形成的胞质同种型,并导入到叶绿体由质体信封位于ADP-glucose运输车为淀粉生物合成。相反，在大多数双子叶植物中，adp -葡萄糖仅通过质体AGPase异构体在质体中形成[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。目前，AGPase基因已在许多物种中被鉴定出来，如水稻、玉米、gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba大麦[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。先前的研究表明，AGPase突变体表现出淀粉含量的减少，例如，在接近无淀粉的情况下gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaTL25突变体gydF4y2Baadg1gydF4y2BaAGPase小亚基结构基因编码基因[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。在大麦突变体Risø 16中也观察到这种淀粉生物合成缺陷，该突变体在胞质AGPase的小亚基编码区有大量缺失[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。迄今为止，关于AGPase基因在莲藕淀粉生物合成中的作用的信息很少。gydF4y2Ba

随着莲子淀粉的开发和商业应用潜力的提高，培育高淀粉含量莲子新品种的工作至关重要。本研究测定了30个品种的莲子营养成分，定量测定了淀粉、可溶性糖、蛋白质和多酚含量。AGPase是淀粉生物合成过程中的关键限速酶，通过系统发育、表达模式和共表达网络分析，对其编码基因进行了系统鉴定和表征。gydF4y2Ba莲属椰子gydF4y2BaGaertn.)测序数据。研究了莲子淀粉含量和AGPase活性的动态变化。此外，淀粉生物合成的两个有前途的基因，gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba在莲子中鉴定出。本研究为了解莲藕淀粉生物合成途径奠定了基础，为高淀粉莲藕新品种的分子选育提供了理论依据。gydF4y2Ba

莲子的营养成分gydF4y2Ba

莲子授粉后30天左右达到质量成熟，经历4个发育阶段，器官形成1-3 DAP，细胞扩增4-9 DAP，物质积累10-25 DAP，休眠26-30 DAP。每个阶段都伴随着形态的变化，如种子的大小和颜色(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).在15 DAP和30 DAP时采集30个莲子品种的种子，测定其营养成分，包括总淀粉、直链淀粉、支链淀粉、蛋白质、可溶性糖和多酚(另附文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表1)。15 DAP采集的种子，总淀粉12.79 ~ 43.60%，平均28.20%，直链淀粉5.67 ~ 22.58%，平均14.41%，支链淀粉5.68 ~ 21.33%，平均13.80%，蛋白质2.43 ~ 8.52%，平均5.55%，可溶性糖8.66 ~ 23.43%，平均14.39%，多酚0.54 ~ 2.31%，平均1.15%(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba30 DAP采集的种子，总淀粉含量为36.67 ~ 55.28%，平均为47.12%，直链淀粉含量为19.57 ~ 35.80%，平均为26.58%，支链淀粉含量为12.96 ~ 26.96%，平均为20.54%，蛋白质含量为9.7 ~ 17.53%，平均为13.32%，可溶性糖含量为3.39 ~ 16.11%，平均为7.56%，多酚含量为0.77 ~ 2.01%，平均为1.32%。gydF4y2Ba1gydF4y2BaB - g)。gydF4y2Ba

30粒DAP莲子的总淀粉、直链淀粉、支链淀粉和蛋白质含量显著高于15粒DAP莲子(方差分析，gydF4y2BaPgydF4y2Ba≤0.01)，而15粒DAP莲子的可溶性糖含量显著高于30粒DAP莲子(gydF4y2BaPgydF4y2Ba≤0.01)，多酚含量无明显变化。另外，15粒DAP莲子直链淀粉和支链淀粉含量差异不显著，而30粒DAP莲子直链淀粉含量显著高于支链淀粉含量(gydF4y2BaPgydF4y2Ba≤0.01)。我们发现30个莲品种的营养成分差异很大。例如，15 DAP时种子淀粉、30 DAP时种子可溶性糖和15 DAP时种子蛋白质的变异系数(CV%)分别为29.10、52.45和28.90(另附文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表1)。gydF4y2Ba

AGPase基因在莲子发育过程中存在差异表达gydF4y2Ba

通过比较转录组分析，探讨CA和JX在种子发育分子机制上的差异[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。CA和JX分别鉴定出9dap ~ 15dap的4416和6916个差异表达基因(deg)，其中共有2895个差异表达基因(deg)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表2)。KEGG分析显示，这些常见的deg主要参与17条通路(修正)gydF4y2BaPgydF4y2Ba值≤0.05)，包括代谢途径、淀粉和蔗糖代谢以及类黄酮的生物合成(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).我们发现了44个参与淀粉和蔗糖代谢途径的基因，它们的表达模式显示，AGPase (NNU_05331、NNU_20629、NNU_06174)、颗粒结合淀粉合成酶(NNU_04661)和1,4- α -葡聚糖分支酶(NNU_25320、NNU_23975)等23个基因在CA和JX中同时上调(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab).基因注释显示，NNU_05331和NNU_06174编码AGPase的大亚基，NNU_20629编码AGPase的小亚基。有趣的是，NNU_05331和NNU_20629在CA和JX中有差异表达。NNU_05331在JX中的表达量分别是CA的16.90倍和27.13倍，分别为12 DAP和15 DAP。而NNU_20629在JX中的表达量分别是CA的4.49倍和4.45倍，分别为12 DAP和15 DAP。已有研究表明，在12dap和15dap条件下，JX比CA能合成更多的淀粉[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。因此，我们很容易推测，AGPase表达的差异可能有助于解释这两个品种淀粉积累的差异。gydF4y2Ba

荷花基因组AGPase亚基基因的鉴定gydF4y2Ba

经过对圣莲基因组的Blast搜索(gydF4y2Ba莲属椰子gydF4y2BaGaertn.)，共鉴定出7个AGPase基因，其中3个gydF4y2BaNnAGPL1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba，gydF4y2BaNnAGPL2bgydF4y2Ba编码大亚基的基因，还有四个gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba，gydF4y2BaNnAGPS1bgydF4y2Ba，gydF4y2BaNnAGPS2agydF4y2Ba，gydF4y2BaNnAGPS2bgydF4y2Ba编码小亚基的基因(表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba;额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba表S3)。四个基因gydF4y2BaNnAGPL1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNnAGPL2bgydF4y2Ba，gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS2agydF4y2Ba分布在Megascaffold_1上，而gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba，gydF4y2BaNnAGPS2bgydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1bgydF4y2Ba分布在Megascaffold_6、Megascaffold_11和Megascaffold_96上。AGPase亚基蛋白全长为311 ~ 614个氨基酸，大亚基分子量为58.6 ~ 67.75，小亚基分子量为35.21 ~ 65.2 kDa。AGPase亚基蛋白的等电点(pI)在6.18 ~ 9.01之间。在6个荷花AGPase基因中鉴定出5个保守基序，除了gydF4y2BaNnAGPS2bgydF4y2Ba它只有两个保守基序(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).基因结构分析显示，大亚基含有14 ~ 17个外显子，小亚基含有5 ~ 9个外显子(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).此外，AGPase蛋白对PSS(马铃薯小亚基基因)的序列比对显示，催化的关键氨基酸(精氨酸，gydF4y2BaRgydF4y2Ba甜菜碱,gydF4y2BaKgydF4y2Ba)存在于两种AGPase亚基蛋白中。NnAGPL1、NnAGPL2a、NnAGPL2b、NnAGPS1a和NnAGPS1b这5种蛋白具有相同的保守结合位点(Lycine，gydF4y2BaKgydF4y2Ba)表示Glc-1-P(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac, d)。gydF4y2Ba

AGPase亚基基因的进化分析gydF4y2Ba

蛋白质序列分析显示，大亚基基因的氨基酸同源性为50.46 ~ 75.36%，小亚基基因的氨基酸同源性为17.69 ~ 78.75%(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa)， NnAGPL2a-NnAGPL2b和NnAGPS1a-NnAGPS1b对的大亚基和小亚基同源性最高。相比之下，在gydF4y2BaNnAGPS2bgydF4y2Ba以及其他六个AGPase基因成员中的任何一个。计算了同源基因对的非同义(dN)和同义(dS)替代率，以探讨荷花与其他植物之间的进化动力学和选择压力gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba大米和玉米。dN/dS均< 1，表明纯化选择作用于AGPase基因(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).构建系统发育树，深入了解AGPase基因的进化关系。所有AGPase基因可分为两个亚家族，且基因在大亚基和小亚基之间表现出明显的分化(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).与水稻和玉米相比，荷花和玉米AGPase基因的进化关系更为密切gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

NnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba主要在荷花中表达gydF4y2Ba

采用Real-time PCR技术研究了莲花AGPase基因在JX不同组织(根、叶、叶柄、花、茎、匍匐茎(根茎1)和膨大期根茎(根茎2)中的表达规律。在至少一个组织中检测到5个基因的表达，除了gydF4y2BaNnAGPL2bgydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS2bgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一个)。gydF4y2BaNnAGPL1gydF4y2Ba在叶片中高表达，在叶柄和根茎1中也有表达，在花和根茎2中不表达。gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba，gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba，gydF4y2BaNnAGPS1bgydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS2agydF4y2Ba在所有组织中均有表达，其中gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba在根茎2中比在根茎1中。此外,gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba总体上表达丰度高于其他基因。gydF4y2Ba

研究了莲子发育过程中AGPase基因的表达规律。对于大的亚基基因，gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba从9dap持续上调至21dap，gydF4y2BaNnAGPL2bgydF4y2Ba24dap时表达变化明显(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).然而，表达的丰度gydF4y2BaNnAGPL1gydF4y2Ba在发育过程中几乎没有发现种子。对于小亚基基因，除gydF4y2BaNnAGPS2bgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab)。gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS2agydF4y2Ba在种子发育过程中被诱导，gydF4y2BaNnAGPS1bgydF4y2Ba趋势无明显变化。此外,gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS2agydF4y2Ba的表达模式相似gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPL2bgydF4y2Ba,分别。gydF4y2Ba

基于以上结果，我们推测gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba分别是AGPase大亚基和小亚基中主要表达的基因，特别是在莲子和根茎的发育过程中。gydF4y2Ba

的共表达网络分析gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba

共表达网络分析是预测基因功能的有力方法[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。荷花发育过程中主要表达的基因;gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba被选为本研究的对象。结果，共表达了408个和444个基因gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba，分别为(|PCC|≥0.9)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba一个;额外的文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(表S4)，共鉴定出359个共同表达的基因。KEGG分析显示，这些共表达基因中富集了8条通路(校正后)gydF4y2BaPgydF4y2Ba值≤0.05)，包括次生代谢产物的生物合成、淀粉和蔗糖代谢以及碳代谢(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab). 14个基因参与淀粉和蔗糖代谢，包括颗粒结合淀粉合成酶(NNU_04661)， α -1,4葡聚糖磷酸化酶(NNU_04529)和1,4- α -葡聚糖分支酶(NNU_23975, NNU_25320)(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S1)。选择5个基因通过qRT-PCR验证表达模式，均从9dap显著上调至18dap，表达模式与gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab;gydF4y2Ba6gydF4y2Ba因此，……的作用很可能是gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba可能与这些共表达基因关联，参与莲子淀粉的生物合成。gydF4y2Ba

序列变异gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba在CA和JX之间gydF4y2Ba

CA和JX品种在种子大小和淀粉含量上存在显著差异[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。为了调查是否gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba在不同的莲花品种中，我们分别从CA和JX中克隆了这两个基因的编码序列(CDS)和启动子区域(附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S2;额外的文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba表5)。为gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba在CA和JX之间的CDS中鉴定出3个非同义突变和4个同义突变，C的核苷酸多态性gydF4y2Ba^117gydF4y2Ba/ GgydF4y2Ba^117gydF4y2BaTgydF4y2Ba^269gydF4y2Ba/ GgydF4y2Ba^269gydF4y2Ba和GgydF4y2Ba^903gydF4y2Ba/一个gydF4y2Ba^903gydF4y2Ba导致了AsngydF4y2Ba^39gydF4y2Ba/赖氨酸gydF4y2Ba^39gydF4y2Ba,微笑gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba/参数gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba和满足gydF4y2Ba^301gydF4y2Ba/ IlegydF4y2Ba^301gydF4y2Ba，分别为(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba一个;额外的文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S2C)。在的启动子区共鉴定出14个SNP和2个IndelgydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba，在−1000 ~−2000 bp区域发现了12个变异(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab;额外的文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S2d)。三种变异引起顺式元件的变化，JX中- 833 bp (C/T)位置的SNP引起G-box (CA)的变化gydF4y2BaCgydF4y2BaGTT→CAgydF4y2BaTgydF4y2BaGTT)， JX中- 1762 bp (G/−)位置的缺失导致I-box (G/−)的变化gydF4y2BaGgydF4y2BaATAAGCTG→GATAAGCTG)， CA - 1862 bp (TC/−−)位置的缺失引起LTR (TT)的变化gydF4y2BaTCgydF4y2BaGG→TTGG)(无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

的序列保守性更强gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba比在gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba在CA和JX之间。在CDS中鉴定出一个SNP，在启动子区域鉴定出两个SNP(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba;额外的文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S2)。T .的核苷酸多态性gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba/ CgydF4y2Ba^37gydF4y2BaCDS导致CysgydF4y2Ba^13gydF4y2Ba/参数gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba而CA - 409 bp (A/T)位置的SNP引起ARE顺式元件(AAACC)的变化gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba→AAACCgydF4y2BaTgydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

莲子淀粉合成过程中AGPase活性增加gydF4y2Ba

由于其在调节植物淀粉合成方面的潜在作用，本研究检测了JX莲子中淀粉含量和AGPase活性的动态变化。淀粉含量和酶活性从9 DAP持续增加到21 DAP(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac, d).淀粉合成在12DAP至15DAP期间达到顶峰，然后积累缓慢直到21dap。JX的淀粉含量高于CA，这与以往的研究结果一致(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac).与淀粉生物合成相比，酶活性在21DAP前呈稳定上升趋势，在24dap时迅速下降(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bad)。此外，在莲子中，JX在18 DAP和21 DAP时的酶活性高于CA(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba

莲子是有性繁殖的产物，由于其丰富的营养成分，在亚洲被大量食用。以往对莲子的研究主要集中在莲子的加工工艺、淀粉的结构和理化性质以及营养成分的功能分析等方面，而对莲子发育的分子机制和品质性状的研究进展缓慢[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。本研究测定了30个莲子品种的关键成分含量，这些数据将为科学评价莲子品质和筛选莲子种质资源提供重要信息。gydF4y2Ba

淀粉按直链淀粉含量可分为低(直链淀粉含量< 20%)、中(直链淀粉含量21-25%)和高(直链淀粉含量> 26%)三类[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。与大多数谷类作物不同，莲子中的淀粉属于天然高直链淀粉，部分品种直链淀粉含量超过32%，如‘建选35’(35.80%)、‘WBG_S1’(32.78%)和‘红花健连’(32.44%)。莲子中的淀粉容易逆行生成抗性淀粉，具有开发降糖功能食品和低血糖指数食品的潜力[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。结果表明，莲子淀粉含量还有待提高，部分主要品种的淀粉含量低于47.12%的平均水平，如“泰康3号”(40.00%)和“京光1号”(42.66%)。前人的研究表明，了解淀粉的生物合成机制可以成功地为水稻、玉米和小麦等作物的高淀粉含量新品种的选育提供分子基础[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。虽然对莲子淀粉生物合成机理的研究引起了植物育种家的关注，但对这一主题的了解仍然很少[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。已有研究表明，莲子中淀粉积累伴随着AGPase mRNA和蛋白的高丰度，表明AGPase在这一过程中起着重要的作用[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]，因此我们的研究需要分析莲子中淀粉的生物合成机制。gydF4y2Ba

在此，我们利用现有的基因组数据系统地鉴定了7个莲花AGPase亚基基因。在莲花中发现的AGPase基因数量与在其他植物中发现的相似，例如，在水稻中发现7个，在玉米中发现8个，在玉米中发现6个gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。AGPase小亚基基因比大亚基基因变异大，这与先前报道的小亚基基因比大亚基基因氨基酸序列保守性高的结果不一致[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。AGPase基因在植物中可明显分为两个亚科，这表明AGPase大亚基基因和小亚基基因具有不同的进化模式(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).荷花AGPase基因与荷花AGPase基因的进化关系更为密切gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba而不是水稻和玉米，因此支持了神圣莲是一种基生植物的结论[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。选择压力分析表明，纯化选择在AGPase基因的进化中起主要作用，这可能表明AGPase同源基因在不同植物物种中的功能是保守的。gydF4y2Ba

基因的空间表达模式可以部分预测基因的功能。在荷花中，AGPase基因在不同组织中表现出不同的表达模式gydF4y2BaNnAGPS2bgydF4y2Ba表明AGPase可能在调节荷花生长中发挥重要作用，特别是在淀粉合成组织，如种子和根茎中(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.两个同源基因对，gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba-gydF4y2BaNnAGPL2bgydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba-gydF4y2BaNnAGPS1bgydF4y2Ba结果显示，AGPase同源基因的表达模式不一致，这可能表明AGPase同源基因在荷花中发生了功能分化。AGPase作为淀粉生物合成途径的关键酶，其调控特性在两个亚基之间协同相互作用[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。值得注意的是gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba是莲子中主要表达的基因，说明这两个基因可能参与了淀粉生物合成和莲子发育的调控。这两个基因的差异表达与CA和JX之间淀粉积累的差异有关[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。系统发育分析显示，NnAGPS1a和NnAGPL2a分别与AtAPS1和AtAPL2同源(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac). AtAPS1是主要的小亚基gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba主要调控淀粉生物合成，其突变体表现为低淀粉表型，而AtAPL2是叶片中次要的调控亚基，具有催化活性，可以促进植物adp -葡萄糖的合成[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。我们推测gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba可能参与莲子淀粉生物合成的调控，但这两个基因的生物学功能和分子机制有待进一步研究。gydF4y2Ba

驯化和育种在大多数作物中导致显著的遗传变化，鉴定有利的单倍型可用于分子育种[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。在小麦中，两种AGPase基因的单倍型，gydF4y2BaTaAGP-S1-7AgydF4y2Ba和gydF4y2BaTaAGP-L-1BgydF4y2Ba，这些基因与千粒重(TKW)相关，而受青睐的单倍型经历了强烈的正选择[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。在这里，我们确定了序列变异gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba在CA和JX之间。在催化和Glc-1-P结合位点未检测到变化，因此CDS的变化是否会影响AGPase的功能值得确定(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa).观察到的gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba在莲子发育过程中CA和JX之间的差异，可能与这两个基因的启动子区域的变异有关(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab).例如，G-box突变gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba启动子可能影响JX中一些环境应激应答转录因子的结合和调控活性，如MYC和bZIP基因[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。此外，G-box还与淀粉生物合成过程的调控密切相关，如有研究表明G-box在调控SBE和AGPase基因表达中发挥作用[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。总的来说，这些结果部分揭示了遗传分化gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba，为在群体水平上鉴定有利单倍型提供重要参考，可用于分子育种。gydF4y2Ba

根茎是莲藕重要的贮藏器官，淀粉是其最丰富的成分之一，占鲜重的10-20% [gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。已有研究表明，AGPase基因参与了根茎中淀粉的生物合成过程[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。我们的数据显示，与ZO (' Zhou Ou ')相比，ZO (' Zhou Ou ')根茎在肿胀初期的AGPase酶活性高于匍匐茎或肿胀后期。自gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba是两个品种JX和ZO根茎膨大期的主要表达和上调基因(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一个;额外的文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:图S3)。我们推测这两个AGPase基因也调控了根茎中淀粉的生物合成。gydF4y2Ba

我们的结果表明gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba都伴随着莲子和莲根中AGPase活性的变化(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab;gydF4y2Ba7gydF4y2Bad;额外的文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:图S3b)。因此，通过基因工程提高这两个基因的AGPase活性可能是提高莲子和莲根中淀粉含量的可行途径。类似的研究策略已经成功地应用于水稻、玉米和小麦等作物[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。表达马铃薯AGPase大亚基的转基因水稻植株gydF4y2BaUpReg1gydF4y2Ba该基因提高了叶片的光合能力和淀粉含量，增加了种子生物量[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。AGPase大亚基过表达gydF4y2BaTaAGPL1gydF4y2Ba显著提高了小麦籽粒AGPase活性和淀粉积累速率[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。为今后莲藕淀粉积累的遗传改良提供了重要的基因资源。gydF4y2Ba

提高淀粉含量是目前莲子育种的主要目标之一。在本研究中，我们揭示了30个莲品种种子的营养成分包括淀粉、可溶性糖、蛋白质和多酚。这些数据为科学评价莲子品质和筛选种子莲子种质资源提供了重要信息。比较转录组分析表明，淀粉含量显著不同的两个品种AGPase基因表达存在差异。7个AGPase基因在荷花(gydF4y2Ba莲属椰子gydF4y2BaGaertn.)，分析了它们的序列保守、进化、表达模式和共表达网络。的表达模式gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2BaAGPase基因在莲子中伴随着淀粉含量的增加和AGPase活性的增强，是调控莲子淀粉生物合成的关键基因(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.本研究为鉴定AGPase基因在荷花淀粉生物合成中的功能提供了一个起点，为选育高淀粉含量荷花新品种提供了理论依据。gydF4y2Ba

莲子转录组分析gydF4y2Ba

为了研究莲子发育过程中淀粉积累的调控机制，利用NCBI (gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra?term=SRP127765gydF4y2Ba）.差异表达基因(DEGs)的鉴定如前所述[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析由KOBAS 3.0实现[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。使用TBtools可视化基因表达的热图分析[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

对于基因共表达分析，基于公共转录组数据库计算pearson相关系数(PCC)来衡量两个AGPase基因(gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba)和其他基因[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。采用|PCC|≥0.9的基因构建共表达网络，通过Cytoscape软件(3.4.0)将网络可视化。gydF4y2Ba

神莲基因组AGPase基因的鉴定gydF4y2Ba

为了从荷花基因组中鉴定AGPase亚基基因，我们从荷花基因组中获得了所有预测的蛋白序列(gydF4y2Ba莲属椰子gydF4y2BaGaertn.)使用基因注释gff3文件[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。完全表征的AGPase亚基蛋白序列gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，大米和玉米可从Tair (gydF4y2Bahttps://www.arabidopsis.org/index.jspgydF4y2Ba)及NCBI网站(gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/gydF4y2Ba）.利用BLAST程序鉴定荷花AGPase亚基基因。去除冗余序列后，利用SMART在线程序分析荷花AGPase亚基蛋白氨基酸序列的NTP_transferase结构域(gydF4y2Bahttp://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?gydF4y2Banormal = 1)。AGPase亚基蛋白的预测分子量(Mw)和等电点(pI)使用ExPASy门户网站(gydF4y2Bahttp://web.expasy.org/protparam/gydF4y2Ba）.利用MEME软件(gydF4y2Bahttp://meme-suite.org/index.htmlgydF4y2Ba)发现AGPase基因的保守基序。使用默认设置的ClustalX (ver.1.83)软件对基因进行多次序列比对。gydF4y2Ba

荷花AGPase基因的系统发育分析gydF4y2Ba

四种植物的AGPase亚基蛋白序列gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba采用水稻和玉米进行系统发育分析。树是用MEGA7软件用前面描述的neighbor - joining方法构建的[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。利用BLASTP程序鉴定了荷花与三种植物之间的同源AGPase亚基基因对。随后，利用同源基因对计算非同义(dN)和同义(dS)替代率，探索AGPase基因的进化动力学。dN/dS由最大似然(PAML) yn00程序计算，采用GMYN方法[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

RNA提取及qRT-PCR分析gydF4y2Ba

荷花品种在武汉植物园(N30°30′，E114°31′)试验田种植。在不同发育阶段收集组织和种子，立即在液氮中冷冻，并在- 80°C保存以备后用。总RNA采用植物总RNA分离试剂盒(北京佐满生物科技有限公司，北京，中国)提取。使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(批号M31212，北京TransGen生物科技有限公司，北京，中国)将高质量rna反转录为cDNA。qRT-PCR实验采用StepOnePlus Real-time PCR System (Applied Biosystems, USA)进行，计算相对基因表达量并归一化gydF4y2BaNnACTINgydF4y2Ba(基因编号NNU_24864)作为内标。利用Primer Premier 5.0软件根据基因编码序列设计qRT-PCR基因特异性引物，并进行商业化合成(天一汇源，武汉，中国)。用于qRT-PCR的引物在附加文件中列出gydF4y2Ba9gydF4y2Ba表S6。gydF4y2Ba

克隆gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba基因及其启动子区域gydF4y2Ba

基因和启动子特异性引物(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba表6)gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba是根据已发表的荷花基因组(gydF4y2Ba莲属椰子gydF4y2Ba)序列数据库[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。的编码序列(CDS)gydF4y2BaNnAGPL2agydF4y2Ba和gydF4y2BaNnAGPS1agydF4y2Ba以CA和JX的18个DAP种子的cDNA为模板，扩增了这两个基因的启动子区，并以CA和JX的基因组DNA进行了扩增。将相应的PCR片段克隆到pDONR ZEO中测序(TIANYI HUIYUAN, Wuhan, China)。JX和CA克隆的CDS和启动子序列通过ClustalX (ver.1.83)软件在默认设置下进行比较。使用PlantCARE程序分析顺式元素[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

AGPase活性测定gydF4y2Ba

使用ADPG焦磷酸化酶(AGP)试剂盒检测adp -葡萄糖焦磷酸化酶活性，试剂盒按照制造商说明书(Cat#BC0430，北京索拉生物科技有限公司，北京，中国)进行检测。收集不同时期(12、15、18、21和24 DAP)的种子组织和根茎样品，立即在液氮中冷冻，并在- 80°C保存待用。所有AGPase活性测定分三次进行，每个阶段用0.1 g新鲜组织进行一次重复测定。一个特定的酶单位被定义为在特定的分析条件下，每克组织每分钟催化一nmol NADPH转化的酶的量。吸收波长设置为340 nm，使用Infinite M200 Luminometer (Tecan, Mannerdorf, Switzerland)进行检测。gydF4y2Ba

莲子中营养成分的测定gydF4y2Ba

在武汉植物园的试验田中保存和种植了30个莲子品种，分析了种子的营养成分。种子在15dap和30dap采集，材料的采集符合当地和国家的指导方针。随后，将胚芽去除，种子在100℃烤箱(DHG-9146A, Shanghai)中干燥1 h，然后在65℃干燥至恒重。干燥的种子被磨成粉末，用100目筛过滤。营养成分的测定由武汉普罗涅茨生物技术有限公司进行。中国(武汉)。本实验采用3个重复。gydF4y2Ba

采用蒽酮-硫酸比色法测定可溶性糖和淀粉含量。将约0.1 g种子粉与10 ml 80%乙醇在离心管中充分混合，在80°C水浴中煮沸30分钟，然后离心。用上清液和球团分别测定可溶性糖和淀粉的含量。取2ml体积的上清液移入新的离心管，与0.5 ml蒽酮-乙酸乙酯(1 g蒽酮溶于50ml乙酸乙酯)和5ml浓硫酸混合，在100℃水浴中煮沸1min，室温冷却。用分光光度计(TU-1810D，中国北京)在630 nm处测定吸光度。对于淀粉含量，将颗粒转移到50ml容量瓶中，与20ml蒸馏水混合，在100°C水浴中煮沸30min。煮沸后加入9.2 mol/L高氯酸2 ml。提取15分钟，室温冷却。最后离心取上清液，用蒽酮比色法测定淀粉含量。gydF4y2Ba

用碘比色法测定直链淀粉的含量[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]。大约0.1 g的种子粉与9毫升1 mol / L氢氧化钠溶液混合在离心管中,煮在100°C水浴10分钟,在使用100毫升蒸馏水冷却能力,5毫升液体被转移到一个新的离心管,和50毫升蒸馏水,1毫升1 mol / L乙酸碘试剂和1毫升(0.2 g碘,20克碘化钾溶解在100毫升蒸馏水)添加轮流。用分光光度计在630 nm处测定吸光度。gydF4y2Ba

用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]。将约0.02-0.05 g种子粉与蒸馏水混合，磨成匀浆，4000rpm /min离心10 min，然后将上清1ml转移到新的离心管中，加入5ml考马斯亮蓝试剂(0.1 g考马斯亮蓝溶解于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85% (W/V)磷酸，蒸馏水加满至1l体积)。用分光光度计在595 nm处测定吸光度。gydF4y2Ba

多酚含量采用先前描述的folin-ciocalteu比色法测定[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]。将约0.02-0.05 g种子粉与10 ml 60%乙醇和盐酸(终浓度为0.024%)在离心管中混合，在75°C水浴中煮沸50 min。用分光光度计在765 nm处测定吸光度。gydF4y2Ba

支持本文结果的主要数据包含在本文和提供的附加文件中。的基因组数据gydF4y2Ban .椰子gydF4y2Ba“中国古董”可从GenBank (PID PRJNA168000，gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/wgs/?val=AQOG01gydF4y2Ba）.两个莲花品种CA和JX的表达丰度对应的公共转录组数据集可在NCBI的序列读取档案(SRA)中获得，登录号为SRP127765。gydF4y2Ba

AGPase:gydF4y2Ba

ADP-glucose焦磷酸化酶gydF4y2Ba

cd:gydF4y2Ba

编码序列gydF4y2Ba

度:gydF4y2Ba

差异表达基因gydF4y2Ba

dN:gydF4y2Ba

非同义gydF4y2Ba

dS:gydF4y2Ba

同义的gydF4y2Ba

Glc1P:gydF4y2Ba

Glucose-1-posphategydF4y2Ba

的PGM:gydF4y2Ba

PhosphoglucomutasegydF4y2Ba

pI:gydF4y2Ba

等电点gydF4y2Ba

PPi:gydF4y2Ba

焦磷酸gydF4y2Ba

SBE:gydF4y2Ba

淀粉支化酶gydF4y2Ba

SS:gydF4y2Ba

淀粉合成酶gydF4y2Ba

瑞士:gydF4y2Ba

可溶性淀粉合成酶gydF4y2Ba

苏西:gydF4y2Ba

蔗糖合酶gydF4y2Ba

UDPase:gydF4y2Ba

UDPglucose焦磷酸化酶gydF4y2Ba

感谢Rodrigo Matus (University of Durham, UK, Durham)和Abid Ullah (University of Malakand, Pakistan)对文章的语言修改。gydF4y2Ba

中国科学院前沿科学重点研究计划项目(QYZDB-SSW-SMC017)、中国科学院青年创新促进会项目(2017390)和国家自然科学基金项目(31872136,31772353)资助。资助者提供资金，但不参与研究设计、数据收集、分析和解释或手稿撰写。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 孙恒和李娟娟对这项工作也作出了同样的贡献。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 中国科学院武汉植物园植物种质改良与特色农业重点实验室，湖北武汉430074gydF4y2Ba

   孙恒，宋鹤云，杨东，邓先宝，刘娟，王云梦，马俊宇，熊雅倩，刘艳玲，杨梅gydF4y2Ba

2. 湖北工程大学生命科学与技术学院，湖北省植物功能成分利用工程技术研究中心，特色果蔬质量控制湖北省重点实验室，湖北孝感432000gydF4y2Ba

   Juanjuan李gydF4y2Ba

3. 中国科学院大学，北京玉泉路19A, 100049gydF4y2Ba

   宋鹤云，王云梦，马俊宇，熊亚倩gydF4y2Ba

4. 中国科学院核心植物园经济植物学研究中心，湖北武汉430074gydF4y2Ba

   杨东，邓先宝，杨梅gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

MY, HS和JJL负责构思和设计实验。HS、JJL、DY、HYS、YMW、JYM和YQX进行了实验。论文是HS写的。MY, XBD, JL和YLL修改了手稿。所有作者已阅读并同意稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba杨美gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和来源，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可协议中，除非在材料的署名中另有说明。如果材料未包含在文章的知识共享许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超过允许的用途，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域免责声明(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

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