结合全基因组关联研究和叶表皮转录组分析，确定了参与表皮蜡生物合成的候选基因gydF4y2Ba芸苔属植物显著gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

芸苔属植物显著gydF4y2BaL.是世界上最重要的油料作物之一。然而，气候变化引起的环境压力对其产量和质量产生了负面影响。众所周知，角质层蜡可以保护植物免受各种非生物/生物胁迫。解剖表皮蜡的遗传和生化基础，对培育抗逆性较好的品种具有重要意义。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

这是192例全基因组关联研究(GWAS)gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba利用栽培品种和自交系，鉴定与叶蜡相关的单核苷酸多态性(SNPs)。共发现202个snp与31个蜡类性状(包括总蜡覆盖率、蜡类和蜡类化合物数量)显著相关。接下来，从高蜡负荷(HW)和低蜡负荷(LW)的叶片表皮剥落，并用于分析所有gwass识别的基因的转录谱。结果显示，147个SNP在HW和LW系中存在差异表达，其中344个SNP对应基因在LW系中表达上调，448个SNP对应基因在HW系中表达下调。根据基因注释信息，将部分差异表达的基因分为植物酰基脂代谢途径，包括脂肪酸相关途径、蜡和角质生物合成途径和蜡分泌途径。一些参与细胞壁形成和应激反应的基因也已被鉴定出来。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

GWAS与转录组学分析结合发现了许多直接或间接的蜡相关基因及其相关snp。这些结果为进一步验证标记辅助育种的snp提供了线索，为蜡质生物合成的遗传控制和提高抗逆性提供了新的思路gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

芸苔属植物显著gydF4y2BaL. (2n = 38，基因组AACC)是由两个二倍体祖先物种之间的自然杂交进化而来的同种异体四倍体作物，gydF4y2Ba芸苔属植物拉伯gydF4y2Ba(AA, 2n = 20)和gydF4y2Ba芸苔属植物oleraceagydF4y2Ba(CC, 2n = 18)，然后是大约7500年前的染色体加倍[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．它是一种全球重要的油料作物，可提供食用油、生物燃料和工业化合物，如塑料的增塑剂和稳定剂、润滑剂和表面活性剂[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．但气候变化引起的干旱、高温等不利环境因素，严重影响其产量和品质[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．为了稳定或扩大油料供应，提高油料的耐应力能力是十分重要的gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba．植物的地上部分被角质层蜡覆盖，这是一种疏水化合物的混合物。在一些过度表达蜡相关基因的转基因作物中，观察到角质层蜡沉积增加和对缺水胁迫的耐受性提高[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]，表明这种疏水层可以保护植物免受非生物胁迫。gydF4y2Ba

表皮蜡由极长链脂肪酸(VLCFAs)及其衍生物，如醇、醛、烷烃、酮和蜡酯组成[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．这些脂肪蜡组分的生物合成涉及CgydF4y2Ba_16gydF4y2Ba- cgydF4y2Ba_18gydF4y2Ba脂肪酸在质体中的合成，CgydF4y2Ba_16gydF4y2Ba- cgydF4y2Ba_18gydF4y2Ba内质网(ER)中的脂肪酸延伸，以及随后通过脱碳或酰基还原途径的修饰[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在拟南芥中已经发现了许多参与表皮蜡质生物合成及其调控的基因。然而，表皮蜡质的遗传基础在gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba仍然没有被完全理解。蜡的负荷gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba与拟南芥的叶片相比，叶片的蛋白质含量要高得多。然而，这两种植物的蜡的组成模式是相似的，都由脂肪酸、醛、烷烃(主要化合物)、伯醇、仲醇、酮和酯组成。一种新的显性光面突变体的特性研究gydF4y2BaBnaA。GLgydF4y2Ba揭示了压抑的gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba(一种推测参与烷烃生物合成的醛脱碳酶基因)和其他与蜡相关的基因，如gydF4y2BaMAH1gydF4y2Ba(一种参与仲醇和酮生物合成的中链烷烃羟化酶基因)和gydF4y2BaWSD1gydF4y2Ba(一种蜡酯合成酶/酰基辅酶a:参与蜡酯生物合成的二酰基甘油酰基转移酶基因)通过烷烃途径彻底改变了蜡的生产gydF4y2BaB显著gydF4y2Ba［gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．的乘积gydF4y2BaKCS1gydF4y2Ba编码一种冷凝酶KCS1(3-酮酰基辅酶a合成酶1)，该酶参与蜡前体生物合成中的关键脂肪酸延伸过程[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．过度的gydF4y2BaBnKCS1-1gydF4y2Ba，gydF4y2BaBnKCS1-2gydF4y2Ba,gydF4y2BaBnCER1-2gydF4y2Ba在gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba促进角质层蜡的产生，提高抗旱性[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．过度的gydF4y2BaBnLAS,gydF4y2Ba该基因是GRAS家族的一员，被认为是转录调控因子，导致了拟南芥转基因叶片上的生长抑制、叶片衰老和开花时间延迟以及更多表皮蜡沉积[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．过度的gydF4y2BaBraLTP1gydF4y2Ba在gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba的脂质转移蛋白基因gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba，导致绿色异常，蜡沉积减少，导致叶片失水[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．然而，这些研究进展还不足以阐明植物角质层蜡产生的分子机制gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

最近，基于高通量基因分型技术的全基因组关联研究(GWAS)成为解剖作物复杂性状遗传结构的有力替代方法[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．在油菜籽中，花期等性状[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，种子含油量[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]、种子重量和种子质量[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，分支角度[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，收获指数[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，以及抵抗gydF4y2Ba菌核病gydF4y2Ba［gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，被GWAS解剖。然而，目前还没有油菜蜡质性状全基因组关联图谱的报道。gydF4y2Ba

在之前的研究中，517人gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba通过对叶片蜡质成分的遗传力分析，表明蜡质成分的变化主要受遗传因素驱动，可能适合于GWAS [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．罗等人[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]还应用GWAS分析确定了与多达50个叶蜡性状相关的假定snpgydF4y2Ba亚麻荠。gydF4y2Ba这些研究表明GWAS在检测蜡类成分相关基因方面是可行的gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba．此外，表皮蜡是在表皮细胞的ER中合成的，因此，空气表皮转录组可能更有效地识别参与蜡和角质层合成的候选基因[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在此，我们对192种植物叶片的总角质层蜡、蜡类和蜡化合物的含量进行了定量分析gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba加入两年。然后，利用31个蜡质性状进行GWAS检测可能与角质层蜡质生物合成相关的基因。为了进一步帮助蜡质相关基因的鉴定和探索蜡质生物合成的分子机制，通过对高和低蜡质负载下叶表皮的转录组测定了所有gwas鉴定的基因的表达谱gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba行。本研究首次使用GWAS工具和表皮转录组识别相关的候选基因gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba蜡特征。我们的研究结果为研究gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba表皮蜡新陈代谢;因此，为遗传改良奠定了基础gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba蜡改性耐应力。gydF4y2Ba

叶角质层蜡的表型变化gydF4y2Ba

总共192个gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba利用材料对2016年和2017年的叶蜡剖面进行了表征。该面板中的角质层蜡剖面与Tassone等人报道的相似。[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba和Holloway等人。[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．叶蜡主要由长链脂肪酸、醛、烷烃、伯醇(1-醇)、仲醇(2-醇)、酮和烷基酯组成。从7个蜡类中共得到21个优势化合物gydF4y2Ba_27gydF4y2Ba烷烃,CgydF4y2Ba_29gydF4y2Ba烷烃,CgydF4y2Ba_31gydF4y2Ba烷烃,CgydF4y2Ba_29gydF4y2Ba产品名称等。总蜡覆盖率、蜡类数量和每种主要蜡化合物的数量作为单一性状进行评估。另外，CgydF4y2Ba_29gydF4y2Ba烷烃,CgydF4y2Ba_29gydF4y2Ba酮和CgydF4y2Ba_29gydF4y2Ba2-醇，三种来自同一生物合成途径的最丰富的化合物也被评估为单一性状(总CgydF4y2Ba_29gydF4y2Ba)．烷烃形成途径的产物和乙醇形成途径的产物的总和也分别被表征为单一性状。31种蜡质性状的完整列表见表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．连续两年观察到这些蜡质性状的广泛表型变化(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。蜡总覆盖度为7.75 ~ 53.93 μg·cmgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}2016年(平均27.44 μg·cmgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba})和4.23 ~ 44.83 μg·cmgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}2017年(平均18.65 μg·cmgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba})．gydF4y2Ba

双向方差分析表明，大部分蜡质性状受基因型(G)、年份(Y)及其相互作用(G × Y)的影响。gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001)，说明环境在蜡合成调控中起着不可或缺的作用gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．遗传力值从0.60 (CgydF4y2Ba_28gydF4y2Ba酸)到0.84 (CgydF4y2Ba_27gydF4y2Ba烷烃)为每个独立的蜡性状(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．大部分蜡性状在gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba显示连续变化，近似正态分布(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)，表明蜡质性状受多基因控制。gydF4y2Ba

CgydF4y2Ba_29gydF4y2Ba烷烃和CgydF4y2Ba_29gydF4y2Ba酮(r = 0.69)和CgydF4y2Ba_29gydF4y2Ba烷烃和CgydF4y2Ba_29gydF4y2Ba2-醇(r = 0.67)是由烷烃分支途径产生的，1-醇与CgydF4y2Ba_38gydF4y2Ba酯(r = 0.87)， CgydF4y2Ba_40gydF4y2Ba酯(r = 0.93)， CgydF4y2Ba_42gydF4y2Ba酯(r = 0.63)，由酒精分支途径产生gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S1)。烷烃形成途径和酒精形成途径的产物之间也存在较高的正相关系数(r = 0.72)，表明这些蜡的组成不受独立调控(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S1)。gydF4y2Ba

群体结构与亲缘关系gydF4y2Ba

缺失数据< 0.2,MAF > 0.2的4623个snp的子集，在整个样本中均匀分布gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba群体结构分析可以提供最优的子群数量(即最优K值)和每个子群在每次加入时所占的比例(即Q矩阵)，这有助于在下一次关联分析中选择最优K值对应的Q矩阵，从而控制群体结构引起的假阳性。对可能聚类(K)从1到10进行的聚类推断表明，当K从2增加到4时，可能性发生了最显著的变化(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa)，当k = 4时Δk-value达到最高值(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).基于Evanno等人描述的Δk方法。[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba， 192个资料可划分为4个主要亚群体，分别为P1、P2、P3和P4(图4)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac).大部分春季油菜品种分布在P1，大部分冬季油菜品种分布在P2和P3gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表S2)。gydF4y2Ba

遗传亲缘性分析显示，55.8%的成对亲缘关系为0,69%的亲缘关系在0 ~ 0.05之间(图5)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaD)，表明该组中的大多数亲缘关系不强或弱，这可能与基因型的广泛收集有关。遗传关联分析的结果将作为随机效应协变量矩阵(K矩阵)在GWAS模型中使用，以避免在下一次关联分析中出现假阳性。gydF4y2Ba

用染色体距离来测量连锁不平衡(LD)衰减率，其平均配对相关系数(gydF4y2BargydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)下降到最大值的一半。192个油菜品系A和C亚基因组全基因组LD衰变如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae. A亚基因组的LD比C亚基因组的LD衰减快。A亚基因组的平均距离为500 kb, C亚基因组的平均距离为1600 kb，其中gydF4y2BargydF4y2Ba^2gydF4y2Ba衰变至0.1。gydF4y2Ba

协会的映射gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba对蜡特征gydF4y2Ba

为评价种群结构(Q, PCA)和亲缘关系(K)的影响，分别用Q, PCA, K, PCA + K, Q + K和naïve(不控制Q, PC和K) 6个模型对31个蜡质性状进行了关联分析(附文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S2)。根据gydF4y2BaPgydF4y2Ba在进行GWAS时，采用PCA + K、Q + K、K等线性混合模型可以有效地校正种群结构和亲缘关系。最终选择PCA + K模型对C进行关联映射gydF4y2Ba_28gydF4y2Ba酸,CgydF4y2Ba_26gydF4y2Ba烷烃,CgydF4y2Ba_30.gydF4y2Ba烷烃,CgydF4y2Ba_29gydF4y2Ba产品名称,gydF4y2Ba_29gydF4y2Ba酮CgydF4y2Ba_38gydF4y2Ba其余25个蜡质性状的Q + K模型用于控制GWAS群体结构。因此，在全基因组扫描中，共识别出31个蜡质性状的202个显著相关snp (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 2.95 e-05)(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S3;额外的文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S3)。在这些snp中，有18个与多个蜡质性状共同相关gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S3)。例如，Bn-A01-p6380934、Bn-A05-p2030789和bn - scaffold _15798_1-p733219同时与总蜡、烷烃、烷烃形成途径和1-醇形成途径相关。标记Bn-A02-p25285941与C密切相关gydF4y2Ba_26gydF4y2Ba1-醇，总1-醇和1-醇形成途径。Bn-A08-p16793918与C密切相关gydF4y2Ba_38gydF4y2Ba酯CgydF4y2Ba_40gydF4y2Ba酯CgydF4y2Ba_42gydF4y2Ba酯和总酯。Bn-A05-p19622826与C密切相关gydF4y2Ba_28gydF4y2Ba醛,CgydF4y2Ba_29gydF4y2Ba2-醇，总共2-醇。根据A-和C-亚基因组的LD衰变情况，选取A-亚基因组上相关snp上下游~ 250kb和C-亚基因组上相关snp上下游~ 800kb的基因进行候选基因鉴定。SNP与C无显著相关性gydF4y2Ba_30.gydF4y2Ba醛。gydF4y2Ba

全基因组表达谱gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba基于RNA-seq数据的表皮gydF4y2Ba

接下来，将表皮RNA分别汇集在高蜡负荷系(HW)和低蜡负荷系(LW)中，并进行测序。LW系叶片的蜡质负荷比HW系低53-70%。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab). LW系叶片中烷烃、2-醇和酮的含量显著降低(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa和c).通过将所有唯一序列映射到gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba基因组，总共获得了21649万个映射reads(258.15个clean reads)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:表S4)。高相关性(RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba> 0.98)，表明测序结果是可靠的(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:图S4)。使用软件DESeq [gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]和FDR < 0.001和绝对倍数变化≥4作为标准，在HW和LW系之间共检测到6966个差异表达基因(DEGs)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba:图S5)。在deg中，与HW相比，LW中有4608个基因下调，2358个基因上调(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).由于本研究使用的表皮样本可能包含所有表皮细胞类型，因此细胞类型特异性基因，如保护细胞特异性基因，也可能包含在DEGs中。在490个被鉴定为编码转录因子(tf)的DEGs中，与HW相比，LW中有152个表达上调，而338个表达下调gydF4y2Ba10gydF4y2Ba:表S5)。另外，20个转录因子仅在LW中表达，109个仅在HW中表达。在这些差异表达的tf中，MYB型86个，锌指型44个，AP2/ERF型40个，其他(附文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba:表S5)。约70%的MYB、WRKY、ERF和锌指型基因在LW中表达下调，其中21个MYB、7个WRKY、3个ERF和7个锌指型基因在LW中未表达。在拟南芥中发现了一些与蜡质调控相关的特异基因，如gydF4y2BaMYB16gydF4y2Ba而且gydF4y2BaMYB30gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba:表S5)。据报道，过度表达gydF4y2BaMYB30gydF4y2Ba在转基因拟南芥植物中促进角质层蜡的产生[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]，而MYB16则是营养器官角质层形成的主要调节因子[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．我们的结果表明，MYB家族可能在蜡质调控中发挥作用gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

中DEGs的功能分类gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba表皮gydF4y2Ba

为了监测LW和HW系之间基因表达模式的差异，进行了基因本体论(GO)富集分析gydF4y2Ba11gydF4y2Ba:图S6)。在HW和LW之间的DEGs中，对胁迫、细胞壁和转录因子活性等的响应显著增加了顶端GO项gydF4y2Ba12gydF4y2Ba:图S7)。在KEGG显著富集的通路中，有12个DEGs在脂肪酸延伸中被注释(ko00062)(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab)和14个DEGs在蜡中注释，角质和suberin生物合成(ko00073)(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac和d)。在大多数情况下，多个DEG被分配到KEGG通路中的同一酶上。gydF4y2Ba

候选基因的鉴定gydF4y2Ba

为了减少假阳性错误，用HW和LW叶表皮的转录组测定了A-和C-亚基因组上候选基因区域的表达谱。共发现792个gwas鉴定的基因与147个gwas鉴定的snp在HW和LW系之间存在差异表达，其中LW较HW表达上调的基因有344个，下调的基因有448个(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一个;额外的文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S3)。KEGG通路分析显示，一些gwas鉴定的差异表达基因富集于脂肪酸延伸、蜡生物合成、角质和亚脂生物合成通路(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab, c和d)。拟与蜡相关的基因列于表中gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，包括一些报道gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba直向同源基因。例如,gydF4y2BaBnaA10g00700DgydF4y2Ba，gydF4y2BaBnaC09g16050DgydF4y2Ba而且gydF4y2BaBnaC09g51620DgydF4y2Ba被标注为gydF4y2BaKCS1gydF4y2Ba，gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaMAH1gydF4y2Ba，分别涉及VLCFAs生物合成、烷烃生物合成和仲醇酮生物合成(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab和c;表格gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

为了进一步验证RNA-seq分析的有效性，采用qRT-PCR检测了GWAS和RNAseq常用的10个基因的表达谱。结果表明，LW和HW这10个基因的表达变化与RNAseq分析结果相似(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，表明RNA-seq数据的可靠性。gydF4y2Ba

显著gydF4y2Ba是一种基因组结构复杂的异源四倍体作物，这对全基因组SNP的发现提出了巨大的挑战。本研究利用芸苔属60 K SNP阵列对192个品系进行了基因分型，并对其角质层蜡的变化进行了连续2年的研究。在GWAS中共鉴定出31个蜡质性状的202个显著相关snp(附加文件)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S3)。选择LD衰变范围内的SNP对应基因进行候选基因的鉴定。考虑到现有基因全基因组识别方法的显著局限性，如GWAS中仍存在假阳性和阴性结果[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，我们进一步分析了在gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba叶从HW和LW系。通过将GWAS与转录组数据进行整合，发现73% GWAS识别的SNPs，包括792个基因，在HW和LW系之间存在表达差异(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).虽然不可能明确地说这些基因与蜡质性状相关，但它们应该被认为是潜在的蜡质相关基因。gydF4y2Ba

根据GO分析，有机物质代谢过程、细胞代谢过程、初级代谢过程、单生物细胞过程和对刺激的反应富集了大部分相关基因。许多基因在细胞过程和代谢过程中富集，提示蜡的产生和沉积是一个复杂的多基因网络gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba．表皮蜡是在表皮细胞质体中与新生C合成的gydF4y2Ba_16gydF4y2Ba和CgydF4y2Ba_18gydF4y2Ba脂肪酰基酰基载体蛋白(ACPs)的合成。gydF4y2BaBnaC09g10800DgydF4y2Ba， SNP bn - scaffold _17487_1-p812141 LD范围内的候选基因，编码拟南芥同源gydF4y2Ba内三世gydF4y2Ba［gydF4y2Ba36gydF4y2Ba并且可能与从头合成脂肪酸有关。在被导出到急诊室之前，CgydF4y2Ba_16gydF4y2Ba和CgydF4y2Ba_18gydF4y2Ba脂肪酸被脂肪酸酰基- acp硫酯酶(FaTA和FaTB)从ACPs中释放出来，随后被长链酰基-辅酶A合成酶(LACS)酯化为辅酶A (CoA) [gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．这些脂肪酸的酰基辅酶a形式被脂肪酸延长酶(FAE)复合物在ER中拉长为VLCFAs的蜡质前体。在这项研究中,gydF4y2BaBnaA05g23790DgydF4y2Ba，gydF4y2BaBnaC06g43550DgydF4y2Ba而且gydF4y2BaBnaA07g08340DgydF4y2Ba分别位于标记Bn-A05-p19622826、bn - scaffold _16485_1-p747170和Bn-A07-p6765464的LD范围内，编码了可能参与C释放的FaTAgydF4y2Ba_18gydF4y2Ba来自ACP的脂肪酸[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．gydF4y2BaBnaA10g00700DgydF4y2Ba，gydF4y2BaBnaA10g02480DgydF4y2Ba而且gydF4y2BaBnaA10g00380DgydF4y2Ba， SNP Bn-A10-p4786596对应基因，被注释为KEGG通路中编码KCS1、KCS2和CYP86A4的基因，催化VLCFAs和角质的生物合成(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2BaB和d) [gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．过度的gydF4y2BaBnaA10g00700D / BnKCS1-2gydF4y2Ba在gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba能促进角质层蜡的产生[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．gydF4y2BaBnaA01g13470DgydF4y2Ba而且gydF4y2BaBnaA05g31340DgydF4y2Ba， LD中的两个基因分别与标记SNP bn - scaffold _18636_1-p11498和bn - scaffold _20270_1-p1172081编码拟南芥同源基因gydF4y2BaLACS4gydF4y2Ba而且gydF4y2BaLACS6gydF4y2Ba分别为(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]，并可能参与从脂肪酸到辅酶a硫酯的激活。gydF4y2Ba

延伸后，vlc -酰基辅酶a通过酰基还原或脱碳途径被修饰。在酰基还原途径中，脂酰辅酶a还原酶(FAR)催化脂酰辅酶a生成伯醇[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]，蜡酯合酶/酰基辅酶a:二酰基甘油酰基转移酶1 (WSD1)催化伯醇和脂肪酸生成蜡酯[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．在脱碳途径中，由er定位的CER1、CER3和细胞色素B5络合物将vlc -酰基辅酶a催化成烷烃[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．最近有报道称，CER1的同源物CER1- like1也参与了烷烃的形成[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．随后，烷烃被链中烷烃羟化酶1 (MAH1)氧化为仲醇和酮[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．在本研究中，在LD块中发现了一些与拟南芥表面脂质生物合成相关基因同源的DEGs。例如,gydF4y2BaBnaA02g05700DgydF4y2Ba位于LD上的标记SNP Bn-A02-p5516551与拟南芥同源gydF4y2BaAlcFAR1gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac) (gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．gydF4y2BaBnaA02g15790DgydF4y2Ba位于LD的SNP Bn-A02-p7004091，注释为gydF4y2BaWSD1gydF4y2Ba-gydF4y2Ba就像gydF4y2Ba．gydF4y2BaBnaC09g16050DgydF4y2Ba， SNP bn - scaffold _20836_1-p125625对应基因，注释为拟南芥同源gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba在KEGG通路中(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Bac)。过度的gydF4y2BaBnaC09g16050D / BnCER1-2gydF4y2Ba在gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba能促进烷烃的生物合成[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．gydF4y2BaBnaA05g06830DgydF4y2Ba位于LD的SNP Bn-A05-p4055839，注释为gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba-gydF4y2Ba像2gydF4y2Ba在KEGG通路。gydF4y2BaBnaC09g51620D,gydF4y2Ba在LD中定位于SNP bn - scaffold _17526_1-p1726345，编码拟南芥MAH1的同源同源体(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac) (gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．gydF4y2BaBnaC09g10340DgydF4y2Ba在LD中定位于SNP bn - scaffold _17487_1-p812141，编码拟南芥同源gydF4y2BaALE2gydF4y2Ba，与角质层的发育有关[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在内质网中合成的蜡组分需要输出到细胞外基质。在目前的研究中，发现一些基因在脂质运输和维持内质网形态中起作用。例如,gydF4y2BaBnaA07g08720DgydF4y2Ba位于LD位点的SNP Bn-A07-p6765464与拟南芥同源gydF4y2BaLTPG1gydF4y2Ba参与角质层蜡的输出[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba];gydF4y2BaBnaC04g45800DgydF4y2Ba，位于LD与标记bn - scaffold _16888_1-p1834154同源gydF4y2Bab·拉伯LTP1gydF4y2Ba，作为脂质转移蛋白成员参与蜡的产生或沉积[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．gydF4y2BaBnaA08g17990DgydF4y2Ba，位于LD与Bn-A08-p16793918同源gydF4y2Ba拟南芥ERD2gydF4y2Ba它介导含有c端K/HDEL信号的可溶性er定位蛋白的运输[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

虽然通常认为角质层与多糖下的表皮细胞壁是独立的，但角质层与细胞壁在结构上是相关的(角质层深入细胞壁)，彼此之间有一些重叠的功能[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．在本研究中还观察到与细胞壁有关的几种DEGs。例如,gydF4y2BaBnaA05g32440DgydF4y2Ba而且gydF4y2BaBnaA05g32300DgydF4y2Ba在LD中定位于SNP Bn-A05-p23445454，编码拟南芥的正交同源gydF4y2Ba木聚糖生物合成基因AXY9gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba纤维素synthase-like D3gydF4y2Ba（gydF4y2BaCSLD3gydF4y2Ba)，它们分别参与细胞壁的形成[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

一些与压力反应相关的基因也已经被发现，比如gydF4y2BaBnaC04g11110DgydF4y2Ba的正交对数gydF4y2Ba拟南芥对脱水基因响应gydF4y2Ba（gydF4y2BaRD20gydF4y2Ba)，属于脂质表面蛋白家族的一员。对gydF4y2Ba葡萄孢菌gydF4y2Ba观察到感染和水分不足gydF4y2Bard20gydF4y2Ba突变体(gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．为适应干燥环境，植物增加叶片角质层蜡质沉积，以限制非气孔水的流失，避免脱水[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．gydF4y2BaBnaC02g39310DgydF4y2Ba，gydF4y2BaBnaC02g39360DgydF4y2Ba而且gydF4y2BaBnaA02g27940DgydF4y2Ba，可能编码拟南芥的同源基因gydF4y2BabZIP63gydF4y2Ba，gydF4y2BaWRKY74gydF4y2Ba而且gydF4y2BabHLH105gydF4y2Ba/gydF4y2BaILR3gydF4y2Ba它们参与调节对饥饿、耐盐和多重应激反应的反应[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]，也在本研究中得到。植物角质层的蜡质与提高植物的耐受力有关。在本研究中，通过gwass - rnaseq联合方法，发现了一些胁迫响应相关基因，提示角质层蜡质的生物合成与环境刺激的响应直接或间接相关。然而，除了调节植物对胁迫的反应外，这些基因是否在蜡的生物合成中有重叠作用还不清楚。需要进一步的研究来探索这些被识别的基因的确切作用。gydF4y2Ba

在本研究中，一些特征良好的拟南芥蜡质相关基因可以通过表皮转录组识别，如gydF4y2BaBnaC02g37590DgydF4y2Ba(同源gydF4y2BaAtMYB16gydF4y2Ba),gydF4y2BaBnaC02g05990DgydF4y2Ba(同源gydF4y2BaAtMYB30gydF4y2Ba)(额外的文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba:表S5) [gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]，而GWAS无法识别它们，这意味着这些基因在蜡质产生中的作用可能通过可变表达发挥作用。我们的结果表明，结合GWAS和表皮转录组测序分析可以提高检测表皮蜡质生物合成相关基因的效率，并优先考虑可能的候选基因，尽管一些蜡质相关基因在基因转录上没有变化，但对酶功能/活性有影响的基因可能被忽略。gydF4y2Ba

本研究首次使用GWAS工具和表皮转录组识别与之相关的候选基因gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba蜡特征。共发现202个snp与31个蜡质性状显著相关。此外，在HW和LW系中发现792个gwasis鉴定的基因及其相关的147个snp表达差异，其中LW较HW表达上调的基因有344个，下调的基因有448个。这些snp为进一步探索和验证标记辅助育种提供了线索，提出的蜡质相关基因为蜡质代谢的遗传控制和提高耐胁迫能力提供了新的思路gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

植物材料与实验设计gydF4y2Ba

总共192个gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba春季、半冬季和冬季类型的样本在本研究中用于关联分析(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表S2)。所有资料由西南大学重庆油菜籽工程技术研究中心提供。其中大部分来自中国的研究机构，其余来自德国、丹麦和加拿大。实验在重庆市北碚区协马实验站(29°45′n, 106°22′38E)进行。的gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba在2016年9月、2017年9月、每3次重复的随机完全块中进行播种。每株栽培两行，行间40厘米，株间20厘米。进行常规现场管理。种植后9周(12月下旬，所有材料的开花前阶段)，从所有地块收集均匀和完全展开的叶片样本进行蜡质性状调查。2016年和2017年9月、10月、11月和12月月平均气温分别为22.9和23.3℃、18.9和17.4℃、12.7和13.3℃、9.4和8.3℃;月雨量分别为95.7和71.9 mm、96.9和178.4 mm、89.7和25.5 mm、17.1和6.9 mm。gydF4y2Ba

表皮蜡分析gydF4y2Ba

根据Wang等人的描述，确定了所有材料叶片的角质层蜡成分。[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，只是做了一些修改。每次加入时，每重复从三株植物中取三片叶子(从顶部取第三片叶子)。采样工作在三天内完成。用含10 μg四烷的氯仿(Sigma Aldrich, missouri, USA)提取叶角质层蜡作为内标。然后用50 μL N, o -双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)和50 μL吡啶进行衍生。将衍生提取物干燥，再溶于氯仿中进行GC-FID分析。用质谱、内标和叶面积对蜡化合物进行了鉴定和定量。叶面积测定采用ImageJ软件(gydF4y2Bahttp://rsb.info.nih.gov/ij/gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

2016年和2017年对蜡质性状进行了3个重复的研究gydF4y2Ba13gydF4y2Ba:表S6)。每个加入的蜡质性状定义为同一年三次重复的平均值。对于每个蜡质性状，基于使用lme4包的线性模型，在两年的时间内估计每个品系的最佳线性无偏预测因子(BLUP) [gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．BLUP值被用作关联分析的表型。广义遗传力计算为gydF4y2BaHgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba=gydF4y2BaδgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba^2gydF4y2Ba/ (gydF4y2BaδgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba^2gydF4y2Ba+gydF4y2BaδgydF4y2Ba_{通用电气gydF4y2Ba}^2gydF4y2Ba/gydF4y2BangydF4y2Ba+gydF4y2BaδgydF4y2Ba_egydF4y2Ba^2gydF4y2Ba/gydF4y2BanrgydF4y2Ba),gydF4y2BaδgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba^2gydF4y2Ba是遗传方差，gydF4y2BaδgydF4y2Ba_{通用电气gydF4y2Ba}^2gydF4y2Ba为基因型与年份的互作方差，gydF4y2BaδgydF4y2Ba_egydF4y2Ba^2gydF4y2Ba为误差方差，n为年数，r为一年内的重复次数。gydF4y2Ba

SNP基因分型，筛选和SNP的硅胶定位gydF4y2Ba

使用Brassica 60 K Illumina SNP阵列进行SNP基因分型，并使用Illumina genome estudio基因分型软件对SNP数据进行分析。研究中排除了呼叫频率< 0.8或MAF < 0.05的snp。经处理，31846个SNP序列与gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba， e值截止值< ' 1E-10 '。选取E值最小、得分最高的爆炸命中进行进一步分析。gydF4y2Ba

种群结构、亲缘关系与失衡(LD)分析gydF4y2Ba

选取4623个SNPs的子集(缺失数据< 0.2,MAF > 0.2，在染色体上的唯一位置)，进行种群结构和亲缘关系分析(K)。使用基于模型的程序structure 2.3.4软件，利用贝叶斯马尔可夫链蒙特卡罗模型(MCMC)估计种群结构(Q) [gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．进行了5次独立试验，k值(遗传组的假定数量)从1到10。在“混合模型”下，燃烧周期长度和燃烧后的MCMC复制次数均设置为10万次迭代。最佳K值由STRUCTURE输出中的数据[LnP(D)]的对数概率和基于LnP(D)在连续K值之间的变化率(Evanno等人描述)的统计量Δk确定。[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．对STRUCTURE上的重复运行结果进行集成，利用clupp软件获得Q矩阵[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]，并使用DISTRUCT软件图形化显示[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．自然种群的相对亲缘关系矩阵采用TASSEL 5.2.1计算[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．两次访问之间的所有负值都设置为0。通过参数估计A-和c -亚基因组上成对snp (MAF≥0.05)之间的连锁不平衡(LD)gydF4y2BargydF4y2Ba^2gydF4y2Ba用TASSEL软件5.2.1版本计算[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

全基因组关联研究gydF4y2Ba

分别采用Q(控制种群结构)、PCA(控制主成分)、K(控制亲缘关系)、PCA + K(控制主成分和亲缘关系)、Q + K(控制种群结构和亲缘关系)和naïve(不控制种群结构和亲缘关系)6个模型进行性状- snp关联分析。初始、Q和PCA模型使用一般线性模型(GLM)进行;K、Q + K和P + K模型采用混合线性模型(MLM)。GLM和MLM都在TASSEL 5.2.1中实现[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．针对每个性状，根据-log的分布选择最优模型gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba（gydF4y2BaPgydF4y2Ba)每个SNP的值相对于分位数-分位数(Q-Q)图中的期望值[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．将显著snp -trait关联的统一阈值设置为−loggydF4y2Ba_10gydF4y2Ba（gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 4.50，在R包qqman中生成了一个曼哈顿的情节[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．选择a亚基因组上相关SNPs上下游~ 250 kb和c亚基因组上相关SNPs上下游~ 800 kb的基因进行候选基因的鉴定。gydF4y2Ba

差异表达基因的转录组测序和鉴定gydF4y2Ba

从GWAS群体中选取3个高蜡负荷系(HW)和3个低蜡负荷系(LW)进行转录组测序，分别为中双11号、十里家和养优6号(HW)和SWU68、铜陵花野和盛光77 (LW)。分别从HW系和LW系中提取叶片表皮，进行3个生物重复。在每次复制中，从每一行中抽取两个独立的植株，并将其汇集在一起。人工从叶片上剥离表皮，形成一层透明薄膜。从果皮样品中提取总RNA进行测序和定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)。测序文库的制备和测序反应在生物标记技术公司(北京，中国)进行。测序文库使用NEBNext UltraTM RNA文库准备试剂盒(NEB, USA)构建。随后，在Illumina平台上对这些库进行测序，并生成对端读取。gydF4y2Ba

在删除包含适配器的读取、包含ploy-N的读取和低质量的读取后，原始读取转换为干净的读取。然后将这些干净的读数映射到gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba参考基因组序列使用Hisat2工具软件。定量的基因表达水平估计的片段每千基转录本每百万的片段映射。根据错误发现率(FDR) < 0.001，绝对折叠变化≥4的标准，筛选出HW和LW表达差异显著的基因。转录因子预测使用BMKCloud (gydF4y2Bawww.biocloud.netgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

差异表达基因的GO和KEGG富集分析gydF4y2Ba

为了评估DEGs的生物学意义，利用基于Wallenius非中心超几何分布的GOseq R包实现了氧化石墨烯富集分析[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]，它可以调节DEGs中的基因长度偏倚。基于Kolmogorov-Smirnov like检验，得到具有统计学意义的GO项。利用KOBAS软件进行KEGG途径富集分析[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

qRT-PCR对DEGs的验证gydF4y2Ba

根据GWAS与RNA-seq分析相结合的结果，筛选出10个候选基因进行qRT-PCR分析。qRT-PCR的引物列于附加文件gydF4y2Ba14gydF4y2Ba:表S7，和gydF4y2Ba7 . B. napus actingydF4y2Ba基因(gydF4y2BaBnACT7gydF4y2Ba)被用作内部控制。总RNA与RNA测序相同。qRT-PCR检测采用Bio-Rad CFX96实时PCR检测系统，使用SYBR预混Ex TaqII (Takara，北京，中国)。相对基因表达量用2gydF4y2Ba^{−ΔΔCtgydF4y2Ba}方法。三个独立的生物重复，每个重复有两个技术重复，分别对HW和LW进行分析。gydF4y2Ba

原始rna测序数据来自gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba叶表皮沉积在NCBI中，SRA注册号PRJNA602672 (gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA602672gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

BLUP:gydF4y2Ba

最佳线性无偏预测gydF4y2Ba

度:gydF4y2Ba

差异表达基因gydF4y2Ba

远:gydF4y2Ba

脂肪酰coa还原酶gydF4y2Ba

罗斯福:gydF4y2Ba

错误发现率gydF4y2Ba

GWAS:gydF4y2Ba

全基因组关联研究gydF4y2Ba

HW:gydF4y2Ba

高蜡油载重线gydF4y2Ba

LD:gydF4y2Ba

连锁不平衡gydF4y2Ba

LW:gydF4y2Ba

Low-wax载重线gydF4y2Ba

MAH1:gydF4y2Ba

中链烷烃羟化酶1gydF4y2Ba

传销:gydF4y2Ba

混合线性模型gydF4y2Ba

高:gydF4y2Ba

多元线性回归gydF4y2Ba

存在:gydF4y2Ba

定量一gydF4y2Ba

单核苷酸多态性:gydF4y2Ba

单核苷酸多态性gydF4y2Ba

TFs:gydF4y2Ba

转录因子gydF4y2Ba

WSD1:gydF4y2Ba

蜡酯合酶/酰基辅酶a:二酰基甘油酰基转移酶gydF4y2Ba

感谢西南大学的Y. J. Guo博士的GC-MS分析。gydF4y2Ba

本研究得到国家自然科学基金项目(31771694)和重庆市基础与先进研究项目(cstc2018jcyjA0857)的资助。作者声明，没有任何资助机构在研究设计、数据收集和分析以及稿件准备中发挥任何作用。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 金树荣和张双娟对这项工作做出了同样的贡献。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 西南大学农业科学院农学与生物技术学院，重庆400716gydF4y2Ba

   金淑荣，张双娟，刘玉华，蒋友伟，王艳梅，李佳娜，倪宇gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

YN和JL在概念和设计上做出了巨大的贡献。SZ、SJ和YW进行了表型分型，并进行了基因分型和生物信息学分析。SJ和YL从事转录组测序分析。SZ, YL, YJ和YN准备了图表和/或表格。YN分析了所有的数据并写了手稿。所有作者都对结果进行了讨论和评论。所有作者阅读并批准了最终稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaYu倪gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明没有利益竞争。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循创作共用署名4.0国际许可协议(Creative Commons Attribution 4.0 International License)，该协议允许在任何媒体或格式中使用、分享、改编、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的署名，提供创作共用许可协议的链接，并说明是否有更改。本文中的图片或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料不包含在文章的创作共用许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超出了允许的用途，您将需要直接从版权所有者那里获得许可。欲查看此许可证的副本，请访问gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献放弃书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba