多年生黑麦草材料耐热性相关的生理性状、分子标记和叶绿素分解代谢基因的自然变异

背景

耐热性及其相关性状的遗传多样性鉴定对提高凉季草的耐热性具有重要意义。本研究的目的是确定多年生黑麦草与表型和生理性状相关的耐热性的遗传变异，并识别与耐热性相关的分子标记。多年生黑麦草l .)。

结果

将98份供试材料的植株在生长箱中经受热胁迫(35/30°C，昼夜)或最佳生长温度(25/20°C) 24 d。根据8个表型和生理性状，采用主成分分析(PCA)对这些材料的整体耐热性进行排序。其中，电解质渗漏(EL)、叶绿素含量(Chl)、相对含水量(RWC)与耐热性PCA排名的相关系数分别为−0.858、0.769和0.764。我们还发现了四种Chl分解代谢基因(CCGs)的表达水平LpNYC1，LpNOL，LpSGR,LpPPH在热胁迫下，热敏性黑麦草品种显著高于耐热性黑麦草品种。利用66对SSR (simple sequence repeat, SSR)标记对PCA结果进行关联分析。黑麦草群体结构可分为3个类群，其中C类群的材料耐热性较A和b类群的材料强，发现与上述性状显著相关的SSR标记(R²> 0.05,p< 0.01)。，including two pairs of markers located on chromosome 4 in association with Chl content and another four pairs of markers in association with EL.

结论

研究结果不仅确定了多年生黑麦草耐热育种的重要生理参数EL、Chl含量和RWC及其相关SSR标记，而且揭示了Chl分解代谢在黑麦草耐热育种中的作用。这些认识对多年生黑麦草和其他冷季牧草的耐热育种和耐热机制具有重要意义。

提高耐热性是冷季草品种育种改进的主要努力之一[1］．具有较大遗传变异性和广泛耐热性的可利用种质资源是牧草育种的重要育种材料[2，3.，4］．为了更好地利用种质资源，了解其遗传多样性及其耐热性的生理和分子因素对培育耐热品种至关重要。

利用表型性状和分子标记了解遗传结构和表型多样性是育种中性状改良(如耐热性)的亲本选择的基础[5，6，7］．表型分析侧重于种质间的生长、形态和生理参数，并提供有关遗传多样性、同质性和稳定性的信息[7，8］．由于非生物胁迫对许多形态和生理过程产生不利影响，许多不同的形态和生理特征被用作标记性状，以评估植物抗胁迫的遗传变异，如根系活力(RA)、光化学效率(Fv/Fm)、光合速率(Pn)、水分利用效率(WUE)、叶绿素(Chl)含量和叶片相对含水量(RWC) [7，9，10，11］．基于生理性状的种质选育是提高作物品种抗逆性的有效途径[7，12，13，14］．在冷季草的耐热性育种中，这种与耐热性密切相关的生理性状的信息仍然很大程度上不清楚。

已开发出与表型和生理性状相关的分子标记，以了解遗传多样性并预测特定种质或育种材料的理想性状[7］．迄今为止，与多年生黑麦草几个重要农艺性状相关的分子制造体已被开发出来，包括抗冠锈病[15，耐旱性[16]、冬季生存和春季再生[17下沉),(18]和耐盐性(Tang等人，2013)。例如，Yu et al.(2011)利用109个简单序列重复(SSR)标记评估了99个不同的多年生黑麦草材料的耐淹性，并鉴定出15对与几种形态和生理性状(如叶片颜色、Fv/Fm、最大株高和相对生长速率)改变相关的SSR标记[18］．Tang等(2013)利用66个SSR标记对56个不同来源的多年生黑麦草材料的遗传多样性进行了分析，发现群体结构影响表型性状和等位基因变异LpNHX1可能解释多年生黑麦草耐盐性的变化[19］．然而，与耐热性相关的分子标记在多年生冷季草种中有待开发。

黑麦草(多年生黑麦草L.)，原产于欧洲、亚洲和北非，是全球温带地区最广泛种植的多年生冷季草，用作草皮和饲料[20.，21］．多年生黑麦草被认为是一种热敏感的草种，现有的黑麦草草地经常受到热胁迫的挑战。尽管如前所述，多年生黑麦草对其他各种胁迫和疾病具有多样性，但既没有定量测量多年生黑麦草种质间耐热性的多样性，也没有开发出与该物种耐热性相关的分子标记。本研究的目的是了解多年生黑麦草的生理性状，并鉴定与耐热性相关的分子标记。这些知识将对多年生黑麦草和其他冷季草的耐热育种有价值。

98个多年生黑麦草材料耐热性的评价

利用7个生理性状(WUE、Pn、RA、Chl含量、RWC、EL和Fv/Fm)和3个表型性状(TQ、LW和PH)对98份多年生黑麦草材料的耐热性进行了评价。补充材料1)．热应激处理、基因型和这两个因素的相互作用均显著(p≤0.05)的WUE、Pn、RA、Chl、RWC、Fv/Fm、EL和TQ。只有基因型变异对LW和PH有显著影响1)．

将98份暴露于热胁迫或最佳温度(对照)条件下的材料的生理和表型性状数据绘制成热图(图1)。1)，其中层次聚类被清楚地分为两个不同的子聚类:控制条件下的(子聚类“a”)和热胁迫下的(子聚类“b”)，如图所示。1)．据此，将用于评价黑麦草耐热性的10个性状分为4个亚群:亚群I包括WUE、Pn和RA，它们在热胁迫下的值低于对照;子类II包括Chl含量、TQ、RWC和Fv/Fm，这些值在热胁迫下也较低;亚群III包括PH和LW两个形态性状，在两种生长条件下变化不一致;亚群IV只包含一个性状(EL)，在热胁迫下有较高的值(图4)。1)．因此，在接下来的分析中，除LW和PH外，用8个性状来评价黑麦草的耐热性。

98个多年生黑麦草品种的整体耐热性排序

基于HSI对98份材料的耐热性变化进行主成分分析，共识别出8个主成分(pc1 - 8)。第1个pc (PC1 ~ PC4)之和解释了总方差的88.45%，其中第1个和第2个pc分别解释了98个黑麦草材料的52.67%和20.37%的方差(补充表)1)．根据主成分分析结果，推导出以下公式(公式详情见补充表2): PC1值= 0.897×TQ + 0.766×阵线/ Fm的背影内容+ 0.373 + 0.858××Pn + 0.244×WUE +(−0.691)EL + 0.891××RWC + 0.785×风湿性关节炎;和PC2价值=(−0.199)×TQ +(−0.311)×阵线/ Fm的背影内容+ 0.809 +(0.055−)××Pn + 0.896×WUE +(−0.043)×EL +(−0.180)×RWC + 0.040×风湿性关节炎;(3)生物价值= 0.196×TQ + 0.413×阵线/ Fm的背影内容+ 0.233 +(0.119−)××Pn + 0.033×WUE EL + 0.095 + 0.566××RWC +(−0.227)×RA;和PC4值= 0.031×TQ +(−0.125)×阵线/ Fm的背影内容+(−0.220)+ 0.219××Pn + 0.130×WUE EL +(−0.166)+ 0.431××RWC + 0.480×RA和PCA排序值=(52.67%×PC1) +(20.37%×PC2) +(8.25%×生物)+(7.17%×PC4)。

根据PCA结果，我们将98份黑麦草材料类聚为两组:第i组由49份PCA值位于所有材料的上半部分组成，其余49份类聚为第ii组(图1)。2)．根据8个参数(WUE、Pn、RA、Chl含量、RWC、Fv/Fm、EL和TQ)的HIS对98个品种的耐热性进行PCA排序，其中275,660、598,892、277,846、516,605和598,443品种的耐热性排在前5位，538,976、321,681、317,452、239,730和303,027品种的耐热性排在最前5位(表4)2)．图中显示了最耐热和最耐热的5个黑麦草品种的表型。3.结果表明，评价最高的品种叶片绿叶较多或更绿，而最热敏感的品种叶片黄叶较多或较少。

为了了解不同性状对多年生黑麦草耐热性的贡献，利用Pearson相关分析确定了基于整体耐热性HSI的PCA排名与各生理/表型性状之间的关系。如表所示3.， PCA排名与用于评价的所有8个性状均显著相关(p≤0.05)，其中PCA与EL排序值的相关系数最大(r=−0.858)。Chl含量、RWC和TQ的排序值也与PCA (r分别= 0.769,0.764,0.744)。Pn和WUE与PCA的相关系数较低(r= 0.306和−0.216)，尽管它们的相关性也具有统计学意义(p≤0.05)(表3.)．

与多年生黑麦草耐热性相关的叶绿素分解代谢基因转录水平

Pearson相关分析结果表明，热耐受性PCA排序值与Chl含量有较大的相关系数(r= 0.769,表3.)，表明以Chl损失为特征的叶片衰老主要与多年生黑麦草的整体耐热性有关。为了证实Chl分解对多年生黑麦草耐热材料的贡献，我们进一步分析了4个Chl分解基因的转录是否存在相关性(在20年代,包括LpNYC1，LpNOL，LpSGR,LpPPH)和98份黑麦草材料耐热性PCA排序值。如图所示。4的相对表达水平在20S在热敏性材料中显著高于耐热性材料。

基于SSR标记的多年生黑麦草98个品种的分类

利用66对SSR分子标记对所选黑麦草材料的基因型多样性进行了估算。SSR分析共获得864个多态条带，平均13个，范围3 ~ 26个每一对引物(补充材料2)．所得多态信息含量(PIC)值变化范围为0.16 ~ 0.93，平均值为0.70;基因多样性指数(Di)为0.16 ~ 0.94，平均值为0.72 (补充材料2)，证实所选材料代表了多年生黑麦草种质资源的多样性基因库。根据SSR分析结果构建N-J树状图，将98份黑麦草种质资源分为3组:A、B和C组，分别由14份、10份和74份黑麦草种质资源组成。5)．

在每个系统发育簇中，对黑麦草材料的耐热性和生理性状的PCA排序值进行平均4结果表明，聚类C的平均PCA排名值(61.67)显著高于聚类A和聚类B的平均PCA排名值(2.65和7.89)，说明聚类A和B的耐热性低于聚类C，各系统发育聚类中耐热性基因型排名的Chl含量、WUE、EL和RA也存在类似差异(表2)4)．

与耐热性生理性状相关的SSR标记

利用一般线性模型(GLM)对66个SSR标记与7个生理性状的相关性进行分析。如图所示。6和表5SSR标记与植株Chl含量、Fv/Fm、Pn、WUE、EL和RA的相对值之间共鉴定出34个关联R²> 0.05 (p< 0.01)。我们发现位于第4染色体上的两个标记M144和rv0941与Chl含量相关。位于染色体3、4、5和7上的标记Lp165、rv0941、DLF008、B3C10、B3B8和B5E1与Fv/Fm相关。位于第6染色体上的标记rv0985-1与Pn相关。位于染色体1、3、4、6、7上的13个标记与WUE相关，包括PRG、PR10、M4213、25ca1、LPSSRH01A07、rv0985-1、rv0005、rv1133、LPSSRH02C11、rv0663、B3B7、LpHCA16B2和PR37。位于染色体1、3和5上的标记M844、LPSSRH01A07、B3B7、B1A10、LpSSR100、LP194、rv0757和LPSSRH02C11与RA相关。标记LM15、LPSSRH01H06、rye012和LpHCA17C6与EL相关。SSR标记与TQ或RWC之间没有关联(图1)。6)．

植物耐热性是一种复杂的性状，可由许多表型和生理因素归因于此，包括本研究中所研究的参数，如Fv/Fm、Pn、Chl含量、WUE和RWC以及根系活性[9，10，22，23，24，25］．主成分分析(PCA)是一种综合反映复杂性状方方面面的多种因素并评价各因素对性状贡献的有效策略，已成功应用于大豆(大豆．L.)及柳枝稷(黍virgatuml .) [26，27，28］．在本研究中，我们采用相同的策略，综合多个参数对98份多年生黑麦草的耐热性进行排名。此外，通过Pearson相关分析，我们发现EL、Chl含量和RWC与基于PCA的整体耐热性排名密切相关。与EL和RWC不同，Chl含量可以用叶绿素仪快速定量。因此，Chl含量单独或与EL结合，都可以作为大群体多年生黑麦草优质耐热种质最方便的筛选标准。

在与耐热相关的形态和生理性状中，叶绿素的损失是冷季草种热胁迫损伤的标志之一。我们的前期研究发现，热胁迫引起的叶片衰老主要是由于热加速了Chl的分解代谢，而不是减弱了Chl的生物合成。Agrostis多茎目)和通过抑制Chl分解基因来降低Chl分解率(产后大出血)在多年生黑麦草(多年生黑麦草L.)延迟热致叶片衰老[25，29，30.］．通过控制叶绿素损失或叶片衰老来选择保持绿色性状对改善凉季草品种具有重要意义。在发现Chl含量与黑麦草耐热性相关的基础上，我们检测了Chl的表达水平在20S在5个最耐热和5个热敏感的材料中。还有几个表达水平在20S与各黑麦草亲本的耐热性等级呈强相关。因此，我们认为Chl含量和Chl分解代谢基因是评价多年生黑麦草材料耐热性的可靠生理性状和标记基因。

Shin等人(2020)最近的一份报告显示，Chl分解代谢基因启动子区域内的自然变异，OsSGR，是水稻叶片延迟衰老的主要遗传因素OsSGR从粳稻类型的大米籼稻型水稻叶片衰老延缓，籽粒增产12.7%籼稻类型水稻[31］．Shen等人(2020)的研究显示了利用CCGs自然变异的潜力[31］．本研究结果表明，这些CCGs在抗热性方面存在丰富的自然变异，可作为黑麦草基因编辑或maker辅助育种的潜在目标基因和/或标记。

Barre等(2017)根据营养和生殖投资性状(如叶片生长参数、分蘖参数、抽穗数据和生殖投资)，将213份多年生黑麦草材料分类为3个类群[32］．本研究利用66对SSR标记，将98份多年生黑麦草材料分为3个类群，这些SSR标记用于鉴定植物耐盐、耐干旱、耐淹、耐冬季胁迫和春季再生长的等位基因[16，18，19］．基于SSR标记分类，Chl含量、WUE和RA等与耐热性呈正相关的生理性状在C类材料中的含量显著高于A类和B类材料，表明C类材料的耐热性高于A类和B类材料，耐热性的变异与其在多年生黑麦草群体中的遗传结构有关。同样有趣的是，几乎没有证据表明这些基因簇与它们的地理位置有关。这一结果可以解释为人类活动对多年生黑麦草分布的干扰。

与重要农艺性状(如抗冠锈病)相关的SSR标记[15下沉),(18]、标题日期[33]在多年生黑麦草中已被鉴定。然而，目前尚无与多年生黑麦草耐热性相关的SSR标记报道。在本研究中，在多年生黑麦草中检测到29个与耐热相关性状相关的SSRs。两个标记LPSSRH01A07和LPSSRH02C11都位于染色体4上，据报道与淹水胁迫下的相对生长速率有关[18]，与WUE和RA相关，提示4号染色体上的一个QTL也可能影响热耐受性。有趣的是，我们发现位于1号染色体上的三个标记M4213、B3B7和PR37与WUE有关，它们之间的距离为6 cM。此外，位于7号染色体上的Lp165、DLF008和B3C10与Fv/Fm相关，且相距12cm。因此，WUE和Fv/Fm的QTL极有可能分别位于染色体1和染色体7。结果表明，位于这些染色体位置的至少3个候选qtl对多年生黑麦草的耐热性起着重要作用。

综上所述，本研究调查的98份多年生黑麦草材料耐热性差异很大。结果表明，C类材料耐热性较A类和b类材料强，EL、Chl含量和CCGs是多年生黑麦草耐热性评价的可靠生理性状和标记基因。此外，还鉴定出与Chl含量、Fv/Fm、Pn、WUE、EL和RA相关的SSR标记。这一结果说明了细胞膜稳定性和Chl分解代谢在冷季草耐热性中的重要性。这些知识对于多年生黑麦草的耐热育种和进一步研究多年生黑麦草以及其他冷季牧草的耐热机制具有重要意义。

植物材料和生长条件

从美国农业部的国家植物种质系统(USDA-GRIN)中收集了98份多年生黑麦草材料，其中包括37份野生材料、33份栽培材料和28份系谱不确定的材料6)．在江苏南京农业大学的一个温室里，每个种质的一颗种子被播种在填充了碎粘土的塑料花盆(直径13厘米，高13厘米)中。用分蘖机进行繁殖，产生砧木。本试验将各砧木的分蘖移栽到8个盆中(每盆10个分蘖)，在25/20℃(昼夜温度)、70%相对湿度、光周期16 h、光合有效辐射750 μmol m的生长室内保持⁻²年代⁻¹每周割草，植株保持在12 cm高，每周用一半强度的Hoagland营养液施肥[34］．

温度的治疗方法

每个加入4个盆栽(4个重复)的植株在生长室内暴露于25/20°C(日/夜)的正常生长温度或35/30°C(日/夜)的热胁迫。每个温度处理在两个生长室重复。在上述温度条件下处理24 d，处理期间定期浇水施肥。

表型和生理测量

叶宽(LW)分析，用数字卡尺测量每一株成熟叶10片。最大植株高度(PH)由人工测量，即每株植株从基部到顶部的长度。根据植物颜色、枝条密度和均匀性，用1 - 9级对TQ进行视觉评分，以评估整体植物健康和活力(1代表棕色和死亡的植物，9代表所有这些质量成分中最好的植物)[35］．Fv/Fm使用荧光计(Dynamax, Houston, TX, USA)测定，Oxborough和Baker(1997年)先前描述过[36］．Chl含量的测定方法参照Arnon(1949)的方法[37］．RWC量化时，取约0.1 g鲜叶，立即称量鲜重(FW)，然后用蒸馏水浸泡，4℃暗处保存24 h，称量膨体重(TW)。然后将叶片样品置于80°C的烤箱中72小时，然后称重为干重(DW)。RWC的计算公式为:(FW-DW)/(TW-DW) × 100% [38］．根据Burgess和Huang(2014)描述的方法，使用便携式光合系统(Li-COR6400, LI-COR Inc.， Lincoln, NE, USA)测量Pn和WUE [39］．为了定量EL，我们收集了大约0.2 g的叶子，用蒸馏水冲洗三次，然后放入一个50毫升的装有30毫升蒸馏水的试管中。摇晃24小时后，使用电导率仪(YSI Model 32, Yellow Spring, OH)量化初始电导率(Ci)。然后将样品蒸压30分钟。在管道冷却到室温后测量其最大电导率(Cmax)。相对EL计算为(Ci/Cmax) × 100。

RA的测定采用2,3,5-三苯基四唑氯化盐(TTC)还原法[40］．TTC还原试验采用Steponkus和lanphher(1967)的方法进行，并进行了少量修改[41］．简单地说，约0.5 g根尖(0-50 mm)被切除，用蒸馏水洗涤三次，转移到10 ml TTC溶液(0.4% TTC在0.1 M磷酸钠缓冲液，pH 7.0)。37°C孵育3小时后，除去TTC溶液，用蒸馏水清洗根段。将根切成1厘米长的段，在室温下10毫升的95%乙醇中孵育一夜。TTC的降低用提取液在485 nm处的吸光度表示。

整体耐热性排名

采用主成分分析(PCA)对98个品种的耐热性进行排序，方法参照Liu等(2015)对不同草基因型的耐旱性和耐盐性进行排序[27和Tang等人(2013)[19］．每次登录的PCA排名值使用公式:PCA排名值=\({\总和}_ {j = 1} ^ n \离开贡献\ \ PCj \ [PCj \倍左右(\ % \)\]\ j = 1, 2, 3, \点,n \)［42］．式中“PCj”表示主成分的值j“PCj的贡献(%)”表示对该主成分的应激处理的响应方差j可以解释。当前几个pc的总贡献大于85%时，选取这些pc进行PCA排名计算[43］．对98份多年生黑麦草材料的相对耐热性进行了PCA排序。

不同材料各生理值的绝对值不能忠实地代表它们的耐热程度。例如，一个在热应激后Chl含量较低的入体无法分辨这种低含量是由于应激还是由于其他因素(例如，即使没有热应激，Chl含量也可能较低)。因此，我们使用一个相对值热应力指数(HSI)进行应力耐受性评价[26]: HSI =(热应力条件下参数值)/(控制条件下参数值)× 100。

遗传多样性与关联分析

共有66对公开的核DNA SSR引物分布在7条染色体上(补充材料3)对98份多年生黑麦草材料进行基因分型[19］．PCR反应在10 μl反应体积，60 ng DNA, 1.0单位TaqDNA聚合酶，1 × PCR缓冲液，0.2 mM dNTP混合物，2.5 mM MgCl₂， 0.05 μM正向尾尾引物，0.05 μM荧光标记M13引物，0.1 μM反向引物。所有的PCR反应都在Bio-Rad热循环器(Bio-Rad Inc.， Hercules, CA, USA)中进行，使用的是Yu等人描述的触控式程序(2013)[16］．PCR产物在ABI 3730 DNA测序仪(Applied Biosystem, Inc.， Foster City, CA, USA)中分离。等位基因采用GeneMarker 1.6软件(SoftGenetics, LLC, State College, PA, USA)进行鉴定。差异大于2 bp的等位带被认为是多态的。所有确认的多态等位基因进行聚类分析。

基于SSR标记数据，利用PowerMarker软件3.25版本的“系统发育”函数估计Nei的遗传距离[44］．然后利用Nei的遗传距离进行聚类分析，并使用FigTree 1.4.2版本生成邻居连接(N-J)树状图(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)[45］．利用TASSEL 5.0软件和通用线性模型(GLM)程序进行SSR标记与耐热性状的关联分析[46］．P≤0.01为显著相关性。

基因表达分析

使用Qiagen RNA提取试剂盒(Qiagen, Valencia, CA, USA)按照制造商的说明从多年生黑麦草叶子中提取总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems, Grand Island, NY, USA)合成了第一链cDNA。qRT-PCR反应使用Roche LightCycler®480 II实时PCR系统(Roche Molecular Systems, Inc.， Branchburg, NJ, USA)进行。所有的PCR反应均在20 μl的反应体积下进行，设4个生物重复。用于qRT-PCR分析的引物见补充表3.而且LpeIHF4A作为参考基因[47］．

数据分析

所有样本的数据采用SAS 9.3软件(SAS Institute Inc.， Cary, NC, USA)进行方差分析(ANOVA)，如表所示1．采用Fisher’s protected LSD检验在0.05概率水平下分离治疗手段，见表4和无花果。4．使用SPSS for Windows软件(版本12,SPSS Inc.， Chicago, IL)中的双变量相关程序进行生理参数之间的皮尔逊相关分析，如表所示3.．热图(无花果。1)和主成分分析(PCA)(图5。2)的形态和生理参数使用R统计软件(R Development Core Team开发的R3.5.2)进行统计。

支持本文研究结果的数据集和材料在稿件及其补充信息文件中给出。

排名:

叶绿素

20:

的背影分解代谢的基因

TQ操作:

草皮质量

阵线/ Fm:

光化学效率

RWC:

叶片相对含水量

埃尔:

电解液泄漏

Pn:

光合速率

WUE:

水分利用效率

类风湿性关节炎:

根系活力

LW:

叶宽度

PH值:

最大的株高

主成分分析:

主成分分析

他:

热应力指数

苏维埃社会主义共和国:

简单序列重复

我们感谢美国农业部国家植物种质系统(USDA-GRIN)善意地提供黑麦草资源。

本研究设计得到江苏省自然科学基金项目(批准号:no. 1)的资助。BK20180546)。数据的收集、分析和解释得到国家自然科学基金项目[no . 31802117和31772659]的资助。

从属关系

1. 南京农业大学农牧科学学院，南京，210095

   张静，李辉，徐志鹏，徐斌

2. 普渡大学农学系，西拉斐特，美国，47907

   江亦未

3. 河北农业大学农学院/华北作物改良与调控国家重点实验室/河北省作物生长调控重点实验室，河北保定071001

   Huibin李

4. 上海生物技术公司，张江高科技园区，上海，201203

   志鹏张

5. 美国新泽西州立大学罗格斯大学植物生物学与病理学系，美国新泽西州新布伦瑞克08901

   Bingru黄

贡献

本研究的JZ, BX, BH设计。生理改变,霍奇金淋巴瘤¹,霍奇金淋巴瘤⁴， ZZ和ZX进行了实验并分析了数据。JZ和BX撰写了手稿。YJ和BH分析了数据并修改了手稿。所有作者均已阅读并认可该手稿。

相应的作者

对应到徐本．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有利益冲突。

出版商的注意

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