葡萄成熟过程中脱落酸代谢的变化(GydF4y2Ba葡萄GydF4y2BaL,简历。Mencia)体细胞胚胎GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

葡萄树中的体细胞胚胎发生是一种复杂的过程，其取决于许多生理和遗传因素。其主要局限性之一是分化介质中躯体胚胎的早熟萌发的过程。该过程从细胞胚胎中降低了植物转化率，并且可能是由低内源性脱离酸（ABA）含量引起的。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

通过培养葡萄株系，成功地避免了体细胞胚的过早萌发。Mencía在分化培养基顶端延伸的半透膜上的胚性聚集物。周分析表明，各团聚体内源ABA和ABA-糖基酯(ABA- ge)含量均呈快速积累。9-的表达式概况GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-epoxycarotenoid加双氧酶(GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba), 8羟化酶(GydF4y2BaVVHYD2.GydF4y2Ba), UDP-glucosyltransferase (GydF4y2BaVvUGTGydF4y2Ba）和β-葡糖苷酶（GydF4y2BaVvBG2GydF4y2Ba)基因的研究表明，在半透膜上培养的第二周内源ABA的第一个积累峰的发生主要依赖于外源基因的表达GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba基因。在培养第四周，内源ABA含量再次增加。在培养的这一点上，我们的结果表明，在参与ABA积累的基因中，有一个(GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba）被压抑，而另一个（GydF4y2BaVvBG2GydF4y2Ba)被激活。同样，这些基因与ABA水平降低有关，一个（GydF4y2BaVvUGTGydF4y2Ba）被压抑的是另一个（GydF4y2BaVVHYD2.GydF4y2Ba)被激活。的相对表达水平GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba在相同条件下培养的胚胎骨聚集体中的基因并用外源性ABA处理，显示出该基因的显着下调。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们的研究结果表明，ABA代谢在对半透膜培养的葡萄树胚胎胚胎成熟中的累积和其内源性ABA水平的两个重要对照点。因此，控制ABA合成和降解的拮抗基因表达的微妙差异可能是在体外成熟期间ABA的最终水平的原因。此外，具有外源ABA的体细胞胚的治疗表明基于反馈的对表达的控制GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2BaABA基因在葡萄葡萄树细胞胚胎的成熟期间。GydF4y2Ba

在被子植物中，早期胚胎发生从单细胞阶段持续到心脏阶段，包括一个由高水平的吲哚-3-乙酸(IAA)和低水平的脱落酸(ABA)控制的广泛的细胞分裂时期。胚胎发生中期包括心脏阶段到鱼雷阶段，以ABA水平迅速增加结束。ABA含量的增加很可能会引起重要的代谢变化，从而允许在胚胎发生的后期储存以及胚胎脱水和休眠[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba]．已经表明，外源ABA的应用增强了苜蓿体细胞胚至干燥的耐受性，从而提高了从这些胚胎转化的植物的质量[GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．在挪威云杉，Vondrakova等。（2018）[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]观察到ABA在熟练的体细胞胚胎中的峰积累和在干燥中的ABA-葡糖基酯（ABA-GE）的另一峰。在棉花体细胞胚胎发生期间[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]，胁迫反应的转录激活，胁迫相关基因表达水平增加，包括几个参与ABA生物合成和信号转导的基因。此外，郁金香体细胞胚的成熟需要较高的ABA水平[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

在本实验室，我们建立了一种有效的葡萄藤雄蕊丝体细胞胚胎发生的方法。Mencía)使用噻代氮脲(1-苯基-3-(1,2,3-噻代氮唑-5-基)尿素)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4- d) [GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．在使用该方案时，我们发现体细胞胚发育不同步，在DM1分化培养基中以小体积接种剂(0.1-0.5 mg鲜重)培养球形体细胞胚集合体时，有相当一部分体细胞胚早发[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba4个星期。我们发现体细胞胚在分化培养基中过早萌发对其进一步转化为植株有负面影响[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba9GydF4y2Ba，所以我们努力试图防止这种现象。通过培养更大的接种量(50-80 mg鲜重)，Mencía体细胞胚避免了早熟[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]，尽管大部分胚胎仍处于早期发育阶段（鱼雷形状）这可能是由于营养物质和生长调节剂的扩散速度较慢，以及作为大接种体培养的胚胎吸水速度较慢所致[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．在葡萄树中，体细胞胚的正确成熟与其对储备产品的积累有关[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba,GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]和干燥[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba]．在这种情况下，获得成熟体细胞胚的一种方法可以是通过例如在醋酸纤维素半透膜的顶部培养体细胞胚的降低水可用性。此过程以前用于控制柑橘和橄榄中体细胞胚的成熟[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba,GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]．在鳄梨（GydF4y2BaPersea美国GydF4y2Ba)，在醋酸纤维素膜上培养胚性愈伤组织，增加发育良好的成熟体细胞胚数量，促进其进一步萌发[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

已经证明，ABA的外源性应用可以改善葡萄综合体胚胎的成熟[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]因为ABA减缓了体细胞胚胎的生长，并通过预防早期萌发来改善它们对植物的转化。已经表明，内源性ABA的累积峰可能是葡萄肢体胚胎的异常成熟和预吞并萌发的原因[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba,GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]．在高等植物中，ABA是由环氧类胡萝卜素9-氧化裂解合成的GydF4y2BaCIS.GydF4y2BaNeoxanthin和9-GydF4y2BaCIS.GydF4y2Baviolaxantin产生黄嘌呤，黄嘌呤在细胞质中转化为ABA。这个反应被9-催化GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)家族的酶，首次描述为玉米胎生14 (VP14)，该反应被认为是ABA生物合成途径的第一个和最重要的调控步骤[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]．然而，ABA的浓度及其调控作用是ABA生物合成和分解代谢速率的结果[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]．ABA分解代谢受到两种不同的途径：氧化和缀合。ABA通常在碳8'中氧化[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba,GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]在由细胞色素P450 707A基因家族基因编码的ABA特异性8′-羟化酶催化的反应中[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba]．编码ABA特异性8'-羟基酶的三个基因（GydF4y2BaVVHYD1.GydF4y2Ba,GydF4y2BaVVHYD2.GydF4y2Ba和GydF4y2BaVVHYD3.GydF4y2Ba)在小道消息中被描述为[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]．与氧化不同，与葡萄糖形成葡萄糖酯（ABA-GE）的ABA缀合是可逆过程，其被ABA特异性UDP-葡糖糖基转移酶（UGT）催化[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba,GydF4y2Ba24GydF4y2Ba]．另一方面，ABA-GE缀合物的水解由β-葡糖苷酶（BG）进行[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba]．BG有三种编码基因(GydF4y2BaVvBG1GydF4y2Ba,GydF4y2BaVvBG2GydF4y2Ba和GydF4y2BaVvBG3GydF4y2Ba）在葡萄[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]，而没有报告本物种中UGT的编码基因数量。GydF4y2Ba

在这项工作中，我们研究了蔗糖浓度的作用和一个半透膜放置在分化培养基上葡萄品种的雄蕊长丝衍生的体细胞胚的成熟。门西亚。为了研究成熟过程的调节，葡萄胚聚集体不同的水分胁迫条件下培养。我们也分析了相关表达谱GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba,GydF4y2BaVVHYD2，VVUGT.GydF4y2Ba和GydF4y2BaVvBG2GydF4y2Ba使用定量PCR（QPCR）的基因，先前测定归一化更稳定的参考基因，并将它们与ABA及其葡萄糖基酯（ABA-GE）的内源水平相关联。外源aba的影响GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba还测试了基因表达作为对ABA生物合成调节在葡萄树躯体胚胎的调节的贡献。GydF4y2Ba

蔗糖水平和半透膜对葡萄株系的影响。Mencía体细胞胚成熟GydF4y2Ba

在目前的工作中，我们评估了蔗糖浓度对葡萄CV的发育和早期发芽的影响。Mencía躯体胚胎。在葡萄树中，用于体细胞胚胎分化的介质含有至少3％的蔗糖[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba，在大多数报告中高达6% [GydF4y2Ba28GydF4y2Ba,GydF4y2Ba29GydF4y2Ba,GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．虽然我们以前使用的是此目标的少于1％[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba[我们在此发现，分化介质中的蔗糖浓度的增加导致达到子叶末期的成熟胚均显着较高，并且预先发芽胚胎的百分比显着降低（图。GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba）.在大豆和大豆中也发现了类似的结果GydF4y2Ba芸苔栗鸟GydF4y2Ba种子，其中蔗糖浓度的增加强烈地影响或延迟早熟的萌发[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba,GydF4y2Ba32GydF4y2Ba]．尽管胚胎成熟发生异步（图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba）这些结果表明，通过调节培养基的渗透潜力，可以改善葡萄树脂胚的成熟。GydF4y2Ba

培养基中蔗糖浓度的增加导致体细胞胚的含水量降低。含有1％蔗糖的DM1培养基上的培养物具有最高的水含量（约95％），在培养的5周内稳定（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.在6％蔗糖上培养的体细胞胚胚的水含量也保持稳定，但在比1％蔗糖中的值（约92％）下降。3％蔗糖中的培养物在1和6％蔗糖培养物之间显示中间水含量。最后，在体细胞胚胎聚集体和培养基之间引入半透膜导致从培养的第二周开始的胚胎中的水损失显着损失（从91.4至84.9％;图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.在这些条件下(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa, b, c)，体胚发育正常(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bad）由于它们没有显示出任何早熟的发芽（0％），尽管未进行胚胎发育阶段的详细定量记录。GydF4y2Ba

基于这些数据，我们得出结论，仅测试所测试水平的蔗糖浓度的增加是不足以达到控制葡萄树脂胚胎成熟所需的水分水平，这对于体细胞胚胎的正常转化是重要的植物，如以前所示[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]．在鳄梨中，在体细胞胚胎的高温步骤中使用半透纤维素膜导致成熟的体细胞胚状质更好的质量和萌发能力[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

在体细胞胚聚集ABA与ABA-GE水平GydF4y2Ba

在开发胚胎中，在种子干燥之前发生ABA的编程积累[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba,GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]．这表明ABA起双重作用，抑制胚胎的早熟发芽并刺激与成熟阶段相关的产品的表达[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]．内源ABA和ABA- ge水平的分析(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba结果表明，在DM1无膜分化培养基上添加蔗糖，体细胞胚聚集体中，其含量稳定在0.5 μM以下。在这些培养基中，体细胞胚聚集体的水分含量没有显著变化(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

相比之下，在具有6％蔗糖的DM1分化培养基上培养的体细胞胚胚细胞培养，其中具有6％蔗糖在培养的第二周的ABA积累了几乎八倍（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa），与胚胎的大量水损失重合（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.在培养的第三周之后，体细胞胚胎聚集体中ABA的内源水平明显低于第二周，达到比培养期结束时初始水平高约4倍的稳定值。此外，观察到在膜上培养的体细胞胚胎聚集体中ABA-GE的内源性含量的显着变化，从第二到第四周的值较高（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab插入）。GydF4y2Ba

在许多物种中，在种子成熟过程中出现了两个ABA积累高峰，这两个高峰都有助于ABA的最终水平。第一个峰值似乎是由母体产生的，并在成熟阶段之前立即出现，而第二个峰值来自胚胎内部ABA合成[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba]．在挪威云杉中，在胚性胚柄块中观察到ABA及其衍生物的内源水平在成熟培养基中通过后急剧增加[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．在该工作中获得的结果显示了类似的ABA含量概况（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa)在DM1培养基上通过半透膜分化的体细胞胚聚集体;这种培养条件阻止了早熟的萌发，而这是正常、高植株转化率的关键[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]．在葡萄藤中，已经有研究表明体细胞胚的提前萌发可能与其ABA含量有关，其ABA含量低于合子胚[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]．这些结果表明，正常体细胞胚胎发育是一定程度的ABA积累，并防止葡萄葡萄酒中的早熟萌发（[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba37GydF4y2Ba]）并且这种反应可能与半透膜引起的水胁迫条件相关联。GydF4y2Ba

葡萄体细胞胚分化过程中ABA代谢基因的表达GydF4y2Ba

我们试图更好地了解水的压力和内源ABA含量的葡萄体细胞胚的发展中的作用。在补充有不同量的蔗糖的和不具有半透膜DM1培养基中培养的体细胞胚中观察到这些参数没有差异。因此，基因的表达水平（GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba,GydF4y2BaVVHYD2.GydF4y2Ba,GydF4y2BaVvUGTGydF4y2Ba和GydF4y2BaVvBG2GydF4y2Ba研究了半透膜对ABA生物合成和分解代谢相关酶的影响。GydF4y2Ba

通过这种目标，我们以前确定了通过QPCR准确地相对定量基因表达水平的最合适的参考基因。为了执行这一点，14个候选基因（使用Reid等人的15个引物对。[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]使用三种不同的统计程序（Genorm，BestKeeper和Normfinder）进行分析。从候选基因的定量循环（CQ）估计的转录物相对丰度范围为24至30，大多数值落在24和27之间（补充图SGydF4y2Ba1.GydF4y2Ba）.所有候选参考基因的PCR效率为1.92和2.00（92-100％）。GydF4y2Ba

用geNorm软件分析所有基因[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba的基因表达稳定性值(M)低于0.9，具有GydF4y2BaEF1 -α(米)GydF4y2Ba和GydF4y2BaGAPDH（M）GydF4y2Ba最小M值(表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba）.与Genorm一样，最稳定的候选参考基因由常常常排名[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba] 是GydF4y2BaEF1 -α(米)GydF4y2Ba和GydF4y2BaGAPDH（M）GydF4y2Ba(表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba）.GydF4y2BaAP47.GydF4y2Ba（Clathrin适配器复合物中等亚基家庭蛋白质指定使用这两种算法最稳定。GydF4y2Ba

作为BestKeeper [GydF4y2Ba41GydF4y2Ba]只能检查多达十个候选参考基因，用Genorm和rangfinder分析后的最低等级的五个基因（表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)未包括在本分析中。GydF4y2BaEF1 -α(米)GydF4y2Ba和GydF4y2BaGAPDH（M）GydF4y2Ba是BestKeeper确定的三个最稳定的候选基因，与geNorm和NormFinder的结果一致，但GydF4y2BaUBQ-L40GydF4y2Ba（泛素延伸蛋白1（UBQ1）/60S核糖体蛋白L40）被BestKeeper排名第一（表1）GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

使用通过使用软件改性计算的对（v）的变化来测定用于归一成用于基因表达归一化的最小参考基因数。在该工作中获得的数据产生了V值为0.14，表明使用两个基因的使用是足以准确的归一化[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba]．因此，GydF4y2BaEF1 -α(米)GydF4y2Ba和GydF4y2BaGAPDH（M）GydF4y2Ba被选为我们的实验系统中的两个最稳定的参考基因。在Reid的研究中排名很好的其他基因[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba这支持了这样一种观点，即将之前在一个实验系统中进行的内参基因分析的结果直接外推到另一个系统中是不合适的，即使是在同一物种中。GydF4y2Ba

使用GydF4y2BaEF1 -α(米)GydF4y2Ba和GydF4y2BaGAPDH（M）GydF4y2Ba作为QPCR标准化的参考基因，我们确定了相对表达GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba(登录代码AY337613.1和VIT_19s0093g00550)，GydF4y2BaVVHYD2.GydF4y2Ba（NM_001281052.1和VIT_02s0087g00710），GydF4y2BaVvUGTGydF4y2Ba和GydF4y2BaVvBG2GydF4y2Ba（XM_002267559.4和VIT_07S0005G00390）基因在成熟期间，在DM1培养基中的葡萄细胞体胚胎中，其补充有6％蔗糖，其中没有半透膜。作为序列GydF4y2BaUGTGydF4y2Ba先前没有在葡萄树中描述的基因，我们对齐序列GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba（L.）Heynh。(NM_113074.2),GydF4y2BaPyrus普通的GydF4y2BaL.（FJ854494.1），GydF4y2BaHevea Brasiliensis.GydF4y2Ba(Willd。a .汁液交货)。考虑。参数。(JQ037843.1),GydF4y2Ba烟草GydF4y2Bal . (NM_001325655.1)和GydF4y2Ba菜豆GydF4y2BaL. (KF569682.1)，目的是确定它们之间的保守区域，获得适合设计用于表达分析的qPCR引物的序列。常规PCR实验结果显示，468 bp的一致序列(XM_003633312.3)与aGydF4y2Ba葡萄GydF4y2Ba获得L.序列(VIT_12s0055g00200)，并利用该序列设计qPCR引物(见表)GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba).此外，这一共识序列为假定的GydF4y2BaVvUGTGydF4y2Ba该基因与基因序列的相似性为79%GydF4y2BaUGTGydF4y2Ba基因GydF4y2BaPanax Ginseng.GydF4y2BaC. A.梅伊。（KM491309.1），和74％的相似性与GydF4y2BaUGTGydF4y2Ba基因GydF4y2BaMaclura PomiferaGydF4y2Ba(空军)。c·k·施耐德。曼(DQ985178.1)。GydF4y2Ba

ABA含量被认为密切依赖于叶片的表达水平GydF4y2Banced.GydF4y2Ba基因。这一概念得到了成熟牛油果(GydF4y2BaPersea美国)GydF4y2Ba水果，其中的表达水平GydF4y2BaPanced1.GydF4y2Ba和GydF4y2BaPanced3.GydF4y2Ba基因的波动与内源性ABA水平相似[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba]．这种想法也得到了过度表达的事实支持GydF4y2Banced.GydF4y2Ba在番茄种子增加了他们的ABA水平和扩展他们的休眠[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba]．与ABA生物合成的作用相比，关于ABA分解代谢在内源性ABA水平调节中的作用，较少。表达分析GydF4y2BaVVHYD2.GydF4y2Ba,GydF4y2BaVvUGTGydF4y2Ba和GydF4y2BaVvBG2GydF4y2Ba该研究为葡萄体细胞胚成熟过程中的分子调控提供了新的信息。GydF4y2Ba

REST软件计算的表达式数据显示GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba在添加6%蔗糖的DM1培养基上培养体胚聚集体时，基因保持了较低的基础表达水平(图2)。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa)，检测到极低水平的ABA(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一种）。在没有半透膜的DM1培养基上分化的胚胎聚集体中，过表达GydF4y2BaVVHYD2.GydF4y2Ba在培养的第一周中观察到基因，并且此后被显著减少;它是在所述第三和第四周压抑和在第五周（图恢复到接近零的值。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab).这一结果与同一植物材料中观察到的低ABA水平一致(图2)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.内源性ABA水平的关系及其表达GydF4y2BaCYP707AGydF4y2Ba基因家族，到了GydF4y2BaVVHYD2.GydF4y2Ba基因属于，也观察到Kondo等人。（2012）[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba，他决定苹果GydF4y2BaMdCYP707A1GydF4y2Ba和GydF4y2Bamdcyp707a2.GydF4y2Ba内源ABA水平降低后基因受到抑制。另一方面，在DM1培养基中分化的葡萄胚性聚集体中，表达模式发生了变化GydF4y2BaVvUGTGydF4y2Ba和GydF4y2BaVvBG2GydF4y2Ba基因（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bac, d)，通过ABA- ge的合成和降解来维持ABA水平，两者相似。这些结果与在没有半透膜的DM1培养基中分化的葡萄胚性团聚体中检测到的低ABA和ABA- ge水平一致(图2)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

然而，在半透膜上培养体细胞胚时，观察到表达谱的差异GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba基因在培养的第二周上上调（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa），而ABA降级的表达GydF4y2BaVVHYD2.GydF4y2Ba基因是接近零（图GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab).这个差异表达谱对应于一个更强烈的失水时期(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）并且与检测到的最大内源性ABA水平相对应（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa).转录水平之间的相关性GydF4y2Banced.GydF4y2Ba基因和ABA浓度也在以前的工作中被观察到[GydF4y2Ba46GydF4y2Ba,GydF4y2Ba47GydF4y2Ba]．此外，aba的反共轭表达GydF4y2BaVvBG2GydF4y2Ba基因（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bad）在培养的前2周内，在体细胞胚胎聚集体上的半透膜接近零。另一方面，ABA缀合表达的显着增加GydF4y2BaUGTGydF4y2Ba基因（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bac)在培养第二周检测到，这有助于解释此时ABA-GE水平显著升高(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab,插入)。总的来说，这些结果支持这一时间的培养时间的积累可能是由于ABA的德无外的合成而不是来自ABA-GE的欺骗的过程。GydF4y2Ba

表达GydF4y2BaVVHYD2.GydF4y2Ba体细胞胚在半透膜上聚集培养3周后，基因显著增加。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab），有助于解释与第二周相比的减少ABA含量（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一种）。这结果表明，随着减少的情况GydF4y2BaNCED1GydF4y2Ba基因表达（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa)，一个活跃的分解代谢过程参与维持ABA水平。的作用GydF4y2BaCYP707AGydF4y2Ba基因(GydF4y2BaVVHYD2.GydF4y2Ba)，编码8 ' -羟化酶，在ABA水平降低中的作用是众所周知的。在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba,GydF4y2BaCYP707AGydF4y2Ba种子吸收后基因表达显着增加，与ABA浓度的急剧下降相吻合[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba]．增加GydF4y2BaCYP707A1GydF4y2Ba和GydF4y2BaCYP707A3GydF4y2Ba基因表达也与ABA的减少有关GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba在高湿度条件下培养植物[GydF4y2Ba48GydF4y2Ba]．突变分析GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba也支持8 ' -羟化酶对ABA水平的调控作用。插入突变体GydF4y2BaCYP707A1GydF4y2Ba[GydF4y2Ba49GydF4y2Ba] 或者GydF4y2BaCYP707A2GydF4y2Ba[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba基因显示比对照的累积6倍。酶8'-羟基化酶的抑制剂已被用于增加ABA中ABA的水平[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba,GydF4y2Ba50GydF4y2Ba]并改善耐旱性GydF4y2BaAgrostis Capillaris.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba51GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

由酶UGT控制的ABA的缀合是一种用于降低植物中ABA水平的另一种途径。GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba插入突变体GydF4y2BaUGT71C5GydF4y2Ba基因呈现比野生型更高的ABA的水平，而其过度表达降低了ABA水平，增加这些ABA-GE [的GydF4y2Ba52GydF4y2Ba]．此外，对基因的过度表达GydF4y2BaUGT71B6.GydF4y2Ba从GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba),GydF4y2BaPvUGTGydF4y2Ba来自bean [GydF4y2Ba53GydF4y2Ba]产生了强的ABA- ge积累，但不影响内源ABA水平。然而，在半透膜上培养的体细胞胚聚集体中，抑制GydF4y2BaVvUGTGydF4y2Ba培养第二周后观察表达情况(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bac).这种表达模式GydF4y2BaVvUGTGydF4y2Ba基因表明，ABA缀合在葡萄树躯体胚胎的分化期间，在快速降低其内源性水平的关键过程。因此，在DM1分化介质中葡萄树细胞胚胎培养的第三周内ABA含量的降低似乎并不是大致ABA缀合的结果，因为当时未检测到ABA-GE的显着增加（无花果。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab）。GydF4y2Ba

表达GydF4y2BaVvBG2GydF4y2Ba基因编码一个GydF4y2BaβGydF4y2Ba-Glucosidase（BG）酶[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba，在半透膜上培养的第三周开始，胚性团聚体显著增加(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bad）。过表达之间的关系GydF4y2Ba背景GydF4y2Ba在葡萄藤中观察到基因和ABA含量的增加[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba,GydF4y2Ba54GydF4y2Ba,GydF4y2Ba55GydF4y2Ba]和西瓜[GydF4y2Ba56GydF4y2Ba]．突变分析GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba结果表明，这些基因的功能丧失导致ABA含量降低[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba,GydF4y2Ba57GydF4y2Ba]，而它们的过度表达在显示干旱胁迫耐受性的植物中产生了更高的ABA浓度[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba,GydF4y2Ba58GydF4y2Ba]．但是，预测的ABA水平增加了GydF4y2BaVvBG2GydF4y2Ba培养3周后未见基因表达。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一种）。这可能是由于显着高的表达GydF4y2BaVVHYD2.GydF4y2Ba基因(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab).因此，BG酶产生的ABA会被8 ' -羟化酶分解，这一过程将阻止检测任何ABA积累。这些结果，以及压抑GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba在培养第三周检测基因表达(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa)，有助于解释ABA水平的下降，尽管在增加GydF4y2BaVvBG2GydF4y2Ba基因的表达。GydF4y2Ba

在培养的第四周，在半透明膜上的DM1分化介质，高表达水平GydF4y2BaVVHYD2.GydF4y2Ba和GydF4y2BaVvBG2GydF4y2Ba基因（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab，d）和低表达GydF4y2BaVvUGTGydF4y2Ba基因（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaC）在葡萄胚胚胎骨聚集体中观察到。这些型材恰逢内源性ABA含量的第二次增加，并且具有低水平的表达GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba合成基因在第四周的培养中被显着压抑（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa） 此外，在培养的第三至第五周，观察到ABA-GE浓度显著降低（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab,插入)。在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba， ABA是由从头生物合成和细胞器特异性β-葡萄糖苷酶在响应非生物胁迫时产生的[GydF4y2Ba59GydF4y2Ba]，从葡萄糖基缀合物中释放活性化合物。由于这些原因，无法忽视ABA-GE的ABA基础释放。同样，还可以考虑潜在地促进ABA的这种增加的其他NCEC酶的活性，因为已知NCED由多粒编码GydF4y2Banced.GydF4y2Ba家庭。这个家庭至少有七个基因GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba60GydF4y2Ba]，其中一些受水分胁迫强烈诱导的[GydF4y2Ba61GydF4y2Ba]．在葡萄树，三个基因（GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba,GydF4y2Bavvnced2.GydF4y2Ba和GydF4y2Bavvnced3.GydF4y2Ba）已经描述了对Ncced酶进行编码[GydF4y2Ba62GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

Kushiro等人。（2004）[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba]观察到GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba进行脱水，其中它们的ABA含量增加，植物显示的活性表达GydF4y2BaCYP707AGydF4y2Ba基因，虽然在较低的水平GydF4y2BaNCED3GydF4y2Ba合成基因。因此，这些作者认为ABA积累可能是生物合成和分解代谢动力学之间微妙差异的结果。豪猫等。（2006）[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba表明aba缺失突变体的8 ' -羟基化分解代谢途径仍然活跃，提示GydF4y2BaCYP707AGydF4y2Ba基因表现出恒定的基本水平的表达。基于这些发现，在葡萄胚性团聚体培养第四周观察到内源ABA含量的增加(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa）可以通过对所有ABA代谢基因表达的整体分析来解释。总之，我们的结果（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）表明，与ABA水平的增加有关的基因，一个（GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba， 无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa）被压抑，而另一个（GydF4y2BaVvBG2GydF4y2Ba， 无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bad)被激活。相反，在与ABA水平降低相关的基因中，一个(GydF4y2BaVvUGTGydF4y2Ba， 无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bac）被压抑在另一个（GydF4y2BaVVHYD2.GydF4y2Ba， 无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab）被激活。因此，控制ABA合成和降解的拮抗基因表达的微妙差异可能对最终ABA水平负责。GydF4y2Ba

上外源ABA的影响GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba在半透膜上培养的体细胞胚胎聚集体中的基因表达GydF4y2Ba

最后，我们试图获得ABA中的下调可能参与更多信息GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba文化第四周的基因。为此，我们研究了相对表达水平GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba在DM1培养基上通过半透膜培养的体细胞胚胚的基因并用在30％蔗糖溶液中施用的外源ABA处理。将其他群体胚胎聚集体用蔗糖（30％）作为对照处理，以验证缺乏水分胁迫是否不会影响ABA的效果GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba基因的表达。结果(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba)表现出显著的下调GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba由于外源ABA的存在，表明在葡萄体细胞胚的分化过程中，ABA介导了一种调节自身生物合成的机制GydF4y2Banced.GydF4y2Ba基因产物已提出是在ABA生物合成途径中进行的第一步[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]，是否由A​​BA调节该基因是一个非常相关的问题。虽然存在上调的证据GydF4y2Banced.GydF4y2Ba由ABA (GydF4y2Ba63GydF4y2Ba，人们还发现GydF4y2Banced.GydF4y2Ba基因表达未被番茄植物中的外源ABA诱导[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba[同样，ABA无法激活GydF4y2Banced.GydF4y2Ba豇豆的基因[GydF4y2Ba64GydF4y2Ba]．然而，我们在此提出的结果表明，ABA可以作为其自身生物合成调节的分子信号。GydF4y2Ba

我们的结果支持假设葡萄藤细胞胚胎培养物中的早熟萌发是由于内源性ABA的积累。在DM1分化介质上培养在透析膜上培养的体细胞胚胚，显示出显着的水损失和完全没有吞噬萌发。这些体细胞胚胎聚集体的分析显示内源性ABA积累的峰值和上调GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba基因表达在培养的第二周，与培养中此时体细胞胚的显著水分流失相一致。此外，aba产生的相关基因表达数据(GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba和GydF4y2BaVvBG2GydF4y2Ba）和aba降级（GydF4y2BaVvUGTGydF4y2Ba和GydF4y2BaVVHYD2.GydF4y2Ba)基因提示了葡萄体细胞胚在半透膜培养第四周分化过程中ABA水平的另一个重要控制点。qPCR分析GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba用外源ABA处理的体细胞胚胎聚集体中的基因表达显示出该基因的显着下调，这表明ABA生物合成的最终产物对其表达的基于反馈的控制。GydF4y2Ba

胚性培养的启动与维持胚性悬浮培养物的建立GydF4y2Ba

Baggiolini（1952）上H期的花序[GydF4y2Ba65GydF4y2Ba]的物候尺度(对应于分离的簇)GydF4y2Ba葡萄GydF4y2Bal .简历。Mencía在Centro de Formación y Experimentación de Viticultura y Enología de Ribadumia(西班牙西北部加利西亚)。Prado等人(2010)通过4 '，6-二氨基-2-苯基lindole (DAPI, SERVA，海德堡，德国)染色证实了双核小孢子晚期。[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]并且用含有一滴洗涤剂的200ml蒸馏水洗涤300分钟的花序，在4℃下冷却4天，然后如Kikkert等人所述灭菌。（2005）[GydF4y2Ba66GydF4y2Ba]．从含有nitsch和nitsch（1969）的诱导培养基上培养的雄蕊的长丝诱导胚胎发生培养物[GydF4y2Ba67GydF4y2Ba]盐补充0.1 μM CoClGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba， Murashige和Skoog (1962) [GydF4y2Ba68GydF4y2Ba[维生素，6%蔗糖，0.1%酪蛋白水解物，1 μM 2,4- d (Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands)和4.5 μM thidiazuron (Duchefa)。将培养基pH调至5.8，然后在98 kPa、121℃下进行高压灭菌，使用0.3% gelite (Duchefa)进行固化。每片25枚雄蕊放置在直径90毫米的聚苯乙烯培养皿中，培养皿中含有25毫升培养基。培养物保持在24±1°C连续黑暗下，每隔30天传代到新鲜培养基上。GydF4y2Ba

将保持在固体诱导培养基上的400 mg(鲜重)球状体胚聚集物转移到100 mL的Erlenmeyer瓶中，瓶中含有50 mL的液体诱导培养基。悬浮液在24°C、连续黑暗、150 rpm的旋转摇床上孵育，每周更换75%的新鲜培养基来维持。4周后，悬浮液通过500 μm尼龙网获得由直径小于500 μm的胚胎细胞聚集物组成的均匀悬浮液，如前所述[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

葡萄体细胞胚分化GydF4y2Ba

通过接种200个细胞，胚性细胞聚集体分化为成熟胚胎 μL胚胎悬浮液在直径为90 mm的聚苯乙烯皮氏培养板上，其中含有25 mL DM1培养基，由上述不含植物激素的诱导培养基组成，并添加0.25%活性炭（Duchefa）[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]．在DM1分化培养基上测试不同的蔗糖浓度(1,3,6% w/v)。文化是维持在连续黑暗24±1°C,在三个不同的发展阶段和胚胎的百分比(torpedo-shape阶段,子叶的阶段,早熟地发芽胚胎)记录文化从四个板块中每4周后治疗,大约每盘70体细胞胚胎。这个实验重复了三次。GydF4y2Ba

为了测试醋酸纤维素半透膜对体细胞胚分化的影响，将固体诱导培养基上保持的球形体细胞胚聚集物转移到透析管醋酸纤维素膜(Sigma, St. Louis, MO，(美国)在90毫米直径的聚苯乙烯培养皿中添加了添加6%蔗糖的DM1培养基。六个胚胎聚集体(约。每盘培养1克鲜重)。膜是按照制造商的说明制备的，并在121°C的蒸馏水中蒸压两次20分钟。在5周的时间内，每周记录鲜重和干重，以计算在所有分化培养基中培养的胚聚集物的相对含水量。GydF4y2Ba

ABA和ABA-GE的测定GydF4y2Ba

在不同蔗糖浓度(1,3,6% w/v)的DM1培养基中培养，在半透膜上添加6%蔗糖，每周收集体细胞胚聚集物，并在液氮中冷冻。按照Prado等人(2014)的描述，从每个处理的三个独立样品中制备提取物[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]有一些修改。将胚胎聚集体的50毫克（干重）用5和3ml萃取溶剂（甲醇/水/甲酸，75：20：5，v / v / v）均化均化两次含有0.01％（w / v）丁基羟基甲苯的溶剂在黑暗中分别在4℃下重复反转，分别为16和3 h。将氘标记的内标（100ng D6-ABA和100​​ng D5-ABA-GE）加入到每个样品中，并如所述在提取过程开始时重复[GydF4y2Ba69GydF4y2Ba]．匀浆通过离心(10000次)清除GydF4y2BaGGydF4y2Ba4. 摄氏度，20 min），合并上清液，并在NGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba然后，甲酸（1 M） 添加以将音量调整为5 将提取物应用于混合模式色谱柱（Oasis MAX，150 mg/6 cc；Waters，Milford，马萨诸塞州，美国）用5 甲醇和5毫升 1毫升 M甲酸。在装载样品后，用5 10毫升 mM KHGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba阿宝GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba(PH 7) and 5 mL of water. The retained ABA and ABA-GE were eluted by applying 5 mL of 1% (v/v) formic acid in methanol. The solvent was vacuum-evaporated in a Savant Speed-Vac centrifugal evaporator (Thermo Fisher Scientific, Madrid, Spain). The dry fractions were reconstituted in 500 μL of water/acetonitrile/acetic acid (90:10:0.05, v/v) and analyzed using a UPLC Acquity system (Waters) and an API 3000 mass spectrometer (PE Sciex, Concord, Ontario, Canada) following the procedure described by Lopez-Carbonell et al. (2009) [69GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

总RNA提取和cDNA合成GydF4y2Ba

每周采集3个独立样本(生物重复)，至少60mg(鲜重)体细胞胚聚集体在有半透膜和没有半透膜的DM1培养基中培养。根据制造商的说明，在使用Aurum™总RNA迷你试剂盒(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)提取总RNA之前，样品用液氮冷冻。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific Inc.， Waltham, MA, USA)测定RNA浓度和纯度(260/280 nm和260/230 nm比值)，并使用Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano LabChip (Agilent, Mississauga, on, Canada)进行分析，以评估RNA质量。根据制造商的说明，使用iScript™cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad)从总RNA中合成cDNA，每20 μL反应体积的比例为1 μg，并在iQ™热循环器(Bio-Rad)上进行反应。GydF4y2Ba

qPCR内参基因的测定GydF4y2Ba

先前用Reid等人使用的一组15个引物对。（2006）[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]在葡萄嘌呤中，靶标14常用的参考基因被评估以确定在补充有6％蔗糖的DM1培养基上培养的葡萄胚胎聚集体中最稳定的表达基因，其中包含或不具有半透膜5周。这些引物中的大多数扩增单个基因区域，除外GydF4y2BaMDH（M）GydF4y2Ba（苹果酸脱氢酶，MULTITGET），GAGydF4y2BaPDH (m)GydF4y2Ba、UBQ10(m)(多聚泛素，多靶标)GydF4y2BaEF1 -α(米)GydF4y2Ba它放大了它们基因家族成员的不同区域。使用LinRegPCR v.11.0分析原始荧光数据[GydF4y2Ba42GydF4y2Ba(可以在GydF4y2Bahttp://linregpcr.nl.GydF4y2Ba）计算每个引物对的平均PCR效率和每次反应的CQ值。GydF4y2Ba

使用3个不同的软件程序分析内参基因候选的稳定性:GydF4y2Ba39GydF4y2Ba], NormFinder [GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]和最好的人[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba]，根据作者描述的条件和限制。对于Genorm和Normfinder程序，CQ值先前使用ΔCT方法转换为相对定量数据。它们是在没有的情况下进行的GydF4y2BaEF1 -α(米)GydF4y2BaReid等人建议的数据。（2006）[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]评估是否与GydF4y2BaEF1-α.GydF4y2Ba考虑到这一点，偏见了结果GydF4y2BaEF1 -α(米)GydF4y2Ba目标GydF4y2BaEF1-α.GydF4y2Ba以及其他的谬误推理。最后，根据三种方法验证的稳定性值进行排序，筛选出两个最稳定的内参候选基因。GydF4y2Ba

底漆设计和实时PCRGydF4y2Ba

qPCR引物进行分析GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba,GydF4y2BaVVHYD2.GydF4y2Ba和GydF4y2BaVvBG2GydF4y2Ba在国家生物技术信息数据库国家中心的这些基因的葡萄葡萄树序列中设计了相对基因表达，以及它们在葡萄CV的基因组中的存在。本研究中使用的Mencía是通过常规PCR验证的。由于搜索没有检索有关序列的信息GydF4y2BaUGTGydF4y2Ba该基因的引物是根据该基因在其他物种中的保守区比对设计的。通过常规PCR验证了其在葡萄基因组中的存在，并测序了468 bp的片段，用于qPCR引物的设计。所有常规PCR和qPCR引物(表GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba)使用Gene Runner软件（美国拉斯维加斯黑斯汀软件公司v3.01）设计。GydF4y2Ba

研究的基因转录物的相对丰度在每周在DM1培养基中的体细胞胚培养上为5周内确定，在DM1培养基加上6％蔗糖和有或没有半透膜。如上用Genorm，Normfinder和BestKeepter程序所述确定最稳定的基因对基因，作为参考基因。在DM1培养基的培养开始时收集的胚胎聚集体被认为是校准剂组。每次处理使用三个生物样品，并用两份测试每个样品。GydF4y2Ba

基因表达分析遵循定量实时PCR实验(MIQE)指南的最低信息发布[GydF4y2Ba70GydF4y2Ba]．在ICCLERE IQ™实时热循环仪（BIO中，在96孔板中，在96孔板中进行QPCR反应（20μl），0.4μm的每个引物和1.66ng cDNA。-rad）。反应如下进行：在98℃下，在98℃下在98℃下的40个循环，在58℃下为58℃，用于退火和延伸。通过在0.5℃/ 10s的斜坡设置下，通过将扩增器从65℃加热到65℃至90℃来获得每个扩增反应的特异性的解离曲线。每个板都包括重复的非模式控制。GydF4y2Ba

外源性ABA的影响GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba半透膜上葡萄体细胞胚分化过程中的基因表达GydF4y2Ba

球形体胚聚集体(100 mg鲜重)在醋酸纤维素半透膜上培养2周，膜上覆盖25 mL含6%蔗糖的DM1固体培养基。然后将含或不含10 μM ABA的30%蔗糖溶液直接移液到体细胞胚集合体中，2天后采集样本进行RNA提取。每个处理3个重复，试验重复2次。的相对表达水平GydF4y2Bavvnced1.GydF4y2Ba与在Sempermery膜上的DM1培养基开始在DM1培养基开始时收集的体细胞胚胎聚集体中的表达水平相比进行分析，其被认为是校准器组。如上所述，还进行RNA提取，cDNA合成和QPCR。GydF4y2Ba

数据及统计分析GydF4y2Ba

所有实验至少独立重复两次，以确保结果的重现性。利用Mann-Whitney统计分析了不同发育阶段葡萄体细胞胚的百分比数据GydF4y2BaUGydF4y2Ba测试。有关相对含水量的数据使用Kruskal-Wallis测试进行统计分析，然后进行Bonferroni后HOC测试。使用单向ANOVA与学生-Newman-Keuls后Hoc测试进行统计分析关于体细胞胚胎聚集体的ABA和ABA-GE含量的数据。统计测试（GydF4y2BaPGydF4y2Ba< 0.05)采用PASW Statistics 18软件(IBM, New Orchard Road, New York, USA)进行。GydF4y2Ba

使用ICYCLER IQ™软件（实时检测系统软件（BIO-RAD，Windows 3.0）分析来自QPCR的数据。使用LINREGPCR软件进行分析原始荧光数据[GydF4y2Ba42GydF4y2Ba]获得每对引物的平均PCR效率。测定相关基因表达并进行统计学分析（P < 0.05）使用REST-2009（相对表达式软件工具，2009年版[GydF4y2Ba71.GydF4y2Ba])的PCR效率校正和归一化两个内参基因，并与2GydF4y2Ba^{-ΔCqGydF4y2Ba}方法。GydF4y2Ba

本研究中使用的数据和材料可在合理的请求时从相应的作者获得。GydF4y2Ba

2,4 - d:GydF4y2Ba

2,4-二氯毒乙酸GydF4y2Ba

阿坝:GydF4y2Ba

脱落酸GydF4y2Ba

ABA-GE:GydF4y2Ba

ABA-葡萄糖基酯GydF4y2Ba

AP47.GydF4y2Ba:GydF4y2Ba

Clathrin适配器复合物中等亚基家庭蛋白基因GydF4y2Ba

背景：GydF4y2Ba

β葡糖苷酶GydF4y2Ba

CQ：GydF4y2Ba

量化周期GydF4y2Ba

DAPI:GydF4y2Ba

4'，6-二氨基-2-苯基吲哚GydF4y2Ba

EF1 -α(米)GydF4y2Ba:GydF4y2Ba

伸长因子1-α基因，多数GydF4y2Ba

GAPDH（M）GydF4y2Ba:GydF4y2Ba

甘油醛3-磷酸脱氢酶基因，多靶GydF4y2Ba

路政署：GydF4y2Ba

8'-羟化酶GydF4y2Ba

IAA：GydF4y2Ba

吲哚-3-乙酸GydF4y2Ba

MDH（M）GydF4y2Ba:GydF4y2Ba

苹果酸脱氢酶基因，多靶点GydF4y2Ba

nc:GydF4y2Ba

9-GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-epoxycarotenoid加双氧酶GydF4y2Ba

PP2AGydF4y2Ba:GydF4y2Ba

丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A基因GydF4y2Ba

定量PCR：GydF4y2Ba

定量聚合酶链反应GydF4y2Ba

沙粒GydF4y2Ba:GydF4y2Ba

沙氏蛋白基因GydF4y2Ba

提示41.GydF4y2Ba:GydF4y2Ba

Tip41的家族蛋白基因GydF4y2Ba

UBC.GydF4y2Ba:GydF4y2Ba

Ubiquitin-conjugating酶基因GydF4y2Ba

UBQ10GydF4y2Ba:GydF4y2Ba

Polyubiquitin基因,多目标GydF4y2Ba

UBQ-L40GydF4y2Ba:GydF4y2Ba

泛素延伸蛋白1（UBQ1）/ 60S核糖体蛋白L40基因GydF4y2Ba

UGT：GydF4y2Ba

UDP-葡糖糖基转移酶GydF4y2Ba

V:GydF4y2Ba

成对的变化GydF4y2Ba

VP14:GydF4y2Ba

viviparous14GydF4y2Ba

本文是木本植物生物技术与生殖生物学校际研究小组的贡献(小组代码08IDI1705)。作者还感谢MªJosé Graña和Julián Benéitez在Centro de Formación y Experimentación de Viticultura y Enología de Ribadumia (Pontevedra，西班牙)收集植物材料期间提供的宝贵帮助，该设施是加利西亚(西班牙)地区政府拥有的一个葡萄栽培设施。我们感谢Fernando Pliego Alfaro教授(Univ. Málaga，西班牙)在使用半透膜进行体细胞胚胎成熟方面提出的建议。我们感谢Ed Etxeberria教授(美国佛罗里达大学柑橘研究与教育中心，Lake Alfred, FL, USA)对手稿的英文风格进行了详细的修改。我们还要感谢CSIC-Univ Ciencias de la Vid y el Vino研究所的Yolanda Ferradás。拉里奥哈-拉里奥哈政府，Logroño，西班牙)，感谢她在表达实验中使用的葡萄藤基因注释方面的帮助。GydF4y2Ba

本研究部分由西班牙经济和竞争力部资助（授予AGL2009-07488）。Yosvanis Acanda感谢西班牙外交和合作部通过Maec-Aecid奖学金支持。óScarMartínez感谢西班牙教育部，文化和运动部通过FPU奖学金支持。作者宣布资金机构在研究中没有作用，在收集，分析和解释数据或写作稿件中。GydF4y2Ba

作者指出GydF4y2Ba

1. Yosvanis Acanda和óScarMartínez同样为这项工作进行了贡献。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. Dealtame DeBiología植物Y Ciencia del Suelo，Universidad de Vigo，校园大学，36310，Vigo，西班牙GydF4y2Ba

   Yosvanis Acanda， Óscar Martínez, María Jesús Prado & Manuel ReyGydF4y2Ba

2. 现在的住址;植物病理科，柑橘研究和教育中心，UF-IFAS，700实验站RD，Alfred，FL，33850，美国GydF4y2Ba

   Yosvanis AcandaGydF4y2Ba

3. 圣地亚哥-德孔波斯特拉大学(universsidad de Santiago de Compostela, Campus Sur)， 15872，圣地亚哥-德孔波斯特拉，西班牙GydF4y2Ba

   维多利亚玛丽亚冈萨雷斯GydF4y2Ba

4. CITACA，农业食品研究和转移群集，校园达AUGA，大学维哥，32004，奥伦塞，西班牙GydF4y2Ba

   曼努埃尔·雷伊GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

YA，óm，MJP和MR构思了该研究并设计了实验。YA和óm执行了实验并分析了数据。MVG和MR编写并编辑了ya和óm的贡献的稿件。所有作者都阅读并修订了稿件，提供了有用的讨论并批准了最终版本。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2Ba曼努埃尔·雷伊GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在公布的地图和机构附属机构的管辖权主张方面保持中立。GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文根据知识共享署名4.0国际许可证获得许可，该许可证允许以任何媒体或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您给予原作者适当的信任和来源，提供到知识共享许可证的链接，并说明是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包括在文章的知识共享许可证中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包括在文章的知识共享许可证和法定法规不允许我们的预期用途或超出允许用途，您需要直接获得版权持有人的许可。要查看本许可证的副本，请访问GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba．创作共用及公共领域专用豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信贷额度中另有说明。GydF4y2Ba

重印和权限GydF4y2Ba