选择性剪接分析提供了深入了解花生PEG发育的分子机制G.ydF4y2Ba

背景G.ydF4y2Ba

栽培花生（G.ydF4y2Ba落花生hypogaeaG.ydF4y2Ba）是世界上最重要的油料作物之一，钉和形成地下豆荚的产生是花生生殖发育所必需的过程。然而，一些信息已经报道了在花生PEG形成和发展剪接（AS）。G.ydF4y2Ba

结果G.ydF4y2Ba

在这里，我们提出了一个完整的全长(FL)转录组分析花生peg和早期荚发育过程中AS亚型。我们分别鉴定了1448、1102、832和902个特异性剪接转录本，分别存在于气栓、地下栓、地下未肿胀的栓和早期肿胀的豆荚中。共有184个剪接转录本与重力刺激、光和机械反应、激素介导的信号通路和钙依赖蛋白相关，可能参与了花生peg的发育。对于气栓，我们得到的剪接转录本主要参与重力刺激和细胞壁形态发生过程。在地下peg中进行AS的基因可能参与重力刺激、细胞壁形态发生过程和非生物反应。对于地下未肿胀的桩，剪接转录本主要与胚胎发育和根的形成有关。膨大豆荚早期进行剪接的基因主要与胚珠发育、根毛细胞膨大、根尖分裂和种子萌发有关。G.ydF4y2Ba

结论G.ydF4y2Ba

本研究提供了有证据表明，多种基因与重力刺激，光和机械响应，激素介导的信号通路和钙依赖性蛋白质，以及在花生PEG发育过程中表现出明显的同种型开关。由于地下钉和豆荚中的同种型提供了有价值的来源，以进一步了解在挂钩中产生的转录后调节机制和地下豆荚的形成。G.ydF4y2Ba

花生（G.ydF4y2Ba落花生hypogaeaG.ydF4y2BaL.）是世界上广泛栽培的石油和现金作物。然而，作为Fabaceae家族的成员之一，花生是一种不同于其他豆类的独特植物，其具有空中克里主历产花和地下豆荚的特征[G.ydF4y2Ba1G.ydF4y2Ba］．地上双受精后，雌蕊柄通过位于子房基部的分生细胞的伸长而形成一个特化的地向气栓。气桩在重力作用下向地面生长，并渗透到土壤中形成地下豆荚。然后在地下的豆荚发育胚并在地下产生种子[G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba］．成功的一代钉和形成地下荚的生产花生中发挥着重要的作用[G.ydF4y2Ba3.G.ydF4y2Ba］．因此，它是研究花生荚果充分认识花生生殖发育的机制是有价值的。迄今为止，许多研究已经对花生荚果进行探索其形成的机制和使用发展的分子途径[G.ydF4y2Ba4.G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba5.G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba6.G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba7.G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba8.G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba9.G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba10.G.ydF4y2Ba］．研究表明，在peg发育过程中，大量的基因和蛋白质参与了向地性回收、光和药物刺激、钙信号、激素生物合成和转运等多个生物学过程。此外，已有证据表明，一些转录后基因调控因子，如mirna，参与了花生peg发育的调控[G.ydF4y2Ba11.G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba12.G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba13.G.ydF4y2Ba[暗示后转录后规定在控制花生豆荚形成和发展方面发挥着重要作用。然而，作为转录后的调节机制之一，已经报道了花生PEG形成和开发中的替代剪接（AS）的信息。G.ydF4y2Ba

作为一个关键的转录后调节模式，允许通过选择不同的剪接位点来产生多个mRNA的前体mRNA [G.ydF4y2Ba14.G.ydF4y2Ba］．在植物中，超过60%的基因会发生AS，大多数剪接的变异具有未知的功能[G.ydF4y2Ba15.G.ydF4y2Ba］．在植物中进行了大量的调查，分析了多个组织和发育阶段的AS模式，确定了多种新的组织或阶段特异性亚型和许多相关基因的阶段依赖亚型开关[G.ydF4y2Ba16.G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba17.G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba18.G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba19.G.ydF4y2Ba］．值得注意的是，编码作为转录物的基因不一定在发育过渡期间显着表达，表明作为转录组的贡献与转录调节无关[G.ydF4y2Ba20.G.ydF4y2Ba］．类似的现象在还发现大尺度的基因表达的转录组研究，在植物发育的早期阶段[AS改变G.ydF4y2Ba17.G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba21G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba22G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba23G.ydF4y2Ba］．因此，优势的标识AS亚型交换机和发展特定AS成绩单将在初期控制植物生长发育提供更深入的理解的重要转录后调节机制。无处不在的转录后基因调控机制之一，然而，无论是开发专用花生AS亚型和AS控制花生PEG的形成和发展在很大程度上仍然要阐明交换机还发挥着重要作用。G.ydF4y2Ba

在这里，我们提出了一个全面的全长（FL）花生PEG和早期荚果发育期间亚型的转录组分析，提供的证据表明，许多基因都与重力的刺激，轻，力学响应，素介导的信号通路，和钙接受AS依赖性蛋白质表达开发特异性剪接的同种型或表现出明显的同种型开关。具体的AS地下钉和豆荚亚型鉴定提供了宝贵的资源，以进一步了解AS的转录后调节机制PEG和形成地下豆荚的产生。G.ydF4y2Ba

花生转录组测序G.ydF4y2Ba

为了构建完整的花生FL转录组景观，我们从花生的根、叶、茎尖、花和S1(气栓尖)、S2(地下栓尖)、S3(地下未膨胀的栓尖)和S4(地下膨胀荚果)的peg样品中构建了8个SMRT Bell条形码库(NCBI Accession Number:PRJNA643877)，产生394,047,898个原始子reads，平均每个样本有49,255,987个子reads，其中95%以上的读长低于5 kbp(表SG.ydF4y2Ba1G.ydF4y2Ba)．在底部的自我校正之后，产生了3,649,775的高质量读数。在这些读数中，基于3'-引物的存在，5'-引物和聚（a）尾部，将643,565（17.63％）分组为NFL（非全长）读数，并将3,006,210（82.37％）分组读取（表G.ydF4y2Ba1G.ydF4y2Ba)．通过去除嵌合转录本，最终获得2814161 (77.11%)FLNC(全长非嵌合)序列用于后续分析。G.ydF4y2Ba

花生全长转录本的重建G.ydF4y2Ba

为了获得不含物质的转录物，生成的FLNC读数用于聚类分析（图SG.ydF4y2Ba1G.ydF4y2Baa）。首先，使用GMAP，2,801,582（99.55％）FLNC读数被映射到花生参考基因组，其中映射了703,199％（25.10％），唯一映射了2,098,383（74.90％）（图。G.ydF4y2Ba1G.ydF4y2Bab）。映射的FLNC读取然后分成共识转录，导致247885独特FL转录从53618个基因模型（图始发：SG.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba)．这些转录本的平均长度(1475 bp)相对于花生参考转录本的平均长度(1571 bp)要短(图1)。G.ydF4y2Ba1G.ydF4y2Baa).在这些获得的FL转录本中，86,318份转录本具有外显子，其中67,457份(78.15%)转录本至少具有两个外显子(图)。G.ydF4y2Ba1G.ydF4y2Bab）。G.ydF4y2Ba

在获得的FL转录本中，223,855个转录本被定位到46,388个已知花生内参基因模型。与内参基因注释相比，已知基因模型28,845个，对应于53,553个FL转录本在3 '或5 '边界扩展。为了更新基因结构，通过ANGEL管道预测花生FL转录本的开放阅读框(ORFs)和非翻译区(utr)，并通过已知的花生二倍体和四倍体基因模型训练优化参数，最终更新了28,686个基因模型。同时，应用cDNA_Cupcake程序，共鉴定出63,070个推定融合基因模型，涉及63,091个融合转录本，其中大部分融合转录本均来自于染色体间的融合事件(图S)G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba)．G.ydF4y2Ba

通过对花生参考基因组FL转录本的解剖，共鉴定出7230个基因模型中位于基因间区域的24,030个新的可变剪接转录本。在这些转录本中，有10062个(4490个基因组位点)(图SG.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba）定义为长期非基于CPAT和PLEK的预测因子的长期非编码RNA（LINCRNA）。这些Lincrnas中的大部分具有至少两个外显子，长度分布范围为0.2至5.0 kbp（图SG.ydF4y2Ba1G.ydF4y2Bac, d)。在这些推测的lincrna中，通过与我们之前的数据集进行比较，共鉴定出131,626个lincrna为新的lincrna(图。G.ydF4y2Ba1G.ydF4y2Bac）。G.ydF4y2Ba

分析FL转录物的3'末端有助于我们鉴定花生中的替代多腺苷酸盐位点。在检测到的53,618种基因模型中，具有至少一种聚（a）位点的47,915个基因，11,109个基因具有至少5个聚（a）位点，平均每种基因的2.23多（a）位点（图。G.ydF4y2Ba1G.ydF4y2Bad）。通过对所有聚（a）位点的侧翼染色核苷酸序列特征来解剖，在3'UTR中的聚（a）位点上下游的尿嘧啶（U）富集和腺嘌呤（a）的尿嘧啶（U）富集，腺嘌呤（a）。发现Aaua​​aa和Uga的两个主题是位于聚（a）位点上游的共同特征（图。G.ydF4y2Ba1G.ydF4y2Bae）。G.ydF4y2Ba

选择性剪接事件鉴定G.ydF4y2Ba

利用获得的FL转录本和AStalavista程序鉴定花生的可变剪接事件。结果，共检测到68823个As事件，来自15903个基因(表S)G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba)．在这些检测到的AS事件中，共有41,398个(60.15%)被很好地分为5个主要AS事件，包括IR(内含子保留)、AA(可选接头)、AD(可选供体)、ES(外显子跳过)和MX(互斥外显子)。作为最丰富的As事件之一，IR包含14,187个(20.61%)事件，代表8619个(54.20%)基因发生As(图。G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Baa）。发现AA是具有12,565（18.26％）的第二次最丰富的最丰富的事件，其代表7709（48.48％）作为基因，其次是AD（9315,13.53％）和ES（5295,7.7％）。G.ydF4y2Ba

作为As事件的结果，共从46,388个参考基因模型中鉴定出170,302个新的FL转录亚型。在这些基因模型中，参考注释中发现5648个(12.18%)基因模型包含一个以上的转录本，而Iso-seq数据中发现29837个(64.32%)包含至少两个转录本亚型(图2)。G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Bab）。通过与已知的参考转录物进行比较，在该分析中含有超过五种转录物（29.2％）的基因的百分比显着高于参考基因组注释的（1.0％）。平均而言，作为事件分析检测到每种基因的4.83转录物，其比起始参考注释中的4.2倍更高（图。G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Bab）。G.ydF4y2Ba

为了比较参考基因组和Iso-seq数据中检测到的可选剪接异构体，我们计算了Iso-seq和参考转录本中源自相同基因的异构体的比例。结果表明，在Iso-seq中，有344个基因(组1)的亚型比参考数据集少;3706个基因(组2)在Iso-seq和参考数据集中共享相同的亚型数;在Iso-seq中，24,803个基因(组3)的亚型数相对多于参考数据集(图3)。G.ydF4y2Ba3.G.ydF4y2Baa）。基于所获得的所有转录物的富集分析表明，第1组中的基因主要涉及细胞发育过程，细胞组分组织调节和生殖过程。第3组中的基因富集，建立了本地化，运输和辅因子代谢过程。例如，一个基因G.ydF4y2BaPB.35200G.ydF4y2Ba从第1组，在ISO-SEQ数据集中仅含有一种同种型，而在ISO-SEQ数据集中仅含有一个同种型，而在包含5个同种型的情况下检测到参考数据组（图。G.ydF4y2Ba3.G.ydF4y2Bab）。在第1组中检测到的大多数这些异形型被AA和AD的事件转录。一个基因G.ydF4y2BaPB.27510G.ydF4y2Ba从编码RNA依赖RNA聚合酶1的组2中，显示在Iso-seq和参考数据集中转录6个转录本(图2)。G.ydF4y2Ba3.G.ydF4y2Bac),一个基因G.ydF4y2BaPB.40789G.ydF4y2Ba从组3中，在ISO-SEQ数据集中检测到编码细胞周期蛋白蛋白，在ISO-SEQ数据集中产生15个同种型，而在参考数据组中被示出仅录制一个转录同种型（图。G.ydF4y2Ba3.G.ydF4y2Bad）。这些结果还表明，由于事件促成了花生转录组的复杂性。G.ydF4y2Ba

组织特异性可变剪接同工型G.ydF4y2Ba

为了鉴定组织特异性亚型，比较了所有组织的FL转录本亚型。维恩图显示，在根、叶、茎尖、花和木桩组织中分别检测到1843、3528、1406、5005和15206个异构体。G.ydF4y2Ba4.G.ydF4y2Baa).在所有组织中共鉴定出4620个重叠的可选择剪接亚型(图。G.ydF4y2Ba4.G.ydF4y2Baa).这些亚型大多来自IR、AA和AD的AS事件(图2)。G.ydF4y2Ba4.G.ydF4y2Bab）。对于PEG组织，15206的11,112具体亚型是从5467个基因通过AS事件转录。GO富集分析表明，这些同种型主要涉及多种代谢过程，生物合成的过程中，蛋白质修饰过程中，信号转导，细胞应激反应，如响应于有机物质（植物生长素，有机氮化合物）和氮化合物，以及植物生长和发育调节过程中，如结瘤，组织发育和形态发生（图G.ydF4y2Ba4.G.ydF4y2Bac）。G.ydF4y2Ba

为了进一步评估组织特异性同种型的可靠性，基于通过高通过放入illumina测序数据获得的同种型表达水平来计算每种同种型的组织特异性得分。结果表明，PEG组织和非PEG组织特异性同种型的JS评分的分布显着高于重叠的同种型（Kolmogorov-Smirnov测试，G.ydF4y2BaP.G.ydF4y2Ba < 2.2 × 10–16) (Fig.4.G.ydF4y2Bad）。结果表明，由ISO-SEQ检测的组织特异性同种型具有高通过放入Illumina测序数据的表达模式，反映了这些组织特异性同种型检测的可靠性。G.ydF4y2Ba

不同peg发育阶段异构体的表达动态G.ydF4y2Ba

为了研究选择性剪接亚型在聚乙二醇发育中的作用，我们比较了聚乙二醇组织特异性选择性剪接亚型在四个聚乙二醇发育阶段中的表达水平。在四个peg发育阶段共发现690个选择性剪接异构体的差异表达。通过TCseq软件将这些亚型进一步划分为2个不同的簇。(无花果。G.ydF4y2Ba5.G.ydF4y2Baa).聚类1包含340个亚型，在peg发育的4个阶段表达均持续增加。对这些异构体进行氧化石墨烯功能分析，丰富了磷酸化、氧化还原过程、脂质代谢过程、离子转运和防御反应等功能项。其中，许多转录因子亚型的表达水平在peg的四个发育阶段均有所升高，包括热应激成员、Myb、GATA、WRKY、bHLH140、Trihelix等家族(图1)。G.ydF4y2Ba5.G.ydF4y2Bab和表sG.ydF4y2Ba3.G.ydF4y2Ba)．此外，在peg发育的4个阶段中发现了剪切因子的4个亚型，包括剪接因子3B和富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子成员，表明剪接因子增加了peg发育过程中转录调控的复杂性。G.ydF4y2Ba

与聚类1的表达模式相反，聚类2包含350个亚型，其中在peg发育的4个阶段，亚型的表达水平持续下降。氧化石墨烯功能富集分析表明，其亚型主要参与多细胞生物的发育、蛋白质运输和代谢过程。在这些亚型中，许多编码转运蛋白家族成员在peg发育过程中表达减少，包括ABC转运蛋白(ABC转运蛋白家族B、C、F和G)、硼转运蛋白、塑性葡萄糖转运蛋白和双向糖转运蛋白(图2)。G.ydF4y2Ba5.G.ydF4y2Bac和表S =G.ydF4y2Ba3.G.ydF4y2Ba)．编码生长素运出载体（PB.13251.3和PB.14190.1）和生长素诱导蛋白（PB.34545.3和PB.51026.1）四个亚型被发现组成跨四个PEG发育阶段下降。编码微管蛋白（PB.17695.3）和早期根瘤样蛋白（PB.9298.3）同种型中的PEG发展阶段表现出减少的表达模式。此外，编码纤维素合酶的同种型跨发育阶段表现出渐减表达模式，表明纤维素的通过整个PED发育阶段的缩小合成。G.ydF4y2Ba

舞台专用剪接异构体G.ydF4y2Ba

为了阐明花生PEG发展阶段特异性剪接异构体的作用，花生独家亚型的表达水平在四个发展阶段跨越PEG组织相比。结果表明，1448，1102，832，和902独特地表达同种型的可变剪接从622，461，363，和389个基因在S1，S2，S3和S4，分别（图的阶段。G.ydF4y2Ba6.G.ydF4y2Baa）。这些阶段的GO功能富集分析可变剪接同工型显示，代谢，生物合成，代谢和发育，响应于刺激，和RNA加工的过程中主要是富含S1;氮化合物或蛋白质代谢过程，蛋白或有机物质输送，蛋白水解，细胞，大分子，或蛋白质定位，生物过程调节，和后胚胎发育均S2富集的主要功能;S3富含氮化合物或蜂窝氨基酸代谢，小分子的生物合成过程中，定位，运输，和发育过程的进程;在S4的特定选择性剪接的同种型主要参与细胞过程，蛋白质磷酸化，信号转导和细胞通讯（图G.ydF4y2Ba6.G.ydF4y2Bab和表sG.ydF4y2Ba4.G.ydF4y2Ba)．G.ydF4y2Ba

间的622个基因与在S1阶段特异性剪接同种型，G.ydF4y2BaPB.38453G.ydF4y2Ba，编码嘌呤霉素敏感氨基肽酶，其具有由于IR和AD事件引起的最大数量的剪接同种型，其中2个同种型来自IR事件，6种同种型来自广告事件（图。G.ydF4y2Ba7.G.ydF4y2Baa）。第二基因，G.ydF4y2BaPB.38816G.ydF4y2Ba，编码肌醇-3-磷酸合酶，产生7个通过IR和AA事件可变剪接的同种型，其中在与表达水平分布S1阶段特异表达为0.15〜65（图G.ydF4y2Ba7.G.ydF4y2Bab)基因G.ydF4y2BaPB.33439G.ydF4y2Ba在S2期特异性表达的亚型数量最多。通过两次AD事件，该基因特异性剪切成7个亚型，表达水平从0.1到35不等(图)。G.ydF4y2Ba7.G.ydF4y2Bac）。在基因S3阶段观察到类似的现象G.ydF4y2BaPB.18797G.ydF4y2Ba为高亲和性硝酸盐转运体编码，G.ydF4y2BaPB.46278G.ydF4y2Ba编码的LRR受体样丝氨酸/苏氨酸 - 蛋白激酶，和一个基因G.ydF4y2BaPB.8144G.ydF4y2Ba编码l-抗坏血酸过氧化物酶。这三个基因都有5个由AD和IR事件引起的可变剪接亚型(图)。G.ydF4y2Ba7.G.ydF4y2Bad-f)。一个基因G.ydF4y2BaPB.16991G.ydF4y2Ba，编码谷氨酰胺合成酶结节同工酶，通过AD和AA事件特异性剪接成8个亚型(图。G.ydF4y2Ba7.G.ydF4y2Bag)，其中在S4期特异表达，表达水平为0.12 ~ 65.5。同样,一个基因G.ydF4y2BaPB.52456.G.ydF4y2Ba，编码筛元件OCCLUSION B蛋白，观察到有7个在S4阶段选择性剪接的同种型由于AD和IR事件（图G.ydF4y2Ba7.G.ydF4y2Bah）。所有这些可变剪接同工型在具有不同的表达水平S4阶段特异表达。此外，这些结果表明，特定的阶段，剪接异构体从AS事件未来可能在花生PEG发展具有重要作用。G.ydF4y2Ba

花生的综合FL转录图谱是由PacBio异SEQ根，叶，芽尖，花，和PEG组织的组织重建。采用ISO-seq的数据，我们检测到多个AS与PEG组织和发育阶段特异FL成绩单关联的事件。我们在花生S1，S2，S3和S4分别标识1448，1102，832，和902倍的可变剪接的转录物，包括184倍与光和机械响应，重力刺激，激素介导的信号传导途径，和钙依赖性可变剪接的转录物蛋白质，这被认为是打在花生PEG发展的重要角色，如PEG伸长率和早期结荚。G.ydF4y2Ba

S1 PEG代表受精势栓，可感知重力和向下倾斜。在该阶段，我们确定了与光和机械刺激，重力刺激，激素响应因子和钙依赖性蛋白激酶和感测受体相关的多个特异性表达的转录物（表S.G.ydF4y2Ba5.G.ydF4y2Ba)．在这些转录物中，我们发现21种与光和机械刺激有关的转录物，包括真空蛋白质分选相关蛋白（9转录物），过氧化物酶相关蛋白（6转录物），V型质子ATP酶亚基（4转录物）和真空阳离子/质子交换器5（2个转录物），据报道，在花生PEG伸长率和POD开发中发挥关键作用[G.ydF4y2Ba4.G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba7.G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba9.G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba24G.ydF4y2Ba］．前期研究表明，ABC转运体、微管、微管相关蛋白和热激蛋白在响应植物重力刺激中发挥重要作用[G.ydF4y2Ba25G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba26G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba27G.ydF4y2Ba］．在该研究中，我们鉴定了与重力刺激有关的20个特异性表达的转录物，其中包括8个ABC转运蛋白转录物，5个α-小管蛋白转录物，3个微管相关蛋白转录物，两个微管结合蛋白缠结的转录物和两个小型热休克蛋白转录物。值得注意的是，两个祖食基因，G.ydF4y2Ba重力响应改变G.ydF4y2Ba（ARG1）和G.ydF4y2Ba祖国主义有缺陷2G.ydF4y2Ba（GRV2），其特征良好地影响植物生长响应于重力[G.ydF4y2Ba28G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba29G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba30.G.ydF4y2Ba]，被检测到的每个可选地转录2个同种型和只在S1栓唯一地表示。据报道重力感知可能会引起生长素的不对称再分配，使植物器官弯曲远离或朝向重力矢量成长[G.ydF4y2Ba31G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba32G.ydF4y2Ba］．我们鉴定了与激素响应因子相关的15个转录物，包括7种毒素响应因子，2个毒素响应蛋白IAA26，2个乙烯 - 过量生产蛋白质1,2乙烯响应性转录因子RAP2-12和2 IAA-氨基酸水解酶ILR1样6，其在S1 PEG中特别表达。重力刺激反应可能会增加CAG.ydF4y2Ba^{2＋G.ydF4y2Ba}细胞质和进一步促进细胞壁的可扩展性水平，这改变了植物生长素的极性运输[G.ydF4y2Ba33G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba34G.ydF4y2Ba］．我们发现与依赖钙蛋白激酶和感测受体有关的6个特异性表达的转录物，包括钙感应受体（3转录物）和依赖钙蛋白激酶（3转录物）。例如，我们鉴定了14个细胞壁结构相关的转录物，包括10个verlins，2个多肢乳糖酶和2个扩展蛋白。villins参与调节植物肌动蛋白动态，例如花粉管和根毛的生长[G.ydF4y2Ba35G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba36G.ydF4y2Ba］．扩展蛋白发挥多种形态发生过程至关重要的作用，如植物细胞壁伸长和延伸，花粉管和根毛生长，生长素作用的调节[G.ydF4y2Ba37G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba38G.ydF4y2Ba］．我们的结果表明，绒毛蛋白和扩张蛋白可能有助于S1钉的伸长。另一个基因，GDSL酯酶/脂肪酶，被报道具有调节乙烯信号成分调节全身免疫的功能G.ydF4y2Ba拟南芥G.ydF4y2Ba[G.ydF4y2Ba39G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba40G.ydF4y2Ba，被鉴定为两种亚型的交替转录，并且只在S1 peg中表达。G.ydF4y2Ba

S2代表了渗透到土壤中的底层栓24小时，其表现出与S1 PEG比较的不同形态学和生理特性。我们识别出在S2钉中特异性表达的多个可拼接转录物（表S.G.ydF4y2Ba5.G.ydF4y2Ba），其中主要涉及机械刺激，重力刺激，生长素转运以及响应蛋白，转运蛋白，以及蛋白激酶。Twenty-two alternatively spliced transcripts related to gravity stimulation (10 transcripts) and mechanical stimulus (12 transcripts) were specifically expressed in S2 pegs, suggesting that the transcripts contributed to the peanut peg elongation after penetration into soil within 24 h. A gravitropic gene,拍向地性6G.ydF4y2Ba（G.ydF4y2BaSGR6G.ydF4y2Ba据报道，据报道，涉及形态学和真空膜结构的调节，重力感测内胚层细胞的变化G.ydF4y2Ba拟南芥G.ydF4y2Ba[G.ydF4y2Ba41G.ydF4y2Ba]，被鉴定为具有由AA事件3个同种型和具体地仅在S2钉表达。确认的可能5个转录物进一步分析是生长素运输以及响应包括参与生长素2转运状生长素响应性蛋白IAA30蛋白4和3。我们确定在S2栓多特异性表达转运转录，包括GABA转运体1（2个转录物），镁转运NIPA6（4个转录），硫酸转运4.2（4个转录本），蛋白转运蛋白Sec24状At3g07100（3个转录本），糖转运ERD6样6（2个转录物），液泡膜二羧酸转运（3个转录本），和二羧酸液泡膜转运体（2个转录物），其中均一致性与以前的研究转录花生[G.ydF4y2Ba4.G.ydF4y2Ba］．大量转录物编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶被鉴定的蛋白质参与冷，盐胁迫和在通过自磷酸化植物生长和发育的调节[G.ydF4y2Ba42G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba43G.ydF4y2Ba］．G.ydF4y2Ba

S3的钉子与S2不同，它代表的是在插入土壤3天后，地下的钉子在重力的作用下重新定位。我们鉴定了许多与机械刺激相关的选择性剪接转录本，如过氧化物酶、液泡分选受体、v型质子atp酶和许多激素反应蛋白，如生长素反应蛋白和乙烯过剩蛋白，表明这些转录本在地下钉的发育中发挥作用。与S2 peg类似，我们发现了与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶蛋白相关的多个转录本，特别是与LRR受体类似的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(10个转录本)，它们参与了脱落酸的早期信号转导，并作为脱落酸中必不可少的调节因子G.ydF4y2Ba拟南芥G.ydF4y2Ba胚胎图案形成和子叶原基代[G.ydF4y2Ba44G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba45G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba46G.ydF4y2Ba］．值得注意的是，我们检测到许多AS转录本参与了S3 peg中开发过程的调控。一个基因,G.ydF4y2Ba胚胎瑕疵1674G.ydF4y2Ba（G.ydF4y2BaEMB1674G.ydF4y2Ba)，有两个亚型的AA事件，参与正常胚胎发育的调节G.ydF4y2Ba拟南芥G.ydF4y2Ba[G.ydF4y2Ba47G.ydF4y2Ba］．的基因G.ydF4y2Ba基本PENTACYSTEINE4G.ydF4y2Ba（G.ydF4y2BaBPC4G.ydF4y2Ba)，作为AD事件有两种亚型，作为正转录调节因子参与发育过程G.ydF4y2Ba拟南芥G.ydF4y2Ba[G.ydF4y2Ba48G.ydF4y2Ba］．一个基因G.ydF4y2Ba异常根形成蛋白4G.ydF4y2Ba（G.ydF4y2BaALF4.G.ydF4y2Ba）编码核局部蛋白质，由于IR事件有两种同种型，这在其上发挥着重要作用G.ydF4y2Ba拟南芥G.ydF4y2Ba侧根形成[G.ydF4y2Ba49G.ydF4y2Ba］．同时，我们发现在发展轻监管，例如涉及到一些基因，G.ydF4y2BaFAR1-RELATED序列5G.ydF4y2Ba（G.ydF4y2BaFRS5.G.ydF4y2Ba），由于AD，AA和ES事件具有三种同种型，其作为转录激活剂的作用，涉及在调节发育的光控制中G.ydF4y2Ba拟南芥G.ydF4y2Ba[G.ydF4y2Ba50.G.ydF4y2Ba]；G.ydF4y2BaXAP5 Circadian考试器G.ydF4y2Ba（G.ydF4y2BaXCTG.ydF4y2Ba)通过一个AA事件有两个亚型，参与协调光形态发生和昼夜时钟的光信号G.ydF4y2Ba拟南芥G.ydF4y2Ba[G.ydF4y2Ba51.G.ydF4y2Ba］．G.ydF4y2Ba

S4表示土壤渗透后地下荚经受膨胀和伸长率。我们确定在S4荚902分选择性剪接的成绩单。在这些转录物中，我们检测到的相关的机械刺激，生长素应答蛋白，钙多个转录结合/转运蛋白，运输，细胞周期蛋白的蛋白质，以及开发过程调节剂。十七与机械刺激（8个转录）和钙结合转录/转运蛋白（7个转录）被确定特异性表达早期肿胀吊舱。八个转录编码生长素应答因子3/4和生长素响应性蛋白IAA9在S4荚果特异性表达，其参与的生长素应答基因的表达调控[G.ydF4y2Ba52.G.ydF4y2Ba］．复合无机离子和小的有机物质转运转录在S4荚果显示出独特地表达。一个基因，G.ydF4y2Ba生长素转运蛋白BIGG.ydF4y2Ba（大）编码鳞状蛋白质，由于广告事件，有两种同种型，其在光介导的刺激期间参与极性养蛋白转运[G.ydF4y2Ba53.G.ydF4y2Ba］．许多编码细胞周期蛋白的AS转录本被鉴定为在早期肿胀荚果中特异性表达。在这些周期蛋白中，G.ydF4y2BaCyclin-D4-1G.ydF4y2Ba（G.ydF4y2BaCYCD4-1G.ydF4y2Ba)作为…的刺激物G.ydF4y2Ba拟南芥G.ydF4y2Ba根尖分裂促进种子萌发[G.ydF4y2Ba54.G.ydF4y2Ba］．此外，我们确定了在S4豆荚中与开发过程调节剂相关的多个特异性表达的转录物。来自基因的七个转录物G.ydF4y2BaTOPLESSG.ydF4y2Ba（G.ydF4y2BaTPL.G.ydF4y2Ba）在早期膨胀荚中唯一表达编码转录核心压力，其作为胚珠发育中的必要因素作用[G.ydF4y2Ba55.G.ydF4y2Ba］．值得注意的是，有五个基因转录本G.ydF4y2Ba根毛瑕疵3G.ydF4y2Ba（G.ydF4y2Barhd.G.ydF4y2Ba3）编码GTP结合蛋白在溶胀吊舱，这是参与根或根毛细胞肿大[鉴定G.ydF4y2Ba56.G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba57.G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba58.G.ydF4y2Ba］．G.ydF4y2Ba

综上所述，我们提出了一个全面的转录花生PEG和早期荚果发育期间亚型的剖析。多个基因都与重力刺激，光和机械响应，激素介导的信号传导途径，和钙依赖性蛋白进行开发特异性AS明示剪接同种型或表现出明显的同种型开关（图G.ydF4y2Ba8.G.ydF4y2Ba)．在地下PEG和豆荚中的同种型的鉴定为同种型提供了有价值的来源，以进一步了解在生成钉和地下豆荚的产生中的转录后调节机制。G.ydF4y2Ba

植物材料G.ydF4y2Ba

花生品种HY9306于2018年3月至8月在中国山东省莱西的温室(25-30°C)中种植。花生种子用去离子水(50℃)预浸10 min，室温孵育过夜。在相对湿度为100%的发芽机(CB-A323B型，中国广东康妮)中，在黑暗中培养5 d。在萌发过程中，温度保持在25℃，种子每10分钟用新鲜去离子水自动冲洗一次。10天后，在蛭石中播种，每块一粒。所有组织均按上述方法采集[G.ydF4y2Ba59.G.ydF4y2Ba］．简而言之，收集根组织10 d后出现后。叶组织被取样幼苗叶10 d后出苗，主干叶和横向（n + 1）叶。从第一次横向（N + 1）的主干和生殖尖端收集芽组织。鲜花汇集了平坦的，古尼奥和androecium。花生荚被采样的空中钉尖端（S1），地下栓尖端（24小时）（S2），地下没有蜡烛PEG尖端（S3）和地下膨胀盒（S4）（图。G.ydF4y2Ba9.G.ydF4y2Ba)．除了在8:30 h收获的花样除外，均收集所有组织。每个组织从十个个体植物中取样。将所有收获的样品在液氮中冷冻15分钟，然后储存在-80℃。G.ydF4y2Ba

RNA孤立G.ydF4y2Ba

使用GeneJET植物RNA纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific, USA)从每个组织样本中提取总RNA。RNA质量由NanoDrop 2000仪器(Thermo Fisher Scientific, USA)检测。RNA完整性由安捷伦2100生物分析仪(美国安捷伦技术公司)评估，完整性值在8.5以上的RNA用于后续分析。G.ydF4y2Ba

PACBIO图书馆建筑和测序G.ydF4y2Ba

每个组织的合格RNA被同等地汇集并用于单分子实时(SMRT)贝尔库的构建。SMRTBell文库是根据太平洋生物科学公司推荐的协议编写的，并进行了以下修改。输入1微克总RNA，用SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech, Japan)合成cDNA。采用KAPA HiFi PCR试剂盒(KAPA biosystems, USA)进行PCR扩增。PCR产物输入美国Sage science公司的BluePippin Size Selection system进行大小选择，筛选出长度为0.5 ~ 6kbp的产物。然后根据推荐协议使用SMRTbell模板准备试剂盒将选定的产品用于SMRTbell模板准备。SMRTBell文库制备完成后，将每个模板30纳米克输入PacBio Sequel平台(KeGene Tech, Shandong)，使用P6-C4聚合酶完成测序。总共对八个SMRTBell库进行了测序。G.ydF4y2Ba

Illumina文库建设和测序G.ydF4y2Ba

Illumina测序文库使用以下推荐的协议Illumina公司TruSeq RNA文库制备试剂盒V2（Illumina公司，USA）完成。Briefly, 1 μg of total RNA were used to synthesize cDNA using SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech, Japan). Then, 300 ng of cDNA were fragmented into length of 250–300 bp using a Covaris E220 Focused-ultrasonicator (Covaris Inc., Woburn, MA, USA). Subsequently, the sheared cDNA was used to construct the sequencing library using Illumina TruSeq RNA Library Preparation Kit v2 using with 10 cycles of PCR. The libraries were sequenced on an Illumina Hiseq X Ten instrument with paired-end 150 bp strategy by KeGene Science & Technology Co. Ltd. (Shandong, China).

PacBio Iso-Seq数据分析G.ydF4y2Ba

读取获得的原始聚合酶使用IsoSeq v3的软件（进行了处理G.ydF4y2Bahttps://github.com/PacificBiosciences/IsoSeqG.ydF4y2Ba)．之后，除去适配器和低质量的读取，清洁subreads进行处理以获得圆形的共有序列（CCS）。据'，5'引物的3是否存在，并同时或不聚A尾巴，该CCS序列分为全长非嵌合（FLNC）读取和非全长（NFL）中读取。随后，FLNC读段输入到簇，并生成最终的抛光FLNC序列。所述抛光FLNC序列映射到G.ydF4y2BaA. hypogaea.G.ydF4y2Ba参考基因组(G.ydF4y2Ba60.G.ydF4y2Ba]使用gmap v2019-12-01软件[G.ydF4y2Ba61.G.ydF4y2Ba[参数设置：--max_introlenth-moutht-moutht = 20,000 --no-chimeras-n 0 - 模板 - 大内含子 - 译。将基因组对齐折叠以使用cDNA_cupcake V11.0.0软件获得独特的转录基因座（G.ydF4y2Bahttps://github.com/Magdoll/cDNA_CupcakeG.ydF4y2Ba）以如下参数设置：-c 0.8 -i 0.7。随后，所获得的独特转录物加工使用切实V6.0.0软件以重构编码基因组（G.ydF4y2Bahttps://github.com/Magdoll/CogentG.ydF4y2Ba)．G.ydF4y2Ba

基因注释G.ydF4y2Ba

为获得各转录本的功能，使用TransDecoder v5.5.0软件(G.ydF4y2Bahttps://github.com/transdecoder/transdecoder.G.ydF4y2Ba）对于每份转录物的最小氨基酸长度，最长的ORF被定义为反冲并选择用于功能注释。使用NCBI BLASTP（BLAST V2.2.28 +）软件使用NCBI BOATTRP（BLAST V2.2.28 +）软件以及参数设置，搜索蛋白质序列：-epalue1e-5 -max_target_seqs 1 -outfmt 6.以识别功能蛋白域，使用PFAMSCAN程序对PFAM V32.0数据库进行搜索蛋白质序列[G.ydF4y2Ba62.G.ydF4y2Ba］．通过BLAST2GO V5.2软件获得每个转录物的GO功能。每个转录的Kegg函数被注释G.ydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳G.ydF4y2Ba蛋白质通过BBH方法通过KAA的在线工具[G.ydF4y2Ba63.G.ydF4y2Ba］．G.ydF4y2Ba

选择性剪接事件G.ydF4y2Ba

将其识别为事件中，AStalavista V4.0.1软件[G.ydF4y2Ba64.G.ydF4y2Ba使用基于FLNC序列的折叠的gff3文件执行。根据输出文件，识别出5种主要的AS事件类型，包括内含子保留(IR，编码:1^2-，0)、外显子跳跃性(ES，编码:1- 2^，0)、备选受体位点(AA，编码:1-，2-)、备选供体位点(AD，编码:1^，2^)和互斥外显子(MX，编码:1- 2^，3-4 ^)。G.ydF4y2Ba

保利(a)分析G.ydF4y2Ba

为了识别Poly（a）尾，使用FLNC序列使用太平洋生物科的SMRT分析管道。当所有FLNC序列的30个碱基中存在超过8个碱基和小于两个非碱而确定聚（a）位点。使用在线MEME工具筛选聚（a）位点的侧翼上的图案峰。G.ydF4y2Ba

新型转录本和长基因间非编码rna鉴定G.ydF4y2Ba

与花生参考基因组的已知基因模型不一致的FLNC序列被鉴定为新的转录本。利用新的转录本鉴定长基因间非编码rna (lincRNAs)。CPAT v1.2.4软件[G.ydF4y2Ba65.G.ydF4y2Ba]和PLEK v1.2软件[G.ydF4y2Ba66.G.ydF4y2Ba]用于识别来自新型转录本的lincRNAs。将候选lincRNA与之前构建的数据集进行比较[G.ydF4y2Ba67.G.ydF4y2Ba］．G.ydF4y2Ba

Illumina RNA-seq数据分析G.ydF4y2Ba

Illumina RNA-seq数据用于检测剪接连接(SJs)。三个工具，TopHat v2.1.1 [G.ydF4y2Ba68.G.ydF4y2Ba]，mapsplice v2.2.1 [G.ydF4y2Ba69.G.ydF4y2Ba]，和STAR v2.7.3a [G.ydF4y2Ba70G.ydF4y2Ba]，用于基因组映射。当鉴定至少有两个软件并且至少有五个RNA-SEQ读取的读取时，SJ被保留。通过Cufflinks V2.2.1软件估算每个转录物的表达水平[G.ydF4y2Ba71G.ydF4y2Ba设置参数:-multi-read-correct - fragment -bias-correct。通过计算每个转录本的Jensen-Shannon (JS) divergence score来确定组织特异性[G.ydF4y2Ba72G.ydF4y2Ba］．G.ydF4y2Ba

本研究中使用和分析的数据集均可根据要求从通讯作者处获得。序列已在PRJNA643877项目下的NCBI序列读取归档中存储。G.ydF4y2Ba

为:G.ydF4y2Ba

可变剪接G.ydF4y2Ba

fl：G.ydF4y2Ba

完整的长度G.ydF4y2Ba

FLNC：G.ydF4y2Ba

全长非嵌合读G.ydF4y2Ba

NFL：G.ydF4y2Ba

非全长G.ydF4y2Ba

ORF：G.ydF4y2Ba

开放阅读框G.ydF4y2Ba

UTRS：G.ydF4y2Ba

未翻译区G.ydF4y2Ba

lincRNAs：G.ydF4y2Ba

长期性非致rnasG.ydF4y2Ba

红外：G.ydF4y2Ba

内含子保留G.ydF4y2Ba

AA：G.ydF4y2Ba

选择适配器G.ydF4y2Ba

AD：G.ydF4y2Ba

替代捐助者G.ydF4y2Ba

es：G.ydF4y2Ba

外显子跳跃G.ydF4y2Ba

MX:G.ydF4y2Ba

相互独家的外显子G.ydF4y2Ba

SC:G.ydF4y2Ba

单一副本(地区)G.ydF4y2Ba

SMRT：G.ydF4y2Ba

单分子实时G.ydF4y2Ba

SJS：G.ydF4y2Ba

接头连接G.ydF4y2Ba

JS：G.ydF4y2Ba

Jensen-Shannon.G.ydF4y2Ba

作者要感谢中国海洋大学的臧晓南博士，她对本文早期版本的出色建议。G.ydF4y2Ba

这项工作得到了国家自然科学基金的支持（授予数字：31901506），山东省泰山学者项目（授予数字：TS201712080），山东省农业工业技术研究体系（授予号码：Sdait-04-02）。资助者在研究和收集，分析和解释的设计中没有作用，以及编写手稿。G.ydF4y2Ba

作者指出G.ydF4y2Ba

1. 刘晓波赵，李Chunjuan同等贡献这项工作。G.ydF4y2Ba

从属关系G.ydF4y2Ba

1. 山东省花生研究所，青岛，中国G.ydF4y2Ba

   赵晓波，李春娟，张浩，闫彩霞，孙全喜，王娟，袁翠玲，单世华G.ydF4y2Ba

贡献G.ydF4y2Ba

XZ和SS构思和设计研究;HZ，QS和CY1（彩霞元）进行的实验;CY2（翠玲元），JW nalyzed所述数据;XZ和CL制备的数字和/或表格;XZ和CL写文章。所有作者阅读并同意最终的文本。G.ydF4y2Ba

相应的作者G.ydF4y2Ba

对应到G.ydF4y2Ba小波赵G.ydF4y2Ba或G.ydF4y2Ba石华山G.ydF4y2Ba．G.ydF4y2Ba

伦理批准和同意参与G.ydF4y2Ba

不适用。G.ydF4y2Ba

同意出版物G.ydF4y2Ba

不适用。G.ydF4y2Ba

竞争利益G.ydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。G.ydF4y2Ba

出版商的注意事项G.ydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。G.ydF4y2Ba

开放访问G.ydF4y2Ba本文根据创意公约归因于4.0国际许可证，这允许在任何中或格式中使用，共享，适应，分发和复制，只要您向原始作者和来源提供适当的信贷，提供了一个链接到Creative Commons许可证，并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明，否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中，除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中，法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用，您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本，请访问G.ydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/G.ydF4y2Ba．Creative Commons公共领域奉献豁免（G.ydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/G.ydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信贷额度中另有说明。G.ydF4y2Ba

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