差分基因表达揭示了与来自新沿海平原杂交兰花之间的栖息地分歧有关的机制

背景

近缘杂交物种是识别适应性差异背后的基因组区域的理想系统。虽然基因表达在决定基于生态的表型差异中起着核心作用，但很少有研究推断基因表达在新热带系统适应性差异中的作用。在这项研究中，我们进行了全基因组表达分析和土壤元素分析Epidendrum fulgens和E黄体石榴（兰科），出现在新热带沿海平原的相邻生境中。

结果

这些物种对其基因表达谱具有高度分化的，如18-21％的转录物．通过对不同地理分布和同域分布种群的比较，丰富了与生殖过程相关的基因本体(GO)术语。在同域分布区，不同物种的耐盐耐涝基因表达存在差异，与环境刺激相关的生物过程在各同域分布区土壤特性相关的转录本中具有代表性。而混血儿们则完全不同e . fulgens但表现出了与耐淹性相似的基因表达谱E. punyolutem。与亲本相比，杂种没有表现出加性表达模式的转录本，几乎所有越轨转录本的表达都增加。

结论

这项研究揭示了促进生态分化和分类交配的一般机制，并提出了候选基因，如编码过氧化氢酶和钙依赖性蛋白激酶的基因，强调了对新热带沿海平原恶劣土壤条件的适应。此外，它还表明，基因表达差异在决定共现物种及其杂种之间基于生态的表型差异中起着核心作用。

预设环境异​​质性以推动人口的适应性分化[1，2，3.，最终导致物种形成[4，5］．通过多倍体的形态通常涉及多种生态过程，该生态过程可能加强由后交配机制产生的生殖隔离[6］．生态分化可以帮助上升的多倍体物种最初建立[6，7，8[从而克服与二倍体祖细胞相关的频率依赖性少数缺点[9］．研究表明，多倍体导致基因数量的增加和功能的冗余[10]，新的遗传变异是多倍体中生态新颖性的来源[11]，从而允许他们对家长种类的不同龛持续存在[12，13］．多倍体也通常与对应激环境条件的适应有关，二倍体物种尚未探索过，尤其是植物[10］．

对土壤生境的适应被认为是植物差异适应和物种形成的主要力量(例如，[14，15)，包括具有明显倍性的物种之间[16，17]. 对土壤条件的适应性反应通常涉及多个表型性状，这些表型性状受许多受遗传背景和环境影响较大的小效应基因座的调控[18，19]. 进化生态学的研究越来越多地采用高通量测序来研究DNA序列和基因表达水平上土壤适应的遗传基础[20]. 基因表达在决定基于生态的表型差异中起着核心作用，并且可以揭示不易识别的生态相关性特征[21，22]比如生理特征。因此，检测重要生态性状的基因表达差异被认为是理解自然选择对物种起源和维持的作用的一个可行的起点[21］．部分表达与适应性差异相关的基因也可能影响适应性，从而促成生态驱动的生殖隔离[21，23］．尽管建立这些链接是挑战，但由于基因表达的复杂模式和关于非模型生物的基因组结构的散射信息，差异基因表达可用于产生关于生殖分离中涉及的分子机制的进一步假设（例如，[14，24])。

近缘杂交种是鉴定适应性分化的基因组区域的理想系统[25]尤其是在物种丰富的地区（例如[26])。然而，模型系统主要来自北半球的温带区域，限制了我们对生态学在热带地区生物多样性的改造和演变过程中的理解[27］．在我们的研究中，我们调查了两种密切相关的新热带兰花的适应遗传基础[28]二倍体Epidendrum fulgens和四倍体E黄体石榴，它在巴西东南部的大西洋沿海平原中杂交，植被植被植被（称为狭窄的植被）热带［29，30］．这些物种与截然症造影有关;然而大肠fulgens主要分布于沙丘，大肠puniceoulutem发现于内陆沼泽地区(图。1; Pinheiro等人，2010年）。因此，土壤因素（如盐分、养分和水的有效性）对土壤的影响程度大肠fulgens和E黄体石榴可能会有所不同。三倍体杂交种则广泛分布于两种生境[29，30，31)，可能比亲本物种拥有更广泛的生态位，这是由基因遗传的越界模式决定的[32，33］．

到目前为止，很少有研究对生态分化的新热带物种的全基因组基因表达模式进行量化(但参见[26])很少有实证研究关注生态分化在多倍体物种形成中的作用（但见[8])。利用RNA测序和土壤组成数据，从分布和分布的种群中收集大肠fulgens和E黄体石榴以及它们的杂交种，我们的目的是1）比较亲本物种之间的基因表达模式，并确定可能与适应不同土壤有关的候选基因；（2）描述了可能解释杂交种与亲本相比明显的广泛生境耐受性的差异表达基因。考虑到差异表达被认为是物种形成过程的基础[21]这种方法对新热带沿海平原高水平生物多样性的起源和维持的一般机制提供了一些见解。

土壤生态位分化

主成分分析（PCA）表明，两种植物之间存在轻微的土壤分化E黄嘌呤和大肠fulgens在PC1上为ICA杂交区，在PC1和PC2上为ICO杂交区。2a-b）。然而，根据这样的分析，杂交种的位点与亲本位点没有很好的区分（图。2a - b)。线性判别分析(LDA)表明，土壤变量的组合，特别是与S和Ca浓度(沿LD1)和Na浓度(沿LD2)相关，见表S2)，可以适当区分大肠fulgens，e . puniceoluteum以及来自ICA的杂交位点（图。2C）。对于ico，反过来，差异化大肠fulgens和E黄体石榴沿PCA的两个轴发生，所有变量沿PC1或PC2的贡献（图。2b）。相反，LDA展示了之间的歧视大肠fulgens和大肠puniceouteum这种杂交带的位点与pH和K的变化高度相关，而pH和K的变化主要与LD1相关(图1)。2d,表2). 然而，与杂种相关的土壤不能与ICO中亲本物种的土壤区分（图。2)．

参考转录组

我们得到了9.53 × 10⁷到1。73 × 10⁸每根派生样本的成对末端原始读取数大肠fulgens，e . puniceoluteum杂交种（总阅读量约39亿次；原始读取可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/prjna678229)， PHRED评分Q30从98.05到98.24%不等(表S4)．最终的转录组总共产生247,978个葡萄片，其长度从200〜15,424,225bp（平均长度= 832bp）不同。根据Busco分析，1440个基因中的1266个完整（88％），而分散和缺失的基因分别对应4.7和7.3％。BLAST2GO分配基因本体（GO）术语（GO）术语，其中202,425个ContIG含量超过300pb（63％）。

基因表达模式

基因表达分析鉴定了每个物种（即，BER和PPR）的各种群体之间的19,062种不同表达的转录物（DETS），从中上调10,696E黄嘌呤(表1). 中国同域居群的比较大肠fulgens和E黄体石榴表明分化水平相似，ICA和ICO中分别有19,617和17,832 DETs。DETs略有上调E黄体石榴在ICA和ICO(表1)．这些物种通过它们的交感和异位表达谱可以很好地区分(图1)。3.A-C）。共有11,689个标题E黄体石榴和大肠fulgens通常从所有比较中出现，而这些物种之间的2419个分歧可以专门从SympaTric区的比较中发现。

考虑到基因本体的丰富性分析，我们确定了106个丰富的GO术语大肠fulgens和E黄体石榴在异域中，在同域带ICA和ICO的种间分别鉴定出43个和75个富集GO项。与染色体分离相关的两个GO术语（GO:0045143和GO:0045132）通常在所有比较中都是丰富的。与半乳糖分解代谢过程（GO:0033499）、溶酶体定位（GO:0032418）和锌离子转运（GO:0006829）相关的三个GO术语仅在同域物种间的比较中过度表达。值得注意的是，与昼夜节律调节（GO:0042752）、生长（GO:0040007和GO:0048589）和氨基酸代谢（GO:0009069）相关的生物过程是异源物种间分析的代表性GO术语（表S）5; 图。4)．GO类别假定与栖息地的差异有关大肠fulgens和E黄体石榴在每个混合区内，如水运输（GO：0006833），响应盐（GO：1902074），并对盐胁迫的反应调节（GO：1901000），磷酸化信号转导系统（GO：0000160）和氧化还原过程（GO：0055114），是混合地区内的比较的代表性术语之一（参见图4中的Treemaps。4；表的年代5)．

在丰富的生物过程中，我们强调了编码钙依赖蛋白激酶26样(CDK)、过氧化氢酶同酶(CAT)、组氨酸磷酸转移蛋白(HPt)、1,4-α-葡聚糖分支酶(GBE)、葡萄糖-1-磷酸尿苷基转移酶(UGPase)和推测的氧化还原酶的DETs，这可能与对涝渍和盐度的胁迫反应有关。这些差异表达的基因在E黄体石榴除组氨酸磷酸转移蛋白（HPt）和葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶（UGPase）外（图。5a - b)。

在每个杂交区域内，比较大肠fulgens和杂交导致更多的DETs(表1）比在与之间的比较E黄体石榴和混合动力车（表1)．实际上，杂交种子很差e . fulgens但表现出类似的基因表达谱E黄嘌呤（图。3.b-c），其中有更高比例的转录物E黄体石榴杂交种子的优势（表2). 我们在所研究的杂交区的杂交种中没有发现显示加性遗传模式的转录本。我们在ICA和ICO的杂交种中分别鉴定出528个和89个转录本为越界的（表1）2). 其中大多数（即，525和88，分别为ICA和ICO）在杂种中上调，与两者相比大肠fulgens和E黄体石榴虽然采样个体之间具有高方差（图S1). 与保守转录本相比，越轨转录本在与刺激反应、定位和ICO中的多种生物和发育过程相关的生物过程中的表达增加（图2b）。

基因-环境协会

潜因子混合模型(LFMMs)显示，与ICA和ICO土壤生态位相关的DETs分别为4278和5018个(图1)。6a-b）。根据基因富集分析，这些转录本与17和41个显著相关(p< 0.05) GO条款，分别。对于ICA，语义分析得到了一系列与内源性刺激和有机物响应(GO:0009719和GO:0010033)、跨膜转运(GO:0055085)和细胞周期正调控(GO:0045787)相关的生物过程(图)。6c） 是的。对于ICO，与植物对非生物条件的反应（GO:1901700、GO:0009416、GO:0042221、GO:0009628和GO:0010035）以及RNA处理（GO:0006396、GO:0006364和GO:0034660）和解剖发育（GO:0048856）相关的几个非冗余GO术语在语义分析中具有代表性（图。6d)。

密切相关物种的差异基因表达模式为生态学在物种分化和形成中的作用提供了重要的见解。基因表达谱可能揭示某些表型，这些表型在传统方法中不容易被发现[5，21]尤其是那些由环境梯度引起的，施加多重选择压力并导致复杂生理反应的[34］．在我们的研究中，我们显示了新热带杂交兰花Epidendrum fulgens和E黄体石榴来自巴西人热带在基因表达水平上差异显著，自然条件下差异表达的基因占18.16 ~ 23.59%。事实上，物种根部转录本的大多数差异是同域和异域比较的共同特征，是一般生物学过程的基础，这可能对应于物种特有的构成反应。然而，许多基因表达的差异似乎与适应的遗传机制有关，因此，可能提供有关因素的信息，有助于物种的起源和/或维持，尽管正在进行的种间基因流动[29］．这些差异将根据可能影响巴西异质生境中基因表达模式的生态决定因素进行进一步讨论热带．

根据判别分析，土壤地点大肠fulgens和E黄体石榴pH值、肥力、有机质和钠的浓度不同。反过来，基因表达分析表明，这些物种在对环境胁迫的适应性反应方面表现出明显的差异。例如，GO术语对应于植物中与胁迫响应相关的过程，如“水分运输”、“盐胁迫响应的调节”、“盐胁迫响应”、“磷脂酶信号转导系统”和“氧化还原过程”，在ICA和ICO同域带内物种之间的富集分析中具有代表性。此外，环境关联分析表明，土壤可作为基因表达的预测因子，约28%和21%的DETs介于大肠fulgens和E黄体石榴分别来自两个同域带。尽管我们没有发现与两个杂交区土壤相关的共同富集GO术语，但这些DET与反映植物差异适应的几种生物功能有关大肠fulgens和E黄体石榴对环境条件的反应，特别是对刺激的反应，如光、有机物和含氧化合物，以及解剖发育、膜运输和RNA处理。因此，对不同土壤的专门化可能使得在物种丰富的植物群落中密切相关的植物物种共存，例如巴西植物群落热带在那里，营养、盐和水分的强烈梯度在小范围内创造了高度可变的土壤条件[35，36］．

我们的结果表明，丰富的生物过程的基因，如编码钙依赖蛋白激酶26样(CDK)和过氧化氢酶同工酶(CAT)的基因，在四倍体中上调E黄体石榴. 这种酶在应对各种环境胁迫时发挥多种作用。cdk通过转录激活因子的调控或应激信号的翻译参与应激耐受[37]， CAT直接与活性氧(ROS)反应，使其处于较低水平[38］．过度表达这种酶E黄体石榴可以促进对盐胁迫的耐受性，正如作物和模式物种(水稻:[39，40]；拟南芥:[41]). 另一方面，编码组氨酸磷酸转移蛋白（HPt）的基因在小鼠体内表达下调E黄体石榴. 事实上，一项关于植物根组织的实验研究Aradapdopsis在渗透胁迫条件下显示出不同HHPT基因的下调[42]. 这些基因参与了一个主要的细胞内信号级联，这与在恶劣条件下生存的几个过程有关[43]，例如渗透传感[44[盐胁迫的反应调节（PHAM [45］．最后，参与氧化还原方法的基因的表达 - 即1,4-α-葡聚糖支化酶（GBE），葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶（UGPase）和推定的氧气压酶 - 也各不相同大肠fulgens和E黄体石榴．这种酶的合成是为了保护植物免受ROS的侵害，ROS在渍水和高盐条件下积累，产生氧化应激[46，47，48］．完全，我们的结果表明，多种特征适应的多种子基础对不同的土壤条件，以及应激相关基因在促进物种之间发散的主要作用热带．然而，将特定基因与环境联系起来的过程并不简单。虽然这项研究表明，物种是仿护者专注的，但使用实验方法的进一步研究将允许这些候选基因在每个栖息地的物种之间推定的差异健康中公开（例如，[49])。

在这项研究中，我们还发现，在异域和同域条件下，与生殖和花粉管发育相关的GO术语（即“染色体分离”、“花粉管发育”、“细胞发育过程”和“多细胞生物生长”）在物种间的比较中过度代表，这表明基因表达变异可能在生殖隔离中起作用大肠fulgens和E黄体石榴．据预测，参与繁殖的基因的调节变化是物种形成过程中差异的基础，但很少有实证研究表明，选择决定了基因表达的变化(见[24，50.]). 尽管表达与适应性分化相关的基因与生殖隔离相关的基因之间存在联系（例如，通过多效性，参见[14])我们的结果可能是一个可行的出发点，有助于理解选择在进化起源和/或维持过程中的作用大肠fulgens和E黄体石榴尽管众多的间隙流动流动[29］．

我们在本研究中进行的基因表达分析表明四倍体Epidendrum punyoluteum.分享具有三倍体杂种的类似根转录物谱，小比例分别在分解区域（ICA和ICO中的〜1.5和1.7％）差异表达的差异表达。Epidendrum punyoluteum.表达优势也比大肠fulgens来自两个合作区的杂交种子的优势。实际上，混合动力车能够与之共存E黄嘌呤在沼泽地区[29]，可能克服部分洪水对植物物种的建立的有害和限制的影响热带［36］．根系浸没导致氧气、光和营养物质的可用性发生剧烈变化，并引发光合作用的抑制和能量储备消耗的加速[51.]，这可能会阻止发生大肠fulgens在沼泽地区。另一方面，混合动力车和E黄体石榴具有相似的健壮的植物形态（个人观察）和生理适应能力，可能赋予对局部渍水的耐受性。这种广泛的生态和形态的相似性可能是由于向四倍体的单向渗入E黄体石榴［29，31，在二倍体-四倍体植物系统中反复出现的模式[52.，53.，54.]. 事实上，这些杂种已经作为三倍体桥梁的基因之间的交换大肠fulgens和E黄体石榴减少种群内的遗传结构[30，31]也可能在跨物种边界的渗透中起到了额外的作用，允许适应与洪水和其他压力相关的恶劣土壤条件。

杂种与后代基因表达差异分析大肠fulgens和E黄体石榴结果表明，大多数DETs在杂交种中表达上调，与亲本种有关。此外，我们还发现在杂种中几乎所有的越轨转录本都没有加性表达模式和表达增加。这种基因表达的越轨模式可能是由一种叫做转录组休克的现象造成的[55.，56.]甚至是基因剂量的变化[57.考虑到倍性在这个系统中是不同的。基因表达的变化为杂种提供了生理新颖性的来源大肠fulgens和E黄体石榴．对于ICO，“发育过程”和“多生物过程”注释的越界基因比例的增加表明它们在杂种与亲本物种的分化中起着关键作用。然而，杂种中的大多数越界基因都参与细胞和代谢过程，这表明一般的过程可能使杂种占据更大的生态位，并可能导致它们在其亲本物种无法到达的新栖息地生存。因此，交配后的隔离，由于降低适合度杂种在亲代栖息地不太可能代表主要的繁殖障碍大肠fulgens和E黄体石榴. 相反，这些物种之间的栖息地差异可能是由于来自另一物种栖息地的亲本物种的移民者生存能力低而造成的一个前期障碍，从而促进了分类交配以及由于减数分裂失败而导致的交配后隔离（见[31])。此外，由于兰花依赖于萌发和/或幼苗发育的共生真菌[58.]，生物相互作用在促进生殖隔离方面的额外作用大肠fulgens和E黄体石榴不能丢弃。

基因表达在物种形成中的作用仍然是一个相对未被探索的话题，尽管越来越多的研究描述了候选基因或描述了与不同系统中的适应性差异相关的基因表达的一般模式(例如[14，24，46]). 对基因表达模式的研究可以同时揭示几个生理生态性状的变异，从而有助于阐明它们对物种形成的适应性重要性。在这项研究中，我们发现基因表达的差异可能使新热带兰花大肠fulgens和E石榴在小范围内共存，也可以在杂种中产生新的表型多样性。考虑到我们从自然人群中取样，我们不能忽视其他变异来源对观察到的基因表达谱的影响。然而，我们认为，我们的方法允许一些候选基因，即，假定参与生态差异，在生理过程和/或基因靶向方法中，在它们的形态过程中进行它们的相对重要性的测试。目前还不能肯定，赋予对不同生境的适应能力的基因是否参与了它们之间最初的生殖隔离大肠fulgens和E黄体石榴或者是形成后适应的结果，但在这个系统中，尽管存在高基因流，但分歧选择在保持分歧方面发挥了关键作用。在未来，我们打算测试可供选择的物种形成方案大肠fulgens和E黄体石榴以及基于模型的框架中自适应基因分解的时序，以解决这个问题。

目标物种和植物采样

Epidendrum fulgens栖息于热带巴西东南部和南部沿海地区的植被，在不受洪水影响的沙丘中，主要由灌木组成(图。1)．Epidendrum punyoluteum.与之共同大肠fulgens在这些沿海地区的一些地方，通常在更远的内陆（相距几米）的莎草沼泽中发现（图。1)，也就是说，连续的海滩脊之间的洼地会被季节性淹没(见[59.])。这两个物种都是由蝴蝶授粉，不产生花蜜，遵循一种通过欺骗授粉的模式，有利于种间基因流动[28，29，60.］．在同域分布地区，这些物种有相同的传粉者和重叠的开花物候[29］．

我们从成年个体的根中取样大肠fulgens和E黄体石榴它们在两个混合区域，ICO和ICA中的杂种，以及每个物种BER和PPR的分类群（图。1；表的年代1). 取样植物有3-4根茎，30-40根 厘米长。采样于2016年4月在晴天进行，时间为13:00至17:00，温度范围为27℃ °C至30 摄氏度。从开花个体中采集根样本，然后立即储存在rnas中™ 稳定溶液（Thermo Fisher Scientific）。所有样本进一步保存在− 80 °C，直到提取RNA。我们在自然条件下采集植物，以确保评估尽可能接近自然种群的基因表达模式，而自然种群可能受到先天和环境依赖机制的共同影响。每个样本的同一性由F。Pinheiro（资深作者）基于形态学特征，并通过微卫星标记和流式细胞术的贝叶斯分配分析进一步证实（见附录）1详细说明所采用的方法和获得的结果)。每个物种和种群的标本保存在巴西圣保罗(SP)研究所Botânica de São Paulo (São Paulo，巴西)的植物标本室(见表S1)．植物材料的收集符合国家指南。COTEC（林业学院技术和科学委员会）授予保护单位的许可证（SãoPaulo，巴西）和Sisbio（生物多样性信息和授权制度，巴西，许可，15206-3）。

土壤特性

为了描述土壤条件，我们取样了根近端土壤(~ 0.5 与以下个体相关的E. Fulgens，E.Punyoluteu并对同域区ICA和ICO的杂种进行了多元素分析。测定了土壤pH、有机质（OM）、阳离子交换量（CEC）、碱总量（SB）、碱饱和百分率（BSP）、铝饱和百分率（ASP）、潜在酸度（PA），以及磷（P）、钾（K）、钙（Ca）、钠（Na）、硫（S）、铝（Al）的可萃取和交换浓度，土壤样品中的镁[61.]. 利用主成分分析法（PCA）对各杂交区土壤变量的变化进行了总结。然后，我们使用R包装质量进行了线性判别分析（LDA）[62.]确定最能解释三个预定义组之间差异的变量（即大肠fulgens，e . puniceoluteum及其杂种）。

RNA提取、文库制备和测序

我们使用安捷伦植物RNA分离迷你试剂盒(安捷伦科技公司;Santa Clara, CA, USA)，并将RNA样本送到Macrogen公司(首尔，韩国)。使用TruSeq RNA Sample Prep Kit v.2构建cDNA文库。根据制造商的协议，在Illumina NovaSeq™6000系统(San Diego, CA, USA)的单道上，共对32个样品进行了单独的条形码和配对末端测序。

转录组组装和注释

一个“杂交转录组”被重新组装，作为基因表达分析的参考，因此，避免对亲本物种之一的偏见。为了做到这一点，我们将所有采样混合数据的读取合并到一个数据集中，并过滤低质量的基（Phred分数） < 30）和适配器(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit)．过滤后的数据使用Trinity v. 2.6.6管道的“normalize_by_kmer_coverage”程序进行归一化[63.]. 随后，使用MIRA汇编程序v进行从头组装。4.9.4 [64.]在以下设置下：质量剪辑打开(−CL:质量控制 = 是），扰流板检测打开(−AS:标准偏差 = 是），最低基本质量 = 5 (−类别：qcmq = 5） ，用于质量剪裁的窗口长度 = 5 (−类别：qcwl = 5); 精确单词匹配的相对百分比 = 70% (−SK:公关 = 70，步进增量 = 2 (−SK:kss公司 = 2); 最大集线器比率 = 1 (−SK:嗯 = 1） ，以及丢弃序列的最小读取次数 = 3 (−AS:mrpc公司 = 3). 为了避免嵌合重叠群，我们放弃了在多个重叠群中映射的读数，或者使用blast\ U检查工具在同一个重叠群中多次映射的读数。该参考转录组被筛选为大于200的重叠群 英国石油公司，最低覆盖率为5倍。我们使用BUSCO工具评估了这个组装的转录组的质量和完整性[65.]使用胚胎植物odb9数据集。

我们使用Blast2GO [66.]为了执行参考转录组的功能诠释。我们过滤超过300bp的contig，然后使用CloudBlast服务将Contig对与NCBI非冗余NR蛋白质数据库对齐。同时，我们使用Transocan工具来检索蛋白质域和主题信息。最后，我们在Blast2Go注释工作流程之后处理了所有匹配的转录物和分配的基因本体（GO）术语。

基因表达分析与基因本体丰富

两组间进行两两差异表达分析大肠fulgens和E黄体石榴异域种群（BER和PPR）和大肠fulgens，e . puniceoluteum以及在三位一体管道之后的每个混合区（ICO和ICA）内的杂种。为此，我们使用RSEM 2.01软件中实现的Bowtie 2映射到参考转录机映射[67.]总结每个图书馆的阅读计数;然后，利用edgeR包进行基于TMM归一化FPKM值的差异基因表达分析[68.]错误发现率（FDR）截止值为0.001且至少为2⁵褶皱表达分化。

我们进行了GO浓缩分析，以识别差分表达转录物（DETS）之间的过度代表的生物过程，使用ELIM-Kolmogorov-Smirnov方法，其在R Topco包中实施的显着性阈值为0.05 [69.]. 这种方法允许测试丰富的GO术语，同时考虑GO图的拓扑结构（条件丰富）。总结来自丰富围棋术语的信息并排除冗余术语（相似性> 0.5），我们使用了在RevigoWeb服务器中实现的语义分析[70］．进一步提取了与助擦性适应相关的已知生物过程的基因，并在每个分子区域中的物种之间进行了它们的表达。我们还在SympaTric（ICA和ICO内）和分类（PPR和BER）条件下的父母物种之间提取常见的GO术语，以及由SympaTric区域（ICA和ICO）公共分享的GO条款，以便揭示生态分化的一般模式。最后，我们提取和总结了与成绩单相关的术语，显示了使用Wego工具的ICA和ICO SympaTric区域的保守，违规，添加剂或主导遗传模式[71.］．在每个杂交区里，如果一个转录本在杂交区里表达相似，则被认为是保守的E富尔根斯，和E黄体石榴; 当杂交种的表达显著高于或低于两个亲本物种时，如edgeR软件包所检测到的。差异表达的转录本在杂种中的表达高于一个亲本，但低于另一个亲本，被认为是加性的。最后，如果杂种的表达与一个亲本物种显著不同，而与另一个亲本物种没有显著差异，则认为遗传是显性的。

环境驱动基因表达

为了获得具有与助辅助利基的显着相关性的DEC，我们在R包'LFMM'中执行了潜在的因子混合模型（LFMM）[72.]. “lfmm”中实施的生态关联测试解释了未观察到的混杂效应，并将响应矩阵的典型定义从基因型扩展到基因表达数据[72.］．对每个取样杂交区(ICA和ICO)分别进行分析。为了解释假定的混杂因素，通过PCA将潜在因素(K)的数量预先定义为ICA和ICO混合区K = 2。每个DET的TMM归一化FPKM值作为响应变量，14个土壤变量的主成分分析的第一个主成分作为预测变量。第一个分量占ICA样本方差的71%，与除PA外的所有土壤变量都存在中度相关(表S3.)．对于ICO，第一个成分占总方差的47.7%，并且与pH、有机质、Al和Na浓度以及CEC、BSP和ASP有中度相关(表S3.)．我们使用在lfmm包中实现的脊方法来最小化基于L2惩罚的最小二乘问题。重要的p-值(< 0.05)采用基因组膨胀法，控制了错误发现率。

进一步进行了致富集分析以确定与仿生乳头肽相关的DECS的过度代表的生物过程。为此，我们使用了在R Topo包中实现的具有0.05的显着性阈值的Elim-Kolmogorov-Smirnov方法。最后，我们汇总来自丰富的GO术语的信息，并使用Revigo Web服务器中实现的语义分析排除了冗余术语（相似性> 0.5）。

原始测序已存入NCBI SRA数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA678229;Bioproject ID：prjna678229;BioSample Accessions：SAMN16790585-SAMN16790616）。组装的转录组和基因注释可在彩色储存库中获得[https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.5203004.v1］．

类别：

过氧化氢酶同工酶

CDK:

钙依赖性蛋白激酶26样

DET：

不同表达的成绩单

gbe：

1,4-α-葡聚糖分支酶

走:

基因本体论

成:

组氨酸phosphotransfer蛋白质

ROS：

反应性氧气

酶：

葡萄糖-1-磷酸尿嘧啶丙烯酸酯

我们感谢Milene Ferro在基因注释程序方面的帮助，以及Espaço da Escrita–Pró-Reitoria de Pesquisa–UNICAMP–提供的语言服务。

这项工作得到了FundaçãodeAmparoàpesquisa（Fapesp; 16/22785-8）的支持，并通过圣保罗州立大学（Unesp）的科学计算中心（NCC / Gridunesp）提供的资源。我们感谢授予B.S.S.L和Conselho Nacional Desenvolvimento（CNPQ）的博士奖学金（18/18967-9）的FAPESP.CIENTíficoeTecnológico（CNPQ），授予C.P.S的研究奖学金。（305398/2019-9）。

从属关系

1. 巴西坎皮纳斯大学植物生物学系，邮编：13083-862

   巴尔巴拉·桑托斯·莱尔、克拉丽丝·帕尔玛·席尔瓦和法比奥·皮涅罗

2. Centro de Biologia MoleculareEngenhariaGeinética，校园Estadual de Campinas，Spinas，Sp，13083-862，巴西

   马塞洛·门德斯巴

贡献

F.P.和C.P-S。构思和设计研究；F.P.和B.S.S.L.收集的植物和土壤材料；F.P.做了实验室工作；B.S.S.L和M.M.B.进行数据分析；B.S.S.L写了手稿的初稿；所有作者都作出了贡献，并批准了手稿的最终版本。

相应的作者

对应到Bárbara Simões Santos Leal．

伦理批准并同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

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