TaClpS1负调控小麦抗性柄锈菌striiformisF。sp。tritici

背景

细胞内蛋白质的降解在植物对胁迫环境的反应中起着重要的作用。ClpS1和E3泛素连接酶分别作为酪蛋白水解肽酶(caseinolytic peptidase, Clp)蛋白酶途径和26S蛋白酶体系统中选择目标底物的接头。目前，E3泛素连接酶在植物对病原体的免疫应答中的作用已得到明确。然而，ClpS1在植物对病原体的免疫应答中的作用尚不清楚。

结果

在这里,小麦(小麦)ClpS1（TaClpS1）编码161个氨基酸，包含一个保守的ClpS结构域和一个叶绿体转运肽（1-32aa）。当在小麦原生质体中瞬时表达时，TaClpS1被发现在叶绿体中特异定位。成绩单水平TaClpS1在小麦侵染过程中显著诱导柄锈菌striiformisF。sp。tritici（太平洋标准时间）.击倒的TaClpS1通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）提高了小麦的抗病性太平洋标准时间，伴随着超敏反应(hypersensitive response, HR)的增加，活性氧(reactive oxygen species, ROS)的积累和表达Tapr1.和Tapr2.，吸器数量减少，感染菌丝长度减少，感染面积减少太平洋标准时间．此外，异源表达TaClpS1在尼古利亚娜·宾夕法尼亚州增强了感染寄生疫霉菌．

结论

这些结果表明，TACLPS1负面调节小麦的抵抗力太平洋标准时间．

为确保其生存本质上，植物必须唤起许多复杂的机制来应对生物和非生物胁迫。越来越多的研究揭示了细胞内蛋白质在植物响应对压力环境中起作用的基本作用。蛋白质降解途径包括泛素-26s蛋白酶体系（UPS）和脑蛋白溶液酶（CLP）蛋白酶[1那2］．两种蛋白质降解机械均由大型多亚基蛋白水解复合物组成。

UPS蛋白质降解的第一个方法是ATP依赖性泛素，其涉及至少三种主要酶的作用来选择靶基质[3.]:泛素激活酶(E1)、泛素偶联酶(E2)、泛素连接酶(E3)。研究表明，UPS中的泛素化与植物的许多生物过程有关，包括激素信号转导、生长发育、昼夜节律控制和细胞周期[4.那5.］．最近的研究表明，泛素化和E3泛素连接酶参与植物对病原体的免疫。例如，一种环指E3泛素连接酶，BLAST AND BTH-INDUCED1 (OsBBI1)，被发现正向调节抗Magnaporthe oryzae通过改变米细胞壁[6.];SPL1，含有E3泛素连接酶活性的水稻U-Box蛋白，负面调节细胞死亡和先天免疫m . oryzae和Xanthomonas oryzae.PV。oryzae.（XOO)[7.];难以泛素连接酶相关蛋白，需要诱导重要的防御机制，包括r基因介导的防御机制，全身获得性阻力和基础防御[8.］．这些研究表明，这些在蛋白质降解机制中选择靶蛋白起重要作用的因子参与了植物对病原菌的抗性调节。最初在细菌中发现的酪蛋白水解肽酶(Clp)蛋白酶介导的蛋白质降解系统由一个蛋白水解蛋白(主要是ClpP)和一些调节AAA+(与多种细胞活性相关的atp酶)蛋白组成[9.］．重要的是，调节AAA+蛋白使用适配器蛋白识别和靶向降解的特定底物。例如,在大肠杆菌，调节AAA +蛋白CLPA使用适配器CLP来识别和靶向植物的底物，用于通过CLPAP蛋白酶降解[10那11那12］．这些研究在大肠杆菌表明适配器ClpS在ClpAP蛋白酶降解靶底物的选择中起着核心作用，这与UPS中E3泛素连接酶的功能相同。ClpS后续从大肠杆菌发现通过分析CLP的晶体结构，含有两个保守区域，分别显示它们与CLPA和基材的相互作用涉及[13那14］．有趣的是，与底物相互作用相关的区域与UPS中的E3泛素连接酶具有二级结构同源性[15］．此外，CLPS蛋白的前一个系统发育分析揭示了细菌，蓝细菌和植物中的进化键[15那16］．这些研究提出了问题：植物中的CLPS蛋白是否可以参与调节植物抗病或病原体的抗性，就像E3泛素连接酶在植物中一样？

植物叶绿体CLP系统包括由五个蛋白水解亚基（CLPP1和CLPP3-6）和四种不同亚基（CLPR1-4），ATP依赖性伴侣CLPC1 / 2和CLPD组成的杂寡糖核糖核心络合物，以及适配器蛋白质CLPS1，基于随后的系统发育分析进行植物CLPS蛋白的重新定义[17那18］．在拟南芥，几个直接的候选叶绿体AtClpS1底物已经通过亲和纯化方法被鉴定出来，包括谷氨酰trna还原酶(GLUTR)和shikimate途径中的4种酶[17那19］．此外，ClpS1与候选底物的相互作用严格依赖于参与识别和结合底物的两个保守的ClpS1残基，这表明ClpS1是叶绿体Clp蛋白酶系统保守的底物选择器[17］．此外，据报道，AtClpS1还与叶绿体伴侣ClpC1、2和适配器ClpF相互作用，这表明ClpS1和ClpF形成一个双适配器，用于选择性底物识别和传递到ClpC [17那18]. 然而，这些报道并未揭示植物ClpS1蛋白参与调节植物对病原菌的抗性。

小麦条锈病，由柄锈菌striiformisF。sp。tritici（太平洋标准时间)是世界范围内分布最广、危害最大的小麦病害之一[20.]. 本研究以小麦与条锈菌的互作系统为基础，研究了ClpS1在植物对病原菌反应中的作用。A.ClpS1基因小麦简历。韩国水原11日指定TaClpS1进行了研究。成绩单水平TaClpS1在小麦中被诱导太平洋标准时间隔离Cyr23 [21］．击倒TaClpS1病毒诱导的基因沉默(VIGS)在小麦中的表达减弱太平洋标准时间感染强度和增强反应性氧（ROS）的积累。此外，瞬态表达TaClpS1在n benthamiana促进了寄生疫霉菌．这些结果表明，TaClpS1很可能作为植物病害增强剂，最终增加植物对病原菌的敏感性。

鉴定小麦taclps1

本研究利用小麦TaClpS1蛋白序列对其进行了鉴定拟南芥AtClpS1 (GenBank登录号。NP_564937.1)爆破六倍体小麦基因组数据库(http://plants.ensembl.org/index.html.）.结果表明，小麦的六个ATCLPS1的同源序列分别位于染色体2a，2b，2d，3a，3b和3d上。来自各种植物物种的CLPS1蛋白的系统发育分析表明，TACLPS1-2A，TACLPS1-2B和TACLPS1-2D蛋白与来自其他植物的CLPS1蛋白质密切相关，包括拟南芥那Zea Mays.和水稻．该组不包括TaClPS1H-3A，TACLPS1H-3B和TACLPS1H-3D蛋白（图。1一个)。因此，在该研究中，我们专注于TACLPS1-2A，TACLPS1-2B和TACLPS1-2D的功能。

预测蛋白TaClpS1-2A、TaClpS1-2B和TaClpS1-2D编码161个氨基酸，序列同源性为98.77%。预测蛋白TaClpS1-2A、TaClpS1-2B和TaClpS1-2D的序列通过Pfam在线(http://pfam.xfam.org/)(图。1b).根据以上分析，鉴定出的基因TaClpS1-2A那TaClpS1-2B,TaClpS1-2D在小麦中编码CLPS1蛋白质。

TaClpS1定位于小麦叶绿体

要确定TACLPS1的亚细胞位置，在线使用Localizer（http://localizer.csiro.au/)、TaClpS1-2A、TaClpS1-2B和TaClpS1-2D预测含有叶绿体转运肽(1-32 aa)(图。1b).考虑到TaClpS1- 2a、TaClpS1- 2b和TaClpS1- 2d在氨基酸序列上高度保守，选择TaClpS1- 2a作为所有TaClpS1的代表，生成融合构建物pCAMBIA1302: TaClpS1- gfp。将缺乏叶绿体转运肽(1 - 32aa)的TaClpS1-2A (TaClpS1Δ)融合到载体pCAMBIA1302中，得到pCAMBIA1302: TaClpS1Δ-GFP，作为阴性对照。这些结构被转换为n benthamiana留下一盏A. Tumefaciens.渗透。共聚焦显微镜显示TaClpS1-GFP定位于细胞的细胞核、细胞膜和叶绿体n benthamiana，而对照pCAMBIA1302: GFP和pCAMBIA1302: TaClpS1Δ-GFP定位于细胞核、细胞膜和细胞质(图。2一个)。

为了进一步证实小麦细胞中TaclPS1的定位，融合构建体PCAMV35S：TACLPS1-GFP和PCAMV35S：通过聚乙二醇（PEG）产生并转化到小麦原生质体中 - 钙。PCAMV35S的GFP荧光信号：TACLPS1δ-GFP和PCAMV35S：GFP出现在小麦原生质体的细胞核中，细胞膜和细胞质中。与观察到的结果相反n benthamiana在小麦原生质体中，TaClpS1-GFP荧光信号主要聚集在叶绿体中。2b)。

相对转录水平TaClpS1在不同的阶段期间太平洋标准时间感染

探索角色TaClpS1中太平洋标准时间感染后，采用qRT-PCR检测TaClpS1在感染期间的不同阶段太平洋标准时间隔离CYR23。qRT-PCR数据显示TaClpS1在接种后12 h开始增加，持续增加到24 hpi，随后在48 hpi时下降，在96和120 hpi时转录水平再次上升(图。3.）.QRT-PCR结果清楚地表明转录水平TaClpS1在小麦的诱导期间太平洋标准时间感染，暗示TaClpS1参与小麦和太平洋标准时间．

TaClpS1是小麦抗性的负调控因子太平洋标准时间

检查TACLPS1是否参与调节小麦防御抵抗太平洋标准时间，使用大麦条纹马赛克病毒（BSMV）诱导的基因沉默（Vigs）策略。两个特定的碎片（TaClpS1-1 / 2as）设计用于特别沉默内源的三个副本TaClpS1基因（TaClpS1-2A/2 b/二维）在SU11小麦（附加文件1：图S1）。接种BSMV：γ（阴性对照）或BSMV:TaClpS1–1/2的患者在12 dpi时出现轻度褪绿马赛克症状（图。4.一个)。随后，用不相容的沉默小麦的第四片叶子太平洋标准时间隔离CYR23。接种CYR23的叶片在阴性对照和BSMV中表现出过敏反应(HR)症状:TaClpS1-1 / 2as粗线（图。4.a） 是的。qRT-PCR证实TaClpS1BSMV显著降低:TaClpS1–1/2as沉默系与BSMV相比：γ处理的小麦在0、24和120 hpi（图。4.b)。病因相关（PR.）基因，包括PR1和PR2，通常被认为是HR中的标志物基因，并且是植物抗性的必要性对病原体[21那22］．然后是转录水平Tapr1.和Tapr2.用CYR23接种0、24和120 hpi的taclps1 - 1/2沉默系和BSMV: γ处理小麦进行分析。我们的qRT-PCR结果显示Tapr1.（图。4.c)和Tapr2.（图。4.d)与BSMV: γ处理相比，沉默系taclps1 - 1/2显著增加。此外，坏死面积和H₂O.₂在24hpi测量通过在小麦叶中与核叶中的Cyr23接种引起的积累。如图1所示。5.H₂O.₂每个感染部位的累积（图。5.a, b)和坏死区域(图。5.c, d)的表达量明显大于BSMV: γ处理的表达量。综上所述，这些结果表明，TaClpS1刺激太平洋标准时间小麦感染，最终在小麦期间增加了植物易感性 -太平洋标准时间不相容的互动。

沉默TaClpS1显著抑制生长太平洋标准时间

除了分析坏死和H₂O.₂菌丝结构的积累，组织学分析太平洋标准时间在24和120hpi的Cyr23感染的小麦叶中进行（图。6.a).吸器数量(图。6.b)、菌丝长度(图。6.c)和菌丝感染区(图。6.d） TaClpS1-1/2as沉默小麦与BSMV：γ处理小麦相比，真菌扩展能力的指标严格降低。这些结果表明沉默TaClpS1减少了生长太平洋标准时间．

taclps1负调节抗病性n benthamiana来寄生疫霉菌

为了进一步验证TACLPS1对植物抵抗病原体的抗性调节植物抵抗的结论，首先是模型植物的相互作用n benthamiana和oomycete寄生疫霉菌被检查过。在这个实验中，A. Tumefaciens.携带质粒pcambia1302：taclps1-gfp或pcambia1302：渗透到gfp（阴性对照），然后p . parasitica菌丝塞被放置在渗透的细胞上n benthamiana叶子。与pCAMBIA1302: GFP阴性对照相比，表达pCAMBIA1302: TaClpS1-GFP的叶片病变直径显著增大，表明pCAMBIA1302: TaClpS1-GFP的异位表达TaClpS1在n benthamiana可以增强p . parasitica感染(图。7.a, b).此外，采用VIGS策略进行沉默TaClpS1然后接种太平洋标准时间毒性CYR31隔离。如图1所示。7.C、尿片打开TaClpS1接种在12hPI的Cyr31接种的沉默的叶子小于阴性对照。此外，QRT-PCR证实了转录水平TaClpS1BSMV中显着降低：TACLPS1-1 / 2as沉默的线与BSMV：γ处理的小麦在24和120hpi（图。7.综合起来，这些结果表明TaClpS1负调节植物的抗病性。

酵母双杂交法研究TaClpS1与TaHEMA1的相互作用

在拟南芥，GluTR，由基因编码Hema1.(AT1G58290)，被鉴定为AtClpS1的候选底物[17]. 为了确定谷氨酰胺基tRNA还原酶是否是小麦TaClpS1的底物，采用酵母双杂交（Y2H）技术。首先，利用蛋白质序列进行BLAST搜索拟南芥HEMA1作为查询，六倍体小麦基因组中含有athma1的3条同源序列，分别位于1A、1B和1D染色体上。随后，利用不同植物的HEMA1蛋白构建系统发育树，将这3个同源基因命名为TaHEMA12:图S2A)。考虑到TaHEMA1的三个拷贝在氨基酸序列上高度保守，同源性为98.37%(附加文件2：图。S2B），选择染色体1B的Tahema1作为表达Y2H测定的代表性。在Y2H测定中，携带Tahema1和TaclPS1的酵母细胞只能在含有X-α-Gal的SD-Leu-Trp-His-Ade培养基上生长并出现蓝色（附加文件2：图。S2C），表明TACLPS1与TAHEMA1相互作用。总体而言，这些结果表明了Glutr编码TaHEMA1可能是TaClpS1在小麦中的候选底物。

在这项研究中TaClpS1是独立于T. Aestivum.Suwon11树叶。TaClpS1与来自不同植物的ClpS1蛋白同源，表明ClpS1在不同植物物种间具有较高的序列保守性。以菌丝长度、吸器数量、菌丝感染面积作为真菌扩张能力的指标，严格减少TaClpS1与BSMV: γ处理相比，TaClpS1处理的小麦对- 1/2表达的敏感性较低，表明TaClpS1对小麦的抗性有促进作用太平洋标准时间．

疫霉属于半生物营养丝状病原菌，其在宿主组织中的病斑大小直观地反映了其侵染程度，提示宿主基因对抗性的调控作用疫霉．例如过氧化氢酶缺乏的病灶直径n benthamiana叶子接种P辣椒大于对照植株，说明过氧化氢酶正调控寄主对P辣椒[22］．过度表达ATRTP5在n benthamiana接种后叶片的损伤直径增加P. Infestans.，表明AtRTP5在调节植物抗虫性中起负作用疫霉[23］．我们的结果表明，瞬时过表达TaClpS1在n benthamiana增强的感染p . parasitica（图。7.b)，表明TaClpS1促进了易感性n benthamiana来P寄生菌。

H₂O.₂每个感染部位的聚集面积和平均坏死面积TaClpS1-1/2as沉默小麦的抗病性显著提高，表明小麦的抗病性增强TaClpS1沉默小麦植物。PR蛋白通常被认为是HRs中的标记基因，对抗性是必要的[24那25］．在此，文字记录水平Tapr1.和Tapr2.在中检测到TaClpS1沉默的小麦植物和阴性对照感染无毒太平洋标准时间CYR23。在0 hpi时，无显著性差异Tapr1.和Tapr2.在TaClpS1沉默小麦植株和阴性对照，揭示了Tapr1.和Tapr2.没有组成型在未感染中诱导TaClpS1沉默的小麦植株。在24hpi，转录水平Tapr1.和Tapr2.显著诱导TaClpS1与0 HPI相比，沉默的小麦和阴性对照，而转录水平Tapr1.和Tapr2.非常大于控制中的。考虑到病原体攻击后PR蛋白的积累与水杨酸（SA）的积累密切相关[26，我们推测的增长Tapr1.和Tapr2.伴随着SA的增加TaClpS1沉默的小麦接种了太平洋标准时间23年。另外，SA作为代表性的免疫信号，在细胞内被合成拟南芥叶绿体(27那28]，Taclps1是本地化的。同在，调查结果表明TaClpS1在SA介导的小麦对太平洋标准时间．

Glutamyl-tRNA还原酶在拟南芥叶绿体已被亲和纯化鉴定为AtClpS1的候选底物[17那29］．基于使用酵母双杂化技术显示小麦中谷氨酸-TRNA还原酶Tahema1与TaclPS1相互作用，我们推断Tahema1可以用作小麦中Taclps1的底物。谷氨酸-TRNA还原酶是四吡咯合成的对照点[30.，越来越多的研究表明四吡咯的生物合成参与了防御反应。例如，四吡咯是单线态氧生成的主要来源，而单线态氧很可能介导各种生物反应，如宿主对病原体的免疫[31］．连胜，Taclps1中断四吡咯合成以负调节小麦的反应是合理的太平洋标准时间通过选择谷氨酰- trna还原酶降解Clp。我们将进行未来的工作来检验我们的假设。

本研究首次报道了小麦同源基因AtClpS1的克隆、定位分析和功能鉴定。表达TaClpS1在小麦中进行诱导太平洋标准时间感染。此外,沉默TaClpS1导致小麦对太平洋标准时间. 此外，TaClpS1基因在大肠杆菌中的异源表达n benthamiana增强了感染p . parasitica．这些结果表明，TaClpS1负调控植物对病原菌的抗性。

菌株、植物材料及生长

在这项研究中，太平洋标准时间分离物Cyr23和Cyr31用于研究转录水平TaClpS1和VIGS分析TaClpS1根据前面描述的程序[32］．新鲜的太平洋标准时间从小麦中采集了感染小麦的尿道孢子太平洋标准时间．p . parasitica本研究中使用的菌株ZQ-1常规保持在10% V8果汁培养基中，25°C，黑暗中[33］．

小麦 （小麦品种Suwon11（AUS-22519）来自Seuseun农业试验站（Sariwon，Korea），在澳大利亚Tamworth的澳大利亚冬季谷物收藏中心注册。Suwon11，含伊尔苏抗性基因[34，是抵抗的太平洋标准时间隔离CYR23。在16℃下生长并在气候室中生长番桃花幼苗。烟草（尼古利亚娜·宾夕法尼亚州)生长在21-25℃的生长室内，光照周期为16小时/8小时。CYR23, CYR31, Suwon11种子和n benthamiana种子来自康振生教授的实验室(中国西北农林科技大学)[35］．p . parasitica菌株ZQ-1来源于上海师范大学乔永利教授[33］．

质粒结构

完整的长度TaClpS1利用taclps1特异性引物TaClpS1-F/R(附加文件3.:表S1)。创建用于检测TaClpS1亚细胞定位的结构，全长TaClpS1和TaClpS1从上述TACLPS1-T构建体扩增δ并插入pCAMBIA1302或PTF486载体中[36]生成pCAMBIA1302: TaClpS1-GFP, pCAMBIA1302: TaClpS1Δ-GFP和pCaMV35S: TaClpS1-GFP, pCaMV35S: TaClpS1Δ-GFP。引物序列在附加文件中报告2：表S1。对于Vigs测定，基于Primer5和NCBI的组合设计了两种大约150bp的特异性沉默片段。大麦条纹马赛克病毒（BSMV），是一种阳性感测RNA病毒，具有由RNAα，β和γ组成的三方基因组。两个设计的碎片被克隆不是我和PAC.I限制性位点并插入原始BSMV：γ载体，制备重组质粒BSMV：TaClpS1–1as和BSMV：TaClpS1-2使用附加文件中所示的特定引物3.：表S1[37］．最重要的是所有构造都是从仁康的实验室教授获得的（中国西北大学，中国）[35］．

系统发育分析

对TaClpS1进行系统发育分析，从其他植物中获得ClpS1蛋白序列拟南芥ATCLPS1（GenBank登录号NP_564937.1）爆炸NCBI数据库。对于Tahema1，从集合植物数据库获得拷贝和其他相关序列。使用Mega5软件中的最大似然法构建系统发育树。DNAMAN V.7.0软件（LynnonBiosoft，USA）用于执行多个序列对齐，使用PFAM Online分析保守的CLPS域（http://pfam.xfam.org/）.

转录水平的RNA提取和分析

接种二叶期小麦幼苗第二叶太平洋标准时间隔离CYR23。接种后，在0,12,4,48,72,96,120HPI下取样三个独立小麦叶以提取RNA。用快速RNA分离套件（华为阳生物技术，中国，北京）提取总RNA。总提取的RNA的约3μg总提取的RNA用于逆转转录与REVERTAID第一链cDNA合成试剂盒的CDNA。VAGS测定中的RNA提取和逆转录TaClpS1，方法如上所述。采用LightCycler SYBR Green I Master Mix进行qRT-PCR检测，将基因的转录水平归一化至内对照基因taef-1α.．QRT-PCR测定中使用的引物列于附加文件中3.：表S1。统计学意义由未配对的双尾学生评估T.以及。

亚细胞定位分析

目的:确定TaClpS1的亚细胞定位n benthamiana树叶，A. Tumefaciens.在最终OD处携带pCAMBIA1302: TaClpS1-GFP, pCAMBIA1302: TaClpS1Δ-GFP或pCAMBIA1302: GFP载体₆₀₀0.5渗透到n benthamiana叶子。PCAMBIA1302：TACLPS1δ-GFP和PCAMBIA1302：GFP被用作阴性对照。渗透道n benthamiana在21-25°C下保持在增长室，具有16-H / 8-H光/暗循环。在48小时后，使用奥林巴斯IX83共聚焦显微镜（日本）获得共聚焦图像，其使用488nm的激发波长为488nm和520nm的发射波长，并且对于叶绿体自发的561nm的激发波长和640nm的发射波长，分别。

为了检测TaClpS1在小麦细胞中的定位，小麦Suwon11幼苗在25℃下在玻璃盆中生长2-3周。融合构建体pcamv35s：taclps1-gfp，pcamv35s：taclps1δ-gfp和pcamv35s：通过聚乙二醇（peg）-calcium方法独立地转化成小麦原生质体 - 如前所述[38那39]. 将含有pCaMV35S:TaClpS1-GFP或pCaMV35S:GFP和小麦原生质体的混合物在22℃下培养 摄氏度。图像是在24小时用Olympus IX83共焦显微镜（日本）获得的 孵育后2h。

BSMV-mediated基因沉默

质粒BSMV:TaClpS11, BSMV:TaClpS1-2as和BSMV: γ被线性化，然后在体外使用RiboMAX大规模RNA生产系统t7和Ribom7G Cap模拟物(均由Promega提供)转录和盖帽(根据制造商的说明)。在小麦叶片上接种BSMV转录本太平洋标准时间根据先前描述的程序分离Cyr23或Cyr31 [40］．以BSMV: γ为阴性对照。在0、24和120 hpi时采集感染CYR23的小麦叶片，估算CYR23的转录水平TaClpS1和TaPR1/2H₂O.₂检测，坏死区域的测定和组织观察TaClpS1．接种后12 d拍摄小麦叶片症状太平洋标准时间Cyr23和Cyr31。这些实验至少重复两次。

DAB染色为h₂O.₂检测，测量坏死

对接种CYR23的小麦叶片采样，在16°C光照下，用1 mg/ml 3,3-二氨基联苯胺(DAB)溶液染色6 h。染色后，在脱色液(无水酒精:冰醋酸，1:1)中澄清约一周。然后，用水合三氯醛进一步澄清脱色的小麦叶片两周。随后,H₂O.₂用Olympus BX-51显微镜在明亮视野下检测透明叶片的积累。同时检测H₂O.₂积聚，在紫外线通道下测量坏死区域。结果是从40个感染部位获得的。从三个独立叶子收集样品。实验重复三次。统计学意义由未配对的双尾学生评估T.以及。

组织学观察太平洋标准时间增长

用于组织学观察太平洋标准时间接种CYR23的小麦叶片在24 hpi和120 hpi的无水酒精:冰醋酸中，1:1，持续一周左右。然后，如前所述，用与Alexa-488 (Invitrogen, USA)结合的小麦胚芽凝集素(WGA)对澄清的小麦样品进行染色[41那42］．对于每个生物复制，记录了来自三个单独叶片的每个样品的40个感染部位以评估Haustoria，亚腿长和感染区域的数量。统计学意义由未配对的双尾学生评估T.以及。

p . parasitica接种

n benthamiana叶子与渗透A. Tumefaciens.携带pCAMBIA1302: TaClpS1-GFP, pCAMBIA1302: GFP在浸润36小时后分离，并受到挑战p . parasitica通过放置菌丝塞（5mm Diam）。将接种的叶子在25℃的黑暗中保持在生长室。在36 hpi下，如前所述，用台盼蓝染色接种叶子[43.］．染色叶片拍照，测量病变区直径。

酵母2台混合动力分析

克隆构建了重组BD-TaHEMA1载体TaHEMA1利用引物TaHEMA1-BD-F/R将其全长序列导入pGBKT7，克隆构建AD-TaClpS1重组载体TaClpS1使用引物TaClpS1-AD-F/R(附加文件3.:表S1)。在相互作用实验中，BD-TaHEMA1和AD-TaClpS1按照酵母协议手册(Clontech)采用醋酸锂法共转化酵母菌株AH109，并在SD/−Trp-Leu或SD/−Trp-Leu- his选择培养基上生长。在含有X-α-gal的SD/ - trp - leu - hise - ade培养基上再次选择SD/ - trp - leu - hise - ade中的菌落进行进一步选择。

本研究产生的所有数据均包含在论文和支持信息文件中。本研究的序列数据可在植物集成数据库(http://plants.ensembl.org/）在加入号码traescs2a02g022700.1（taclps1）和traescs1b02g191200.1（tahema1），并提交给ncbi genebank数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)，注册编号为MW233893 (TaClpS1)和MW233894 (TaHEMA1)。

CLP：

酪蛋白水解肽酶

太平洋标准时间：

柄锈菌striiformisF。sp。tritici

中收取:

病毒诱导基因沉默

人力资源：

过敏反应

ROS:

活性氧

UPS：

Ubiquitin-26S蛋白酶体系统

E1:

Ubiquitin-activating酶

E2:

泛素结合酶

E3：

泛素连接酶

AAA +：

atp酶与多种细胞活性相关

PEG：

聚乙二醇

存在:

定量实时聚合酶链反应

BSMV:

大麦条纹马赛克病毒

现病史:

h post-inoculation

公关:

pathogenesis-related

WGA：

小麦胚芽凝集素

轻拍:

3, 3-diaminobenzidine

我们感谢中国上海师范大学的雍丽乔教授提供寄生疫霉菌．

本研究由农业部转基因重点项目(2020ZX08009-15B)，国家自然科学基金项目(31972224)，国家重点研发计划项目(2018YFD0200402)资助，陕西省自然科学基础研究资助项目(2020JZ-13);B07049)。资助者在研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的撰写中没有起到任何作用。

作者指出

1. 钱阳和阿什拉夫·伊斯拉姆博士对这项工作做出了同样的贡献。

隶属关系

1. 西北农林科技大学植物保护学院，干旱地区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌712100

   杨倩，蔡坤艳，田树新，刘艳，康振生，郭军

贡献

JG和ZSK设计了实验。Qy，Mai，Kyc，SXT和YL进行了实验。QY和JG写了稿件。所有作者都已读取并同意发布的稿件版本。

相应的作者

通信温恒康或小君郭．

伦理批准并同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

出版商的注意

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