利用全基因组方法解构大豆缺铁性褪绿症的遗传结构gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

铁是植物生长发育所必需的微量元素。由钙质土壤或高pH引起的缺铁褪绿症(IDC)会限制铁的有效性，对大豆(gydF4y2Ba大豆gydF4y2Ba)收益。本研究利用全基因组关联研究(GWAS)和全基因组上位性研究(gbes)与之前的基因表达研究，确定大豆基因组中在铁缺乏症耐受中重要的区域。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

利用来自27个国家的460个不同大豆PI系，在田间和水培铁胁迫条件下，使用超过36000个单核苷酸多态性(SNP)标记，进行了GWAS和GWES研究。将这种方法与现有的rna测序数据相结合，确定了与缺铁相关或对缺铁有反应的重要标记物、基因组区域和新基因。GWAS在19条染色体上鉴定出69个与IDC耐受性相关的基因组区域，包括Gm03染色体上的主要效应数量性状位点(QTL)。对该区域的重要snp进行聚类分析，将这一历史上显著的QTL解构为四个不同的连锁区块，从而鉴定出耐铁褪绿症的多个候选基因。互补的GWES鉴定了该区域的snp与其他9个基因组区域相互作用，为上位相互作用影响铁缺乏症提供了第一个证据。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

本研究表明，整合前沿的全基因组关联(GWA)、全基因组上位(GWE)和基因表达研究是从不同种质中鉴定新的耐铁QTL和候选位点的有力策略。与模式物种不同，作物经历了数千年的选择，限制和/或增强了应激反应。利用基因组学方法来研究这些适应性对未来的作物改良至关重要。gydF4y2Ba

铁(Fe)是植物多种代谢过程所必需的微量营养素，包括光合作用、呼吸和电子传递[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．虽然铁是地壳中最丰富的元素之一，但有氧条件、高pH值和/或钙质土壤使其不溶于水，不能用于植物利用。在世界上的耕地土壤中，大约30%被归类为钙质土壤[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]，包括美国中西部地区的农田，那里的大豆是主要作物。缺铁对植物生长和产量有负面影响[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．模式生物的研究gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba已经证明了一些潜在基因的表达受铁可用性的调控[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．拟南芥中涉及铁获取和稳态的其他基因已成为许多研究的主题[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba];然而，对模式物种的研究并没有转化为提高作物物种的铁效率。与尚未被驯化的拟南芥不同，大豆在5000多年前就被驯化了[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．在驯化之后，大豆和其他作物在产量、生物和非生物胁迫耐受性方面进行了持续的选择，这使得它们很可能通过长期选择和突变策略来应对缺铁胁迫。因此，迫切需要研究一种作物物种内和广泛的不同基因型之间的铁缺乏反应。gydF4y2Ba

全基因组关联研究(GWAS)已用于检测与水稻、玉米、小麦和大豆重要农艺性状相关的数量性状位点(qtl) [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．在GWAS中加入不同的植物引种(PI)种质资源增加了识别新基因和稀有等位基因的可能性[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．大豆先前的缺铁褪绿症(IDC) GWAS在7条染色体上鉴定了QTL [gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．这项研究是在两个由公共和私人育种项目为上中西部地区开发的先进育种系种群中进行的。然而，美国商品大豆品种的遗传基础狭窄[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]限制了识别IDC耐受性的新机制和自然遗传变异的可能性，这些机制和遗传变异可用于未来的大豆改良。gydF4y2Ba

GWAS通常关注加性遗传效应。然而，上位性相互作用也有助于遗传变异[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．检测全基因组上位性(GWE)相互作用是对传统遗传研究的一种补充方法，对理解数量性状的遗传结构至关重要[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．对人类和动物系统的研究表明，上位性相互作用对复杂疾病性状的遗传结构有重要影响[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．虽然GWE研究的实用性在作物研究界得到了承认，但它们还没有被广泛整合。gydF4y2Ba

本研究的目的是利用GWAS和GWES对大豆对铁缺乏反应的遗传结构进行研究，并利用单核苷酸多态性(SNP)标记进行基因分型。与传统的QTL或表达分析不同，这种组合方法使我们能够在大豆种质资源中鉴定出对IDC的耐受性的新基因和机制。通过将这些研究与30多年的IDC研究结合起来，我们将大豆3号染色体(Gm03)上主要的IDC QTL解构为多个有助于IDC耐受性的离散区域。从GWAS和GWES中鉴定这些候选基因将拓展我们对IDC耐受机制的认识，并鉴定出对大豆育种和改良具有重要意义的遗传标记。gydF4y2Ba

表型gydF4y2Ba

在2014年的实地研究中，PI种质间IDC得分的表型变异，在重复间的平均值，范围从高抗性(1.0)到高易感(4.7)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1a)和2015年实地研究中从1.0到4.6的差异，表明IDC症状表达的PI线之间存在显著差异(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．在每个时间点，人群的视觉评分和SPAD测量值近似正态分布。不同时间点IDC评级之间的相关性在2014年为0.71 ~ 0.86,2015年为0.95 ~ 0.98，其中T2和T3在田间和水培研究中相关性最大(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1b)。估计的广义遗传力[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]的视觉评分分别为82分、64分和52%，在第一、第二和第三个时间点。比较任何两个样本的结果是正相关的，支持在我们的分析中包含所有收集的数据。gydF4y2Ba

GWASgydF4y2Ba

在所有实验中共鉴定出97个独特的snp，其中2014年和2015年的田间条件和水培条件分别鉴定出43个、32个和48个独特的snp(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2和附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S3)。在2014年和2015年的现场数据中，分别有10个(23%)和23个(72%)snp在两个或两个以上的时间点或表型方法中被鉴定出来。在水培条件下，在两个或两个以上的时间点或表型方法中鉴定出6个SNPs(13%)。97个snp中有12个(12%)是在多年的现场数据中确定的，其中4个(4%)是在多年的现场数据和水培中确定的。在多个环境中检测到的snp在附加文件中列出gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

GWAS鉴定的97个独特SNP被用来定义IDC感兴趣的69个基因组区域，每个区域至少包含一个重要SNP，用于至少一个实验测量。这些区域平均长度为35 kb，标准差为25.5 kb。在Williams 82参考基因组的69个感兴趣的区域中，共鉴定出278个基因[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba](附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．为了识别高优先级的候选基因，我们从铁胁迫后30、60和120分钟的铁高效品系Clark的叶片和根中提取了可用的RNA-seq数据[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]以及铁胁迫后1和6 h [gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．此外，我们挖掘了铁效率低下品系Isoclark在铁充足和缺铁条件下GmRPA3c基因沉默21天后的叶片数据，GmRPA3c是先前确定和表征的铁反应基因[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．在278个候选GWAS基因中，65个在之前至少一项RNA-seq研究中显著差异表达gydF4y2Ba（gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．大多数差异表达基因(48个)是在水培条件下铁胁迫应用2小时内鉴定出来的。在多项研究中仅鉴定出7个基因，反映了大豆铁胁迫响应的动态性质。65个差异表达基因中，26个在叶中差异表达，36个在根中差异表达，5个在叶与根中差异表达。gydF4y2Ba

有趣的是，在多年的现场数据中确定的12个snp位于Gm03的392 kb窗口内(从34364354到35757,151)。考虑到该区域对应于历史上的IDC QTL [gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]，我们有兴趣研究整个地区的联系。Gm03(34,227,914-34,955,422)上显著snp的聚类(r2 > 0.5)在这个730 kb区域内确定了四个不同的连锁区块(基因组间隔)(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．Gm03上的间隔为1gydF4y2Bass715585424gydF4y2Ba而且gydF4y2Bass715585454gydF4y2Ba(对应基因gydF4y2BaGlyma.03 g127900gydF4y2Ba-gydF4y2BaGlyma.03 g129500gydF4y2Ba)．在这个区间的17个基因中，有10个与Peiffer等人鉴定的120 kb IDC渐渗重叠。[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．五个基因(gydF4y2BaGlyma.03 g127900gydF4y2Ba,gydF4y2BaGlyma.03 g128200gydF4y2Ba,gydF4y2BaGlyma.03 g128300gydF4y2Ba,gydF4y2BaGlyma.03 g129300gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlyma.03 g129400gydF4y2Ba)对铁胁迫的响应有显著差异，在根中有4个，在叶中有1个(附加文件)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．其中三个也与其他物种的非生物应激和防御反应有关(gydF4y2BaGlyma.03 g128200gydF4y2Ba,gydF4y2BaGlyma.03 g128300gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlyma.03 g129400gydF4y2Ba)．区间2为snpgydF4y2Bass715585456gydF4y2Ba而且gydF4y2Bass715585460gydF4y2Ba(对应五个基因:gydF4y2BaGlyma.03 g129600gydF4y2Ba-gydF4y2BaGlyma.03 g130000gydF4y2Ba)．在这段时间内gydF4y2BaGlyma.03 g129600gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlyma.03 g130000gydF4y2Ba在根系对铁胁迫的响应中均有显著差异表达。间隔3为snpgydF4y2Bass715585463gydF4y2Ba-gydF4y2Bass715585473gydF4y2Ba(对应6个基因:gydF4y2BaGlyma.03 g130100gydF4y2Ba-gydF4y2BaGlyma.03 g130600gydF4y2Ba)，包括Peiffer等人报告的120 kb IDC渐渗的最后一段。[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．在这6个基因中，有3个基因对铁胁迫的反应有差异，包括gydF4y2BaGlyma.03 g130200gydF4y2Ba,gydF4y2BaGlyma.03 g130400gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlyma.03 g130600gydF4y2Ba．区间4为snpgydF4y2Bass715585477gydF4y2Ba-gydF4y2Bass715585531gydF4y2Ba(对应30个基因:gydF4y2BaGlyma.03 g130700gydF4y2Ba来gydF4y2BaGlyma.03 g133400gydF4y2Ba)．其中，6个基因在铁胁迫RNA-seq数据中有差异表达，包括gydF4y2BaGlyma.03 g130900gydF4y2Ba-gydF4y2BaGlyma.03 g131200gydF4y2Ba,gydF4y2BaGlyma.03 g132700gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlyma.03 g132900gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

吉瓦gydF4y2Ba

上位性测试识别了20个SNP: 5个SNP之间的SNP相互作用(gydF4y2Bass715585442gydF4y2Ba,gydF4y2Bass715585444gydF4y2Ba,gydF4y2Bass715585450gydF4y2Ba,gydF4y2Bass715585469gydF4y2Ba,gydF4y2Bass715585486gydF4y2Ba在Gm03染色体上与其他染色体上的12个snp相互作用(图3)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．用于识别GWAS QTL中的候选基因的相同方法被用于识别GWES区域中的候选基因。我们鉴定了50个候选基因(附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)，其中13个在不同的铁胁迫响应RNA-seq数据集中表达差异。Gm03上的5个snp均与gydF4y2Bass715591282gydF4y2BaGm05(图;gydF4y2Ba2gydF4y2Baa, c和e).该SNP不在任何先前确定的IDC QTL中。与GG等位基因相比，该SNP的AA等位基因在IDC量表上提高了一点(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac). Gm03的5个snp中有3个与之相互作用gydF4y2Bass715624343gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB, d和f);该SNP位于大豆Gm16上，此前未报道为IDC QTL。分析表明，的TT等位基因gydF4y2Bass715624343gydF4y2Ba与CC等位基因相比，在5分褪绿评定量表上增加了1分。gydF4y2Ba

为了验证GWES结果，我们利用了StringDB，它存储了蛋白质之间已知的相互作用[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．这证实了候选基因之间的相互作用gydF4y2BaGlyma.03 g129400gydF4y2Ba(AtBIGYIN)，响应铁应力(附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba),gydF4y2BaGlyma.16 g148100gydF4y2Ba(At5g55610，附加文件gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)．在拟南芥中，这两种蛋白质都位于线粒体外膜内，并被认为在胁迫期间发挥线粒体信号传导的作用[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

大豆Gm03的IDC QTL的历史性发现gydF4y2Ba

在过去的35年里，人们采用了几种不同的方法来鉴定大豆抗IDC的基因。Cianzio等人[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]和Cianzio和Fehr [gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]，首次在大豆中证实了抗IDC的遗传特性。1997年和1998年，林等人。[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]通过田间和水培研究确定了大豆Gm03的IDC QTL，该QTL解释了70%的表型变异(图3)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．2010年，Severin等人。[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]使用新一代测序数据确定铁效率低的T203渗入铁效率高的Clark，用于开发低效率的Isoclark。佩弗等人。[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]精细地绘制了渐渗区域，使用Clark和Isoclark子nils识别出一个赋予IDC容差的120 kb区域。在该区域的18个基因中，大豆中的两个候选基因被鉴定为与拟南芥中调节根中铁摄取的AtbHLH38转录因子具有最大的同源性[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

大豆耐IDC基因的表达研究gydF4y2Ba

虽然作图研究表明单基因可能控制Clark的IDC反应，但表达研究表明涉及多个调控级联。2009年，O 'Rourke等人。[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]比较了铁胁迫处理后克拉克叶和异克拉克叶的基因表达。这项研究表明，Isoclark含有一个突变，负责调节下游铁摄取和运输基因的表达。这也表明，DNA复制和防御的调节是克拉克铁应激反应的重要组成部分。阿特伍德等人[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]使用病毒诱导的基因沉默(VIGS)来抑制GmRPA3c(复制蛋白A，亚单位3c)在Isoclark中的表达，以反映在Clark中观察到的表达。GmRPA3c沉默改善了铁胁迫下的Isoclark性能，并导致大量参与铁摄取和稳态、防御/细胞死亡、DNA复制、非生物应激、生物钟调节和自噬的基因的转录重编程。现在，早在铁胁迫处理一小时后，大豆中就观察到DNA复制基因的差异表达[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．DNA复制参与了非生物和生物胁迫反应，目前已在多种作物物种中得到报道，包括玉米、大麦和洋葱[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

大豆中铁、防御和DNA复制级联的差异表达表明至少有两个调控基因参与了大豆的铁胁迫反应。佩弗等人。[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]在根中Fe胁迫诱导Gm03的IDC QTL中鉴定出两个候选BHLH38转录因子。已经开发了多种结构来沉默这些基因，但沉默的克拉克植物在铁胁迫条件下生长时没有显着的表型变化。虽然阴性结果并不排除这些大豆BHLH38基因参与了Clark 's Fe胁迫反应，但它再次表明了其他基因的参与。此外，没有证据表明AtBHLH38调控DNA复制或防御基因的表达，也没有证据表明这些基因的调控是拟南芥Fe胁迫反应的组成部分[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．因此，在非生物胁迫下，DNA复制和防御机制的调节很可能是作物物种的一种独特适应。由于在大豆中仅鉴定出一个主要的IDC QTL，这表明该区域存在多个候选基因。gydF4y2Ba

分离大豆angm03的IDC QTLgydF4y2Ba

在本研究确定的69个基因组区域中，有8个与之前确定的IDC QTL重叠[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]和渐渗区域[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba3号。在这个区域内，在三个或三个以上的实验条件下，16个显著而独特的snp中有13个被识别出来。考虑到SNPs在这730 kb区域的物理分布，这些SNPs之间的连锁不平衡(LD)被检查。该方法将先前描述的IDC QTL分解为四个不同的区间，分别为175、37、55和309 kb(区间分别为1-4，图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，表明Gm03的这一窗口内的多个基因对IDC耐受性有贡献。区间2和3与之前研究中确定的120 kb渐渗完全重叠[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．相比之下，区间4与Peiffer IDC渐渗完全没有重叠。在每一个区间内，都鉴定出参与信号转导的高优先级候选基因，这些基因可以解释大豆铁胁迫反应的特征:防御、DNA复制和铁摄取/运输。gydF4y2Ba

区间1包含4个高优先级候选基因:gydF4y2BaGlyma.03 g128200gydF4y2Ba(AtTGA6),gydF4y2BaGlyma.03 g128300gydF4y2Ba(AtGLU1),gydF4y2BaGlyma.03 g128900gydF4y2Ba(AtLYC),gydF4y2BaGlyma.03 g19400gydF4y2Ba(AtBIGYIN)。AtTGA6调节水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)之间的交叉信号/乙烯防御反应[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．这三种激素也都参与了铁缺乏反应的调节[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．AtGLU1编码铁氧还原蛋白依赖的谷氨酸合酶。AtGLU1基因敲除会引起轻微的脓毒性[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．AtGLU1的基因表达分析揭示了广泛的转录重编程，包括光合作用相关基因的抑制和非生物胁迫相关基因的诱导。同样，AtLYC在强光条件下参与非光化学猝灭[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．AtLYC的转化导致烟草对盐胁迫的耐受性增强。AtBIGYIN调节线粒体大小和数量[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．线粒体对于铁- s簇的合成至关重要，而铁- s簇与细胞内铁稳态有关[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．所有这些基因，除了gydF4y2BaGlyma.03 g128900gydF4y2Ba(AtLYC)在铁胁迫30min后根中差异表达(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

区间2包含一个高优先级候选基因。gydF4y2BaGlyma.03 g130000gydF4y2Ba在30 min时，根系对Fe胁迫的响应差异表达(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．gydF4y2BaGlyma.03 g130000gydF4y2Ba编码AtRR4(响应调节因子4)的同源物，AtRR4是细胞分裂素信号通路的一个组成部分。细胞分裂素信号调节广泛的营养和环境应激反应[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]并直接或间接参与调节铁摄取基因[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．AtARR4还直接参与生物钟和细胞周期的调节。生物钟反过来调节铁稳态基因AtIRT1, AtBHLH38和AtFERRITIN1 [gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．类似地，Atwood等人。[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]和Moran Lauter等人[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]观察到了大豆在铁胁迫下生物钟基因的差异表达。gydF4y2Ba

间隔3包含两个AtBHLH38 (gydF4y2BaGlyma.03 g130400gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlyma.03 g130600gydF4y2Ba)由Peiffer等鉴定的转录因子[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．AtBHLH38与FIT相互作用，直接增强下游Fe基因FRO2和IRTI的表达[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．这两个基因在30分钟内对根中铁的反应中表达差异(附加文件)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．gydF4y2BaGlyma.03 g130600gydF4y2Ba在1 h时根中也有差异表达(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．含有12 bp缺失的大豆系gydF4y2BaGlyma.03 g130400gydF4y2Ba均不能诱导铁摄取基因GmFRO2和GmFIT1在铁胁迫条件下的表达。gydF4y2Ba

区间4可能是最新颖的区域之一，因为我们的分析将其置于Peiffer等人确定的120 kb渐渗之外。[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．该区域包含4个高优先级候选基因:gydF4y2BaGlyma.03 g130900gydF4y2Ba(AtSDP1),gydF4y2BaGlyma.03 g131100gydF4y2Ba(AtSQD1),gydF4y2BaGlyma.03 g132400gydF4y2Ba(At1G52950)和Glyma.03 g133000 (AtRECA)。在酵母、哺乳动物和植物的应激条件下，SDP1的同源物在脂质代谢和细胞存活中发挥重要作用[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．虽然AtSQD1突变体没有明显的表型，但AtSQD2突变体在磷酸盐饥饿条件下表现出严重的褪绿症[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．这两个gydF4y2BaGlyma.03 g130900gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlyma.03 g131100gydF4y2Ba铁胁迫对叶片的抑制作用在120 min。gydF4y2Ba通用电气gydF4y2Ba妈3 g131100在30 min时受铁胁迫诱导gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．gydF4y2BaGlyma.03 g132400gydF4y2Ba与RPA亚基1同源，包含RPA1结构域(PTHR23273)。RPA是一种由三个亚基(RPA1、RPA2和RPA3)组成的异三聚体蛋白，在DNA修复和复制过程中结合单链DNA [gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．阿特伍德等人[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]表明大豆中大部分RPA亚基对Fe胁迫有反应。此外，沉默RPA亚基3c (GmRPA3c)恢复了Isoclark的IDC耐受性。AtRECA通过同源重组调节DNA修复，也是DNA复制的重要组成部分[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．由于RECA是针对叶绿体的，因此RECA的缺失会导致与DNA修复缺失相关的叶片异常。RPA和AtRECA都是DNA复制和修复机制的重要组成部分(KEGG: ath03030, ath03420, ath03430, ath03440)。生物和非生物胁迫，如IDC，会导致活性氧的释放，从而破坏DNA [gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．识别DNA损伤导致细胞增殖抑制，允许修复发生。这也会抑制生长，减少对铁的需求。gydF4y2Ba

GWAS在大豆基因组中发现了新的IDC基因gydF4y2Ba

涉及不相关个体的基于人群的关联研究是确定复杂性状(如IDC耐受性)遗传基础的有前途的方法。以往的大豆IDC研究由于依赖于模式种中IDC相关基因的同源性或有限基因型、条件或组织中响应铁胁迫的差异基因表达而受到限制。利用多种表型分型方法、发育阶段、生长条件和多样化的种质面板，我们将能够发现大豆种质资源中控制IDC耐受性的多种机制。gydF4y2Ba

除Gm04染色体外，其他染色体上均有与缺铁显著相关的snp。Gm03和Gm19的基因组区域位于先前确定的铁效率QTL [gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba60gydF4y2Ba,gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．其余显著的snp和在整个基因组中鉴定的相关228个基因是本研究所独有的。铁特异性应激反应基因包括与重金属感应、吸收和稳态相关的基因。AtURH2 (gydF4y2BaGlyma.20 g000200gydF4y2Ba)参与酵母和哺乳动物的铁感应[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]，以及AtOSX3的表达(gydF4y2BaGlyma.06 g056600gydF4y2Ba)可耐受高金属含量及氧化性化学品[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．gydF4y2BaGlyma.08 g347000gydF4y2Ba与AtMRP3同源，AtMRP3是一种由多种重金属诱导的多药耐药相关蛋白，但不包括Fe [gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

与显著SNPs相关的疾病和应激相关基因具有耐受各种应激的功能，包括热应激(gydF4y2BaGlyma.05 g001200gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlyma.06G056400gydF4y2Ba［gydF4y2Ba48gydF4y2Ba,gydF4y2Ba64gydF4y2Ba,gydF4y2Ba65gydF4y2Ba])、冷应激(gydF4y2BaGlyma.05G000200gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlyma.12G235700gydF4y2Ba［gydF4y2Ba48gydF4y2Ba,gydF4y2Ba65gydF4y2Ba,gydF4y2Ba66gydF4y2Ba])、耐镉性(gydF4y2BaGlyma.09G110400gydF4y2Ba, (gydF4y2Ba64gydF4y2Ba])、避阴(gydF4y2BaGlyma.14G032200gydF4y2Ba, (gydF4y2Ba67gydF4y2Ba])、盐胁迫(gydF4y2BaGlyma.09G051200gydF4y2Ba, (gydF4y2Ba68gydF4y2Ba])，以及缺乏磷酸盐(gydF4y2BaGlyma.09G110200gydF4y2Ba, (gydF4y2Ba69gydF4y2Ba])。促进疾病和病原体反应的基因包括Gm19上编码典型疾病抗性基因的4个基因(gydF4y2BaGlyma.19G139400gydF4y2Ba,gydF4y2BaGlyma.19G139500gydF4y2Ba,gydF4y2BaGlyma.19G139600gydF4y2Ba,gydF4y2BaGlyma.19G139700gydF4y2Ba)，尽管没有一种与特定疾病有关。其他疾病反应基因包括AtCDR1的同源基因(gydF4y2BaGlyma.12G235400gydF4y2Ba)，一种参与丁香假单胞菌反应的构成性疾病反应基因AtPCC1 (gydF4y2BaGlyma.15G256200gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlyma.15G256300gydF4y2Ba)，可产生依赖rpp7的霜霉病抗性[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba,gydF4y2Ba71gydF4y2Ba,gydF4y2Ba72gydF4y2Ba]，及AtLECRK (gydF4y2BaGlyma.02 g043000gydF4y2Ba)，参与抗性疫霉菌gydF4y2Baspp。gydF4y2Ba

DNA复制和细胞生长相关基因与显着snp包括gydF4y2BaGlyma.01G193400gydF4y2Ba(AtCYCD5),gydF4y2BaGlyma.02G074800gydF4y2Ba(AtGAI),gydF4y2BaGlyma.05G168600gydF4y2Ba(AtEBS1)，这些都是调节植物生长和细胞周期的重要成分[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba,gydF4y2Ba74gydF4y2Ba,gydF4y2Ba75gydF4y2Ba］．此外，在两个蔗糖转运蛋白(AtSUC2)同源物(gydF4y2BaGlyma.02 g075000gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlyma.02 g075100gydF4y2Ba)．根中糖积累的增加诱导还原酶活性和铁获取基因的表达[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba］．一个SWEET糖转运蛋白家族和两个SUC2基因在大豆缺铁胁迫1 h后差异表达，证实了糖信号在大豆铁胁迫响应中的重要性[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．在本实验中鉴定了涉及铁特异性、一般生物/非生物胁迫响应和DNA复制的基因，证实大豆的铁缺乏反应通过多种新机制发生。gydF4y2Ba

缺铁和上位症gydF4y2Ba

上位相互作用分析确定了Gm03上的5个snp，位于图中所示的4个基因组区间中的3个区间内。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba(区间1有三个SNP，区间3和区间4各有一个SNP)。累计来看，这5个SNPS与13个不同的基因组位置存在上位互作，代表50个候选互作基因。这些SNP中的每一个都与SNP相互作用gydF4y2Bass715591282gydF4y2Ba，位于Gm05(图;gydF4y2Ba2gydF4y2Baa，附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．该SNP不在任何先前确定的IDC QTL (gydF4y2BaSoyBase.orggydF4y2Ba)．此外，它与本GWAS研究中发现的任何QTL都不相关。与GG等位基因相比，该SNP的AA等位基因在IDC量表上提高了一个点以上(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac).在IDC的五分制评级量表上，每增加一分，收益率就会降低20% [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．SNP的基因组分析确定了9个候选基因，其中3个在铁胁迫反应中表达差异。gydF4y2BaGlyma.05 g172300gydF4y2Ba(AtPSBY)编码光系统II的一个组成部分，该组成部分在应激下产生活性氧[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba］．另外两个铁反应基因的功能(gydF4y2BaGlyma.05 g172400gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlyma.05 g172800gydF4y2Ba)是未知的。值得注意的是，苏格兰民族党本身就位于苏格兰gydF4y2BaGlyma.05 g172600gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Bae).该基因的拟南芥同源物是肌动蛋白调节蛋白3 (AtARP3)，参与盐胁迫下Ca2+信号的调节[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba］．虽然钙信号尚未在IDC反应中被表征，但它是一种保守的信号反应，已知涉及多种营养缺乏，包括磷酸盐、钾、硼和盐。这一区域的9个基因中的任何一个都可能参与与SNP相关的上位性相互作用gydF4y2Bass715591282gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

一个额外的上位相互作用包括在区间1上与SNP相互作用的三个SNPgydF4y2Bass715624343gydF4y2BaGm16(图;gydF4y2Ba2gydF4y2Bab). Gm16未发现IDC QTL (gydF4y2BaSoyBase.orggydF4y2Ba)．虽然在该区域鉴定了三个候选基因，但没有一个在铁胁迫响应中表达差异，也没有一个与生物或非生物胁迫响应相关的明显功能。值得注意的是，与CC等位基因相比，该SNP的TT等位基因在IDC量表上提高了>一个点(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad). SNP的GWAS候选基因内gydF4y2Bass715585450gydF4y2Ba，我们确定gydF4y2BaGlyma.03 g129400gydF4y2Ba(AtBIGYIN)，对铁胁迫有反应。使用StringDB [gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]，我们能够识别出一个与SNP对应的候选上位基因gydF4y2Bass715624343gydF4y2Ba,gydF4y2BaGlyma.16 g148100gydF4y2Ba．考虑到Gm03区域的复杂性以及三个不同的非连续GWAS snp能够与多个基因组位置相互作用，我们决定使用StringDB来测试所有Gm03候选GWAS基因与所有候选GWAS基因的相互作用。这确定了6个潜在的网络，每个网络至少包含一个GWAS和GWES候选基因。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．在六个网络中，有两个包含铁胁迫反应基因。特别令人感兴趣的是包含GWAS铁胁迫响应基因的网络gydF4y2BaGlyma.03 g128300gydF4y2Ba(AtGLU1)。AtGLU1编码铁氧还原蛋白依赖的谷氨酸合酶。敲除突变体显示叶片褪绿和多种应激反应的激活[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．在该网络中，AtGLU1与GWES候选基因相互作用gydF4y2BaGlyma.05 g127900gydF4y2Ba(At1G72550)， tRNA合成酶gydF4y2BaGlyma.06 g206600gydF4y2Ba(At5G08110/AtHRQ1)，这是基因组稳定和修复所必需的[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba］．这些结果为我们的上位论分析提供了进一步的支持。利用这些新发现可以提高作物在胁迫条件下的性能。gydF4y2Ba

在本报告中，我们发现了大量与铁缺乏相关的分子标记、基因组区域和候选基因。利用基因组学的方法来研究缺铁性褪绿症对于未来大豆改良项目的多个目标至关重要[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba］．全基因组研究将受益于数字化和自动化表型分型[gydF4y2Ba81gydF4y2Ba,gydF4y2Ba82gydF4y2Ba,gydF4y2Ba83gydF4y2Ba］．此外，本研究中报告的标记可能有助于未来的大豆基因组研究。我们的全基因组研究利用了数千个SNPs、多样化的大豆种质面板、多种表型方法、发育阶段和生长条件。这种方法使我们能够确定新的IDC QTL，可用于未来的大豆改良。通过整合大豆铁胁迫反应的RNA-seq研究中的基因表达数据，我们能够识别高优先级的候选基因。这项新的GWES研究使我们能够识别有助于大豆铁胁迫反应的新基因网络。此外，我们能够将Gm03的历史IDC QTL解剖成四个不同的基因组区间。30多年来，人们一直认为一个单一的候选基因控制着这个QTL，在观察到的铁缺乏症表型变异中占70%。只有通过结合30年育种、基因表达和新的全基因组关联研究的跨学科方法，我们才能证明这个区域包含多个候选基因。与相同的生化和分子途径的联系表明，在大豆中产生对IDC的耐受性有多种途径，可以用于未来的作物改良。gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

本研究以美国农业部国家植物种质资源系统(gydF4y2Bawww.ars-grin.govgydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．品种按成熟度组进行分类，分别为31、36和33%，分别为I、II和III成熟度组。采用完全随机区组设计，2014年2个重复，2015年4个重复。2014年，在0.3 m长、0.91 m地块间距(小巷)和0.76行间距的地块上手工种植了3至4颗每种基因型的种子。2015年，在长0.3 m、地块间距0.61 m(小巷)、行距0.76 m的山地地块上人工种植了5粒种子。用人工除草控制播种后出现的杂草。gydF4y2Ba

2015年，在爱荷华州立大学农学系温室的水培条件下，在16小时的光周期下，对PI品种进行了评估。每个PI附加5粒种子在发芽纸上发芽7 d。然后，按照Chaney等人的描述，将每个加入的均匀幼苗移植到含有240 L缺铁培养基并补充每日营养液的水培系统中。[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba］．试验采用随机完全区组设计，每组2个重复。包括大豆IDC检测Clark (IDC耐受性)和Isoclark (IDC易感性)。gydF4y2Ba

试验田及土壤检验gydF4y2Ba

在爱荷华州立大学Bruner农场，选择了一块以前用于IDC研究的试验田进行实地实验。土壤采样使用土壤探针(JMC Soil sampler, Newton, IA)进行，每个样品都在爱荷华州立大学的土壤和植物分析实验室进行分析。土壤参数为pH值(1:1,H2O: soil) [gydF4y2Ba85gydF4y2Ba]，碳酸钙含量[gydF4y2Ba86gydF4y2Ba]， Fe含量[gydF4y2Ba87gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

缺铁性褪绿症评估gydF4y2Ba

在现场，IDC症状在T1(代表V2到V3)， T2(代表V5到V6)和T3(代表R1, T2后大约2周)的视觉尺度上被评级为1(无褪绿症)到5(严重褪绿症，发育迟缓和坏死)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1a) [gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba88gydF4y2Ba］．在T1和T2时，在田间使用土壤植物分析发展仪(SPAD)测量叶绿素浓度。在水培系统中，分别在T1、T2和T3分别代表V1、V2和V3三叶期记录视觉表型。在V1和V2进行SPAD测量。gydF4y2Ba

基因分型和质量控制gydF4y2Ba

如先前研究所述，使用Illumina Infinium SoySNP50K BeadChip对所有460个PI种质进行基因分型[gydF4y2Ba89gydF4y2Ba]，数据来源于SoyBase (gydF4y2Bahttps://soybase.org/snps/gydF4y2Ba)，共包含42,506个高置信snp。BEAGLE遗传分析软件(3.3.1版本，[gydF4y2Ba90gydF4y2Ba])与默认设置一起使用，以补充缺失的数据。从进一步的分析中删除频率大于10%的缺失标记。输入后，从数据集中去除小等位基因频率小于5%的snp。GWA和GWE分析共使用了36139个snp。gydF4y2Ba

连锁不平衡gydF4y2Ba

利用R包synbreed[，计算标记间的LD为等位基因频率相关系数的平方(r2)。gydF4y2Ba91gydF4y2Ba］．对于纯色区域和异色区域，r2值是独立计算的，因为这两个区域的重组率存在显著差异[gydF4y2Ba92gydF4y2Ba］．每条染色体的常染色质和异染色质的物理长度由SoyBase (gydF4y2Bahttps://soybase.org/SequenceIntro.phpgydF4y2Ba版本为Williams82.a2。v1, (gydF4y2Ba24gydF4y2Ba])。在纯色或异色区域中，对距离小于10 Mbp的snp的r2值绘制在LD衰减图上[gydF4y2Ba93gydF4y2Ba用R [gydF4y2Ba94gydF4y2Ba］．LD衰变的速率被确定为平均r2下降一半的染色体距离[gydF4y2Ba95gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

GWAS和gwsgydF4y2Ba

使用最佳线性无偏预测(BLUP)和R包lme4[对每个时间点每个PI接入的IDC表型数据进行分析]gydF4y2Ba96gydF4y2Ba以减少环境变化的影响。利用基因组关联和预测集成工具(genome association and prediction integrated tool, GAPIT) R package对每个时间点拟合解释家族关系的混合线性模型[gydF4y2Ba97gydF4y2Ba,gydF4y2Ba98gydF4y2Ba］．使用模型适应度的贝叶斯信息标准检验，没有检测到群体结构，可能是由于在本研究中使用了遗传多样性的核心基因型集合(附加文件)gydF4y2Ba12gydF4y2Ba, (gydF4y2Ba99gydF4y2Ba,gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba])。实证显著性水平gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001，由1000个排列决定，被用作snps -性状关联的阈值[gydF4y2Ba92gydF4y2Ba］．考虑到大豆全基因组LD的衰减率较低[gydF4y2Ba92gydF4y2Ba]，我们用SNP最显著的LD r2 > 0.5聚类邻近的SNP形成QTL，并选取最显著的SNP代表每个位点，结果在Gm03号之前报道的主要效应位点上出现了多个位点。使用PLINK version 1.07软件分析SNP对之间的全基因组上位相互作用[gydF4y2Ba101gydF4y2Ba,gydF4y2Ba102gydF4y2Ba］．为了纠正snp的多重比较，使用Bonferroni阈值α = 0.05 [gydF4y2Ba103gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

候选基因预测gydF4y2Ba

为了鉴定包含候选基因的GWAS和GWES基因组区间，在一个显著SNP的两侧鉴定出两个最接近的非显著SNP(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．然后在SoyBase基因组浏览器中查询不显著的snp (gydF4y2Bawww.soybase.org/gb2/gbrowse/gmax2.0/gydF4y2Ba)来确定它们在基因组中的位置，并识别位于SNPs之间的所有基因。重叠的SNP区间被组合成一个单一的基因组区域。然后使用SoyBase注释工具对识别的基因进行注释(gydF4y2Bawww.soybase.org/genomeannotation/gydF4y2Ba)，提供了最好的拟南芥同源物(the Arabidopsis Information Resource version 10, www.;gydF4y2Baarabidopsis.orggydF4y2Ba)．通过文献检索拟南芥同源基因，鉴定与铁缺乏和非生物胁迫耐受性相关的基因。我们还将位于SNP区间内的大豆基因与之前报道的其他大豆铁缺乏基因进行了查询，以将候选基因与IDC响应差异表达的基因以及之前报道的IDC QTL联系起来[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．有需要时，使用SoyBase基因模型对应查找(gydF4y2Bahttps://www.soybase.org/correspondence/gydF4y2Ba)用于比较来自不同基因组组合的基因表达数据。为了检测潜在的候选基因相互作用，使用StringDB version 10.5检测了所有Gm03 GWAS和所有GWES的候选基因的拟南芥同源性[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

各时间点收集的IDC视觉评分和SPAD测量数据的模型为yijk = μ + gi + bj + eijk，其中μ为总平均值，gi为第i个基因型的遗传效应，bj为块效应，eijk为残差效应，包括随机误差和基因型与块之间可能的相互作用。IDC的广义遗传力估计是在条目平均值基础上计算的，使用公式HgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba=σgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_ggydF4y2Ba/(σgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_ggydF4y2Ba+(σgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_{g * ygydF4y2Ba}/y) + (σgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_egydF4y2Ba/ry)]，其中σgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_ggydF4y2Ba=基因型方差，σgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_{g * ygydF4y2Ba}=基因型按年份相互作用，y =年数，gydF4y2BargydF4y2Ba=重复次数[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．方差分量估计使用SAS版本9.3计算(SAS Institute Inc.， Cary, NC)。gydF4y2Ba

支持本研究结论的数据集包含在本文(及其附加文件)中。补充文件中未包含的数据可向通讯作者索取。用于实验的种子可从美国农业部国家植物种质资源系统获得。gydF4y2Ba

BLUP:gydF4y2Ba

最佳线性无偏预测gydF4y2Ba

GWAS:gydF4y2Ba

全基因组关联研究gydF4y2Ba

GWE:gydF4y2Ba

全基因组上位gydF4y2Ba

瓦:gydF4y2Ba

全基因组上位研究gydF4y2Ba

国际数据公司(IDC):gydF4y2Ba

缺铁性褪绿症gydF4y2Ba

LD:gydF4y2Ba

连锁不平衡gydF4y2Ba

QTL:gydF4y2Ba

数量性状位点gydF4y2Ba

SNP:gydF4y2Ba

单核苷酸多态性gydF4y2Ba

我们真诚地感谢爱荷华州立大学的Jae Brungardt, Brian Scott和Singh大豆小组成员提供的研究援助。我们感谢Jennifer Hicks审阅手稿。gydF4y2Ba

本研究部分得到了爱荷华州大豆协会(AKS和AS)、孟山都大豆育种主席(AKS)、R F Baker植物育种中心(AKS)、北中部大豆研究计划(MAG和JAO)、美国农业部CRIS IOW04403和拨款2017-67021-25965 (AS和AKS)以及美国农业部农业研究服务项目3625-21220-005-00D和5030-21220-006-00D (MAG和JAO)的支持。美国农业部是一个平等机会的提供者和雇主。在本出版物中提及商品名称或商业产品仅为提供特定信息的目的，并不意味着美国农业部的推荐或认可。资助机构在研究设计、数据收集、分析、数据解释、撰写手稿和发表决定方面没有任何作用。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 爱荷华州立大学农学系，艾姆斯，IA，美国gydF4y2Ba

   Teshale Assefa，张教平，R. V. Chowda-Reddy, Arti Singh & Asheesh K. SinghgydF4y2Ba

2. 美国农业部，农业研究处，玉米昆虫和作物遗传研究单位和农学系，爱荷华州立大学，艾姆斯，IA，美国gydF4y2Ba

   埃德里安娜·n·莫兰·劳特，杰米·a·奥洛克和米歇尔·a·格雷厄姆gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

A.S.和A.K.S.设计的研究;t.a.， A.S.和A.K.S.进行研究;主导者——,t, J.Z J.A.O, M.A.G. A.K.S.分析数据;实际高度,J.Z A.N.M.L, R.V.C.R,其子as, J.A.O M.A.G.和A.K.S.写手稿。所有作者都阅读并批准了手稿的最终版本。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaAsheesh K. SinghgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突gydF4y2Ba

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开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba