长链酰基辅酶a合成酶2参与种子油的生产芸苔属植物显著

背景

三酰甘油(TAGs)是植物种子油的主要成分。长链酰基辅酶A合成酶(LACSs)催化合成长链酰基辅酶A，是合成TAG的主要底物之一。在拟南芥， LACS基因家族包含9个成员，其中LACS1而且LACS9在TAG生物合成中具有重叠功能。然而，关于油菜LACS蛋白功能的研究报道较少。

结果

的同词拟南芥LACS2基因(BnLACS2)，在发育中的种子中高度表达，在油菜籽(芸苔属植物显著)．的BnLACS2-GFP融合蛋白主要定位于内质网，TAG生物合成发生在内质网。有趣的是，过度表达BnLACS2与野生型相比，转基因油菜的含油量显著增加BnLACS2-RNAi转基因油菜植株含油量降低。此外，实时荧光定量PCR的表达数据显示，在转基因植物中，与糖酵解、脂肪酸(FA)和脂质生物合成相关的几个基因的表达也受到影响。

结论

一种长链酰基辅酶A合成酶，BnLACS2，位于内质网中被鉴定为显著．过度的BnLACS2在酵母和菜籽粕中可以增加油分含量，而BnLACS2-RNAi转基因油菜植株含油量降低。此外,BnLACS2转录增加了种子发育过程中糖酵解、FA和脂质合成相关基因的表达。这些结果表明BnLACS2是种子油生产的重要因素显著．

油菜(芸苔属植物显著。L)是世界四大油料植物之一，在生产供人类食用的植物蛋白和食用油方面发挥着重要作用。此外，种子油是生物燃料和制药工业的重要原料，具有巨大的经济价值和近年来的高需求[1，2］．因此，提高种子含油量对遗传育种具有重要意义，已成为油料作物研究的一个主要课题[3.，4］．

植物油主要在种子成熟期积累，为种子萌发和幼苗生长提供碳和能量[5，6］．种子油主要由三酰甘油(TAGs)组成，占种子重量的60%，是真核细胞中最有效的能量储存形式[7，8］．鉴于TAG的重要作用，了解限制其积累的因素有助于通过基因工程提高TAG含量。在开发油籽过程中，TAG的生物合成发生在内质网(ER)中。碳水化合物和脂肪酸(FA)代谢也参与这一途径。在细胞质和质体中，己糖通过糖酵解途径转化为乙酰辅酶a，其中一部分被用作合成FA的碳源。FAs可转化为长链酰基辅酶a，是TAG生物合成的前体。许多基因编码的酶参与糖酵解，以及FA和脂质生物合成在这一途径中发挥关键作用。其中，编码长链酰基辅酶a合成酶的基因(LACS, EC 6.2.1.3)在CoA、ATP和Mg存在下催化游离FAs生成酰基辅酶a硫酯^{2 +}．它是原核生物和真核生物FA代谢的关键过程，涉及两步反应。在第一步中，游离的FAs与ATP反应生成酰基-AMP，之后形成酰基-辅酶a硫酯键，AMP在接下来的步骤中被释放[9，10］．LACSs属于AMP结合蛋白(AMPBP)超家族，主要催化合成12-20个碳的酰基辅酶a [11］．以往的研究表明，lacs在几乎所有fa衍生的途径中都占有重要地位，包括脂质代谢、茉莉酸生物合成和β-氧化[12，13]，以及各种微生物和哺乳动物细胞内FA的内稳态和转运[14，15，16］．在硅藻Phaeodactylum tricornutum，一种较低的光合作用生物体，有5个假定的lacs (PtACSL1-5)，其中只有两种能够恢复酵母双突变体的生长，促进外源FA的吸收，增强脂质积累，FAA1ΔFAA4Δ［17］．这些研究为研究lacs介导的FA和不同生物体内脂质代谢提供了分子基础。

在高等植物中，lacs有几种异构体，在不同的细胞室中执行不同的生物功能[10，18，19，20.，21］．在拟南芥，有九个虫胶参与FA和甘油脂代谢的基因。其中7种可以有效补充lacs缺陷酵母突变株YB525的生长表型。不能补充生长表型的两种是过氧化物异构体[13］．AtLACS1而且AtLACS2定位于ER，在蜡和角质合成中具有重叠功能，具有超长链酰基辅酶A合成酶活性[22，23，24］．AtLACS1而且AtLACS4在花粉被膜形成过程中表现出协同作用[25］．AtLACS6而且AtLACS7参与过氧化物酶体β-氧化并成功成苗[10，26］．LACS9位于叶绿体包膜上，参与酰基辅酶a的产生[21]，其功能与的部分重叠LACS1而且LACS4分别在TAG生物合成和脂质从ER转运到质体的过程中起重要作用拟南芥［18，27］．在其他植物中也发现了LACS同源物，如油菜籽、水稻、大豆和棉花等。一种过氧化物酶病GmACSL2从大豆可能参与种子萌发过程中FA和脂质的降解[28］．向日葵HaLACS1而且HaLACS2，显示序列与拟南芥LACS9而且LACS8基因分别在种子发育过程中高水平表达，并在葵花籽油合成中发挥重要作用[29］．

先前的研究表明有6种同源基因虫胶基因在显著，其中包括BnLACS2,酶活性在什么时候表达大肠杆菌［30.，31］．但是，其生化特性和生理功能BnLACS2仍无特征。在这项研究中显著BnLACS2克隆了该基因，并对其在种子油脂生产中的作用进行了研究。过度的BnLACS2在油菜植株中导致油分含量的提高，而在油菜中抑制基因表达降低油分含量。研究还显示，在BnLACS2基因功能与糖酵解生理过程、FA和脂类合成有关。

BnLACS2的同义词是拟南芥LACS2在油菜籽

利用的蛋白质序列在LACS2 (NP_175368)作为查询探针，两个高度同源序列(BnaC05g51350D而且BnaA05g16170D)从芸苔属植物基因组数据库和推定的全长cDNA (2001 bp)BnaA05g16170D轨迹(指定为BnLACS2)克隆自中爽9号品种(补充文件1:图S1)。BnLACS2含667个氨基酸残基，理论等电点为6.07，计算分子量为74.35 kDa。序列分析显示BnLACS2具有保守的amp结合结构域，是AMPBP超家族的特征结构域。使用ScanProsite Results Viewer软件对其他LACS序列的Motif分析也发现了显著的amp结合域，这意味着该Motif对LACS具有重要的功能。氨基酸序列Bn将LACS2蛋白与来自不同物种的24条LACS序列进行比对，包括显著，陆地棉，拟南芥，酿酒酵母,而且智人．根据该氨基酸序列构建了系统发育树，结果表明，两者之间存在密切的遗传关系BnLACS2而且拟南芥LACS2，表明它们可能具有相似的功能(图。1)．

BnLACS2可以补充YB525酵母突变体

之前的研究表明BnLACS2具有体外酶活性[31];然而，它的确切功能和作用机制尚未被发现。酵母表达系统是生产重组真核蛋白的有力工具。而且，酵母细胞可以积聚油脂，这与菜籽油体类似[32］．因此，酵母表达系统适合于研究脂质代谢途径中基因的功能。YB525酵母突变体缺乏酰基辅酶a合成酶活性，为评估这类酶的功能作用提供了一个独特的工具[33］．拟南芥LACS2具有酶活性，可以补充缺乏lacs的YB525菌株[13］．以确定是否BnLACS2在体内具有类似的活性，BnLACS2克隆到pYES2，转化到YB525。转化体以月桂酸12:0、肉豆花酸14:0、棕榈酸16:0、硬脂酸18:0、油酸18:1、芥酸22:1等多种FAs为唯一碳源的液体培养基培养。然后根据光密度(OD)评价各菌株的生长情况。如图所示。2， pYES2-的变换BnLACS2挽救YB525在含有14:0、16:0、18:0、18:1、22:1 FAs的培养基中生长缺陷，而不是12:0 FAs，即短链FA。然而，用pYES2控制载体转化的酵母细胞无法在以FAs为唯一碳源的培养基中生长。此外，酵母细胞含有pYES2-BnLACS2构象偏好使用18:0 FAs作为生长碳源。因此,BnLACS2具有酰基-辅酶a合成酶活性，底物偏好长链FAs。

表达式的分析BnLACS2在油菜不同组织和不同发育阶段

虽然BnLACS2能激活游离FA，其生理功能尚不清楚。考虑到LACS基因的组织分布可能与其功能密切相关，采用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测LACS基因的表达模式BnLACS2授粉后25天，在不同的油菜籽组织中，包括根、茎、叶、花和发育中的种子(DAP)。结果表明BnLACS2该基因在所有检测的组织中都有表达，但主要在TAG被积极合成的发育种子中表达(图4)。3.a).此外，丰度存在明显差异BnLACS2高、低含油量种子在25 DAP、35 DAP、45 DAP和50 DAP之间的转录产物。无论表达是在高含油量或低含油量的种子中评估，BnLACS2在45 DAP强烈表达，这是一个阶段，TAG积累在高速率(图。3.b).根据上述转录分析结果，BnLACS2可能参与在种子发育过程中为TAG生物合成提供酰基辅酶a。

亚细胞定位BnLACS2

在高等植物中，不同亚细胞定位的LACS蛋白可能参与不同的代谢途径。已知ER是FA碳链延伸和脂质合成的重要位点。在LACS2同源于BnLACS2，位于ER。因此，我们推测BnLACS2也是一种内质网蛋白。为确定其定位，我们选择CRT3 (calreticulin 3, CRT3)作为ER定位标记[34]与红色荧光蛋白(DsRed)融合(图2)。4右)。Bn在CaMV 35S启动子控制下，利用pK7FWG2.0载体将LACS2表达为与绿色荧光蛋白(GFP)融合的蛋白(图3)。4左)。质粒,35 s:: BnLACS2-GFP而且35 s:: DsRed-CRT3，并转染到叶表皮细胞烟草benthamiana瞬时表达。如图所示。4b-d, GFP荧光由Bn发现LACS2-GFP融合蛋白与DsRed- crt3融合蛋白产生的DsRed荧光重叠，表明BnLACS2与CRT3共定位于ER，即TAG生物合成位点。

BnLACS2转基因酵母和油菜籽的表达与脂质和脂肪酸含量相关

表达模式及亚细胞定位分析BnLACS2提示它可能参与了种子油的生产。的功能BnLACS2首先被鉴定为酿酒酵母pep4四种空泡蛋白酶活性至少降低90%的突变体[35］．用苏丹黑B染色法测定宿主酵母细胞中中性脂质的相对含量。结果表明，其吸光度值BnLACS2与空pYES2转化对照相比，-转化细胞系增加了85.7%。此外,BnLACS2过表达导致酵母产生新的磷脂成分。根据气相色谱-质谱(GC-MS)分析，异源表达BnLACS2也显著提高了总FAs的合成，尤其是两种主要的FA成分，棕榈油酸(C16:1)和油酸(C18:1)(附加文件2:图S2)。

进一步确定的功能BnLACS2向量,BnLACS2超表达(OE)和BnLACS2-RNAi构建并转化到油菜籽(显著l .简历。中爽9)采用花浸法(图。5a).通过PCR初步筛选耐潮霉素或卡那霉素的油菜转化子。选取几株独立转化的T0转基因植株，培养至成熟，获得纯合子株系(图;5b).检测BnLACS2在T2转基因株系中进行qRT-PCR转录结果显示其表达水平较高BnLACS2-OE转基因植株比未转化对照植株表达量更低BnLACS2-RNAi转基因植株，与对照相比(图1)5c).表型BnLACS2oe和BnLACS2-RNAi转基因植物也进行了分析。与非转基因植株相比，转基因植株表型正常，形态变化不明显。进一步确定是否BnLACS2，我们利用近红外光谱(NIRS)结合核磁共振(NMR)对T2转基因油菜植株的种子含油量进行了分析，两种方法的结果一致。如表所示1而且2的含油量BnLACS2oe植株增加了6 - 8%，减少了3 - 6%BnLACS2-RNAi转基因植物，与野生型植物相比。气相色谱-质谱分析显示过表达BnLACS2也显著增加了C18:2、C20:0、C20:1、C22:0等长链FAs的含量。6)．这些结果表明，表达BnLACS2油菜籽和酵母细胞中脂质和FAs含量增加。因此，作为一种催化游离FAs生成长链酰基辅酶的重要酶，BnLACS2在油菜籽生产中起着重要作用。

BnLACS2过表达影响种子发育过程中糖酵解相关基因的表达

的表达BnLACS2在酵母pep4能提高脂质和脂肪酸含量。进一步表征的效果BnLACS2pYES2和pYES2-蛋白在控制脂质和FA合成方面的作用BnLACS2利用双向凝胶电泳(2-DE)对转化子进行分离。结果表明，pYES2-中部分糖酵解酶表达上调BnLACS2转化株(附加文件3.而且4:图S3和表S1)。基因表达引起糖酵解酶的上调BnLACS2促使我们检测这些基因是否在BnLACS2转基因油菜籽植物。qRT-PCR分析结果显示，该菌的主要糖酵解酶基因有表达磷酸果糖激酶(PFK)，磷酸甘油酸酯激酶（PGK)，烯醇酶（伊诺),丙酮酸激酶（PYK)[36，37，38的数量显著增加BnLACS2-OE转基因植株中，这些基因的表达降低BnLACS2-RNAi转基因植物与非转基因植物的比较7)．这一结果表明BnLACS2影响种子发育过程中糖酵解基因的表达。

高水平的BnLACS2的活性改变了种子发育过程中FA和脂质合成基因的表达

从以上结果中，我们发现对BnLACS2活性水平影响糖酵解基因表达，但其作用机制尚不清楚。进一步了解的作用BnLACS2在控制种子油脂生产的过程中，研究了种子发育过程中FA和脂质合成通路中几个代表性基因的表达水平，包括乙酰辅酶a羧化酶1（ACC1)，beta-ketoacyl——(酰基载体蛋白)(ACP)合酶（内二世)，脂肪酸ELONGATION1（FAE1)，脂肪酸去饱和酶3（FAD3)，lysophosphatidyl酰基转移酶1（LPAT1),二酰基甘油酰基转移酶1（DGAT1)．在这些基因,ACC1而且KASII参与了FA缩合反应[39，40),而FAE1而且FAD3分别参与FA链延伸和去饱和反应[41，42］．LPAT1而且DGAT1与脂类生物合成有关[43，44］．表达谱分析表明，这些基因均显著增加BnLACS2-OE转基因植株和减少BnLACS2-RNAi转基因植物与野生型植物比较(图1)8)．这些结果表明，高水平BnLACS2可改变种子发育过程中FA和脂质合成基因的表达，在种子的油脂生产中发挥重要作用，但由于LACS的其他活性变化有限(±10%)，因此应与LACS的其他活性有关。

油菜是世界上主要的油料作物，在经济和农业生产中发挥着重要作用。提高油菜籽含油量具有重要的经济价值，是油菜育种的一大挑战。乳酸盐是影响FA和脂代谢的重要因素。许多LACS蛋白已经在模型植物中进行了研究，拟南芥和大米(13，45］．然而，对油菜LACS蛋白功能的研究却鲜有报道。在本研究中，LACS基因BnLACS2从中双9号油菜中提取的BnLACS2编码一种LACS蛋白，可使LACS缺陷酵母株(YB525)在互补时恢复正常生长。此外,过度的BnLACS2酵母和油菜均能显著提高油脂含量。因此,BnLACS2是油菜高含油量育种的候选基因。

BnLACS2包含保守的amp结合域，这是典型的AMPBP基因超家族，在通过腺苷酸活化羧酸的过程中共享一个机制步骤[46］．系统发育分析表明BnLACS2同源于拟南芥AtLACS2(无花果。1)，它已被证明可以挽救lacs缺陷酵母(YB525)的生长缺陷[13］．基于序列之间的同源性BnLACS2而且AtLACS2据推测，它们可能具有类似的功能。结果表明，异质表达BnLACS2也可以补充YB525酵母突变体。酵母互补试验不仅证实了长链酰基辅酶a合成酶的活性BnLACS2也显示其对底物的偏好和特异性。YB525酵母细胞经BnLACS2在含不同碳链长度(C12-C22) FAs的营养不良培养基中均能存活。结果表明，以长链FAs (C14-C22)为碳源时，与YB525相关的生长缺陷得到拯救BnLACS2表达，但不含短链FAs (C12)。这些结果表明BnLACS2具有较高的酰基辅酶a合成酶活性，在FAs对酰基辅酶a的激活中发挥重要作用。此外,BnLACS2优选地利用长链FAs作为底物(图;2),因此,BnLACS2是一个长链酰基辅酶a合成酶基因。

多项研究报道，几种植物lacs在不同组织中表现出不同的表达模式[13，20.，28，29］．在我们的研究中,BnLACS2主要表达在发育中的种子中，TAG被积极合成(图1)。3.a).的进一步分析BnLACS2胚胎发育25 - 50 DAP的表达模式表明BnLACS2在45 DAP强烈表达，这是TAG以高速率积累的点(图。3.b).这些数据表明BnLACS2可能参与与种子油生产有关的代谢过程。有报道称，植物中的LACS蛋白可能定位于不同的细胞器组分，以确定LACS蛋白的功能[18，30.，47］．与上述数据一致的是，亚细胞定位分析显示，gfp标记BnLACS2以及标记为dsred的ER定位标记CRT3是共同定位的，这说明BnLACS2定位于TAG生物合成位点(图2)。4)．同样，一些位于ER的植物LACS蛋白也被报道在TAG生物合成中发挥作用，包括拟南芥LACS1和向日葵LACS2［27，29］．因此,BnLACS2在种子发育过程中参与激活长链FAs进行脂质合成。此外,BnLACS2在叶片中表达水平较高，这与拟南芥LACS2角质生物合成[23，24］．然而，功能AtLACS2在种子油的生物合成方面仍不清楚。

评估…的贡献BnLACS2在标签生产,BnLACS2oe和BnLACS2获得-RNAi转基因植株，并对其种子含油量进行分析。结果表明，转基因油菜植株过度表达BnLACS2与野生型相比，rnai介导的基因在种子中具有更高的含油量BnLACS2与野生型相比，沉默导致了更低的含油量1而且2)．类似地，的表达式BnLACS2在pep4酵母显著增加脂肪和FA含量(附加文件2:图S2)。因此，这些结果表明BnLACS2参与TAG生物合成。此外,这两个BnLACS2oe和BnLACS2-RNAi转基因植株生长发育正常。因此,BnLACS2可能是提高油菜籽粒含油量的较好候选基因，且不产生负作用。

酵母蛋白的2-DE分析显示BnLACS2导致与糖酵解相关的表达谱改变(附加文件4:表S1)。在转基因油菜植株中，过表达BnLACS2也会影响糖酵解基因的表达。7)．此外，糖酵解活性的增加伴随着酵母脂质含量的增加BnLACS2这可能是由于碳通量增加到FA生物合成途径。在细胞质和质体中，己糖通过糖酵解途径转化为乙酰辅酶a，其中一部分作为合成FA的碳源。这个结果表明BnLACS2也会影响脂肪酸和脂类生物合成。因此，作为……的结果，就不足为奇了BnLACS2脂质合成途径，包括ACC1，KASII，FAE1，FAD3，LPAT1,DGAT1，被上调BnLACS2转基因植物，并下调BnLACS2沉默植物(图。8)．

先前的研究表明，FAs的转运涉及两个过程，包括以酰基-ACP的形式从头合成塑料FAs，然后通过硫酯酶从ACP释放，随后通过LACS作用以酰基-辅酶a的形式从质体输出;因此，为ER中TAG的组装提供酰基供体[48，49，50］．因此，lacs介导质体中FA的从头合成和ER中脂质的生物合成[29，48］．酰基辅酶a酯除了在TAG合成中起重要作用外，还在植物的酰基链延长反应、β-氧化等脂质代谢中起着代谢中间体的作用[45］．一般认为外线粒体和过氧化物体膜上合成的酰基辅酶a用于氧化[28，51]，而那些在ER中合成的则扮演着合成的角色[27］．然而，酰基辅酶a在细胞内的分割仍不清楚。在这项研究中,BnLACS2以ER为靶点，这表明FAs通过质体运输并不需要LACS2。与此同时，测定了黄芪多糖的脂质和脂肪酸含量pep4对酵母突变体进行改良BnLACS2超表达;因此,建议BnLACS2有能力为TAG合成提供酰基辅酶a底物[52］．为了平衡细胞质和内质网中的酰基辅酶a库，我们推测一些酰基辅酶a酯在细胞质中释放CoA的同时被输出到内质网。然后，长链FAs被LACS重新激活形成酰基辅酶a酯，如BnLACS2;因此，促进了TAG在ER中的积累。然而，它只是一种可能的功能方式，通过它，过度表达BnLACS2导致酵母和油菜籽中脂质含量增加，需要进一步研究来证实这一推论。

在目前的研究中，BnLACS2的同义词拟南芥LACS2基因是决定四倍体种子含油量的重要因素。显著．BnLACS2与野生型相比，过表达提高了油菜籽含油量，而RNAi沉默降低了油菜籽含油量。此外，水平的改变Bn在转基因植物中，LACS2与糖酵解、FA和脂质合成途径的增强或减弱有关。这些结果表明BnLACS2基因是通过基因操作提高油菜籽油产量的一个潜在目标。根据我们的数据，我们推测BnLACS2水平可改变细胞不同部位的三种代谢途径，包括糖酵解、FA合成和脂质合成。然而，精确的分子机制是由BnLACS2影响这些生理过程基因表达的因素有待进一步研究。

植物材料及生长状况

植物的显著(中双9号)由中国农业科学院油料作物研究所获得，在江苏大学镇江试验田种植。为了进行组织特异性表达分析，将油菜籽的根、茎、叶、花和发育中的种子收集并保存在−70°C。低(EM91)和高(EM102)油菜籽系均来自南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室。在25、35、45和50 DAP采集种子组织。烟草benthamiana在植物生长室内生长5-6周，光照时间16 h/d，调节温度的白夜周期为22/20℃。

序列的分析BnLACS2

的全长编码区域BnLACS2利用?的蛋白质序列获得AtLACS2(NP_175368)搜索芸苔属植物基因组序列数据库(http://www.genoscope.cns.fr/blat-server/cgi-bin/colza/webBlat)．利用ExPASy数据库中的ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)．利用国家生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov的ScanProsite结果查看器(http://us.expasy.org/prosite/)．利用NCBI和blast方法从非冗余蛋白序列数据库中检索植物LACS的氨基酸序列芸苔属植物基因组序列数据库。利用ClustalW程序对LACS同源氨基酸序列进行多重比对分析[53］．系统发育分析采用MEGA 5.0软件中的Neighbor-joining算法[54］．

亚细胞定位BnLACS2

使用Trizol RNA制备试剂盒(美国Invitrogen公司)从中爽9号发育中的种子中提取总RNA，按照制造商的操作规程。以1-2 μg总RNA为模板，oligo (dT)为引物，逆转录酶(Fermentas)为引物，合成第一链cDNA。基因的cDNABnLACS2引物5 ' - atgtacacaagcgggacgaac -3 '和5 ' -ACGCCAGTATCCAACAGAGG-3 '通过PCR扩增该基因，并克隆到pMD18 T质粒中。观察其亚细胞定位BnLACS2，平动融合BnLACS2-pK7FWG2.0和CRT3-pCX-DR构建并转化为根癌土壤杆菌使用Karimi等人描述的冻融法提取GV3101菌株。[55］．瞬时表达的亚细胞分布35 s: BnLACS2-GFP而且35 s: DsRed-CRT3在n benthamiana使用徕卡TCS扫描共聚焦显微镜观察，如前所述[56，57］．

酵母转化和互补

基因的cDNABnLACS2用引物F: 5′-ggtaccATGGCTGCAGCTGCTGATCATG-3′和R: 5′-ggatccCTAGCTCTGGACGCCTTTGCTTC-3′扩增基因，插入到多个克隆位点(Kpn I / BamH我)来生成pYES2-BnLACS2向量。重组质粒pYES2-BnLACS2， pYES2空载体通过尿嘧啶auxotrophy导入YB525酵母菌株[13，58］．利用合成Dropout Medium-Uracil (SC/ura)筛选阳性重组克隆⁻)板中添加0.67% (w/v)缺乏氨基酸的酵母氮碱，0.077% (w/v)尿嘧啶默认混合物，2% (w/v)葡萄糖。随机选取单个菌落，在SC/ura-液体培养基中培养至对数生长期。收集细胞，在3 - 5ml SC/ura中孵育⁻2%半乳糖液体培养基4小时。将细胞浓度调整至均匀后，将30 μL培养物移至3 ml SC/ura上⁻以2%半乳糖+ 98 μM不同FAs为唯一碳源，分别为:12:0月桂酸、14:0肉豆花酸、16:0软脂酸、18:0硬脂酸、18:1油酸和22:1芥酸溶解在0.1%的Triton X-100中。培养物在30℃下培养84 h。利用分光光度计根据600 nm处的吸光度估算酵母细胞的生长。

酵母中脂质和FAs的分析pep4

重组载体pYES2-BnLACS2,pYES2对照转化为pep4，一个蛋白酶缺失的突变株。阳性酵母单克隆的筛选及诱导BnLACS2蛋白与上述方法一致。酵母细胞浓度根据600 nm处的光密度调整为相同浓度。如Thakur等人所述[59]，取等量的酵母悬液离心收集细胞，0.3%苏丹黑B染色检测中性脂质含量。采用Bligh和Dyer所述的氯仿和甲醇法从酵母细胞中提取脂质[60］．采用20 × 20 cm硅胶60F254铝板(Merck, Germany)进行二维薄层色谱(2D-TLC)。第一维溶剂为氯仿/甲醇/水(65:30:2.5,v/v)，第二维溶剂为氯仿/甲醇/醋酸/水(80:12:15:4,v/v)。按照Guan等人的描述，用显色试剂染色检测极性脂质[61］．

FAs按照Brandenburg等人的方法进行甲基化[62］．GC-MS分析前，在提取的脂质样品中加入10 μl甲基十七烷酸(10 μg/μl, Sigma-Aldrich, USA)作为内标。采用配备30 m × 0.25 mm BPX 70熔硅毛细管柱的GC-MS测定FA轮廓(SGE, Austin, TX, USA)，如前所述[63］．根据不同的保留时间对不同种类的FA进行鉴定后，用内标法对FA进行定量。

蛋白质组学分析pep4转化的酵母菌株BnLACS2基因

pYES2-诱导后BnLACS2和pYES2载体，提取总蛋白pep4如Isola等人所述，使用基于Tris缓冲的方案。[64］．蛋白质浓度是用Bradford法测定的[65］．按照Ding等人的描述进行2-DE。[66，只做了一些小改动。蛋白样品在17 cm pH值3-10的线性凝胶条(Bio-Rad)中分离。等电聚焦程序分别设置为250、500和2000 V, 1小时，然后设置为8000 V, 5.6万Vh。平衡后进行二次元十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用考马斯亮蓝R-250(0.1%)染色显示凝胶，并使用SanMaker 9700XL仪器(Bio-Rad)扫描。使用PDQuest软件(Bio-Rad)进行图像分析和凝胶内消解，如Ding等人所述[67］．

统计上有显著变化的点(学生的t以及,P< 0.05)高于2倍阈值时，选择使用UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF仪器(Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA)进行质谱分析。在正离子反射模式下获取大量数据。在NCBI非冗余(nr)数据库中，使用吉祥物软件(http://www.matrixscience.com)．检索参数为:分类、菌类;胰蛋白酶;一个遗漏乳沟是允许的;固定的修改,carbamidoethyl;dioxidation变量修改;肽耐受性，±0.2 Da;肽电荷是1+。蛋白质评分> 65被认为是显著的(P< 0.05)。

转基因油菜籽一代

为了生成CaMV 35s驱动的结构，全长编码区域BnLACS2使用引物5 ' -ggtaccATGGCTGCACTGCTGATCATG-3 '和5 ' -ggatccCTAGCTCTGGACGCCTTTGCTTC-3 '扩增。产生的碎片被消化BamH我而且Kpn我，然后插入到pCAMBIA1300-35S-Nos载体的相同位点。构建BnLACS2-RNAi质粒，部分片段BnLACS2使用2对引物进行扩增:5 ' -ctcgagCAGCTATTTAGTGAGGCTGTGAA-3 '， 5 ' -ggtaccGGAAGTGTCTTATCCGAGT-3 '和5 ' -tctagaCAGCTATTTAGTGAGGCTGTGAA-3 '， 5 ' -ggatccGGAAGTGCTGTCTTATCCGAGT-3 '。产生的碎片被消化Xho我，Kpn我而且Xba我，BamH我分别插入pKANNIBAL载体的相同位点。重组质粒经酶切不是我片段被插入pART27。所有质粒均经酶切和DNA测序验证。

的BnLACS2oe和BnLACS2-RNAi结构被引入农菌株GV3101，然后用于转化。用花浸法对油菜植株进行转化[68］．从转化植株上收获种子，并筛选假定的转化人。积极的BnLACS2首先在含湿霉素(100 μg/mL)或卡那霉素(50 μg/mL)的培养基上筛选-OE或-RNAi转基因植株，然后使用附加文件中提供的引物进行PCR和RT-PCR5:表S2)。

转基因油菜含油量及FAs的测定

采用近红外光谱(NIRS)和核磁共振(NMR)测定种子含油量，如Bellincontro等人所述[69］．中爽9和独立T₂收集同一生育期的转基因株系，测定3个重复的含油量。采用气相色谱-质谱法测定FA含量，如上所述。

实时荧光定量PCR分析

Wang等人使用SYBR®PremixExTaq™II (TaKaRa, Japan)对第一链cDNA进行qRT-PCR。[70］．优化qRT-PCR条件后，标准曲线扩增效率在90%以上，Ct值范围为20.9 ~ 29.3，所有熔体曲线均为单个特定峰。将目的基因的相对表达量归一化为的表达数据BnACTIN2使用2^{——∆∆CT}方法(71］．所有qrt - pcr均在3个重复中进行。用于qRT-PCR分析的引物列在附加文件中6:表S3。

在当前研究中使用和/或分析的数据集可以根据合理的要求从相应的作者获得。

ACC1：

乙酰辅酶a羧化酶1

CRT:

Calreticulin

DGAT1：

二酰基甘油酰基转移酶1

伊诺：

烯醇酶

呃:

内质网

FAD3：

脂肪酸去饱和酶3

FAE1：

脂肪酸ELONGATION1

FAs:

脂肪酸

G3P:

glycerol-3-phosphate

KASII：

-酮酰-[酰基载体蛋白](ACP)合成酶

LACSs:

长链酰基辅酶A合成酶

LPAT1：

lysophosphatidyl酰基转移酶1

PFK：

phosphofructo激酶

PGK：

磷酸甘油酸酯激酶

PYK：

丙酮酸激酶

标签:

甘油三酯

感谢陕西省杂交油菜研究中心陈文杰进行了气相色谱-质谱分析。我们感谢约克大学生物系新型农产品中心(CNAP)的伊恩·格雷厄姆和托尼·拉尔森对实验设计的宝贵建议。

国家重点研发计划项目(2016YFD0101900、2016YFD0100305)和国家自然科学基金项目(31471527、31271760)资助。资助机构没有在本研究和相关数据的设计、分析或解释中发挥任何作用。

作者指出

1. 丁丽娜和古寿来对这项工作做出了同等的贡献。

从属关系

1. 江苏大学生命科学研究所，镇江，中国

   丁丽娜，顾守来，朱福阁，马中燕，李娟，李明，王铮，谭晓丽

贡献

X-LT构思和设计研究。S-LG、F-GZ - Z-YM和L-ND进行了实验。J-L、M-L和ZW贡献了新的试剂或分析工具。L-ND和S-LG分析数据。L-ND和X-LT撰写了手稿。所有作者阅读并批准稿件。

相应的作者

对应到小李谭．

伦理认可和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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