木薯GRAS基因家族成员的全基因组鉴定与表达

背景

木薯对压力条件高度耐受，特别是干旱胁迫条件;然而，这种耐受性的机制被理解得很差。GRAS基因家族是一个大型的转录因子，参与调节植物的生长，发育和应力反应。目前，在木薯尚未系统地研究了GRAS转录因子，这是世界上第六个最重要的作物。

结果

七十七年MeGRAS从木薯基因组数据库中鉴定了基因。系统发育分析表明，MeGRAS蛋白可分为14个亚家族。蛋白质的基因结构和基序组成在同一亚家族内相当保守。复制事件，特别是分段重复，被确定为主要驱动力肝木薯基因扩增。整体表达分析表明MeGRAS不同品种的基因在不同组织中表现出相似或不同的表达谱。通过qRT-PCR分析，揭示了其表达模式MeGRAS响应非生物胁迫(干旱、盐、冷和H₂O.₂)，结果表明这些基因可能具有多种功能。

结论

本研究首次提供了关于木薯GRAS基因家族成员的全面信息。这些数据将增加我们对其分子基础和影响的理解肝基因。此外，这些结果将有助于进一步确定对各种环境条件的响应，并提供对潜在功能的见解肝基因。

木薯（Manihot Esculenta.Crantz）是非洲，亚洲，拉丁美洲和加勒比地区的第六最重要的现金和食品作物。木薯为其淀粉根培养，用于食品和许多产品。由于其固有的容忍对压力环境和所需的最小护理，木薯经常被认为是针对饥荒的粮食安全来源，其中其他食物作物物种将失败。在最佳环境条件下，木薯的能量产生大于大多数其他主要主食作物物种的产量[1]．

随着下一代测序技术的到来，大量的基因组、转录组、蛋白质组和代谢组数据产生，为代谢工程的发展提供了巨大的机遇[2那3.那4.那5.那6.那7.那8.那9.那10.]．最近可用的木薯的高质量基因组序列，这极大地增加了木薯生物过程和分子/细胞机制的理解[2那3.]．

转录因子在高等植物的多种生理过程中起着调节作用。转录因子作为基因调控的开关;促进或抑制特定基因的功能性表达;参与维持植物的生长、发育和胁迫反应[11.那12.]．术语“GRAS”衍生自该家族中鉴定的前三个转录因子：甘油酸不敏感（GAI），GAI（RGA）的阻遏物和稻草人（SCR）[13.]．通常，GRAS蛋白具有某些c端同源性，但在其n端出现序列和长度多样化[13.]．亮氨酸七肽重复（LHR）I，VHIID，LHR II，PFYRE和SAW主题是保存的，这有利于C末端区域内蛋白质的功能[13.那14.]．VHIID的结构以及其两个侧翼区域（LHRS和LER II）对于蛋白质 - 蛋白质相互作用是重要的。PFYRE和SAW主题中的突变导致了不同的表型异常拟南芥[15.那16.那17.]．GRAS蛋白的n端是多样的;然而，DELLA和TVHYNP基序在n端DELLA亚家族中是保守的。

肝最近在各种植物物种中进行了基因，即，拟南芥[18.]， 白饭 [18.]、大白菜[19.]，杨树[20.]，李春万[21),烟草(22]，蓖麻[23],葡萄藤[24]，Medicago Truncatula.[25那26]，玉米[27]，Malus Domestica.[28]， 胡椒 [29]和茶厂[30.]．根据以前的研究拟南芥和米[18.， GRAS家族成员可分为8个亚家族:DELLA、HAM、LAS、PAT1、SCR、SHR、SCL3和lisl亚家族。然而，在其他植物中，亚科的数量从8到16个不等。GRAS蛋白在植物生长发育的各个生理过程中发挥作用。考虑到各亚科之间氨基酸(aa)序列的高度差异，每个亚科可能具有不同的功能。例如，DELLA成员主要作为赤霉素(GA)信号的抑制因子[15.那16.那31那32那33]．这多毛的分生组织HAM亚家族的基因通过调节来自分化细胞的信号来控制芽分生组织的维持[34]．三个基因（MOC1那LS， 和拉斯）从Las亚家族中发挥重要作用，在腋生分生启动中[35那36那37]．三拟南芥基因（PAT1那SCL5.， 和SCL21.)是光敏色素- a信号转导的正调控因子[38那39]， 然而SCL13来自同一亚家族的主要参与光敏色素b信号转导[40]．SCR和SHR形成一个SCR/SHR复合体，在根、茎径向组织中起重要作用[41那42那43]．SCL3作用于GA/DELLA和SCR/SHR通路的下游并控制根发育过程中的GA稳态[44]．而且，这是LISCL来自Liscl亚家族的基因参与了花药的微孢子发生器[45]．

直到最近，木薯的GRAS基因家族尚未表征。因此，在本研究中，从先前的木薯基因组数据库中鉴定了GRAS基因系列的成员。构建了系统发育树，进行了交往的基序和基因外显子/内含子结构分析，MeGRAS基因被定位到木薯染色体上，然后CIS.元素的MeGRAS分析了Megras蛋白的基因和相互作用网络。另外，表达模式MeGRAS通过可用的转录组数据调查不同的木薯品种和不同组织之间的基因，并通过在木薯中通过QRT-PCR研究了响应各种非生物应激的表达模式。这项研究是第一个提供有关木薯的证据的研究肝基因家族，这可能有助于阐明Cassava中应力反应的分子机制。

识别的肝木薯的基因家族成员

共77个非冗余MeGRAS基因被证实并用于后续分析(附加文件1:表S1)。除MeGRAS4的GRAS结构域被15个aas序列分成两部分外，所有的MeGRAS蛋白都包含一个完整的GRAS结构域(PF03514)。其中3个MeGRAS成员(MeGRAS12、72和73)具有一个DELLA结构域(PF12041)，因此被认为是DELLA蛋白(附加文件)1:表S2)。对蛋白性质和亚细胞定位进行了分析，结果汇总在附加文件中1:表S3。MeGRAS蛋白的长度和分子量变化较大，长度范围为230 ~ 829 aas，分子量范围为26.08 ~ 89.79 kDa。平均理论等电点(pI)为5.7，表明大多数MeGRAS蛋白呈弱酸性。除8个MeGRAS蛋白(MeGRAS11、19、31、34、55、63、71、74)均为稳定蛋白外，其余均为不稳定蛋白。大多数MeGRAS蛋白含有较高比例的脂肪族砷，预测脂肪族指数为68.16 ~ 99.77。由于它们的平均亲水性(肉汁)值相对较低(< 0)，所有MeGRASs都是亲水性的。预测67.53%的MeGRAS蛋白定位于细胞核。除GRAS21蛋白外，MeGRAS蛋白中没有跨膜螺旋，其中包含一个从细胞膜内到细胞膜外的螺旋。二级结构预测结果表明，α螺旋和随机螺旋在所有MeGRAS aa序列中占主导地位，其次是扩展链和β螺旋，平均发病率分别为44.90、40.73、10.11和4.26%1：表S4）。

MeGRAS家族的系统发育分析

揭开木薯血脂基因家族的进化关系，并帮助他们分类，共有211克蛋白，包含来自木薯，33的77拟南芥，50来自米饭，13来自蓖麻，13杨树其中13个来自番茄，12个来自茶树1:表S5) [18.那20.那23那29那48[是否通过MEGA-X来制备由最大似然（ML）方法构建大型的系统发育树（图。1）.鉴定了14个亚属，包括在Pat1，Liscl，Pt20，火腿，SCR，SCL3中的15,11,9,9,8,2,2,2和1 megras构件中的15,11,9,9,3,2,2,2,2和1 megras构件，分别的Della，SCR，DTL，OS4，LAS，SCL4 / 7，OS19和OS43 Subfamilies（图。1， 图。2一个)。

MeGRAS家族成员的Motif组成和基因结构

为了进一步调查木薯草的结构特征，分析了蛋白质保守的主题和基因内含子/外显子分布。通过MEME鉴定了总共20个保守的图案（称为泳学1-20）（http://meme-suite.org/tools/meme)，位于c端区域的基序比位于n端区域的基序多(图3)。2b）;这些蛋白质图案的特征在附加文件中列出1：表S6。来自同一基本家族的图案显示几乎相似的模式。例如，SCL3的成员具有相同的主题。这一发现提供了额外的证据，以支持Megras成员在同一亚家族中的近容进化关系。主题与相应的GRAS结构域匹配。图案1和2在N末端区域内的LHRI结构域，其次是VHIID结构域中的图案3,4和5;LHRII结构域的图案6和7;PFYRE域中的图案8,9和10;在C末端区域内的SAW结构域中的图案12和13（图。2b).基因结构多样性是基因家族进化的重要组成部分，进一步支持系统发育分类[46]．在本研究中，内含子的数量从1个到3个不等。2C）。在77中MeGRAS36个有内含子，34个只有一个内含子，41个没有内含子。一般来说,MeGRAS系统发育树中同一亚家族的基因具有相似的外显子-内含子结构。LAS、DELLA和Os4亚家族没有内含子，SCL4/7、Os43和PAT1亚家族分别有1、2和0-3个内含子。其他亚家族有0-1个内含子。

染色体定位和基因重复分析MeGRAS基因

所有的MeGRAS基因在木薯染色体上的分布不均匀MeGRAS77(无花果。3.）.没有MeGRAS成员映射到Chr16。铬含量最多MeGRAS基因（N= 16;21.05%)，其次为Chr1 (N= 8;10.53%)，然后是Chr3和Chr15，每个都有7个成员。此外,六MeGRAS将基因分布在CHR13上，并在CHR8上分布五个基因。四MeGRAS在Chr11和Chr12上都发现了3个基因MeGRAS基因分别分布在Chr5、Chr9、Chr14和Chr18上，还有两个MeGRAS基因同时位于Chr4和Chr10上。只有一个肝基因分布在Chr6、Chr7和Chr17上。值得注意的是,许多MeGRAS基因集中在染色体的两端。

基因复制在新型功能和基因家族扩张的发生中起重要作用;因此，复制事件MeGRAS对木薯基因组中的基因进行了分析。如图所示。3.和4.，两组串联重复基因（MEGRAS14 / 15/16和Megras22 / 23.)位于Chr2上，而另外两组串联复制基因(MeGRAS29/30/31和MeGRAS68/69/70/71)分别位于Chr3和Chr15上。另外，34对MeGRAS基因被鉴定为节段复制(图。3.）.

分析CIS.-Elements在MeGRAS启动子

这CIS.的启动子区域(翻译起始位点上游1.5 kb)扫描-元素MeGRAS为了更好地理解潜在的调控机制MeGRAS基因(图。4.）.这些CIS.-元件可分为四组:1)光响应元件;2)与防御和应激有关，如干旱、低温、伤害和缺氧;3)与植物激素反应有关，如ABA、MeJA、GA、生长素、水杨酸和乙烯;4)参与时间和空间基因表达，如分生组织、胚乳和种子。确定的主题表明MeGRAS可能被各种各样的管制CIS.-元素在生长过程中。

木薯蛋白的互动网络

为了了解Megras蛋白的相互作用进一步，通过串软件基于原始工程来构建交互网络拟南芥．具有最高比特评分的蛋白质被认为是串蛋白，并且由于考虑可靠性而仅选择46兆瓦蛋白质（图。5.）.通常，SCL3亚家族（Megras8和18）的Megras蛋白（Megras8和18）和Liscl Subfamily（Megras14,38和40）的相互作用伴侣比其他亚属的成员更多。这些发现与考虑到ATSCl3蛋白质的调节，与ATSCl3蛋白的调节一致，这与其他信号传导途径相结合;但是，这种关系需要确认[47]．这些相互作用网络可以提供了解理解未知蛋白质的功能的重要线索。

表达分析MeGRAS不同组织中的基因

累积证据证实，草在植物生长和发展中发挥着重要作用。了解的功能MeGRAS木薯基因更好，成绩单水平MeGRAS通过公开的转录组数据，研究了栽培品种Arg7和KU50以及野生亚种W14的叶、茎、早贮藏根、中贮藏根和晚贮藏根等不同组织中的基因[2]．每百万次映射读取（FPKM）值的每千碱基碎片MeGRAS基因列在附加文件1:表S7，生成分层聚类的热图，显示的表达谱MeGRAS基因(图。6.）.

十二的表情MeGRAS基因（MeGRAS21那22那23那24那28那29那30.那41那51那55那61， 和74)在分析的任何组织中均未检测到，这可能是由于空间和时间表达模式的差异。在77个品种中，有63个表达MeGRAS在至少一种组织中检测到基因，其中26,28,34,30和26个基因在叶，茎，早期储存根，中储根和后根储存中呈现高转录物丰度（FPKM> 5）组织分别。关于KU50品种，表达58中的77分MeGRAS在至少一种组织中检测到基因，其中26,31,29和30个基因分别在叶片，早储存根，中间储存根和后储管根组织中呈现高转录物丰度（FPKM> 5）．关于W14品种，表达61分：77分MeGRAS其中，在叶片、茎和中间贮藏根组织中分别有28、33和31个基因表达高转录本丰度(FPKM > 5)。总的来说，除了MeGRAS25和MeGRAS64在Arg7的叶和茎组织中，表达量分别为15MeGRAS基因（MeGRAS37那72那75那12.那73那25那4.那44那7.那64那62那20.那15.那26， 和3.(PAT1、DELLA、liiscl、HAM和SCL4/7)的基因在三个品种的所有组织中都很高(FPKM > 5)，表明这些基因在组织发育中起关键作用。

最多MeGRAS基因在Arg7，Ku50和W14的同一组织中表现出类似的表达曲线，表明最多MeGRAS在三种基因型中，基因在组织发育中起着相似的作用。然而，一些基因表现出不同的表达谱。例如,MeGRAS33转录性丰度在W14的中间储存根中高（FPKM> 5），但在ARG7和KU50的中间储存根中低。相比之下，梅格拉斯42.ar7和KU50中贮藏根转录本丰度较高(FPKM > 5)， W14中贮藏根转录本丰度较低。这一现象也在其他组织中检测到。这些发现表明这些基因在不同基因型的组织发育中具有不同的作用。

回复MeGRAS不同的非生物治疗的基因

来测量MeGRAS不同非生物胁迫(干旱、盐、冷和H₂O.₂)，不同木薯品种(D346、NZ199和GR891)， 15MeGRAS对不同亚家族的基因进行qRT-PCR。

在干旱治疗（图。7.)，大多数的表达MeGRAS基因在三种木薯品种中诱导。五个表达MeGRAS基因（MeGRAS1那3.那11.那17.， 和51）在24小时达到峰值，在三种木薯品种的3℃下达到峰值。表达七MeGRAS基因（MeGRAS2那4.那12.那32那41那53， 和63)在D346中先升高后降低，NZ199和GR891有相对一致的趋势，但峰值不同。这七个的表达MeGRAS基因在GR891中高度诱导。的表达MeGRAS27在D346和NZ199中明显上调，在GR891中明显下调，而MeGRAS37D346和GR891明显升高，NZ199则降低。的表达式MeGRAS1和MeGRAS27在干旱处理下，NZ199高于D346和GR891。

在盐处理下（图。8.)，大多数的表达MeGRAS3种木薯品种的基因均先增加后减少。四的表达式MeGRAS基因（MeGRAS2那11.那22， 和32)在6 h达到峰值，但在3 d后下降。其他四个的表情MeGRAS基因（MeGRAS1那3.那17.， 和51）在D346和NZ199中以6小时达到峰值，而在GR891的2小时内达到峰值。表达三个MeGRAS基因（梅格拉斯12.那41， 和63)MeGRAS基因（MeGRAS27那37， 和41）在GR891中倾向于增加。五个表达MeGRAS基因（MeGRAS32那12.那2那22， 和63)在盐处理下，GR891的表达量显著增加，其中两种表达量显著增加MeGRAS基因（梅格拉斯17.和1)在NZ199中也是高度诱导的。

在冷处理下(图。9.)，表示“八”MeGRAS基因（MeGRAS2那3.那11.那17.那27那37那51， 和53）首先增加，但随后在D346和NZ199中减少，分别在6小时和2小时达到峰值。五个表达MeGRAS基因（MeGRAS1那3.那4.那17.， 和53）首先减少但随后在GR891中增加，达到2小时的最低点，表达四个MeGRAS基因（MeGRAS2那22那41， 和51)在GR891中表达上调。梅格拉斯12.是GR891中最高诱导的基因，MeGRAS32在冷治疗下在NZ199中诱导。

在H₂O.₂治疗(图。10.)，表示“九”MeGRAS基因（MeGRAS1那2那3.那4.那11.那27那32那41， 和63）在D346上市，九个MeGRAS基因（MeGRAS1那2那3.那11.那17.那32那51那53， 和63)在GR891中表达上调。表达九MeGRAS基因（MeGRAS2那3.那4.那12.那22那32那37那53， 和63)表现为先升高后降低;其中五个基因的表达(MeGRAS4那12.那32那37， 和63）在2小时迅速达到峰值，另外四个的表达MeGRAS基因（MeGRAS2那3.那22， 和53）在6小时达到尖峰。表达七MeGRAS基因首次增加，但在GR891中减少;其中两个的表达（MeGRAS2和37)在2 h时迅速达到峰值，而其他3种(MeGRAS4那22， 和27）在6小时达到尖峰。五个表达MeGRAS基因（梅格拉斯17.32那22那1， 和17.)是高度诱导的NZ199, 4MeGRAS基因（梅格拉斯12.那41那63， 和53)在GR891中高度诱导。最后，the的表达MeGRAS32和51基因在H下的D346中高度诱导₂O.₂治疗。

GRAS转录因子在调控植物的生长发育和胁迫反应中发挥着重要作用。然而，目前还没有对木薯GRAS家族成员的患病率和功能多样性进行全面的调查。在本研究中肝彻底分析了木薯的基因家族。我们探讨了MeGRAS基因，包括它们的系统发育分类，基因结构，染色体分布，CIS.-元素、表达轮廓和对各种应力的反应。这些结果使我们能够研究GRAS家族的进化，并推测未知基因的潜在功能。

在本研究中，共77岁肝在木薯中鉴定基因。这个数字低于那个Malus Domestica.(127) (28]，杨树（106）[20.]和玉米（86）[27)，但比那还要高拟南芥（34）[20.]，米（60）[20.]，大白菜（48）[19.]，李春万（46）[21]、烟草(53)[22]，蓖麻(48)[23]，葡萄（52）[24]，Medicago Truncatula.（68）[25那26]，胡椒(50)[29]和茶厂（52）[30.]．这个变化肝基因数量可能与基因复制事件或基因组大小有关[24]．四组串联复制MeGRAS基因和34对节段重复MeGRAS基因在本研究中被检测。似乎节段复制比串联复制对木薯GRAS扩展的贡献更大。这MeGRAS基因位于几乎所有染色体上，除了CHR16，并且在CHR2（16个成员）上的“热区域”分布不均匀。与其他物种中发生的那一致一致Medicago Truncatula.[25]， 番茄 [48]，拟南芥，米饭和杨树[20.),最肝木薯的基因缺乏内含子（53.2％）或仅具有单一内含子（44.2％）。GRAS基因家族中的内部内基因的高比例暗示了GRAS成员的密切进化关系。在其他大型基因家族中也发现了内部基因，例如死箱RNA Helicase [49和F-box转录因子家族[50]．尽管无内含子基因是原核基因组的典型特征，但一项研究[51]显示植物肝基因在原核生物基因组中主要通过水平基因转移和复制事件产生。这一现象可以解释大量无内含子的形成肝基因。

根据其序列同源性和分类，将77个MeGRAS蛋白分为14个亚家族拟南芥和米[20.]．值得注意的是，一些克拉斯蛋白被认为是以前出版物的特异性特异性的蛋白质在木薯中具有同源物。例如，九个木薯MeGRAS基因（MeGRAS22那23那27那28那29那30.那31那34， 和66),与Ptgras20.（属于“PT20”Subfamilly）和rcgras27.（29,889.m003282;属于“RC_GRAS”亚家族），其先前被认为是特定的亚家族[20.那23]．他们也被番茄聚集了slgras22.，它与Pepper特定的“CA_GRAS”亚家族聚集了[29]．综上所述，所有来自“Pt20”、“Rc_GRAS”和“Ca_GRAS”亚家族的GRAS基因均来自于同一个亚家族。三个(MeGRAS57那63， 和65),两个(MeGRAS21和76一个（Megras51Cassava.肝基因，分别聚为“Os4”、“Os19”和“Os43”亚家族，此前报道为水稻特异蛋白亚家族[20.]．这四个亚家族不包括任何一个拟南芥基因，暗示谱系特异性基因损失拟南芥．在进化过程中，其他植物物种可能已经失去了这些物种特异性肝基因。另一种可能是它们在进化过程中变得非常专门化。对木薯蛋白保守基序的分析进一步证实了MeGRAS家族的分类。在GRAS区域内发现了保守的基序，可能具有重要的功能。虽然所有这些MeGRAS蛋白的保守基序相似，但其物理化学特征也存在一些差异，这些差异也存在于MeGRAS成员之间。这些差异可能是由于非保守MeGRAS成员区域内的aa差异，表明MeGRAS蛋白在其微环境中的功能不同[48]．

对具有远亲和性的不同品种(野生亚种和栽培品种)的不同组织的表达谱进行了广泛的分析MeGRAS基因。RPKM数据显示没有12的表达MeGRAS5个亚家族(HAM、SHR、Os19、Os43和Pt20)基因在任何组织中均有高表达，但15个亚家族中有高表达MeGRASpa1、DELLA、liiscl、HAM和SCL4/7 5个亚家族基因(FPKM > 5)。这些组织之间的表达模式存在差异，如之前在大白菜中所示[19.]，李春万[21，胡椒[29]．从高表达水平推断出重要的角色MeGRAS基因。例如，梅格拉斯73.那72年,和12.对于各种信号集线器的控制来说是非常重要的。此外,7MeGRAS基因（梅格拉斯75.那64那44那37那26那25和20.）来自Pat1亚家族以各种各样的组织表示;这些基因可能通过植物信号传导调节系统参与各种发育过程，就像这种情况一样拟南芥[13.那40]．总之，这些结果表明肝基因可能经历了亚官能化或新功能化。

有害的环境条件会对木薯的生长和发展造成重大损害。肝基因可能在植物对非生物胁迫的反应中发挥关键作用[23那25那30.那48]．一种肝基因杨树那PeSCL7，被认为有利于工程盐和耐旱树木[52]，而过度表达芸苔属植物显著BnLAS基因拟南芥增加耐旱能力[53]．DELLA蛋白与许多非生物胁迫反应有关，如一氧化氮、寒冷和磷酸盐饥饿[54那55那56]．在本研究中，表达分析表明，木薯中大多数GRAS基因的表达受到各种应激处理（干旱，盐，冷，氧化胁迫）的影响，提示MeGRAS基因在应对非生物胁迫中起着至关重要的作用。品种D346、NZ199和GR891之间存在一定的表达趋势差异。例如，在H下₂O.₂治疗，表达MeGRAS4NZ199和GR891先升高后降低，在2 h和6 h达到峰值;另一方面，表达MeGRAS4在D346增加，但在24小时内没有达到峰值。这些不同的趋势MeGRAS基因表达可能与三个品种对非生物胁迫的不同反应有关。

这项综合研究为进一步调查提供了基础肝木薯的基因也可能对木薯以及其他相关物种具有潜在价值。

鉴定肝基因在木薯

Cassava的基因组注释的最新版本（Manihot Esculenta.V6.1）从植物血统v12数据库下载（https://phytozome.jgi.doe.gov/）.使用HMMER 3.0扫描注释蛋白数据库(http://hmmer.org/)和GRAS域隐马尔可夫模型(HMM) (PFD03514)，从Pfam (http://pfam.xfam.org/）.基于通过GRAS HMM获得的蛋白质，对高质量的蛋白质组进行比对(e值<1e^{- 20.})，并使用HMMER 3.0中的hmmbuild构建木薯专用的GRAS HMM。利用该新型木薯特异性HMM筛选e值低于1e的所有蛋白质⁻⁵．此外，通过默认参数，所有OsGRAS和AtGRAS蛋白被用作查询来探索木薯数据库。利用Pfam数据库和CDD数据库，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，只有全长GRAS结构域的序列被选择为MeGRAS蛋白，用于后续分析。

ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/)用于预测MeGRAS蛋白的理化特性。为了验证所鉴定的MeGRAS蛋白的亚细胞定位，使用WoLF PSORT对蛋白序列进行预测(https://wolfpsort.hgc.jp/）.tmhmm server v2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）用于预测蛋白质中的跨膜螺旋。

系统发育分析肝基因

本研究研究了木薯的GRAS蛋白，拟南芥，大米，蓖麻，杨树、番茄和茶树。拟南芥和大米是研究遗传相关性的最常用的模型植物物种。一肝从蓖麻的每个亚科中选择基因，杨树，番茄和茶树的一个更好的分类MeGRAS基因。附加文件1：表S5列出了GRAS成员的基因ID。通过使用Mega-X的最大似然方法构建一个大型的系统发育树，使用Mega-X重复（https://www.megasoftware.net/）.“木薯GRAS”成员进一步根据其他物种已确立的分类方法，分为不同的子类[18.那20.那23那29那48]．

蛋白质保守基序与基因结构分析

利用模因程序识别保守的基序。搜索还涉及到默认参数，除了最大的主题数量，它被设置为20。通过基因结构显示服务器(GSDS) 2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)项目。

染色体定位和基因重复分析

每一个肝基因与木薯的基因组注释与木薯的染色体相匹配。MapGene2Chromosome（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)用来绘制地图。基因复制被探索MeGRAS根据玉米中描述的方法的基因[27];该方法包括1)对整个被覆盖蛋白长度进行比对(>是最长基因的80%)，2)对比对区域进行80%的同源性，3)对紧密连锁基因只计数一次重复事件。如果有5个或少于5个由两个同源基因分开的基因，它们就被标记为串联复制。然而，当有超过5个基因分开这两个基因或有分布在不同的染色体，他们被称为节段复制。

启动子CIS.-Elements分析

1.5 kB上游用于CIS.- 在候选人的推动者中MeGRAS基因。PlantCARE软件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）用于搜索监管要素。

MeGRAS蛋白-蛋白相互作用网络的预测

为了进一步说明MeGRASs之间的相关性，我们用对话拟南芥用于预测蛋白质相互作用网络。使用STRING软件构建蛋白质功能相互作用网络，置信度为0.15 [57]．

表达分析MeGRAS不同组织中的基因

利用在线可获得的转录组数据来探索表达谱MeGRAS不同木薯品种不同组织中的基因[2)(附加文件1:表S8列出了登录号)。以野生亚种(W14)和栽培品种(KU50和Arg7)的叶、茎、贮藏后期根、贮藏中期根和贮藏早期根为材料，研究其表达谱MeGRAS基因。随后计算RPKM值以评估基因表达。

木薯植物制备和压力处理

所有研究的植物都是在2018年4月至7月期间从广西大学(中国南宁)的温室中获得的。将木薯茎段移植到单个花盆中。然后定期给植物浇水。对抗逆性不同的3个木薯品种(D346、NZ199和GR891)的3月龄植株进行不同的非生物胁迫处理，其中20%聚乙二醇(PEG) 6000处理2、6、24 h和3 d;300 mM NaCl处理2,6,24 h;冷(4°C) 2、6和24小时;和10% H₂O.₂持续2、6和24小时。每个样本包括三个独立的生物学复制。

RNA分离及qRT-PCR表达分析

RNA提取套件（华为阳，中国）用于在每次治疗后从叶片中提取mRNA。CDNA通过CDNA合成试剂盒（Takara，Japan）用于1μg总mRNA的逆转录。Primer 5.0用于设计所用的引物（附加文件1:表S9)。归一化,MeActin使用基因，用作内源性对照。PCR的反应机理含有0.5μL引物，1μL模板cDNA和5μL的2x········SYBR QPCR主混合物（中国vazyme）。之后，DDH.₂加入o以达到10μl的最终体积。该方案如下：30 s，30s，30℃，95℃的40℃，55℃，10 s，72℃，20 s。每次反应三次，2^-ΔΔct方法 [58用来计算相对基因表达水平。

总之，77肝基因组织基因组的基因家族成员在系统发育关系的基础上表征并分为14个亚属。蛋白质的基因结构和基序组合物在同一亚组内显着保守。复制事件，特别是分段重复，被确定为主要驱动力肝木薯基因扩增。整体表达分析表明，该基因的表达谱MeGRAS基因在不同品种的不同组织中类似或不同。表达模式MeGRAS响应非生物胁迫的基因提示这些基因可能具有多种功能。总的来说，我们的研究是第一次全面的表征肝木薯基因。这些数据提供了阐明植物生长和发育以及应力生物学的施用Gras介导的分子机制的基础。本研究可以作为Cassava未来功能调查和分子育种的参考。

RNA测序(RNA-seq)数据MeGRAS基因从以前的不同木薯品种组织中的研究获得[2]．

AA：

氨基酸

装备:

染色体

FPKM：

每百万百万映射的成绩单每千碱基映射的碎片

不适用。

亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室开放项目(no . SKLCOSA-b201609, no . SKLCUSA-b201704);亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室自主研究项目(no . SKLCUSA-a201802);广西科技计划项目(AB18221127)。资助方没有参与研究的实验设计、数据收集、分析和解释，也没有参与手稿的撰写。

从属关系

1. 2 .广西大学农学院，广西南宁530005

   中盈山，兴禄罗，美燕吴，雷西伟，Zhupeng Fan＆Yanmei朱

2. 亚丁农业生物资源保护和利用国家重点实验室，南宁530004

   Xinglu罗

3. 德州学院生态与园林学院，山东德州253023

   钟颖山

贡献

X.L.发起并设计了这个实验。Z.S、M.W、L.W、Z.F和Y.Z.进行了实验并收集了数据。Z.S.分析了数据并写了手稿。X.L.和z . s修改了手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

通讯作者

对应于Xinglu罗．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

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